Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng vào sản xuất rượu brandy từ quả dứa

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:198

Thêm vào BST

Báo xấu

36
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của Luận án này nhằm tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực lên men etanol cao, tạo hương thơm đặc trưng, phù hợp để sản xuất rượu brandy từ quả dứa đạt chất lượng tốt. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng vào sản xuất rượu brandy từ quả dứa

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI -- -- HOÀNG THỊ LỆ THƯƠNG NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM MEN ĐỂ ỨNG DỤNG VÀO SẢN XUẤT RƯỢU BRANDY TỪ QUẢ DỨA Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Quang Hào TS. Trần Thị Thuý Hà Nội - 2020
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả của đề tài Luận án Tiến sỹ: Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng vào sản xuất rượu brandy từ quả dứa” là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả và số liệu trình bày trong Luận án là trung thực, chưa được công bố trong bất cứ nghiên cứu của các tác giả trước đây. Các bài báo khoa học được công bố với sự cho phép, đồng ý của các đồng tác giả. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm về công trình nghiên cứu này. Tác giả Hoàng Thị Lệ Thương
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy Cô hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Quang Hào và TS. Trần Thị Thúy đã luôn tận tâm giúp đỡ, hướng dẫn, động viên tôi trong quá trình nghiên cứu, thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn GS. TS. Nguyễn Thành Đạt, PGS. TS. Dương Minh Lam, PGS. TS. Đoàn Văn Thược, TS. Phan Duệ Thanh, ThS. Tống Thị Mơ, CN. Phạm Thị Hồng Hoa đã những góp ý và những hỗ trợ tinh thần quan trọng trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành cảm ơn tập thể Bộ môn CNSH – Vi sinh, Khoa Sinh học, trường Đại học Sư Phạm Hà Nội; Bộ môn Hóa – Sinh, Khoa Khoa học cơ bản; Ban Giám hiệu Trường Đại học Tân Trào – Tuyên Quang đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Công ty cổ phần Thực phẩm xuất khẩu Đồng Giao; Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghệp thực phẩm; Phòng Phân tích hóa học, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viên Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Viện Kiểm Nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, đã hỗ trợ tôi trong quá trình thu thập mẫu, thu thập số liệu, phân tích kết quả một số thí nghiệm. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các đồng nghiệp, gia đình và bạn bè đã luôn động viên, khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 18 tháng 8 năm 2020 Tác giả Hoàng Thị Lệ Thương
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................................................ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...................................... 5 1.1. Nấm men ......................................................................................................... 5 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và sử dụng nấm men trong trong lên men rượu ............. 5 1.1.2. Đặc điểm sinh học của nấm men ................................................................... 7 1.1.3. Phân loại, tiêu chí tuyển chọn các chủng nấm men thường dùng để sản xuất brandy ................................................................................................................... 10 1.1.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển và lên men của nấm men ................................................................................................................... 13 1.1.5. Cải biến chủng nấm men ............................................................................. 18 1.2. Dứa – nguyên liệu để sản xuất Brandy dứa ............................................... 19 1.2.1. Nguồn gốc của cây dứa ............................................................................... 19 1.2.2. Sơ lược tình hình trồng và chế biến dứa ..................................................... 20 1.2.3. Đặc điểm sinh học và thành phần dinh dưỡng của dứa ............................. 22 1.3. Công nghệ sản xuất rượu Brandy ............................................................... 24 1.3.1. Lịch sử nghiên cứu và sản xuất rượu brandy .............................................. 24 1.3.2. Sản xuất vang để chưng cất thu brandy ..................................................... 33 1.3.3. Chưng cất rượu vang để thu brandy ........................................................... 38 1.3.4. Tàng trữ và tạo hương cho brandy.............................................................. 43 1.3.5. Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng brandy Việt Nam .......................................45 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 49 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị ................................................................. 49 2.1.1. Nguyên liêu ................................................................................................. 49 2.1.2. Hoá chất và môi trường .............................................................................. 49 2.1.3. Chủng giống vi sinh vật .............................................................................. 50 2.1.4. Thiết bị nghiên cứu ..................................................................................... 50 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 51 2.2.1. Phương pháp vi sinh ................................................................................... 51 2.2.2. Phương pháp hoá lý .................................................................................... 63
2.2.3. Phân tích cảm quan rượu ............................................................................ 69 2.2.4. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu ...................................................... 72 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 73 3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men từ dịch ép dứa Queen ............... 73 3.1.1. Phân lập nấm men trong môi trường dịch ép dứa Queen ........................... 73 3.1.2. Tuyển chọn chủng nấm men ........................................................................ 73 3.2. Đặc điểm sinh học của chủng nấm men D8 tuyển chọn ......................... 76 3.2.1. Hình thái của khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng nấm men D8 ......... 76 3.2.2. Đặc điểm sinh hóa – sinh lý của chủng nấm men D8 .................................. 77 3.2.3. Xác định tên khoa học của chủng D8 ............................................................. 80 3.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm men S. cerevisiae D8 ........................................................................................................ 81 3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men vang dứa ........................... 94 3.3.1. Thành phần hóa học cơ bản của dịch dứa ép .............................................. 94 3.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men vang dứa .............................. 94 3.3.4. Sản xuất brandy dứa ở quy mô thực nghiệm (100 lít )bằng chủng S. cerevisiae D8 ...................................................................................................... 105 3.4. Cải biến chủng nấm men S. cerevisiae D8 bằng kĩ thuật đột biến ngẫu nhiên ................................................................................................................. 106 3.4.1. Tác dụng gây chết của hóa chất NTG, tia cực tím UV và kết hợp NTG với UV đến tế bào nấm men S. cerevisiae D8 .......................................................... 107 3.4.2. Hoạt lực lên men ethanol của các biến chủng........................................... 108 3.5. Chưng cất, làm sạch, tàng trữ và tạo hương ............................................ 114 3.5.1. Chưng cất và làm sạch rượu ..................................................................... 115 3.5.2. Tàng trữ và tạo hương đặc trưng cho brandy dứa bằng gỗ sồi ................. 125 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................................... 139 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ............ 141 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 142 PHỤ LỤC
DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Diễn giải Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt 2KG Calcium-2; keto-gluconate Calcium-2; keto-gluconate ADO Adonitol (ribitol) Adonitol (ribitol) ARA L-arabinose L-arabinose CEL Cellobiose Cellobiose CFU Colony Forming Units Đơn vi hình thành khuẩn lạc Da Dalton Dalton DNS 3,5- Dinitrosalicylic acid 3,5- Dinitrosalicylic acid Nồng độ hoạt chất làm giảm 50% tốc EC50 Effective Concentration độ sinh trưởng của Vi Sinh Vật GAL D-galactose D-galactose Gas Chromatography Mass Hệ thống mãy phân tích sắc kí khí – GC-MS spectrophotometer khối phổ GLU D-glucose D-glucose GLY Glycerol Glycerol INO Inositol Inositol LAC D-lactose D-lactose MAL D-maltose D-maltose MDG Methyl-α D-glucopyranoside Methyl-α D-glucopyranoside MLZ D-melezitose D-melezitose NAG N-acetyl-glucosamine N-acetyl-glucosamine N-methyl-N-nitro-N- NTG N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine nitrosoguanidine RAF D-raffinose D-raffinose S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae SAC D-saccharose D-saccharose SOR D-sorbitol D-sorbitol TRE D-trehalose D-trehalose
UV Ultraviolet Tia cực tím UV-VIS Ultraviolet - visible Thiết bị quang phổ hấp thụ phân tử V/V Volume/Volume = Vol. Thể tích/ thể tích VSV Microbiology Vi sinh vật Vietnam Type Cultrure VTCC Bộ sưu tập giống chuẩn Việt Nam Colection WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới XLT Xylitol Xylitol XYL D-xylose D-xylose
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần các chất hữu cơ cơ bản trong tế bào nấm men [146] ............8 Bảng 1.2. Một số enzyme quan trọng trong nấm men [149] ....................................11 Bảng 1.3. Thành phần hoá học của một số giống dứa chủ yếu ở nước ta [10] 5 .....22 Bảng 1.4. Thành phần dinh dưỡng trong 100 g thịt quả dứa trồng ở Trung Mỹ [100] ..23 Bảng 1.5. Thành phần hóa lý và cảm quan của brandy dứa 41% [11] ....................32 Bảng 1.6. Thành phần hóa lý và cảm quan của brandy dứa 29% [11] ....................33 Bảng 1.7. Xếp hạng chất lượng sản phẩm - TCVN 3217 – 1979 [2] ........................46 Bảng 1.8. Các chỉ tiêu hóa học của rượu chưng cất – TCVN 7043:2013 [3] .........47 Bảng 1.9. Giới hạn tối đa hàm lượng kim loại nặng đối với đồ uống có cồn - TCVN 7043:2013 [3] ................................................................................................47 Bảng 2.1. Thể tích dịch men giống các chủng nấm men tuyển chọn (D1- D8 được dùng bổ sung vào bình lên men để đạt 13,4×106 tế bào/ ml ..........................54 Bảng 2.2. Tiêu chuẩndung dịch McFarland ở bước sóng 600nm (12/10/2014), được đo tại Phòng thí nghiệm UCRF DeRisi: ........................................................59 Bảng 2.3. Bảng mẫu thử và dung dịch furfurol chuẩn ..............................................68 Bảng 2.4. Yêu cầu cảm quan đối với rượu chưng cất - TCVN 3217 – 79 [2] ..........70 Bảng 2.5. Hệ số quan trọng của từng chỉ tiêu cảm quan [2]....................................71 Bảng 2.6. Bảng chuyển đổi điểm cảm quan có trọng số [2] .....................................71 Bảng 2.7. Mức chất lượng cảm quan của rượu [2] ..................................................72 Bảng 3.1. Mật độ tế bào của 8 chủng nấm men trong bình nhân .............................73 giống và thể tích dịch nhân giống cần lấy để bổ sung vào bình lên men .................73 Bảng 3.2. Hoạt lực lên men ethanol và khả năng tạo hương của 8 chủng nấm men phân lập ..........................................................................................................74 Bảng 3.3. Khả năng lên men của 4 chủng nấm men D3, D4, D5, D8 ......................75 ở các môi trường có pH thấp ....................................................................................75 Bảng 3.4. Khả năng lên men đường của chủng D8 và chủng TCCY bằng kit API C 20 AUX ...........................................................................................................78 Bảng 3.5. Khả năng lên men đường của chủng D8 và chủng TCCY bằng kit API ID 32 C ...79 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường đến quá trình nhân giống chủng S. cerevisiae D8 ...................................................................................83
Bảng 3.7. Thành phần hóa học cơ bản của dịch ép dứa ...........................................94 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men dịch dứa ........................95 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men vang dứa..................96 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men ......................97 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa tan ban đầu trong dịch lên men đến quá trình lên men vang dứa............................................................................98 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của lượng men giống đến quá trình lên men vang dứa .......99 Bảng 3.12. Động thái của quá trình lên men dịch dứa trong 24 giờ đầu quy mô 20 lít/mẻ .............................................................................................................103 Bảng 3.13. Hoạt lực lên men ethanol của các biến chủng đã được xử lý đột biến bằng NTG .....................................................................................................109 Bảng 3.14. Hoạt lực lên men ethanol của các biến chủng được xử lý đột biến tích lũy (kết hợp NTG và UV)..............................................................................110 Bảng 3.15. Khả năng lên men trong môi trường có hàm lượng đường cao của biến chủng tích lũy NU 120.4 và chủng nấm men S. cerevisiae D8 ....................113 Bảng 3.16. Lên men ethanol bằng biến chủng tích lũy NU 120.4 .........................114 Bảng 3.17. Sự liên quan giữa lượng rượu đầu được ngắt ra với hàm lượng aldehyde và acid còn lại trong rượu giữa ...................................................................116 Bảng 3.18. Thành phần brandy dứa được làm sạch bằng phương pháp hóa học trong môi trường acid có pH khác nhau .....................................................120 Bảng 3.19. Biến động về màu sắc, mùi, vị của brandy dứa trong quá trình tàng trữ 24 tháng với gỗ sồi (dạng thanh và dạng bột) .......................................................127 Bảng 3.20. Một số thành phần hương chính của brandy dứa trắng sau 24 tháng tàng trữ không có gỗ sồi ...............................................................................130 Bảng 3.21. Thành phần hương của brandy dứa được tàng trữ 24 tháng với bột gỗ sồi thương mại (4g/l) ....................................................................................131
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Quy trình sản xuất brandy nho (Viện Nghiên cứu Bông và phát triển nông nghiệp Nha Hố) [21] ...............................................................................31 Hình 1.2. Cơ chế quá trình lên men rượu ethanol [63] .........................................35 Hình 1.3. Hệ thống nồi chưng cất brandy [116] ......................................................40 Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn xác định hàm lượng đường khử glucose theo phương pháp DNS ................................................................................................57 Hình 2.2. Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng furfurol ...............................................68 Hình 3.1. Khuẩn lạc của chủng D8 trên môi trường Hansen đặc ở 28oC sau 96 h nuôi cấy ...................................................................................................76 Hình 3.2. Hình dạng tế bào của chủng D8 trên môi trường Hansen đặc sau 96h nuôi cấy ở 28oC (chụp dưới kính hiển vi điện tử S4800-NHE) .........................77 Hình 3.3. Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường đến quá trình nhân giống chủng S. cerevisiae D8 ............................................................................82 Hình 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến quá trình nhân giống .... chủng S. cerevisiae D8 ...........................................................................85 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình nhân giống nấm men S. cerevisiae D8....86 Hình 3.6. Ảnh hưởng của (NH 4 )2 SO4 đến quá trình nhân giống chủng S. cerevisiae D8 ..........................................................................................88 Hình 3.7. Ảnh hưởng của pepton đến quá trình nhân giống chủng S. cerevisiae D8 .....90 Hình 3.8. Ảnh hưởng của nước chiết giá đỗ đến quá trình nhân giống chủng S. cerevisiae D8 ...........................................................................................92 Hình 3.9. Động thái của quá trình lên men vang dứa quy mô 20 lít/mẻ.................104 Hình 3.11. Khả năng chịu ethanol của biến chủng tích lũy NU120.4 và chủng nấm men S. cerevisiae D8..............................................................................112 Bảng 3.15. Khả năng lên men trong môi trường có hàm lượng đường cao của biến chủng tích lũy NU 120.4 và chủng nấm men S. cerevisiae D8 .............113 Hình 3.15. Thành phần tạp chất có trong brandy dứa được làm sạch bằng phương pháp kết hợp...........................................................................................124
Hình 3.16. Sắc ký đồ GC-MS phân tích thành phần hương của brandy dứa trắng ....129 Hình 3.17. Sắc ký đồ GC-MS phân tích thành phần hương của brandy dứa được tàng trữ với bột gỗ sồi thương mại 24 tháng ...................................................130 Hình 3.18. Sơ đồ quy trình sản xuất brandy dứa .....................................................135
1 MỞ ĐẦU Brandy là loại rượu cao độ chưng cất từ vang chất lượng cao, rất được ưa chuộng. Brandy có tác dụng kích thích thần kinh, tim mạch, tiêu hóa nên sử dụng một lượng nhỏ mỗi ngày rất tốt cho sức khỏe. Rượu brandy phù hợp với nhu cầu của giới trẻ nói riêng và người dân nói chung nên được sử dụng ngày càng nhiều. Tuy nhiên, rượu brandy mà chúng ta sử dụng hiện nay chủ yếu vẫn là nhập ngoại, khối lượng nhập đứng thứ 3 trong số các loại rượu mạnh nhập khẩu vào Việt Nam, mức tăng trưởng thị trường tăng bình quân mỗi năm là 18,8% nên giá thành cao, chưa được sử dụng rộng rãi [10]. Chính vì vậy, việc tìm ra nguồn nguyên liệu trong nước và công nghệ phù hợp để chủ động sản xuất brandy đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng có ý nghĩa quan trọng. Dứa là cây ăn quả phổ biến ở nước ta, được phân bố từ Bắc đến Nam. Năm 2007 tổng sản lượng dứa trong cả nước đạt 529.100 tấn, năm 2011 đạt 532.700 tấn, năm 2016 đạt 579.982,3 tấn, năm 2018 đạt 674 nghìn tấn...luôn đứng đầu trong các loại cây ăn quả [4, 5, 40, 41]. Quả dứa Queen có dinh dưỡng phù hợp (độ đường và acid cao, khoáng chất đầy đủ), có hương thơm hấp dẫn (hoa hậu của các loài trái cây). Ngoài giá trị dinh dưỡng cao, dứa Queen được trồng tập trung trong các nông trường với sản lượng lớn, giá thành rẻ thu hoạch quanh năm ở nhiều nơi. Do vậy, dứa Queen phù hợp cho sản xuất rượu vang chất lượng để chưng cất thành brandy có hương vị đặc trưng [138]. Cho đến nay, theo các tài liệu mà chúng tôi tham khảo được, các nghiên cứu về quả dứa ở Việt Nam mới chỉ dừng lại ở quy trình bảo quản quả tươi, sấy khô, làm siro, các đồ uống và lên men vang. Nhiều công ty, doanh nghiệp và các cơ quan nghiên cứu về thực phẩm trong nước đã tiến hành quy trình sản xuất rượu brandy từ vải thiều, táo, mận, điều…Riêng với rượu brandy từ dứa, hiện mới có duy nhất dự án “Hoàn thiện công nghệ sản xuất brandy trái cây (vải, dứa) ở quy mô công nghiệp” do Công ty TNHH MTV Bia rượu Eresson chủ trì [10]. Theo hướng này, nấm men được thu thập từ nhiều nguồn trong và ngoài nước, quy trình công nghệ chưng cất bằng tháp cao. Sản phẩm brandy dứa
2 đang dừng lại ở mức thăm dò thị trường, số lượng ít, giá thành cao, chưa phổ biến. Do đó, việc nghiên cứu chế biến dứa thành rượu brandy theo hướng truyền thống thành công sẽ là cơ sở khoa học để tổ chức sản xuất rượu brandy từ dứa ở Việt Nam, đưa thêm hướng tiêu thụ cho quả dứa, giải quyết công ăn việc làm cho nông dân lao động, góp phần phát triển kinh tế cho nhiều địa phương trồng dứa. Xuất phát từ yêu cầu của thực tiễn sản xuất, nhằm giúp nông dân giải quyết khâu tiêu thụ dứa bằng phương pháp chế biến, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm men để ứng dụng vào sản xuất rượu brandy từ quả dứa”. Mục tiêu của đề tài Tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực lên men ethanol cao, tạo hương thơm đặc trưng, phù hợp để sản xuất rượu brandy từ quả dứa đạt chất lượng tốt. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu: Các chủng nấm men lên men rượu ethanol phân lập từ dịch ép dứa Queen trồng tại Nông trường Đồng Giao - Tam Điệp - Ninh Bình. Phạm vi nghiên cứu: - Chủng vi sinh vật nghiên cứu: Các chủng nấm men lên men rượu được phân lập từ dịch ép dứa Queen lên men tự nhiên. - Nguyên vật liệu: Giống dứa Queen trồng tại Nông trường dứa Đồng Giao - Tam Điệp - Ninh Bình. Nội dung nghiên cứu (1) Tuyển chọn chủng nấm men có hoạt lực lên men ethanol cao và cho hương thơm đặc trưng trong quá trình lên men dịch dứa Queen. (2) Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chủng nấm men được tuyển chọn: Hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, khả năng lên men các loại đường, khả năng đồng hóa muối nitrat, định tên khoa học, ảnh hưởng của các yếu tố môi trường (hàm lượng đường, ảnh hưởng của pH môi trường, ảnh hưởng của nguồn nitơ) đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng nấm men tuyển chọn (3) Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men vang dứa của chủng nấm men được tuyển chọn: pH, nhiệt độ, acid hữu cơ, hàm lượng đường, hàm lượng oxy hòa tan, tỉ lệ men giống; nghiên cứu quá trình lên men vang từ dịch dứa Queen.
3 (4) Cải biến chủng nấm men D8 bằng kĩ thuật đột biến ngẫu nhiên. (5) Nghiên cứu quy trình chưng cất, làm sạch, tạo màu và hương vị cho brandy. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án - Ý nghĩa khoa học: Luận án đã cung cấp những dẫn liệu khoa học về việc sử dụng quả dứa để lên men vang sản xuất brandy chất lượng cao. Kết quả nghiên cứu đã phân tích được thành phần cơ bản của dịch ép dứa (nguyên liệu dùng để lên men vang sản xuất brandy); tuyển chọn được chủng nấm men có hoạt lực lên men cao, hương thơm đặc trưng; cải biến chủng nấm men này theo phương pháp gây đột biến ngẫu nhiên tạo biến chủng nấm men có khả năng chịu độ rượu, chịu đường và có hoạt lực lên men cao hơn 22% so với chủng gốc. Luận án cũng đã đề xuất phương pháp loại bỏ các tạp chất không mong muốn trong rượu brandy thô, chỉ ra tác dụng của gỗ sồi trong việc tàng trữ tạo màu sắc và hương vị cho brandy dứa; xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất brandy từ dứa. - Ý nghĩa thực tiễn Các kết quả nghiên cứu của luận án có thể ứng dụng để sản xuất brandy dứa, làm đa dạng hóa sản phẩm chất lượng cao từ quả dứa, mở thêm hướng giải quyết được đầu ra cho quả dứa. Bên cạnh đó, luận án cũng có thể được dùng như một tài liệu tham khảo phục vụ học tập, nghiên cứu, giảng dạy về lên men vang và ứng dụng trong sản xuất rượu brandy từ quả dứa. Những điểm mới của luận án - Luận án là công trình đầu tiên của Việt Nam nghiên cứu có hệ thống về sản xuất brandy dứa từ phân lập, tuyển chọn, định tên khoa học của chủng nấm men được tuyển chọn, điều kiện nhân giống, lên men, chưng cất, loại bỏ tạp chất, tàng trữ tạo hương vị và màu sắc đặc trưng cho brandy. - Tạo đươc biến chủng có hoạt lực lên men rượu cao đạt hàm lượng etylic 15,1 % v/v từ chủng S. cerevisiae bằng đột biến ngẫu nhiên. - Đề xuất được quy trình lên men vang để sản xuất brandy dứa sử dụng chủng nấm men S. cerevisiae D8 và nguồn nguyên liệu dứa Queen
4 - Đề xuất phương pháp loại bỏ tạp chất trong rượu brandy trong môi trường acid bằng cách kết hợp phương pháp hóa học và vật lý. - Phân tích thành phần hương của brandy dứa sau khi xử lý bằng gỗ sồi Cấu trúc của luận án Luận án gồm 140 trang, bao gồm các phần sau: Mở đầu: 4 trang Chương 1. Tổng quan vấn đề nghiên cứu: 44 trang Chương 2. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 24 trang Chương 3. Kết quả và Thảo luận: 66 trang Kết luận và Kiến nghị: 2 trang Tài liệu tham khảo: Luận án tham khảo được 43 tài liệu tiếng Việt, 135 tài liệu tiếng nước ngoài, 02 trang Web. Phụ lục: Luận án có 10 phụ lục các kết quả phân tích
5 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Nấm men 1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và sử dụng nấm men trong trong lên men rượu Trên thế giới Lịch sử ngành lên men đã có từ khoảng 6.000 năm trước Công nguyên. Rượu và rất nhiều loại đồ uống làm từ hoa quả lên men, sản xuất theo quy mô gia đình, dòng tộc đã được sử dụng như thứ đồ uống do thượng đế ban tặng. Mãi đến năm 1854, Louis Pasteur mới phát hiện nấm men là tác nhân thực sự gây nên quá trình lên men rượu, mở đầu cho các nghiên cứu về tuyển chọn nấm men trong sản xuất vang. Cuối thế kỷ XVIII, đầu thế kỷ XIX, các nghiên cứu trên thế giới về nấm men đã được quan tâm và thu được nhiều thành tựu. Các kết quả tập trung vào nghiên cứu về: (1) các enzyme tham gia quá trình lên men trong nấm men; (2) cơ chế của quá trình lên men từ đường; (3) làm sáng tỏ vai trò của các enzyme nấm men trong ngành lên men rượu [169]. Nhờ thành tựu của các công trình nghiên cứu trên, các chủng nấm men được ứng dụng nhiều, nhanh chóng được đưa ra thị trường dưới dạng thương mại, trở thành đối tượng quan trọng trong sản xuất rượu [88]. Năm 1780, dịch nấm men S. cerevisiae đã xuất hiện trên thị trường Hà Lan. Năm 1800, ở Đức S. cerevisiae được sản xuất dưới dạng kem. Từ năm 1825 đến năm 1867 ngành công nghiệp sản xuất sinh khối nấm men được tăng cường mở rộng ở Châu Âu. Năm 1872, tại Baron de Max Springer (Pháp), quá trình sản xuất men hạt phát triển, thuận tiện hơn trong vận chuyển và sử dụng. Năm 1876, tại Hoa Kỳ, trong triển lãm thương mại Centennial, Philadelphia, nhiều loại chế phẩm nấm men đã được Fleischmann trưng bày và bán trên thị trường phục vụ sản xuất bánh mì và rượu vang [107]. Đầu năm 1980, việc sử dụng sinh khối nấm men S. cerevisiae dạng khô đã được nghiên cứu và phổ biến rộng rãi. Ngày nay, phần lớn các cơ sở sản xuất rượu
6 vang dựa trên việc sử dụng nấm men khô, đảm bảo cho quá trình lên men nhanh, làm giảm nguy cơ bị tạp nhiễm do vi sinh vật lạ. Hầu hết, các chủng nấm men rượu vang dạng thương mại hiện nay đã được tuyển chọn theo những đặc tính quý như hiệu suất lên men cao, chịu độ rượu cao, không tạo hương vị lạ và các chất chuyển hóa không mong muốn. Điều này đã góp phần cải thiện chất lượng của rượu vang, tăng khả năng kiểm soát quá trình lên men để đạt được hiệu suất lên men cao. Đến nay, quy trình sản xuất rượu vang đã khá ổn định, các sản phẩm rượu vang ngày càng đa dạng, chất lượng ngày càng cao. Tác giả Legras và các cộng sự (2007) cho biết trong vài thập kỷ qua, việc áp dụng các đặc điểm di truyền, sinh lý học và công nghệ tái tổ hợp ADN đối với nấm men S. cerevisiae đã tạo ra các chủng nấm men rượu vang có khả năng chịu nhiệt, chịu acid, tăng chất lượng cảm quan, tăng hiệu suất quá trình lên men, nâng cao chất lượng rượu [115]. Một số chế phẩm nấm men thương phẩm dùng cho sản xuất rượu có bán trên thị trường hiện nay như: Pasteur Champagne (Pháp), Wyeast (Pháp), Montrachet (Pháp), Pasteur red (Mỹ), Pasteur white (Mỹ)…Nhìn chung các nghiên cứu về nấm men trên thế giới là vô cùng phong phú và đa dạng, tạo ra nhiều loại chế phẩm nấm men cung cấp cho lên men rượu chất lượng cao, ngày càng đáp ứng được nhu cầu sản xuất rượu trên thế giới [169]. Ở Việt Nam Văn hóa rượu đã có ở các nước Châu Á và Việt Nam từ hàng nghìn năm trước công nguyên cùng với ngành lên men và nấu rượu bằng men lá, bánh men thuốc bắc. Tuy nhiên, các nghiên cứu về men rượu và nấm men S. cerevisiae ở Việt Nam trong thời kì chiến tranh trước 1975 không được lưu giữ có hệ thống. Sau năm 1975, các nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong sản xuất, đặc biệt là các nấm men sử dụng trong lên men vang, sản xuất brandy được báo cáo chủ yếu là phân lập, tuyển chọn, nghiên cứu đặc điểm sinh học, xác định tên khoa học và ứng dụng của nấm men trong sản xuất vang [18, 28, 30]. Nghiên cứu đầu tiên về nấm men trong lên men vang được công bố là của Nguyễn Quang Hào và cộng sự (1983) trên
7 các loại quả dâu, mơ…Áp dụng kết quả nghiên cứu đó, các sản phẩm vang mang nhãn hiệu vang “Thăng Long” được xuất hiện trên thị trường vào năm 1983 [16]. Nghiên cứu nấm men sản xuất brandy đầu tiên ở Việt Nam là trên quả nho (2008) [21] nhưng sản phẩm brandy đầu tiên xuất hiện trên thị trường là brandy Blue Star của Công ty cổ phần Rượu rượu Hà Nội (2010) [28]. Những năm gần đây nhiều chủng nấm men được nhập nội để đáp ứng nhu cầu sản xuất vang trong nước. Do nấm men có vai trò quan trọng, quyết định đến chất lượng thành phẩm rượu vang nên nhu cầu về nấm men có chất lượng tốt ở Việt Nam ngày càng tăng. Trong khi đó, chỉ có rất ít cơ sở sản xuất rượu (các viện nghiên cứu, công ty rượu lớn…) đảm bảo được nguồn giống. Các cơ sở sản xuất tư nhân, hộ gia đình…với trang thiết bị thô sơ, quy trình công nghệ lạc hậu chủ yếu sử dụng nguồn nấm men tự nhiên (có trong không khí, trên vỏ quả, trên các dụng cụ lên men) hoặc có thể lấy dịch lên men mẻ trước để làm giống trong lên men mẻ sau hoặc nhân giống từ các ống giống nấm men thuần. 1.1.2. Đặc điểm sinh học của nấm men Đặc điểm hình thái và cấu tạo Khuẩn lạc đặc trưng của nấm men rượu có màu trắng sữa, tròn, nhẵn bóng; kích thước khuẩn lạc thay đổi theo thời gian nuôi cấy. Hình thái tế bào nấm men khá đa dạng; có thể hình tròn, hình trứng hay bầu dục, hình dài hoặc hình elip… (tùy loài). Tế bào nấm men có thể thay đổi hình dạng trong các giai đoạn phát triển và điều kiện môi trường xung quanh. Hình thái của tế bào nấm men không thay đổi chỉ khi tế bào còn non trong các điều kiện dinh dưỡng tiêu chuẩn [49]. Các nấm men Saccharomyces sử dụng trong công nghiệp thường có kích thước tế bào (3 - 5) × (5 - 10) μm, nặng 10 – 12pg (1pg=10-12g). Các chồi được hình thành từ bề mặt của tế bào, có kích thước nhỏ hơn hoặc bằng kích thước tế bào mẹ [137], [142]. Hình thái, kích thước khuẩn lạc, chồi, tế bào nấm men tế bào, được phân loại trực tiếp thông qua đối chiếu với các khóa phân loại [115, 119]. Các đặc điểm kiểu hình này cũng đã được xây dựng thành phần mềm, các webside để
8 chụp ảnh, phân tích định lượng, các công cụ tính toán, phân tích tự động hình thái khuẩn lạc, chồi và tế bào nấm men [73, 150]. Nấm men có cấu tạo điển hình của một tế bào nhân chuẩn (Eucaryote). Thành phần các chất hữu cơ cơ bản trong tế bào nấm men được ghi lại trong bảng 1.1 [145]. Bảng 1.1. Thành phần các chất hữu cơ cơ bản trong tế bào nấm men [145] Thành phần các chất hữu cơ cơ bản trong tế bào nấm men Độ ẩm 2-5% Protein thô 50-52% Protein tinh 42-46% Acid Nucleic 6-8% Khoáng 7-8% Lipid 4-7% Cacbonhydrat 30-37% Các nghiên cứu về đa dạng hình thái tế bào nấm men được giải thích từ góc độ di truyền và môi trường. Họ enzyme Rho của GTPases hiện diện trong tất cả các tế bào nhân thực, từ nấm men đến động vật có vú có vai trò điều hòa các enzyme liên quan đến quá trình phát sinh hình thái và phân bố actin trên thành tế bào [53]. Hình thái và thể tích thực của tế bào nấm men có thể thay đổi bởi tỷ lệ các liên kết glucosid trong glucan trên thành tế bào. Nghiên cứu của Jamas và cộng sự (1986) cho thấy sự tăng liên kết β (1 → 6) glucoside trong thành tế bào nấm men làm tăng hệ số hình dạng và độ nén của tế bào và thành tế bào [102].” Đặc điểm sinh lý Chu kỳ sống của nấm men Saccharomyces có hai loại hình phổ biến [98]: ưu thế đơn bội và ưu thế lưỡng bội (tùy loài). Các tế bào dinh dưỡng đơn bội (n) có thể kết hợp với nhau để tạo ra tế bào dinh dưỡng lưỡng bội (2n). Sau quá trình giảm phân, các tế bào lưỡng bội sẽ sinh ra các bào tử túi (thường là 4 bào tử túi). Bình thường, khi không có sinh sản hữu tính, chúng vẫn tiếp tục sinh sản vô tính bằng nảy chồi. Nếu nấm men sinh sản vô tính từ tế bào đơn bội là chủ yếu (thời gian tồn tại chủ yếu ở dạng đơn bội), chúng tuân theo chu kì sống ưu thế đơn bội. Nếu nấm men sinh sản vô tính từ tế bào lưỡng bội là chủ yếu (thời gian tồn tại chủ yếu ở dạng lưỡng bội), chúng tuân theo chu kỳ sống ưu thế lưỡng bội.
9 Thời gian thế hệ của nấm men là khoảng thời gian giữa 2 lần phân chia liên tiếp của tế bào. Đối với các tế bào sinh trưởng, phát triển trong điều kiện không bị ức chế số lượng tế bào tăng lên gấp đôi trong một chu kỳ tế bào. Nấm men S. cerevisiae tăng gấp đôi khối lượng sau mỗi 100 phút. Chu kỳ tế bào chia làm 4 giai đoạn G1, S, G2, M [104]. Nấm men có thể sinh sản bằng nhiều hình thức: 1) sinh sản vô tính bằng nảy chồi, phân đôi, bào tử đốt (chi Geotrichum), bào tử bắn (chi Sporobolomyces), bào tử áo (Candida albican) và 2) sinh sản hữu tính bằng bào tử túi [98]. Sinh sản vô tính bằng nảy chồi: Nảy chồi là phương pháp sinh sản phổ biến nhất ở nấm men Saccharomyces. Ở điều kiện thuận lợi, nấm men sinh sôi nảy nở rất nhanh. Quan sát dưới kính hiển vi hầu hết các tế bào đều có chồi. Các enzyme thủy phân sẽ phân giải polysaccharide của thành tế bào khiến thành tế bào, chỗ bị enzyme tác động phình lên. Các vật chất mới được tổng hợp sẽ được huy động đến chồi và làm cho chồi to dần lên và có đầy đủ các thành phần giống tế bào mẹ. Khi chồi đạt được một kích thước nhất định (nhỏ hơn hoặc bằng kích thước tế bào mẹ) một vách ngăn sẽ xuất hiện giữa chồi và tế bào mẹ. Thành phần của vách ngăn cũng tương tự như thành tế bào. Khi chồi tách khỏi tế bào mẹ, ở chỗ tách trên tế bào mẹ xuất hiện một vết sẹo và trên tế bào con cũng mang một vết sẹo [172]. Ngoài chi Schizosaccharomyces (chỉ có sinh sản vô tính bằng phân đôi), các chi khác của nấm men đều có thể sinh sản vô tính bằng nảy chồi hai cực (chi Kloakera, Saccharomycoder, Hansenniaspora) hoặc đa cực (chi Dekkera, Hansenula, Pichia, Saccharomyces…[98]) Sinh sản hữu tính bằng bào tử túi Bào tử túi được sinh ra trong các túi, hai tế bào khác giới đứng gần nhau sẽ mọc ra hai mấu lồi, tiến lại gần nhau và dung hợp với nhau. Chỗ tiếp nối sẽ tạo ra một lỗ thông và chất nguyên sinh có thể đi qua để tiến hành phối chất, nhân cũng đi qua để phối nhân. Sau đó, nhân phân cắt thành 2, thành 4, thành 8. Mỗi nhân được bao bọc bởi chất nguyên sinh rồi màng nhày dày được tạo ra xung