Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu thành phần loài, mật độ, tập tính muỗi anopheles, tỷ lệ nhiễm Plasmodium spp. trên véc tơ chính và chỉ điểm gen kháng thuốc của Plasmodium falciparum tại bốn tỉnh Tây Nguyên

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:210

Thêm vào BST

Báo xấu

4
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Sinh học "Nghiên cứu thành phần loài, mật độ, tập tính muỗi anopheles, tỷ lệ nhiễm Plasmodium spp. trên véc tơ chính và chỉ điểm gen kháng thuốc của Plasmodium falciparum tại bốn tỉnh Tây Nguyên" trình bày các nội dung chính sau: Xác định thành phần loài, mật độ, tập tính của muỗi Anopheles spp. và tỷ lệ An. minimus và An. dirus nhiễm Plasmodium spp. bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại 4 tỉnh Tây Nguyên, 2019-2022; Phân tích các chỉ điểm phân tử kháng thuốc (K13, plasmepsin 2, exonulcease, Pfmdr1, Pfcrt) trong quần thể Plasmodium falciparum tại điểm nghiên cứu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu thành phần loài, mật độ, tập tính muỗi anopheles, tỷ lệ nhiễm Plasmodium spp. trên véc tơ chính và chỉ điểm gen kháng thuốc của Plasmodium falciparum tại bốn tỉnh Tây Nguyên

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG NGUYỄN THỊ MINH TRINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI, MẬT ĐỘ, TẬP TÍNH MUỖI Anopheles, TỶ LỆ NHIỄM Plasmodium spp. TRÊN VÉC TƠ CHÍNH VÀ CHỈ ĐIỂM GEN KHÁNG THUỐC CỦA Plasmodium falciparum TẠI BỐN TỈNH TÂY NGUYÊN LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC HÀ NỘI, 2024
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG NGUYỄN THỊ MINH TRINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN LOÀI, MẬT ĐỘ, TẬP TÍNH MUỖI Anopheles, TỶ LỆ NHIỄM Plasmodium spp. TRÊN VÉC TƠ CHÍNH VÀ CHỈ ĐIỂM GEN KHÁNG THUỐC CỦA Plasmodium falciparum TẠI BỐN TỈNH TÂY NGUYÊN Chuyên ngành: CÔN TRÙNG HỌC Mã số: 942 01 06 Hướng dẫn 1: PGS.TS.BS. Nguyễn Thu Hương Hướng dẫn 2: TS.BS. Nguyễn Xuân Xã HÀ NỘI, 2024
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi cùng các đồng nghiệp công tác chuyên môn của Khoa Xét nghiệm - Sinh học phân tử, Khoa Nghiên cứu điều trị, Khoa Côn trùng thuộc Viện Sốt rét - Ký sinh trùng- Côn trùng Quy Nhơn thực hiện. Các số liệu về kết quả nêu trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Nguyễn Thị Minh Trinh
ii LỜI CẢM ƠN Luận án được hoàn thành với sự giúp đỡ của Quý Thầy Cô, bạn đồng nghiệp và gia đình. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn: Quý thầy hướng dẫn khoa học PGS.TS.BS. Nguyễn Thu Hương, TS.BS. Nguyễn Xuân Xã đã dành nhiều thời gian, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ chỉnh sửa, bổ sung từ khi viết đề cương đến khi hoàn chỉnh luận án, động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thành các nội dung luận án. Trân trọng cảm ơn sự đóng góp ý kiến chuyên môn có giá trị khoa học và thực tiễn từ Quý thầy cô qua các hội đồng đánh giá để cho luận án ngày càng hoàn thiện và bản thân hàm thụ được nhiều kiến thức, kinh nghiệm trong nghiên cứu chuyên môn; Trân trọng cảm ơn tập thể Khoa Xét nghiệm - Sinh học phân tử, Khoa Nghiên cứu - Điều trị, Khoa Côn trùng thuộc Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Quy Nhơn và các Trung tâm CDC và TTYT huyện của tỉnh Gia Lai, Đắk Lắk, Đắk Nông, Kon Tum tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình thực hiện luận án tại la bô và thực địa; Trân trọng cảm ơn PGS.TS. Cao Bá Lợi-Trưởng Phòng Khoa học-Đào tạo cùng cán bộ trong phòng đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm hồ sơ dự tuyển đến khi hoàn thành luận án. Trân trọng cảm ơn PGS.TS. Hồ Văn Hoàng - Viện trưởng Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn, TS.BS. Hoàng Đình Cảnh - Viện trưởng Viện Sốt rét-KST-CT TƯ và TS.BS. Huỳnh Hồng Quang - Phó Viện trưởng Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn đã luôn khuyến khích, tạo động lực cho tôi hoàn thành luận án; Xin bày tỏ lòng biết ơn Ba Mẹ - người luôn mong muốn các con mình tiến bộ, cảm ơn Chồng và các con đã luôn là động lực mạnh mẽ, gánh vác việc gia đình cho tôi chuyên tâm vào học tập và nghiên cứu khoa học. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn đến tất cả bệnh nhân, người tình nguyện đã hợp tác nghiên cứu tích cực để tôi có đầy đủ số liệu hoàn chỉnh luận án. Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Minh Trinh
iii DANH MỤC MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Diễn giải tiếng Anh Diễn giải tiếng Việt ACTs Artemisinine-based combination therapies Liệu pháp phối hợp có artemisinine An. Anopheles Giống Anopheles ART Artemisinin Artemisinin AS Artesunat Artesunat AS-PCR Allele specific polymerase chain reaction Phản ứng trùng hợp đặc hiệu alen BĐTN Bẫy đèn trong nhà BĐNN Bẫy đèn ngoài nhà BMGS Bẫy màn gia súc c/đ/đ con/đèn/đêm c/ng/đ con/người/đêm c/m/đ con/màn/đêm CQ Chloroquine Chloroquin COI cytochrome oxydase I Cytochrom oxydase tiểu đơn vị I crt chloroquine resistance transporter Ct Cycle threshold value Giá trị chu kỳ ngưỡng CSP circumsporozoite protein protein thoa trùng D3 Day 3 Ngày thứ 3 (kể từ khi dùng thuốc) ddPCR digital droplet PCR PCR kỹ thuật số dạng giọt DHA Dihydroartemisinine Dihydroartemisinin DNA Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleic acid dNTP deoxy nucleotide triphotphate deoxy nucleotide triphotphate ELISA enzyme-linked Immunosorbent assay XN miễn dịch hấp phụ liên kết enzym ETF Early Treatment Failure Thất bại điều trị sớm GMS Greater Mekong Sub-Region Tiểu vùng Sông Mê Kông mở rộng ITS internal transcribed spacers vùng giao gen nội loài KST Ký sinh trùng
iv KSTSR Ký sinh trùng sốt rét K13 Kelch 13 gen Kelch 13 LHSR Lưu hành sốt rét LPF Late Parasitological Failure Thất bại ký sinh trùng muộn LTF Late Treatment Failure thất bại điều trị muộn LTSR Loại trừ sốt rét mdr multidrug-resistance Đa kháng thuốc MNTN Mồi người trong nhà MNNN Mồi người ngoài nhà MQ Mefloquine mRNA Messenger RNA RNA thông tin PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp PCSR Phòng chống sốt rét PM plasmepsin gen plasmepsin PPQ piperaquine phosphate piperaquine phosphate SNPs Single nucleotide polymorphisms Đa hình đơn nucleotide spp. Species pluralis Nhiều loài SRLH Sốt rét lưu hành TCYTTG Tổ chức Y tế thế giới WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới
v MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................... 1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 1.1. Khái quát chung về muỗi Anopheles truyền bệnh sốt rét................................ 3 1.2. Thành phần loài, phân bố và đặc điểm sinh học của muỗi sốt rét trên thế giới... 3 1.2.1. Nghiên cứu về thành phần loài của véc tơ sốt rét trên thế giới .................... 3 1.2.2. Đặc điểm sinh học, phân bố của một số véc tơ sốt rét chính trên thế giới .. 6 1.3. Nghiên cứu về muỗi truyền bệnh sốt rét tại Việt Nam ................................... 9 1.3.1. Đặc điểm sinh học và phân bố một số véc tơ truyền bệnh sốt rét chính ...... 9 1.3.2. Nghiên cứu thành phần loài muỗi truyền bệnh sốt rét tại Việt Nam .........11 1.3.3. Nghiên cứu xác định thành phần loài bằng kỹ thuật sinh học phân tử ......13 1.4. Xác định vai trò truyền bệnh sốt rét của muỗi Anopheles ............................14 1.4.1. Các nghiên cứu về vai trò truyền bệnh sốt rét của muỗi Anopheles..........14 1.4.2. Các kỹ thuật sử dụng xác định ký sinh trùng sốt rét trong cơ thể muỗi ....16 1.4.3. Ứng dụng sinh học phân tử xác định ký sinh trùng sốt rét trong cơ thể muỗi..................................................................................................................17 1.5. Tình hình kháng thuốc sốt rét trên Thế giới và Việt Nam ............................20 1.6. Ký sinh trùng sốt rét P. falciparum và một số thuốc điều trị phổ biến .........22 1.6.1. Ký sinh trùng sốt rét Plasmodium gây bệnh ở người.................................22 1.6.2. Đặc điểm di truyền của ký sinh trùng sốt rét P. falciparum.......................22 1.6.3. Một số thuốc sốt rét thiết yếu và cơ chế tác dụng trên P. falciparum ........24 1.7. Một số chỉ điểm phân tử liên quan kháng thuốc sốt rét ở P. falciparum ......26 1.7.1. Gen mã hóa cho protein Kelch (K13)-chỉ điểm phân tử kháng artemisinin ..........................................................................................................................26 1.7.2. Chỉ điểm phân tử để xác định kháng piperaquine phosphate ....................31 1.7.3. Một số chỉ điểm đa kháng thuốc của ký sinh trùng P. falciparum .............34 1.8. Lý do chọn các địa điểm nghiên cứu trong đề tài .........................................39 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................41 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu của mục tiêu 1 ................................41 2.1.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu.............................................41
vi 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................42 2.1.3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................43 2.1.4. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu .....................................................43 2.1.5. Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ..........................................51 2.1.6. Các thuật ngữ và chỉ số sử dụng trong mục tiêu 1 .....................................52 2.2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu của mục tiêu 2 ................................53 2.2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu.............................................53 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................53 2.2.3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................54 2.2.4. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu .....................................................55 2.2.5. Thiết bị và hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ..........................................66 2.2.6. Định nghĩa và cách thu thập các biến số sử dụng trong mục tiêu 2...........67 2.3. Phân tích và xử lý số liệu ..............................................................................67 2.4. Kiểm soát sai lệch chọn lựa các dữ liệu và khắc phục sai số........................68 2.5. Khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu ............................................................68 2.5.1. Sự chấp thuận của Hội đồng Khoa học và Đạo đức Y sinh .......................68 2.5.2. Cam kết tham gia nghiên cứu.....................................................................69 2.5.3. Thực hiện đúng với Thực hành lâm sàng tốt .............................................69 2.5.4. Cam kết tham gia nghiên cứu thông qua ký bản chấp thuận .....................69 2.5.5. Bảo mật thông tin và số liệu.......................................................................70 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..............................................................71 3.1. Kết quả xác định thành phần loài, mật độ, tập tính của muỗi Anopheles spp. và tỷ lệ An. minimus và An. dirus nhiễm Plasmodium spp. bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại 4 tỉnh Tây Nguyên, 2019-2022 ...............................................71 3.1.1. Thành phần loài muỗi Anopheles tại các điểm nghiên cứu .......................71 3.1.2 Mật độ và tập tính hoạt động đốt người Anopheles tại các điểm nghiên cứu ...78 3.1.3. Xác định Phức hợp Minimus và Dirus bằng kỹ thuật PCR .......................89 3.1.4. Kết quả xác định ký sinh trùng sốt rét trong An. minimus và An. dirus bằng kỹ thuật ddPCR .......................................................................................92 3.2. Phân tích các chỉ điểm phân tử kháng thuốc K13, plasmepsin 2, exonulcease, Pfmdr1, Pfcrt trong quần thể Plasmodium falciparum tại điểm nghiên cứu ...95
vii 3.2.1. Xác định loài ký sinh trùng Plasmodium spp. của các mẫu nghiên cứu....95 3.2.2. Kết quả xác định đột biến điểm trên gen mã hóa K13 của P. falciparum ...97 3.2.3. Kết quả xác định biến thể đa hình gen Plasmepsin 2 của P. falciparum .102 3.2.4. Xác định đột biến điểm trên gen exonuclease liên quan đến kháng piperaquine phosphate của P. falciparum ......................................................106 3.2.5. Kết quả xác định các đột biến điểm trên gen Pfcrt của P. falciparum ..110 3.2.6. Kết quả xác định biến thể đa hình của gen Pfmdr1 của P. falciparum ....114 Chương 4 BÀN LUẬN .....................................................................................119 4.1. Xác định thành phần loài, mật độ, tập tính của muỗi Anopheles spp. và tỷ lệ An. minimus và An. dirus nhiễm Plasmodium spp. bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại 4 tỉnh Tây Nguyên, 2019-2022 ....................................................119 4.1.1. Thành phần loài muỗi Anopheles tại các điểm nghiên cứu .....................119 4.1.2. Mật độ và tập tính hoạt động đốt người Anopheles tại các điểm nghiên cứu 123 4.1.3. Xác định Phức hợp Minimus và Dirus bằng kỹ thuật PCR .....................130 4.1.4. Xác định ký sinh trùng sốt rét trong An. minimus và An. dirus ..............132 4.2. Xác định chỉ điểm phân tử kháng K13, Plasmepsin 2, Exonulcease, Pfmdr1, Pfcrt trong quần thể Plasmodium falciparum ................................................133 4.2.1. Xác định các đột biến điểm trên gen mã hóa K13 propeller .....................133 4.2.2. Xác định biến thể đa hình của gen Plasmepsin 2 .....................................138 4.2.3. Xác định đột biến điểm trên gen exonuclease liên quan kháng piperaquine phosphate .......................................................................................................140 4.2.4. Xác định các đột biến điểm trên gen Pfcrt ...............................................142 4.2.5. Xác định biến thể đa hình của gen Pfmdr1 trên P. falciparum ................146 KẾT LUẬN .......................................................................................................157 KHUYẾN NGHỊ...............................................................................................159 TÍNH MỚI, TÍNH KHOA HỌC, TÍNH THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN....160 MỘT SỐ HẠN CHẾ CỦA ĐỂ TÀI LUẬN ÁN .............................................161 DANH SÁCH CÁC BÀI BÁO KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ ..............................................................................................162 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Các đột biến trên gen K13 theo phân loại Tổ chức Y tế thế giới ........27 Bảng 1.2. Mối tương quan giữa các đa hình trên gen Pfcrt và kết quả thử nhạy/kháng với CQ “in vitro” ............................................................36 Bảng 3.1. Số lượng Anopheles tại các điểm nghiên cứu bằng định loại hình thái .............................................................................................................71 Bảng 3.2. Số lượng các loài muỗi Anopheles thu thập tại Ia H’Drai - Kon Tum72 Bảng 3.3. Số lượng các loài muỗi Anopheles thu thập tại Ia Dom (Đức Cơ-Gia Lai) ......................................................................................................73 Bảng 3.4. Số lượng các loài muỗi Anopheles thu thập tại Ia O (Ia Grai-Gia Lai) .............................................................................................................74 Bảng 3.5. Số lượng các loài muỗi Anopheles thu thập tại Ea Sô (Ea kar - Đắk Lắk)......................................................................................................75 Bảng 3.6. Số lượng loài muỗi Anopheles thu thập tại Krông Na (Buôn Đôn-Đắk Lắk)......................................................................................................76 Bảng 3.7. Số loài muỗi Anopheles thu thập tại Đắk Wil (Cư Jut- Đắk Nông) ....77 Bảng 3.8. Mật độ muỗi Anopheles qua các đợt điều tra tại Ia H’Drai-Kon Tum78 Bảng 3.9. Mật độ muỗi Anopheles các đợt điều tra tại Ia Dom (Đức Cơ - Gia Lai) ......................................................................................................79 Bảng 3.10. Mật độ muỗi Anopheles các đợt điều tra tại Ia O (Ia Grai-Gia Lai) .80 Bảng 3.11. Mật độ muỗi Anopheles các đợt điều tra Ea Sô (Ea kar - Đắk Lắk) .81 Bảng 3.12. Mật độ muỗi Anopheles các đợt điều tra tại Krông Na (Buôn Đôn- Đắk Lắk) ..............................................................................................82 Bảng 3.13. Mật độ muỗi Anopheles các đợt điều tra tại Đắk Wil (Cư Jut- Đắk Nông) ...................................................................................................83 Bảng 3.14. Mật độ véc tơ sốt rét qua các phương pháp ở Kon Tum ...................84 Bảng 3.15. Mật độ véc tơ sốt rét qua các phương pháp ở Gia Lai.......................84 Bảng 3.16. Mật độ véc tơ sốt rét qua các phương pháp ở Đắk Lắk .....................85 Bảng 3.17. Mật độ véc tơ sốt rét qua các phương pháp ở Đắk Nông ..................86 Bảng 3.18. Kết quả phân bố các véc tơ chính tại các điểm nghiên cứu ...............89
ix Bảng 3.19. Kết quả định loại phức hợp Minimus và Dirus bằng kỹ thuật PCR ..91 Bảng 3.20. Số lượng mẫu sử dụng phân tích ddPCR xác định KSTSR trong muỗi .............................................................................................................93 Bảng 3.21. Tỷ lệ nhiễm KSTSR trên mẫu An. minimus và An. dirus bằng ddPCR..................................................................................................95 Bảng 3.22. Kết quả xác định các mẫu máu nhiễm P. falciparum ........................97 Bảng 3.23. Số lượng và tỷ lệ các đột biến trên gen K13 tại các điểm nghiên cứu ...........................................................................................................100 Bảng 3.24. Kết quả xác định các giá trị Ct và 2-∆∆Ct gen Plasmepsin 2 .............103 Bảng 3.25. Số lượng và tỷ lệ biến thể đa hình gen plasmepsin2 tại điểm nghiên cứu .....................................................................................................105 Bảng 3.26. Số lượng và tỷ lệ đột biến Exonuclease E415G tại các tỉnh............108 Bảng 3.27. Số lượng và tỷ lệ đột biến trên gen Pfcrt tại điểm nghiên cứu ........111 Bảng 3.28. Kết quả xác định các giá trị Ct và ∆∆Ct của gen Pfmdr1................115 Bảng 3.29. Số lượng và tỷ lệ biến thể đa hình gen Pfmdr1 tại các địa điểm .....117
x DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Gen K13 và các vị trí có sự thay đổi axit amin trên gen K13 ...............27 Hình 1.2. Mô hình khuếch đại gen Plasmepsin 2-3; 4 gen plasmepsin được biểu thị bằng 4 màu khác nhau và được đánh số I-IV ................................32 Hình 1.3. Giả thuyết cơ chế kháng của P. falciparum với PPQ ...........................33 Hình 1.4. Vị trí gen Pfcrt trên nhiễm sắc thể số 7 và vị trí đột biến liên quan kháng chloroquin phosphate................................................................34 Hình 1.5. Gen Dd2 Pfcrt dự đoán protein xuyên màng gồm 424 acid amin .......35 Hình 2.1. Địa điểm nghiên cứu các tỉnh Gia Lai, Kon Tum, Đắk Lắk, Đắk Nông .............................................................................................................42 Hình 2.2. Sơ đồ cartridge tạo vi giọt. Hàng 1 là vị trí bơm phản ứng chứa mẫu. Hàng 2 là vị trí bơm dầu tạo giọt. Hàng 3 là vị trí lấy vi giọt được tạo ra. .........................................................................................................48 Hình 2.3. Quy trình phản ứng ddPCR ..................................................................49 Hình 2.4. Đồ thị vi giọt theo cường độ tín hiệu huỳnh quang ............................50 Hình 2.5. Sơ đồ phản ứng nested-PCR gen 18S để xác định 4 loài KSTSR .......56 Hình 3.1. Thời gian đốt người trong đêm của các véc tơ tại Kon Tum ...............87 Hình 3.2. Thời gian đốt người trong đêm của các véc tơ tại Gia Lai ..................87 Hình 3.3. Thời gian đốt người trong đêm của các véc tơ tại Đắk Lắk.................88 Hình 3.4. Thời gian đốt người trong đêm của các véc tơ tại Đắk Nông ..............89 Hình 3.5. Điện di sản phẩm PCR xác định loài Anopheles. ................................90 Hình 3.6. Điện di sản phẩm PCR xác định loài Anopheles dirus. .......................90 Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR xác định loài Anopheles spp...........................91 Hình 3.8. Kết quả ghi nhận số vi giọt từ các giếng mẫu thực địa. .......................93 Hình 3.9. Đồ thị nồng độ mục tiêu trong phản ứng của các mẫu xét nghiệm trong nghiên cứu này (đơn vị: bản/μl). .........................................................94 Hình 3.10. Kết quả điện di định loài các mẫu P. falciparum. ..............................96 Hình 3.11. Bản đồ phân bố thời gian và địa điểm thu thập mẫu KSTSR P. falciparum ............................................................................................97 Hình 3.12. Điện di sản phẩm nested PCR nhân bản gen K13 của P. falciparum..98 Hình 3.13. Kết quả phân tích trình tự phát hiện các đột biến trên vùng gen K13.99
xi Hình 3.14. Bản đồ phân bố các đột biến gen K13 propeller tại điểm nghiên cứu ...........................................................................................................101 Hình 3.15. Biểu đồ các đường biểu diễn khuếch đại của các mẫu P. falciparum ...........................................................................................................102 Hình 3.16. Điện di sản phẩm nested-PCR nhân bản gen exonuclease của P. falciparum tại các điểm nghiên cứu. .................................................106 Hình 3.17. Kết quả phân tích trình tự phát hiện đột biến gen Exo E415G. .......107 Hình 3.18. Bản đồ phân bố sự xuất hiện các đột biến gen exonuclease và plasmepsin2 tại các tỉnh nghiên cứu .................................................109 Hình 3.19. Điện di sản phẩm nested-PCR nhân bản gen Pfcrt của P. falciparum tại các điểm nghiên cứu. ....................................................................110 Hình 3.20. Biểu đồ thể hiện tỷ lệ xuất hiện đột biến trên gen Pfcrt tại các tỉnh nghiên cứu .........................................................................................113 Hình 3.21. Biểu đồ các đường biểu diễn khuếch đại của các mẫu KSTSR. ......114 Hình 3.22. Bản đồ sự phân bố xuất hiện các biến thể đa hình gen Pfmdr1 tại các tỉnh nghiên cứu ..................................................................................118
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong hơn thập niên qua, Việt Nam đã và đang đạt được nhiều thành quả quan trọng trong phòng chống và tiến tới loại trừ sốt rét (PC&LTSR) với số trường hợp mắc và tử vong giảm dần qua thời gian. Dù vậy, bệnh sốt rét vẫn tiếp tục là vấn đề y tế công cộng quan trọng, đặc biệt khu vực miền Trung-Tây Nguyên vẫn đang đối mặt với thách thức như sốt rét trên nhóm dân giao lưu biên giới, di biến động, đi rừng, ngủ rẫy khó kiểm soát, muỗi kháng hóa chất, thay đổi cơ cấu và ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc điều trị. Tình trạng các vector sốt rét chính An. minimus và An. dirus thay đổi tập tính, thời gian đốt máu người sớm và kéo dài làm cho khâu phòng chống vector giảm hiệu quả. Sự thay đổi các yếu tố vi khí hậu, điều kiện tự nhiên, môi trường và tác động của con người đã ảnh hưởng đến phân bố, tập tính, thành phần loài cũng như vai trò truyền bệnh muỗi Anopheles. Việc xác định nhiễm Plasmodium trong cơ thể muỗi rất quan trọng để hiểu được sinh thái, phân bố địa lý, số lượng và hành vi loài véc tơ đặc biệt ở vùng địa lý có sốt rét lưu hành (SRLH). Hiện nay, các phương pháp để phát hiện thoa trùng như mổ tuyến nước bọt, xét nghiệm miễn dịch hấp phụ liên kết enzyme (ELISA), sinh học phân tử như PCR, realtime PCR hoặc gần đây nhất là PCR kỹ thuật số dạng giọt (ddPCR). Tình hình kháng thuốc artemisinin và giảm nhạy với thuốc phối hợp có thành phần artemisinin (ACTs) do P. falciparum được xác định tại Tiểu vùng Sông Mê Kông mở rộng đã và đang đe dọa đến thành quả PC&LTSR. Hiện nay, việc dùng chỉ điểm phân tử liên quan kháng thuốc trên quần thể ký sinh trùng P. falciparum là hướng nghiên cứu mới bên cạnh các thử nghiệm in vitro và in vivo. Để thúc đẩy nhanh lộ trình loại trừ sốt rét, nhiều quốc gia tăng cường khả năng tiếp cận các liệu pháp ACTs đặc biệt là ở Đông Nam Á. Việc này dù làm giảm tỷ lệ mắc bệnh nhưng lại tạo áp lực chọn lọc, dẫn đến tăng kháng artemisinin và ACTs. Điều quan trọng là phát triển chiến lược nhằm giảm áp lực chọn lọc và
2 lan rộng chủng P. falciparum kháng thuốc trong khi vẫn đảm bảo ưu tiên giảm tỷ lệ mắc và tử vong [1]. Do đó, xác định các chỉ điểm phân tử trên quần thể P. falciparum là cần thiết để theo dõi phân bố, bản đồ phân bố kháng thuốc, đồng thời hiểu rõ hơn sự tiến hóa và cơ chế kháng thuốc, kể cả artemisinin và các ACTs. Hơn nữa, cả về mặt lý thuyết và thực hành trên một khu vực có bệnh sốt rét lưu hành, nếu quần thể ký sinh trùng Plasmodium spp. nói chung và P. falciparum nói riêng kháng thuốc được mang bởi quần thể vector sốt rét Anopheles spp. chính và phụ sẽ rất nguy hiểm do chúng phát tán rộng chủng ký sinh trùng kháng thuốc [2], [3], trong khi các thuốc hiện dùng có số lượng hạn hữu và thuốc mới vẫn đang trong giai đoạn thử nghiệm. Với ý nghĩa như trên, đề tài “Nghiên cứu thành phần loài, mật độ, tập tính muỗi Anopheles, tỷ lệ nhiễm Plasmodium spp. trên véc tơ chính và chỉ điểm gen kháng thuốc của Plasmodium falciparum tại bốn tỉnh Tây Nguyên” được tiến hành nhằm 2 mục tiêu: 1. Xác định thành phần loài, mật độ, tập tính của muỗi Anopheles spp. và tỷ lệ An. minimus và An. dirus nhiễm Plasmodium spp. bằng kỹ thuật sinh học phân tử tại 4 tỉnh Tây Nguyên, 2019-2022. 2. Phân tích các chỉ điểm phân tử kháng thuốc (K13, plasmepsin 2, exonulcease, Pfmdr1, Pfcrt) trong quần thể Plasmodium falciparum tại điểm nghiên cứu.
3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát chung về muỗi Anopheles truyền bệnh sốt rét Muỗi là một trong những véc tơ trung gian truyền bệnh sốt rét và một số bệnh khác như sốt xuất huyết, bệnh giun chỉ, viêm não Nhật Bản, Zika, Chikungunya. Các ký sinh trùng sốt rét (Plasmodium) được mang bởi nhiều loài muỗi Anopheles spp. khác nhau là nguyên nhân gây ra sốt rét. Về phân loại khoa học, muỗi Anopheles thuộc giới động vật, ngành chân khớp, lớp côn trùng, bộ hai cánh, họ Culicidae, giống Anopheles. Muỗi Anopheles là một nhóm lớn và phong phú, có mặt khắp ở các vùng ôn đới và nhiệt đới trên thế giới với 721 loài được xếp vào hai phân họ Anophelinae và Culicinae tổng cộng gồm 113 giống. Phân họ Anophelinae (Grassi, 1900) chia thành ba giống Anopheles, Bironella và Chagasia. Giống Anopheles (Meigen, 1818), gồm 493 loài và nhiều phức hợp loài đang được định danh [4]. Các loài chính thức phân theo 7 phân giống là Anopheles (182 loài), Baimaia (1 loài), Cellia (220 loài), Kerteszia (12 loài), Lophopodomyia (6 loài), Nyssorhynchus (39 loài) và Stethomyia (5 loài). Giống Bironella (Theobald, 1905) có 8 loài được chia thành 3 phân giống là Bironella (2 loài), Brugella (3 loài) và Neobironella (3 loài). Giống Chagasia (Cruz, 1906) là một giống chỉ có 5 loài [5]. 1.2. Thành phần loài, phân bố và đặc điểm sinh học của muỗi sốt rét trên thế giới 1.2.1. Nghiên cứu về thành phần loài của véc tơ sốt rét trên thế giới Các nghiên cứu về hình thái muỗi Anopheles đã cho thấy các loài mang tính đa hình, thường là thành viên của nhóm loài hoặc phức hợp loài và phức hợp gồm các loài có quan hệ gần, trong đó có cả véc tơ truyền bệnh và không có khả năng truyền bệnh, có hình thái tương đối giống nhau nhưng khác về đặc điểm di truyền, sinh lý, sinh thái và vai trò truyền bệnh.
4 1.2.1.1. Phức hợp Gambiae ở Châu Phi Anopheles gambiae là phức hợp của ít nhất 7 thành viên khó phân biệt bằng hình thái, gồm các véc tơ sốt rét quan trọng nhất ở cận sa mạc Sahara, Châu Phi và là một trong các loài muỗi truyền sốt rét hiệu quả nhất. Phức hợp gồm Anopheles gambiae s.s (senso stricto), Anopheles arabiensis, Anopheles merus, Anopheles melas và Anopheles quadriannulatus, Anopheles coluzzii, Anopheles christyi [6]. 1.2.1.2. Phức hợp Maculipenis ở Châu Âu Maculipenis là phức hợp loài đầu tiên được mô tả trong giống Anopheles. Việc khám phá phức hợp này đã làm rõ về dịch tễ học sốt rét những năm 1930 về sự lan truyền sốt rét ở châu Âu và Bắc Mỹ. Nghiên cứu về đặc điểm sinh học và di truyền tế bào đã xác định 8 loài trong phức hợp Maculipenis ở châu Âu. Trong đó, An. atroparvus, An. labranchiae, An. messeae, An. sacharovi và An. subalpinus là véc tơ vì tập tính ưa đốt máu người; trong khi An. maculipenis s.s., An. melanoon, An. beklemishevi không có vai trò truyền bệnh mà chúng thích đốt máu động vật. Một số thành viên loài này sống ở nước ngọt và các loài khác sống ở nước lợ [7]. 1.2.1.3. Phức hợp Quadrimaculatus ở Châu Mỹ An. quadrimaculatus từng được coi là véc tơ truyền sốt rét chủ yếu tại miền Đông của Mỹ. Dựa trên nghiên cứu về hình thái, tế bào, sinh học phân tử, di truyền các nhà khoa học đã chứng minh đây là một phức hợp gồm 5 loài An. diluvialos, An. iniendatus, An. maverlius, An. quadrimaculatus, An.samaradinus [8]. 1.2.1.4. Phức hợp ở các nước Đông Nam Á Tại vùng Đông Nam Á gồm nhiều phức hợp loài và đến nay phức hợp loài được ghi nhận ở Đông Nam Á gồm Annularis, Barbirostris, Culicifacies, Fluviatilis, Leucosphyrus, Maculatus, Philippinensis, Subpictus, Sundaicus, Sinensis , Minimus và Dirus.
5 Nhóm Maculatus (Neocellia Series) Nhóm loài đồng hình Maculatus gồm 14 thành viên, trong đó có cả An. pseudowillmori và An. willmori và 6 loài được quy thành các nhóm phụ; nhóm phụ Maculatus có An. dispar, An. greeni, An. dravidicus và An. maculatus và nhóm phụ Sawadwongporni gồm An. notanandai và An. sawadwongporni [9], [10]. Các thành viên của nhóm được phân bố ở các vùng khác nhau từ Ấn Độ đến Indonesia và Philippines. Hai loài An. dispar và An. greeni chỉ thấy ở Philippines [11]. Nghiên cứu di truyền trên nhóm Maculatus tìm thấy kiểu nhiễm sắc thể K ở miền Đông Thái Lan có trình tự ITS2 duy nhất có mức sai khác đến 3,7% so với loài gần nhất An. sawadwongporni và biểu hiện một sự khác biệt [12]. Nhóm này gồm 9 loài với nhiễm sắc thể kiểu K được xếp vào nhóm phụ Sawadwongporni [9]. Phức hợp Sundaicus (Pyretophorus Series) Đối với An. sundaicus, Reid (1968) nghi ngờ là loài chị em do sự có mặt ở cả hai môi trường nước mặn và nước ngọt và có sự khác biệt về tập tính, sinh thái ở muỗi trưởng thành [13]. Quần thể An. sundaicus được phân biệt thành 3 dạng là A, B và C. Dạng A phân bố ở Thái Lan và Indonesia, trong khi dạng B tìm thấy ở Bắc Sumatra và Trung Java, dạng ở vùng nước ngọt. Dạng C chỉ có mặt ở Bắc Sumatra. Dạng D được tìm thấy trên đảo Car Nicobar, Ấn Độ và có mặt ở cả 2 môi trường là nước ngọt và lợ [14]. An. epiroticus (An. sundaicus loài A) có mặt từ vùng ven biển miền Nam Việt Nam, Campuchia, Thái Lan và phía Nam đến bán đảo Malaysia. An. sundaicus loài D nằm trên đảo Nicobar và Andaman, Ấn Độ. An. sundaicus loài E được tìm thấy trên đảo Sumatra và đảo Java của Indonesia. Phức hợp Minimus Phức hợp An. minimus có ít nhất 3 loài đồng hình, 2 loài có tên chính thức là An. minimus và An. harrisoni và một loài có tên chưa chính thức là An.minimus E [5]. Nghiên cứu cho thấy An. minimus và An. harrisoni là các véc
6 tơ chính ở vùng đồi núi ở các nước phương Đông và thường ở độ cao từ 200-900 m, nhưng ít gặp ở độ cao trên 1500m [15]. Định loại sinh học phân tử, thành viên phức hợp Minimus được ghi nhận ở Campuchia [16], miền nam Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản, Lào, Thái Lan, Việt Nam [17], [18]. An. harrisoni được ghi nhận ở Việt Nam, Lào, Thái Lan, miền Trung Myanmar và Nam Trung Quốc (đến vĩ độ bắc 32,5N). An. minimus và An. harrisoni tìm thấy phân bố cùng nhau trên diện rộng ở miền Bắc, miền Trung Việt Nam, phía Nam Trung Quốc, Phía bắc Lào và Tây Thái Lan [5]. Phức hợp Dirus An. dirus thuộc nhóm loài An. leucosphyrus Donitz, là véc tơ chính ở Thái Lan và Đông Nam Á. Phức hợp Dirus có 8 thành viên gồm An.dirus (trước đây là loài An. dirus A), An. cracens (trước đây là sp. B), An. scanloni (trước đây là sp. C), An. baimaii (trước đây là sp. D), An. elegans (trước đây là sp. E), An. nemophilous (trước đây là sp. F), An. takasagoensis và các loài mới được thêm vào gần đây có tên không chính thức là An. aff. takasagoensis [5]. Trong số đó, An. dirus và An. baimaii là các vectơ đặc biệt đều có tính ưa đốt máu người cao và đóng vai trò chính trong việc truyền sốt rét qua đốt người cả trong và ngoài nhà và tránh hầu hết các phương pháp kiểm soát thông thường do chủ yếu sống ngoài trời. Bọ gậy thường được tìm thấy trong hồ nước ngọt nhỏ, nông và có bóng râm trong môi trường rừng như vũng nước, hố, dấu chân động vật, vết bánh xe, khúc gỗ rỗng và dòng chảy chậm [5]. 1.2.2. Đặc điểm sinh học, phân bố của một số véc tơ sốt rét chính trên thế giới Vùng địa lý khác nhau sẽ có loài muỗi truyền bệnh sốt rét khác nhau phù hợp với điều kiện tự nhiên từng vùng. Bên cạnh véc tơ chính còn có nhiều véc tơ phụ đóng vai trò thứ yếu trong lan truyền sốt rét. Mỗi véc tơ có phân bố nhất định và đóng vai trò chính trong khu vực nào đó. Cùng vùng địa lý có thể có cả véc tơ chính và một số véc tơ phụ. Vai trò chính hay phụ có thể thay đổi theo thời gian,
7 khu vực địa lý và sự có mặt của véc tơ chính và phụ là một trong những yếu tố quyết định có lan truyền sốt rét hay không [19]. Loài An. gambiae sống trong rừng thích sống ngoài nhà hơn ở miền nam Sierra Leone, trong khi khu vực Savannah hầu hết thích sống trong nhà. An. dirus đốt máu ban ngày cũng được thấy trong rừng, nhất là nơi ít ánh sáng mặt trời xuyên qua những tán cây [20]. Tập tính véc tơ sốt rét ở các vùng cao và vùng đồng bằng ở Tây Kenya dưới tác động của các biện pháp kiểm soát véc tơ cho thấy An. gambiae s.l. là phố biến nhất, tiếp theo là An. funestus s.l., An. gambiae (91%), An. arabiensis (8%) tại Bungoma, trong khi ở Kisian, An. arabiensis (60%) và An. gambiae (39%). Tập tính trú đậu của An. gambiae s.l và An. funestus trong nhà cao hơn ngoài nhà ở hai điểm [21]. De ene Getache và cộng sự (2019) [22] nghiên cứu ở phía Tây Nam của Ethiopia đã thu thập 13 loài, trong đó An. gambiae s.l. phố biến nhất ở Ghibe (87,9 ) và ở Darge (67,7 ). Mật độ muỗi An. gambiae (s.l.) thu thập bằng bẫy đèn trong và ngoài nhà lần lược 0,7 và 1,8 ở Ghibe, và 0,125 và 0,07 ở Darge. Muỗi Anopheles phong phú hơn ở những ngôi nhà gần sông so với nhà xa sông ở cả hai điểm nghiên cứu. Trong số muỗi thu bằng bẫy đèn CDC thì có 67,6 không no máu và chỉ số đốt máu trong và ngoài nhà của An. gambiae (s.l.) lần lượt là 58,4 và 15,8 ở Ghibe, trong khi ở Darge tỷ lệ này lần lượt 57 và 50 . Như vậy, An. gambiae (s.l.) là véc tơ chính ở Ethiopia và loài này hoạt động trong và ngoài nhà, đốt cả người và gia súc, mật độ cao hơn ở các nhà gần sông. An. gambiae (s.l.) ghi nhận nhiễm thoa trùng ở Ghibe, còn ở điểm Darge không ghi nhận. Nghiên cứu phân bố véc tơ sốt rét và động lực lan truyền ở vùng Gbeke, miền Trung của Bờ Biển Ngà giai đoạn 2017-2019 của Koffi AA và cộng sự (2023) cho biết An. gambiae s.l. là véc tơ phổ biến nhất, chiếm hơn 84,5% so với số véc tơ thu được, tiếp theo An. funestus (12,0%) và An. nili (3,5%) [23]. Về phân bố không gian và mô hình sinh thái về sự mở rộng địa lý của phức