Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng vi rút Beijing-1 để ứng dụng sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam

Chia sẻ: Cố Linh Thư | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:174

Thêm vào BST

Báo xấu

21
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng vi rút Beijing-1 để ứng dụng sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam" được thực hiện với mục tiêu nhằm xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng của chủng (chủng gốc và chủng sản xuất) vi rút Beijing-1 để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam. Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Sinh học: Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng vi rút Beijing-1 để ứng dụng sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ LÝ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VI RÚT BEIJING-1 ĐỂ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT VẮC XIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TRÊN TẾ BÀO VERO TẠI VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NGUYỄN THỊ LÝ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG VI RÚT BEIJING-1 ĐỂ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT VẮC XIN VIÊM NÃO NHẬT BẢN BẤT HOẠT TRÊN TẾ BÀO VERO TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS. TS. Huỳnh Thị Phương Liên 2. PGS.TS. Đinh Duy Kháng Hà Nội, 2022
LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự kính trọng, lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới: Tôi xin trân trọng cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong suốt quá trình làm nghiên cứu sinh tại Viện. Tôi xin trân trọng cảm ơn tới các thầy cô, anh chị Cơ sở đào tạo là Viện Công nghệ sinh học và Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt quá trình làm nghiên cứu sinh tại Viện. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế, TS. Đoàn Hữu Thiển đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện nghiên cứu và tham gia khóa đào tạo này; Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Huỳnh Thị Phương Liên, PGS.TS. Đinh Duy Kháng, những người thầy đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và viết luận án; Tôi xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp tại Khoa Kiểm định vắc xin Vi rút, Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã tạo điều kiện hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập; Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình tôi, nơi đã cho tôi thêm sức mạnh vượt qua những khó khăn trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Lý i
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do chính tôi thực hiện. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực. Các số liệu này chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu khoa học nào khác Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Lý ii
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ i LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. vi DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ..................................................................x MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU .........................................................4 1.1. Vi rút Viêm não Nhật Bản .................................................................................4 1.1.1. Đặc điểm cấu trúc..............................................................................................4 1.1.2. Kháng nguyên và các yếu tố độc lực của vi rút ................................................4 1.1.3. Sự nhân lên của vi rút trên tế bào ......................................................................7 1.1.4. Dịch tễ học phân tử của vi rút Viêm não Nhật Bản ..........................................8 1.2. Vắc xin Viêm não Nhật Bản ..............................................................................9 1.2.1. Lịch sử phát triển vắc xin VNNB .....................................................................9 1.2.2. Sự phát triển của vắc xin Viêm não Nhật Bản trên tế bào ..............................13 1.2.3. Các biến thể di truyền và kháng nguyên trong vi rút VNNB và việc tiêm phòng[34] ..................................................................................................................15 1.2.4. Đánh giá chất lượng an toàn và tính sinh miễn dịch của vắc xin....................16 1.3. Chủng vi rút sản xuất vắc xin Viên não Nhật Bản ........................................20 1.3.1. Chủng vi rút Nakayama-NIH ..........................................................................20 1.3.2. Chủng vi rút Beijing-1 ....................................................................................20 1.3.3. Chủng SA14-14-2 ...........................................................................................22 1.3.4. Chủng Beijing-3 ..............................................................................................24 1.3.5. Dòng tế bào nuôi cấy (nhân) vi rút .................................................................26 1.4. Các khuyến cáo của TCYTTG cho sản xuất và kiểm định chủng sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt[22].....................................................................................27 1.4.1. Yêu cầu chung trong sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt ..................................27 1.4.2. Yêu cầu đối với nguồn nguyên liệu đầu vào: ..................................................28 1.5. Tóm tắt quy trình thiết lập ngân hàng chủng (Beijing-1) để sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam ...............................31 iii
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....35 2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................35 2.2. Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................36 2.2.1. Sinh phẩm, hóa chất, thiết bị ...........................................................................36 2.2.2. Động vật thí nghiệm ........................................................................................38 2.3. Thiết kế nghiên cứu ..........................................................................................38 2.4. Biến số và nội dung nghiên cứu ......................................................................39 2.5. Phương pháp nghiên cứu (chi tiết xem phụ lục 5) ........................................41 2.5.1. Kiểm định vi rút ngoại lai ...............................................................................41 2.5.2. Kiểm định vô khuẩn ........................................................................................42 2.5.3. Nhận dạng .......................................................................................................42 2.5.4. Đánh giá ổn định di truyền ..............................................................................42 2.5.5. Hiệu giá vi rút..................................................................................................45 2.5.6. Thử nghiệm công hiệu của vắc xin .................................................................47 2.5.7. An toàn chung .................................................................................................48 2.5.8. An toàn đặc hiệu..............................................................................................49 2.5.9. Chất gây sốt .....................................................................................................49 2.5.10. Hàm lượng Thimerosal .................................................................................50 2.5.11. Hàm lượng Formaldehyde ............................................................................50 2.5.12. Hàm lượng DNA tồn dư ................................................................................50 2.5.13. Hàm lượng protein tổng số............................................................................52 2.5.14. pH ..................................................................................................................52 2.5.15. Cảm quan ......................................................................................................52 2.6. Xử lý và phân tích số liệu ................................................................................53 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................54 3.1. Kết quả nghiên cứu ..........................................................................................54 3.1.1. Tính ổn định về hiệu giá và di truyền của chủng Beijing-1 ............................54 3.1.2. Tính an toàn và sinh miễn dịch bảo vệ của chủng trên các lô vắc xin thành phẩm sản xuất từ chủng BV-WSV-0310 ở quy mô phòng thí nghiệm ...............................66 3.1.3. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của chủng sử dụng để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam .....................................................................72 3.2. Bàn luận ............................................................................................................74 iv
3.2.1. Tính ổn định về hiệu giá, di truyền của chủng vi rút Viêm não Nhật Bản sau sản xuất và điều kiện bảo quản .................................................................................74 3.2.2. Sự tương đồng kháng nguyên của chủng sản xuất vắc xin VNNB so với các chủng Viêm não Nhật bản lưu hành tại Việt Nam ....................................................81 3.2.3. Tính an toàn và tính sinh miễn dịch của JECEVAX sản xuất từ chủng BV- WSV-0310 ở quy mô phòng thí nghiệm ...................................................................88 3.2.4. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng của chủng để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero (JECEVAX) ...................................................................................93 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................103 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ..........................................105 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................106 PHỤ LỤC v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AE Adverse events (biến cố bất lợi) BYT Bộ Y tế BHK-21 Baby Hamster Kidney – 21 (Tế bào thận chuột Hamter sơ sinh) BR209 Beijing reference (Vắc xin mẫu chuẩn Beijing-1) CF Complement Fixation (Cố định bổ thể) CPE Cytopathic effect (hiệu quả gây độc/hủy hoại trên tế bào) CV Challenge virus (vi rút thử thách) E Envelope protein (Protein vỏ) FTM Fluid Thioglycollate Medium (môi trường nuôi cấy vi khuẩn) HA Haemagglutinin Assay (thử nghiệm ngưng kết hồng cầu) HI Haemagglutinin inhibition (ức chế ngưng kết hồng cầu) HT Huyết thanh HLKN Hàm lượng kháng nguyên HGKTTH Hiệu giá kháng thể trung hòa IC51 Vắc xin VNNB trên tế bào vero của Intercell – Áo JEVAX Vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất từ não chuột tại Việt Nam JECEVAX Vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất trên tế bào vero tại Việt Nam JE-MB Vắc xin VNNB sản xuất trên não chuột của Nhật Bản KT Kháng thể MRC5 Tế bào phôi phổi bào thai người NICVB Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin và sinh phẩm Y tế (National Institute for Control of Vaccines and Biologicals). NS Non structural Protein (Protein không cấu trúc) NSX Nhà sản xuất vi
NT Neutralization test (thử nghiệm trung hòa) PHK Primary Hamster kidney (thận chuột Hamster tiên phát) PreM Premium membrane (Protein tiền màng) PRNT50 Plaque reduction neutralization test (Trung hòa giảm 50% đám hoại tử) TCCS Tiêu chuẩn cơ sở TCYTTG/WHO Word Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới) THGĐHT Trung hòa giảm đám hoại tử TNLS Thử nghiệm lâm sàng TNMD Thử nghiệm miễn dịch VNNB Viêm não Nhật Bản VABIOTECH Công ty TNHH MTV vắc xin và sinh phẩm số 1 VERO Verda Reno (Tế bào thường trực thận khỉ xanh châu Phi) VX Vắc xin vii
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1. Các loại vắc xin VNNB và công nghệ sản xuất hiện nay.........................12 Bảng 1. 2. Tỷ lệ mắc VNNB ở bệnh nhân VNVR năm 1991-2019 .......................13 Bảng 2.1. Cỡ mẫu sử dụng trong nghiên cứu ........................................................35 Bảng 2. 2. Sinh phẩm sử dụng trong nghiên cứu ....................................................36 Bảng 2.3. Môi trường, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ...................................37 Bảng 2.4. Trang thiết bị, vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu ......................37 Bảng 2.5. Trang thiết bị, vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu ......................38 Bảng 2.6. Chỉ tiêu nghiên cứu trên lô chủng gốc BV-MSV-0210 và lô chủng sản xuất BV-WSV-0310 ..............................................................................39 Bảng 2.7. Chỉ tiêu nghiên cứu trên vắc xin JECEVAX .........................................40 Bảng 2.8. Thông tin về trình tự vùng gen E của các chủng vi rút VNNB phân lập ở Việt Nam trong các năm khác nhau và từ các vật chủ khác nhau sử dụng trong nghiên cứu ..............................................................................................45 Bảng 3.1. Kết quả nhận dạng của chủng gốc và chủng sản xuất bằng phương pháp ELISA ....................................................................................................54 Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra LD50 trên não chuột Swiss của chủng gốc BV- MSV-0210 ............................................................................................56 Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra LD50trên não chuột Swiss của chủng sản xuất BV- WSV-0310 .............................................................................................56 Bảng 3.4. Kết quả kiểm tra hiệu giá chủng gốc BV-MSV-0210bằng thử nghiệm tạo đám hoại tử (PFU) trên tế bào BHK21 ..................................................57 Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra hiệu giá chủng sản xuất BV-WSV-0310 bằng thử nghiệm tạo đám hoại tử (PFU) trên tế bào BHK21 ...............................57 Bảng 3.6. Tỷ lệ tương đồng về nucleotide và protein gen mã hóa kháng nguyên E của chủng gốc (BV-MSV-0210) và chủng sản xuất (BV-WSV-0310) so với trình tự vùng gen E của các chủng virút VNNB phân lập ở Việt Nam trong các năm khác nhau và từ các vật chủ khác nhau ..........................61 Bảng 3.7. Vị trí các epitope và vị trí của các axit amin quyết định tính kháng nguyên thuộc epitope protein E của chủng sản xuất (BV-WSV-0310), chủng tham chiếu (Beijing-1 Kanonji), chủng vi rút VNNB phân lập ở người năm 2014 và chủng vắc xin SA14-14-2. ...............................................62 viii
Bảng 3.8. Tính ổn định hiệu giá chủng gốcBV-MSV-0210 và chủng sản xuất BV- WSV-0310 khi bảo quản trong nitrogen lỏng .......................................63 Bảng 3.9. Hiệu giá chủng sản xuất BV-WSV-0310 khi bảo quản ở -20oC ...........63 Bảng 3.10. Hiệu giá chủng sản xuất BV-WSV-0310 khi bảo quản ở 2-8oC ...........64 Bảng 3.11. Kết quả thử nghiệm vô trùng .................................................................64 Bảng 3.12. Kết quả kiểm tra Mycoplasma chủng gốc và chủng sản xuất ...............65 Bảng 3.13. Kết quả kiểm tra vi rút ngoại lai trên động vật thử nghiệm của chủng gốc và chủng sản xuất ..................................................................................65 Bảng 3.14. Kết quả kiểm tra vi rút ngoại lai trên tế bào của chủng gốc và chủng sản xuất ..66 Bảng 3.15. Kết quả kiểm tra an toàn chung trên chuột nhắt và chuột lang thí nghiệm của 10 lô vắc xin JECEVAX .................................................................67 Bảng 3.16. Kết quả kiểm tra chất gây sốt trên thỏ của 10 lô vắc xin JECEVAX....68 Bảng 3.17. Kết quả đánh giá cảm quan, tỷ trọng và vô trùng của 10 lô vắc xin JECEVAX .............................................................................................69 Bảng 3.18. Kết quả kiểm định các chỉ số hóa học của 10 lô vắc xin JECEVAX ....69 Bảng 3.19. Kết quả đánh giá tính sinh miễn dịch (công hiệu/hiệu giá kháng thể trung hòa (HGKTTH)) của các lô vắc xin JECEVAX trên động vật thực nghiệm ..........................................................................................70 Bảng 3.20. Kết quả nghiên cứu tiêu chuẩn chất lượng của chủng sử dụng để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam .........................72 Bảng 3.21. Xây dựng tiêu chuẩn về số đời cấy chuyển, tế bào cấy chuyển và nhiệt độ bảo quản chủng gốc và chủng sản xuất ............................................73 Bảng 3.22. Xây dựng tiêu chuẩn về tính ổn định di truyền và hiệu giá vi rút chủng gốc và chủng sản xuất............................................................................74 ix
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Cấu trúc bộ gen của vi rút VNNB ..........................................................5 Hình 1.2. Các tác nhân gây sốt ..............................................................................17 Hình 1.3. Một số vắc xin VNNB sản xuất từ chủng Beijing-1 .............................22 Hình 1.4. Hình ảnh 1 số vắc xin VNNB sản xuất từ chủng SA14-14-2 ...............24 Hình 1.5. Vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất từ chủng 821564-XY .......................26 Hình 1.6. Sơ đồ thiết lập ngân hàng chủng gốc (BV-MSV-0210) và chủng sản xuất (BV-WSV-0310) ...................................................................................33 Hình 2.1. Hình ảnh ống chủng Beijing-1 và vắc xin JECEVAX ..........................36 Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu ...................................................................................38 Hình 2. 3. Quy trình giải trình tự gen E vi rút Viêm não Nhật Bản .......................44 Hình 3.1. Kết quả giải trình tự gen và xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự nucleotide (A) và axít amin (B) của chủng gốc và chủng sản xuất với chủng Beijing chuẩn ............................................................................55 Hình 3.2. Hình ảnh plaque (đám hoại tử- đốm trắng) của chủng sản xuất BV-WSV- 0310 ở các độ pha 10-6; 10-7; 10-8 ..........................................................57 Hình 3.3. Hình ảnh plaque (đám hoại tử- đốm trắng) của chủng sản xuất BV-WSV- 0310 trên dòng tế bào BHK21 và dòng tế bào Vero. ............................58 Hình 3.4. Điện di gel agarose 1% kiểm tra sản phẩm RT-PCR khuếch đại gen mã hóa kháng nguyên E của các chủng: chủng gốc BV-MSV-0210 (đường chạy số 1); chủng sản xuất BV-WSV-0310 (đường chạy số 2); chủng chuẩn tham chiếu JEV Beijing-1 Kanonji (đường chạy số 3). M: Farmentas 1 kb DNA ladder. .................................................................58 Hình 3.5. Trình tự acid amin kháng nguyên E của vi rút VNNB lô chủng giống gốc BV-MSV-0210 (A) và sản xuất BV-WSV-0310 (B) ............................59 Hình 3.6. Trình tự nucleotide gen mã hóa kháng nguyên E của vi rút VNNB lô chủng giống gốc BV-MSV-0210 (A) và lô chủng sản xuất BV-WSV- 0310 (B)m ..............................................................................................60 Hình 3.7. Kết quả kiểm tra an toàn đặc hiệu trên nhắt của 10 lô vắc xin JECEVAX ...67 Hình 3.8. Hiệu giá kháng thể trung hòa của vắc xin JECEVAX và vắc xin mẫu chuẩn BR209 .........................................................................................71 Hình 3.9. Công hiệu tương quan của vắc xin JECEVAX và vắc xin mẫu chuẩn BR209 ....................................................................................................71 x
1 MỞ ĐẦU Viêm não Nhật bản (VNNB) là một trong các bệnh gây nhiễm trùng thần kinh cấp tính với nhiều mức độ khác nhau, đáng ngại hơn cả là bệnh thường để lại di chứng thần kinh (như điếc, mù, động kinh, yếu liệt cứng toàn thân hoặc liệt tay chân…)và tỷ lệ tử vong cao. Bệnh lan truyền rộng rãi ở hầu hết các nước ở Châu Á (như Nhật Bản, Trung Quốc, Triều Tiên, Thái Lan, Philippin, Việt Nam, Ấn Độ…), vùng viễn đông của Liên bang Nga... Cho đến nay gần 3 tỷ người sống trong vùng có lưu hành dịch và có khoảng 25.000-50.000 ca bệnh hàng năm, trong số đó 20-30% tử vong, 30-50% sống sót đã để lại di chứng thần kinh[1,2]. Theo thống kê ở Việt Nam, hàng năm ước tính có khoảng 2.000-3.000 trường hợp bị hội chứng viêm não cấp nghi ngờ do vi rút; Trong số này 70-75 % được xác định do vi rút VNNB. Nguồn lây bệnh chủ yếu là do muỗi đốt truyền vi rút cho người. Cho đến nay chưa có thuốc đặc trị bệnh VNNB, do vậy biện pháp phòng bệnh hiệu quả nhất là tiêm vắc xin. Vi rút VNNB có rất nhiều chủng, nhưng hiện nay hầu hết các chủng sử dụng để sản xuất vắc xin đều thuộc genotype 3 gồm chủng Nakayama; Beijing -1; Beijing- 3 và SA-14-14-2. Từ các chủng này, bằng các công nghệ sản xuất khác nhau đã tạo ra rất nhiều loại vắc xin VNNB như vắc xin VNNB sống giảm độc lực (RS-JEV của Trung Quốc), vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất trên não chuột (Jevax- Vabiotech- Việt Nam; JE-VAX - Biken - Nhật Bản, JEV-GCC của Hàn Quốc, JE-BM), vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất trên tế bào (IC51 hay IXIARO hay JESPECT; KD-287 của Nhật Bản); vắc xin VNNB dạng sống giảm độc lực tái tổ hợp (ChimeriVax-JE hay Imojev – Sanofi Pasteur)… Nhật Bản là nước đầu tiên nghiên cứu, sản xuất thành công vắc xin VNNB. Việc sử dụng vắc xin VNNB trong cộng đồng đã góp phần giảm tỷ lệ mắc bệnh VNNB đáng kể[3, 4, 5]. Việt Nam bắt đầu nghiên cứu sản xuất và sử dụng vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất trên não chuột từ năm 1989, đem lại hiệu quả phòng bệnh rất tốt cho cộng đồng. Dù vậy, theo xu thế chung, từ năm 2006, công ty vắc xin và sinh phẩm số 1 đã nghiên cứu sản xuất vắc xin bất hoạt trên tế bào Vero, sử dụng chủng Beijing-1 (JECEVAX) để sớm đưa vào sử dụng tại Việt Nam thay thế cho vắc xin VNNB bất hoạt sản xuất
2 trên não chuột[6, 7]. Đây là một vắc xin mới, lần đầu nghiên cứu sản xuất tại Việt Nam. Để sản xuất và đưa vắc xin mới này vào sử dụng là một vấn đề không đơn giản, đòi hỏi phải có rất nhiều nghiên cứu chứng minh tính an toàn và hiệu quả bảo vệ theo các tiêu chuẩn của tổ chức Y tế thế giới (WHO). Do vậy, việc kiểm soát tốt chất lượng của chủng vi rút trước khi đưa vào sản xuất vắc xin đại trà là yêu cầu cần thiết vì chủng vi rút là nguyên liệu chính, thành phấn chính trong vắc xin sau này và chất lượng của chủng sẽ ảnh hưởng đến tất cả các công đoạn còn lại của sản xuất vắc xin. TCYTTG đã đưa ra một số hướng dẫn về việc thiết lập chủng cho sản xuất vắc xin này (WHO TRS số 963). Tuy vậy, TCYTTG mới chỉ đưa ra tiêu chuẩn cho 1 số chỉ tiêu cơ bản áp dụng chung cho hầu hết các chủng vi rút để sản xuất vắc xin (như tiêu chuẩn về vô trùng, Mycoplasma, vi rút ngoại lai); còn rất nhiều chỉ tiêu như hiệu giá, độ ổn định về hiệu giá, độ ổn định về di truyền của chủng, số đời cấy chuyển tối đa từ chủng gốc sang chủng sản xuất… TCYTTG mới chỉ khuyến cáo NSX kiểm tra chứ không đưa ra tiêu chuẩn vì nó mang tính đặc thù riêng cho từng sản phẩm. Chính vì vậy tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng vi rút Beijing-1 để ứng dụng sản xuất vắc xin viêm não Nhật Bản bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam”. Mục tiêu nghiên cứu của luận án Xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng của chủng (chủng gốc và chủng sản xuất) vi rút Beijing-1 để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam. Nội dung nghiên cứu của luận án Để thực hiện các mục tiêu nghiên cứu nêu trên, đề tài đã thực hiện các nội dung nghiên cứu dưới đây: 1. Nghiên cứu tính ổn định về hiệu giá, ổn định về di truyền và tính sinh miễn dịch của chủng vi rút sản xuất vắc xin VNNB theo thời gian (sau sản xuất: 0, 3, 4, 6, 8, 9, 10 năm) ở nhiệt độ Nitrogen lỏng; Ở các nhiệt độ bảo quản khác (-20oC sau bảo quản: 1, 3, 6 tháng; 2-8oC sau bảo quản: 1, 3, 5, 7 ngày). 2. Nghiên cứu sự tương đồng nucleotide và axít amin Protein E của chủng sản xuất so với các chủng VNNB lưu hành ở Việt Nam từ 1964-2014. 3. Đánh giá tính an toàn và tính sinh miễn dịch bảo vệ của chủng trong 10 lô vắc xin JECEVAX được sản xuất từ lô WSV ở quy mô phòng thí nghiệm.
3 4. Xây dựng 9 chỉ tiêu, phương pháp & tiêu chuẩn chất lượng của chủng (chủng gốc và chủng sản xuất) để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam. Những đóng góp mới của luận án Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống về tiêu chuẩn chất lượng cho chủng gốc, chủng sản xuất Beijing-1 để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam. 1. Đưa ra được dải nhiệt độ phù hợp giúp chủng Beijing-1 duy trì sự ổn định về hiệu giá ≥ 6log PFU/ml trong ít nhất 10 năm sau sản xuất là điều kiện bảo quản trong nitrogen lỏng; ở -20oC trong 3 tháng và ở 2-8oC trong 3 ngày. 2. Xác định được các tỷ lệ tương đồng về trình tự nucleotide và trình tự axit amin vùng gen sinh tổng hợp kháng nguyên E của lô chủng gốc BV-MSV-0210, chủng sản xuất BV-WSV-0310 với chủng chuẩn tham chiếu Reference JEV Beijing-1 Kanonji và các chủng vi rút VNNB trên người, muỗi và lợn tại Việt Nam ở các giai đoạn khác nhau. 3. Xây dựng được 9 chỉ tiêu chất lượng và phương pháp kiểm định chủng(chủng gốc và chủng sản xuất) Beijing-1 để sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero tại Việt Nam. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Kết quả luận án cung cấp các dữ liệu khoa học giúp nhà sản xuất Vabiotech trong việc xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng cơ sở của chủng vi rút VNNB Beijing- 1 sử dụng trong sản xuất vắc xin VNNB bất hoạt trên tế bào Vero (JECEVAX) tại Việt Nam và áp dụng các tiêu chuẩn này để quản lý chất lượng của chủng đạt chất lượng ổn định nhằm tạo ra các lô vắc xin có tính an toàn và hiệu quả ổn định cho người sử dụng . Bố cục của luận án Luận án gồm 114 trang, trong đó phần mở đầu 3 trang, tổng quan tài liệu 30 trang, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 19 trang, kết quả và bàn luận 49 trang, kết luận và kiến nghị 2 trang, danh mục các công trình công bố 1 trang, tài liệu tham khảo 9 trang gồm 98 tài liệu. Trong luận án có 18 hình, 32 bảng và 48 trang phụ lục.
4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. Vi rút Viêm não Nhật Bản 1.1.1. Đặc điểm cấu trúc Vi rút VNNB là một thành viên của vi rút Arbo (arthropod borne viruses), là những vi rút do côn trùng tiết túc truyền cho động vật có xương sống qua đường máu. Tất cả các vi rút arbo đều có hệ gen (genome) là RNA[8]. Vi rút VNNB thuộc họ Flaviviridae, chi Flavivirus nhóm B và có liên quan chặt chẽ với virus West Nile và virus viêm não St. Louis… Flavivirus có đường kính 40- 50 nm; bề mặt ngoài là màng lipit kép có nguồn gốc từ tế bào chủ gắn với lớp vỏ là glycoprotein E và protein màng (M). Vật liệu di truyền là 1 sợi RNA đơn phân cực dương xoắn, được bao bọc bởi nucleocapsit. Hạt vi rút VNNB tinh khiết bao gồm sợi RNA chiếm 6%, protein chiếm 66%, lipit 17% và carbohydrate chiếm 9%[1, 8, 9]. Cấu trúc phân tử của sợi RNA gồm 11.000 nucleotide, tương ứng với 3.400 axit amin. Hệ gen của vi rút VNNB mã hóa cho 10 protein gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc trong một khung đọc mở liên tục và trật tự từ đầu 5’ đến đầu 3’ và các vùng không mã hóa [8].Vi rút VNNB có tỷ trọng 1,19-1,2 g/cm3 trong đường và 1,22- 1,24 g/cm3 trong Cesium chlorid, hệ số lắng 200S, trọng lượng phân tử: 60-70 x106 dalton, độ bền vững: Bền với pH=7-9, thích hợp nhất là pH=8. Vi rút VNNB dễ bị bất hoạt bởi nhiệt độ cao: 50oC trong 50 phút, 37oC trong vài giờ; nhiệt độ thấp như -80oC, -20oC vi rút tồn tại trong nhiều năm và trong Nitrogen lỏng (-196oC) vi rút tồn tại lâu dài. Vi rút VNNB rất nhậy với dung môi hòa tan lipit như ether, sodium deoxycholate, dễ dàng bị bất hoạt bởi tia cực tím, formaldehyde...[1], [8]. 1.1.2. Kháng nguyên và các yếu tố độc lực của vi rút Vi rút VNNB có kháng nguyên gây ngưng kết hồng cầu (HA) và hoạt tính trung hòa là glycoprotein trên preM và E (vỏ và tiền màng của vi rút). Đây cũng chính là kháng nguyên sinh kháng thể ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) và kết hợp bổ thể (CF), kháng thể trung hòa (NT) - tức kích thích cơ thể sinh kháng thể bảo vệ [1, 10].
5 Hình 1.1. Cấu trúc bộ gen của vi rút VNNB (Nguồn: Bobade S. S, Gade R. M. Zika Virus –A Vector Borne Zoonotic Disease: an International Public Health Emergency. Biosc.Biotech.Res.Comm. 2016;9(2). Available from: https://bit.ly/2MLfJRM) Bộ gen RNA gồm: 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc. Các protein cấu trúc: Protein C (Capsid): Rất nhỏ, chỉ 9-12 Kda gồm 112-127 axit amin được tạo thành rất vững chắc gồm 1 số lớn axit amin Lys và Arg. Các axit amin trong protein C liên kết với nhau rất chặt chẽ, có thể loại trừ khả năng trung hòa của phân tử RNA của vi rút với các tác nhân liên quan[11]. Protein M (Membrane): có 2 dạng là protein preM chưa trưởng thành trong tế bào chủ và protein M. +Protein preM: có 165 axit amin không trùng lặp với protein E. Trước khi vi rút được giải phóng ra ngoài tế bào, preM được phân cắt bởi một phân tử protease để tạo thành protein M hoàn chỉnh. PreM chưa trưởng thành không tự tiến tới tế bào đích nhưng lại rất cần thiết cho hoạt động duy trì nòi giống của vi rút trưởng thành [1, 11, 12]. +Protein M: Có trong vi rút trưởng thành ngoài tế bào. Hạt vi rút trưởng thành có khả năng kháng axit kém hơn hạt vi rút chưa trưởng thành khoảng 400 lần, vì vậy khả năng tiếp cận với vi rút dễ dàng hơn. Sự ly giải preM khi ra ngoài tế bào tạo ra
6 sự sắp xếp lại các cấu trúc Oligo trên bề mặt hạt vi rút, do đó làm tăng khả năng gây nhiễm của vi rút trưởng thành tới vật chủ [1, 12]. Protein E (Envelope): Có trọng lượng phân tử 55-60 Kda, là một glycoprotein bao gồm 494-501 axit amin là thành phần cấu tạo chính của vỏ (E). So sánh chuỗi axit amin tương đồng cho thấy, protein E là một protein cấu trúc có tính bảo tồn cao trong các vi rút thuộc nhóm Flavivirus. Protein E liên quan chặt chẽ đến chức năng sinh học của vi rút như chức năng bám dính, cảm thụ, ngưng kết hồng cầu, trung hòa kháng thể, điều chỉnh pH nội nguyên sinh chất của tế bào chủ [1, 11, 12]. Các protein không cấu trúc (NS:nonstructural) NS1: Có trọng lượng phân tử 42-50 Kda, là một glycoprotein gồm 353-354 axit amin. Chức năng chưa rõ, có thể như một bổ thể hòa tan cố định kháng nguyên khi bộc lộ trên tế bào cảm nhiễm. NS3: Có trọng lượng phân tử 67-70 Kda gồm 618-623 axit amin, có tính bảo tồn cao trong chuỗi nucleotit của nhóm Flavivirus, đóng vai trò mã hóa cho enzym protease và helicase[1, 13]. NS5: Có trọng lượng phân tử 104-106 Kda gồm 900-905 axit amin, có tính bảo tồn cao trong chuỗi nucleotit. NS5 gắn liền với sự tạo vỏ capsit của RNA. NS2A, NS2B, NS4A & NS4B: Đều rất nhỏ, có tính bảo tồn kém trong chuỗi nucleotit, sự mã hóa của chúng có thể liên quan đến protein M. Trong quá trình vi rút phóng thích khỏi tế bào, protein PreM được tách ra nhờ enzym protease để thành protein trưởng thành và đây là thành phần có khả năng gây nhiễm của vi rút. Bộ gen của vi rút được bọc trong lớp lipit và protein E rồi hoàn thiện với protein C. Protein E chịu trách nhiệm tấn công đến tế bào đích và hòa màng tế bào; chính protein E mang các kháng nguyên bề mặt là kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (HA) và hoạt tính trung hòa để tạo kháng thể trung hòa. Đây chính là tiêu chuẩn để chọn bất kỳ chủng dự tuyển nào cho sản xuất vắc xin VNNB. Vi rút VNNB được phân thành 5 kiểu gen (I-V) dựa trên cấu trúc gen vỏ (protein E) nhưng chỉ có 1 type huyết thanh được biết đến[14].
7 Phương pháp phân biệt và nhận dạng kháng nguyên Theo các nghiên cứu cho thấy kháng nguyên của các Flavivirus có phản ứng chéo với nhau, 3 nhóm vi rút có kháng nguyên quan hệ mật thiết và khăng khít với nhau đó là các vi rút gây bệnh sốt Tây sông Nile (West Nile fever), viêm não Louis (Louis encephalitis) và VNNB (Japanese encephalitis), do đó các phản ứng huyết thanh với kháng thể đa dòng rất khó phân biệt. Vì vậy,để phân biệt và nhận dạng kháng nguyên của các vi rút này sử dụng phản ứng trung hòa (NT) là nhậy nhất rồi đến phản ứng kết hợp bổ thể (CF) tiếp đến là phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IF). Do đó việc đánh giá đáp ứng miễn dịch sau khi tiêm vắc xin bằng kỹ thuật trung hòa là đặc hiệu nhất, đặc biệt là trung hòa giảm 50% đám hoại tử (PRNT50) trên tế bào; hoặc dùng kháng thể đơn dòng để định loại Flavivirus và phân biệt với vi rút VNNB. Hiện nay sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như PCR, với cặp mồi đặc hiệu, hoặc dùng phương pháp phân tích trình tự gen... có thể định loại được type vi rút trong các Flavivirus cũng như phân loại được các chủng vi rút VNNB khác nhau rất nhanh chóng và chính xác. 1.1.3. Sự nhân lên của vi rút trên tế bào Chu kỳ nhân lên của vi rút RNA Khi vi rút gặp tế bào cảm thụ và nhận biết các thụ thể trên màng tế bào, tiến đến và bám vào thụ thể, màng tế bào bị tác động và tạo khe hở cho vi rút thâm nhập vào bên trong tế bào gây cảm ứng tổng hợp RNA[1, 15]. Sau đó sợi RNA được bộc lộ là RNA đơn polymerase để tạo thành RNA phân cực (-) bổ sung thành chuỗi RNA kép nhờ phiên mã sớm và thông tin trung gian sao chép sợi RNA kép được làm khuôn để tổng hợp các sợi RNA mới theo cách bán bảo tồn và không đối xứng. Khung đọc mở được đồng dịch mã bằng cách cắt đoạn protein liên tiếp thành các đoạn protein cấu trúc và không cấu trúc. RNA và protein của vi rút được tổng hợp trên lưới nội chất có hạt, vùng quanh nhân trong nguyên sinh chất của tế bào chủ. Sự nhân lên của vi rút liên quan đến phát triển của lưới nội chất tạo thành các nội bào đặc trưng. Các sản phẩm tổng hợp được lắp ráp ở màng tế bào chất. Sau đó các hạt virion được giải phóng qua mạng lưới Golgi bằng ngoại bào xuất tiết và các virion mới tiếp tục xâm nhập vào tế bào khác và bắt đầu một chu kỳ mới.
8 Sự nhân lên của vi rút trong tế bào Vi rút VNNB nhân lên trên nhiều loại tế bào cả ở trên tế bào tiên phát và tế bào thường trực có nguồn gốc từ người, khỉ, gặm nhấm, lợn, chim, gia cầm và muỗi(tế bào C6/36 muỗi Albobitus).Tế bào tiên phát gồm thận bào thai người, thận khỉ, thận lợn, tế bào phôi gà...hay các dòng tế bào thường trực như GMK2, Vero (thận khỉ), BHK21 (thận chuột hamster)[1]. Trong tế bào nuôi vi rút nhân lên gây hủy hoại tế bào (CPE) nhưng cũng có một số loại tế bào quan sát dưới kính hiển vi quang học, không thấy hiện tượng CPE. Hiệu giá vi rút đạt được tùy thuộc vào tế bào chủ, loại cảm ứng và trong điều kiện thích hợp vi rút nhân lên tốc độ nhanh, thời gian tạo CPE nhanh sau 1-2 ngày gây nhiễm (tế bào C6/36, Vero và BHK21). Hình ảnh tổn thương tế bào được quan sát trên kính hiển vi quang học cho thấy: Tế bào phình to, các tiểu thể hạt xuất hiện ở lưới nội chất làm rối loạn chức năng phân chia tế bào, vỏ màng nội bào tạo thành các không bào căng phồng và các tiểu thể trong nhân bị méo mó. Có biểu hiện tăng sinh tiểu thể Lysosom và làm loãng nguyên sinh chất của tế bào. Do đó hoạttính enzym lysosom tăng lên trong tổ chức tế bào nhiễm. 1.1.4. Dịch tễ học phân tử của vi rút Viêm não Nhật Bản Dịch tễ sinh học phân tử tập trung khai thác khía cạnh di truyền, dựa trênsự so sánh trình tự nucleotide của một gen đích hoặc toàn bộ gen của các chủng vi rút VNNB được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau để dự đoán tình hình lưu hành dịch, giúp kiểm soát tốt nguy cơ dịch bệnh,đồng thời là cơ sở cho lựa chọn chủng trong sản xuất vắc xin… [2]. Hiện nay, dịch tễ học phân tử là phương pháp hiện đại nhất để xác định về đặc điểm phân tử của tác nhân gây bệnh trên cơ sở đó xác định được nguồn gốc của căn nguyên gây bệnh, sự lan truyền của tác nhân gây bệnh theo không gian, thời gian ở cấp độ phân tử; theo dõi được sự thay đổi các chủng gây bệnh ở mức phân tử theo thời gian và phân vùng địa lý; sự thay đổi trong quá trình cấy chuyển nhân giống, cất giữ chủng trong sản xuất vắc xin; trong một số trường hợp nó còn là cơ sở để phân biệt vi rút vắc xin hay vi rút hoang dại…