Luận án tiến sĩ Sinh học: Tách dòng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất của endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:174

Thêm vào BST

Báo xấu

63
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của đề tài là tuyển chọn được chủng vi khuẩn B. thuringiensis bản địa có khả năng sinh chitinase cao và biểu hiện được chitinase tái tổ hợp trong E. coli phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗ trợ khả năng diệt côn trùng của chế phẩm BT và ức chế nấm hại cây trồng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Sinh học: Tách dòng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất của endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam

1 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRỊNH THỊ THU HÀ TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENDOCHITINASE TỪ Bacillus thuringiensis PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9420107 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2018 1
2 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRỊNH THỊ THU HÀ TÁCH DÕNG, BIỂU HIỆN VÀ NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT CỦA ENDOCHITINASE TỪ Bacillus thuringiensis PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 9420107 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Ngô Đình Bính Viện Công nghệ sinh học 2. PGS.TS. Đồng Văn Quyền Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, 2018 2
i LỜI CÁM ƠN Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Ngô Đình Bính, giáo viên hướng dẫn khoa học, người đã tạo điều kiện và luôn ở bên truyền dạy kiến thức, kinh nghiệm và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cám ơn người hướng dẫn khoa học - PGS. TS. Đồng Văn Quyền - Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám đốc Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học cùng các cán bộ thuộc Trung tâm đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin cám ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện làm việc thuận lơi nhất cho tôi hoàn thành khóa học và bản luận án này. Tôi xin cám ơn Bộ phận đào tạo, Viện Công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành mọi thủ tục trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành đến các đồng nghiệp, bạn bè trong và ngoài Viện Công nghệ sinh học đã luôn quan tâm, động viên và chỉ dẫn cho tôi để tôi hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thân trong gia đình, những người luôn bên tôi động viện, chia sẻ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày……tháng…..năm 2018 Tác giả Trịnh Thị Thu Hà
ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả; Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các số liệu, nội dung đã trình bày trong luận án. Hà Nội, ngày …..tháng …….năm 2018 Tác giả Trịnh Thị Thu Hà
iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU…………………………………………………………. 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Vi khu n Bacillus thuringiensis………………………………… 5 1.1.1. S cv . thuringi nsis……………………………………………. 5 1.1.2. S phát tri n và ng ng c chitin s t . thuringi nsis tr n th gi i 7 1.2. Chitinase t nhiên………………………………………………. 10 1.2.1. Ngu n g c c chitin s ………………………………………………. 11 1.2.2. Ph n o i chitin s …………………………………………………….. 12 1.2.3. Cấu trúc c chitin s …………………………………………………. 14 1.2.4. C ch ho t ộng c chitin s ……………………………………….. 16 1.2.5. Các y u t nh h ng n ho t t nh c chitin s …………………... 18 1.2.6. Các y u t nh h ng n quá tr nh sinh t ng h p chitin s ........... 20 1.3. Chitinase tái tổ h p.......................................................................... 22 1.3.1. Hệ i u hiện Esch richi co i............................................................. 26 1.3.2. Một s y u t nh h ng n quá tr nh n m n t ng h p chitin s tái t h p………………………………………………………………… 29 1.3.3. Thu h i và tinh s ch chitin s tái t h p…………………………….. 30 1.4. Ứng d ng c a chitinase................................................................. 31 1.4.1. Trong nông nghiệp và o vệ môi tr ng......................................... 31 1.4.2. Ứng d ng trong công nghiệp............................................................ 33 1.4.3. Ứng d ng trong y c...................................................................... 34 1.4.4. Ứng d ng trong c tính sinh kh i nấm............................................ 34 1.4.5. Ứng d ng trong công nghệ sinh học............................................... 35 1.5. Sơ lƣ c về tình hình sâu bệnh hại cây trồng…………………….. 36
iv Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1. Vật liệu nghiên cứu...................................................................... . 39 2.1.1. Ch ng gi ng và p smi ………………………………………………… 39 2.1.2. Thi t bị…………………………………………………………………….. 39 2.1.3. Hóa chất…………………………………………………………………… 40 2.1.4. Môi tr ng nuôi cấy……………………………………………………… 40 2.1.5. Dung dịch.......................................................................................... 41 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................. 41 2.2.1. Ph ng pháp vi sinh...................................................................... 41 2.2.2. Ph ng pháp hó sinh.................................................................... 43 2.2.3. Ph ng pháp sinh học phân tử....................................................... 45 2.2.4. T i u i u kiện i u hiện th o ph ng pháp mặt áp ng......... 52 2.2.5. Nghiên c u tính chất hóa lý c a chitinase tái t h p....................... 52 2.2.6. Ph ng pháp thử nghiệm............................................................... 54 2.2.7. Xử lý s liệu……………………………………………………………….. 56 2.2.8. S nghi n c u.......................................................................... 57 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 58 3.1. Phân lập vi khu n Bacillus thuringiensis có khả năng sinh chitinase ở Việt Nam……………………………………………… 58 3.1.1. Ph n p vi khu n . thuringi nsis…………………………………… 58 3.1.2. Phân lo i i loài các ch ng B. thuringiensis phân l p………….. 61 3.1.3. Sàng ọc ho t t nh th y ph n chitin c các ch ng . thuringi nsis s rov r kurst ki……………………………………………………….. 63 3.1.4. Sàng ọc g n n ochitin s chi c các ch ng . thuringi nsis s rov r kurst ki………………………………………………………… 65 3.1.5. Sàng ọc ho t t nh kháng nấm c các ch ng . thuringi nsis s rov r kurst ki………………………………………………………… 66 3.2. Khảo sát iều kiện sinh tổng h p chitinase c a ch ng Bacillus thuringiensis var. kurstaki MSS1.1……………………………….. 66
v 3.2.1. Th i gian nuôi cấy……………………………………………………… 67 3.2.2. Nhiệt ộ nuôi cấy……………………………………………………….. 67 3.2.3. Ngu n c chất…………………………………………………………… 67 3.2.4. N ng ộ c chất………………………………………………………… 68 3.2.5. pH môi tr ng nuôi cấy……………………………………………….. 68 3.2.6. Ngu n c c on…………………………………………………………… 69 3.2.7. Ngu n ni t ……………………………………………………………… 69 3.2.8. Môi tr ng thay th ……………………………………………………. 70 3.3. Nhân d ng gen chiA mã h a chitinase từ ch ng vi khu n B. thuringiensis var. kurstaki MSS1.1.................................................. 70 3.4 Biểu hiện gen chiA trong vi khu n E. coli BL21………………… 74 3.4.1. Thi t k vector bi u hiện gen chiA trong vi khu n E.co i L21…….. 74 3.4.2. Bi u hiện chiA tái t h p trong E. coli L21 DE3 ………………….. 77 3.4.3. Nghiên c u i u kiện bi u hiện gen chiA c a ch ng tái t h p…….. 79 3.4.4. T i u kh năng i u hiện rChi ằng ph ng pháp mặt áp ng……………………………………………………………………….. 84 3.4.5. Ki m tra s t ng th ch giữa mô hình và th c nghiệm..................... 88 3.4.6. Tinh s ch và xác ịnh ho t tính c a chitinase tái t h p……………. 89 3.5. Nghiên cứu tính chất c a chitinase tái tổ h p…………………… 90 3.5.1. Nhiệt ộ t i u và ộ b n nhiệt………………………………………… 90 3.5.2. pH t i u và ộ b n pH…………………………………………………. 91 3.5.3. Ảnh h ng c a ion kim lo i và EDTA lên ho t t nh chitin s ……… 92 3.5.4. Ảnh h ng c a chất t y rử ……………………………………………. 92 3.5.5. Ảnh h ng c a dung môi hữu c ………………………………………. 93 3.5.6. Động học c a ph n ng nzym ……………………………………….. 93 3.5.7. S n ph m c a s th y ph n c chất b i chitin s ……………………. 95 3.6. Th nghiệm khả năng kháng nấm gây bệnh th c vật và tăng hoạt tính diệt sâu c a chitinase tái tổ h p……………………… 95 3.6.1. Kh năng kháng nấm gây bệnh th c v t c a chitinase tái t h p….. 95
vi 3.6.2. Hỗ tr ho t tính diệt sâu Bộ cánh v y c a chitinase tái t h p…….. 97 Chƣơng 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ 99 4.1. Phân lập vi khu n Bacillus thuringiensis có khả năng sinh chitinase ở Việt Nam……………………………………………. 99 4.1.1. Ph n p vi khu n . thuringi nsis…………………………………….. 99 4.1.2. Phân lo i i loài kurstaki các ch ng B. thuringiensis phân l p… 100 4.1.3. Sàng ọc ho t t nh th y ph n chitin c các ch ng . thuringi nsis s rov r kurst ki………………………………………………………….. 100 4.1.4. Sàng ọc g n n ochitin s chi c các ch ng . thuringi nsis s rov r kurst ki……………………………………………………….. 101 4.1.5. Sàng lọc ho t tính kháng nấm c các ch ng . thuringi nsis serovar kurst ki……………………………………………………….. 101 4.2. Khảo sát iều kiện sinh tổng h p chitinase c a ch ng Bacillus thuringiensis var. kurstaki MSS1.1……………………………….. 102 4.2.1. Th i gi n nuôi cấy………………………………………………………. 102 4.2.2. Nhiệt ộ nuôi cấy………………………………………………………… 103 4.2.3. Ngu n c chất…………………………………………………………… 103 4.2.4. N ng ộ c chất…………………………………………………………. 104 4.2.5. pH môi tr ng nuôi cấy…………………………………………………. 104 4.2.6. Ngu n các on…………………………………………………………….. 105 4.2.7. Ngu n ni t ………………………………………………………………. 105 4.2.8. Môi tr ng thay th …………………………………………………….. 106 4.3. Phân tích trình t gen chiA và cấu trúc mô phỏng c a protein ChiA ……………………………….………………………………. 107 4.4. Biểu hiện rChiA trong vi khu n E. coli BL21 (DE3)…………… 108 4.4.1. Bi u hiện rChiA trong vi khu n………………………………………… 108 4.4.2. T i u i u kiện bi u hiện……………………………………………….. 109 4.4.3. T i u kh năng i u hiện rChiA bằng ph ng pháp mặt áp ng……………………………………………………………………… 112
vii 4.4.4. Tinh s ch và xác ịnh ho t tính c a chitinase tái t h p…………… 113 4.5. Nghiên cứu tính chất c a chitinase tái tổ h p…………………… 114 4.5.1. Nhiệt ộ t i u và ộ b n nhiệt………………………………………… 114 4.5.2. pH t i u và ộ b n pH………………………………………………… 115 4.5.3. Ảnh h ng c a ion kim lo i và EDTA lên ho t t nh chitin s ……… 115 4.5.4. Ảnh h ng c chất t y rử .............................................................. 116 4.5.5. Ảnh h ng c a dung môi hữu c ...................................................... 117 4.5.6. Động học c a ph n ng enzym........................................................ 117 4.5.7. S n ph m c a s th y ph n c chất b i chitinase............................. 118 4.6. Th nghiệm khả năng kháng nấm gây bệnh th c vật và tăng hoạt tính diệt sâu c a chitinase tái tổ h p...................................... 118 4.6.1. Kh năng kháng nấm gây bệnh th c v t c a chitinase tái t h p..... 118 4.6.2. Hỗ tr ho t tính diệt sâu Bộ cánh v y c a chitinase tái t h p......... 119 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................... 122 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN... 123 TÓM TẮT KẾT QUẢ LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH.………. 124 TÀI LIỆU THAM KHẢO……….……………………………….. 130 PHỤ LỤC
viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ch viết tắt Ch viết ầy Bp Base pair BSA Bovine serum albumin – albumin huyết thanh bò BT Chế phẩm Bacillus thuringiensis Bt Bacillus thuringiensis Btk Bacillus thuringiensis serovar kurstaki Colloidal chitin Chitin dạng keo cs Cộng sự chiA Gen mã hóa chitinase ĐC Đối chứng dH2O Nước khử ion DNA Deoxyribonucleic acid dNTP deoxyribo Nucleotide 5‟- Triphosphate DNS 3,5 - dinitrosalicylic E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid EtBr Ethidium Bromide g/l Gam/lít GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc)2 Diacetyl-chitobiose (GlcNAc)3 Triacetyl-chitotriose (GlcNAc)4 Tetraacetyl-chitotetraose IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside – chất cảm ứng Kana Kanamycine kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria –Bertani – môi trường nuôi cấy vi khuẩn MTCS Môi trường cơ sở OD Optical density - mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi
ix PDA Môi trường khoai tây rChiA Chitinase tái tổ hợp SDS Sodium dodecyl sulphate Điện di trên gel polyacrylamide có chứa sodium SDS-PAGE doecyl sulfat Sol Solution – dung dịch TAE Tris acetic acid EDTA TE Tris EDTA U Unit - đơn vị v/p Vòng/phút X-gal 5- bromo- 4 Cloro- 3 indolyl β- d galactoside
x DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần các môi trường nuôi cấy………………………… 40 Bảng 2.2. Thành phần và nồng độ các loại dung dịch………………….. 41 Bảng 3.1. Kết quả phân lập và kết quả xác định hình dạng tinh thể của các chủng Bt phân lập………………………………………… 60 Bảng 3.2. Phân loại Bt bằng phương pháp huyết thanh………………… 62 Bảng 3.3. Hoạt tính thủy phân chitin của các chủng Btk……………….. 64 Bảng 3.4. Hoạt tính kháng nấm của các chủng sinh chitinase………….. 66 Bảng 3.5. Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide và amino acid………. 72 Bảng 3.6. Sinh trưởng của tế bào và hoạt tính enzym ở các nhiệt độ cảm ứng khác nhau………………………………………………... 79 Bảng 3.7. Kết quả của 20 thí nghiệm cho 3 yếu tố ảnh hưởng…………. 84 Bảng 3.8. Kết quả phân tích hồi quy hoạt độ chitinase………………… 85 Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra giữa mô hình và thực nghiệm……………… 88 Bảng 3.10. Kết quả tinh sạch chitinase tái tổ hợp………………………... 90 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính enzym của rChiA……………………………………………. 92 Bảng 3.12. Các thông số động học của rChiA với các cơ chất khác nhau.. 95 Bảng 3.13. Nồng độ gây chết 50% (LC50) của protein tinh thể Cry và rChiA………………………………………………………….. 98
xi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo tế bào Bt…………………………………….. 6 Hình 1.2. Phản ứng ngưng kết của vi khuẩn Bt với kháng nguyên tiêm mao H……………………………..…………………... 6 Hình 1.3. Cấu trúc không gian họ chitinase 19….……………………. 14 Hình 1.4. Sự tương đồng vùng xúc tác của chiA74 với chitinase của các loài khác…………………..……………………………. 16 Hình 1.5. Cơ chế hoạt động của enzym chitinase ở Trichoderma.…… 17 Hình 2.1. Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng N-acetyl glucosamine theo phương pháp Miller………………………………….. 44 Hình 2.2. Đồ thị đường chuẩn hàm lượng BSA theo Bradford……… 45 Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu………………………………………….. 57 Hình 3.1. Bản đồ 7 vùng địa lý của Việt Nam………………………. 58 Hình 3.2. Khuẩn lạc vi khuẩn Bt trên môi trường MPA sau 72 giờ nuôi cấy…………………………………………………… 59 Hình 3.3. Hình dạng tinh thể dưới kính hiển vi của một số chủng Bt.. 61 Hình 3.4. Hình ảnh ngưng kết của Bt với huyết thanh đ c hiệu 4D4... 63 Hình 3.5. Hình ảnh sàng lọc hoạt tính thủy phân chitin của một số chủng Bt (A) và hoạt tính chitinase của 11 chủng Bt có đường kính vòng phân giải ≥ 25mm (B)…..………………. 65 Hình 3.6. Kết quả sàng lọc gen chiA t các chủng Btk phân lập ở Hà Nội…………………………………….……………………. 65 Hình 3.7. Ảnh kháng nấm R. solani (A) và F. oxysporum (B) của các chủng Btk………………………………………………….. 66 Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian (A) và nhiệt độ nuôi cấy (B) lên khả năng sinh tổng hợp chitinase………………………….. 67 Hình 3.9. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất (A) và nồng độ cơ chất (B) lên khả năng sinh tổng hợp chitinase……………………… 68 Hình 3.10. Ảnh hưởng của pH môi trường (A) và nguồn các bon (B) lên khả năng sinh tổng hợp chitinase……………………… 69
xii Hình 3.11. Ảnh hưởng của nguồn ni tơ lên khả năng sinh tổng hợp chitinase…………………………………………………… 70 Hình 3.12. Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen chiA t các dòng khuẩn lạc trắng (A) và điện di sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết t các khuẩn lạc dòng pGEM-Teasy/MSS1.1 trên gel 1% agarose (B)……………………………………...….. 71 Hình 3.13. So sánh trình tự nucleotide đoạn gen chiA của chủng B. thuringiensis MSS1.1 với trình tự EF581163.2…………… 73 Hình 3.14. So sánh trình tự amino acid của chủng B. thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 với trình tự có mã số ABQ65137.2 trên ngân hàng dữ liệu……………………… 73 Hình 3.15. Cấu trúc 3 vùng của protein ChiA………………………… 74 Hình 3.16. Sơ đồ thiết kế vector biểu hiện gen chiA……… 75 Hình 3.17. Điện di đồ gen chiA (A) và vector pET28b(+) tinh sạch (B) 76 Hình 3.18. Kết quả PCR khuẩn lạc các dòng biến nạp mang gen chiA với c p mồi đ c hiệu (A) và cắt vector tái tổ hợp pET28b/chiA với EcoRI và XhoI (B)………………...…..... 77 Hình 3.19. Phổ điện di protein trên gel SDS-PAGE …….…………….. 77 Hình 3.20. Phân tích Western blot (A) và kết quả kiểm tra hoạt tính chitinase của dịch chiết protein tái tổ hợp trên đĩa thạch (B)…………..……………………………………………… 78 Hình 3.21. Phổ điện di protein ChiA tái tổ hợp biểu hiện ở các nhiệt độ khác nhau……………………………………………….. 80 Hình 3.22. Kết quả điện di protein ChiA tái tổ hợp biểu hiện ở các nồng độ IPTG khác nhau (A) và ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến hoạt tính protein tái tổ hợp (B)………… 81 Hình 3.23. Ảnh hưởng của thời gian cảm ứng (A) và mật độ tế bào (B) đến hoạt tính protein tái tổ hợp……………………………. 82 Hình 3.24. Ảnh hưởng của nồng độ lactose đến hoạt tính chitinase, sinh trưởng của chủng E. coli tái tổ hợp (A) và phổ điện di protein tái tổ hợp khi cảm ứng bằng lactose (B)…………… 83
xiii Hình 3.25. Bề m t đáp ứng của t ng c p các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chitinase của chủng E. coli tái tổ hợp.……… 87 Hình 3.26. Điện di SDS-PAGE chitinase tinh sạch (A); kiểm tra hoạt tính chitinase bằng Zymogram (B) và phân tích Western blot (C)……………………...……………………...………. 90 Hình 3.27. Nhiệt độ tối ưu (A) và độ bền nhiệt (B) của rChiA………... 91 Hình 3.28. pH tối ưu (A) và độ bền pH (B) của rChiA …………..…… 91 Hình 3.29. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa (A) và dung môi hữu cơ (B) lên hoạt tính enzym của rChiA…………………………….. 93 Hình 3.30. Biến đổi vận tốc phản ứng theo nồng độ chitin (A) và 4- MU-(GlcNAc)3 (C). Đồ thị Linewever-Burk của rChiA với cơ chất chitin (B) và cơ chất 4-MU-(GlcNAc)3 (D)……….. 94 Hình 3.31. Phân tích bản mỏng (TLC) các sản phẩm thủy phân chitin bởi chitinase………………………………………………... 95 Hình 3.32. Sự ức chế phát triển nấm F. oxysporum (A), R. solani (B) và Mucor sp. (C) của rChiA sau 3 ngày……………………. 96 Hình 3.33. Sợi nấm F. oxysporum, R. solani và Mucor sp. khi xử lý với enzym đã bất hoạt (A, C, E) và với rChiA (B, D, F)..…. 97 Hình 3.34. Thử nghiệm khả năng diệt sâu tơ (A) và sâu khoang (B) của protein tinh thể Cry, rChiA……………………………. 98 Hình 3.35 Hình ảnh thử sâu tơ (A) và sâu khoang (B)…………..…… 98 Hình 4.1. Cấu trúc không gian mô phỏng của protein ChiA t chủng Btk MSS1.1…………….…………………………………………. 107
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn ề Trong nhiều năm qua, thuốc tr sâu sinh học t vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) đã được nghiên cứu và ứng dụng để diệt tr các loại côn trùng hại cây trồng và bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Cùng với sự phát triển kinh tế - xã hội, nhu cầu sử dụng các sản phẩm nông nghiệp sạch, hạn chế mức thấp nhất thuốc tr sâu hóa học trong sản xuất nông nghiệp của con người ngày càng cao. Thuốc tr sâu sinh học Bt đã được sử dụng, do chúng khắc phục được tính kháng thuốc của côn trùng và chỉ diệt các loài côn trùng có hại mà không ảnh hưởng đến môi trường sinh thái cũng như sức khỏe con người. Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn Bt sản sinh một số chất chuyển hóa có tiềm năng ứng dụng như: enzym thủy phân chitin (chitinase) và chất kháng sinh. Các sản phẩm chuyển hóa này có thể ức chế vi khuẩn gây bệnh qua thực phẩm ho c kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh như vi khuẩn, nấm. Vì vậy, việc tạo ra một lượng lớn enzym, đ c biệt là chitinase bổ sung vào chế phẩm sinh học Bt để tăng hoạt tính diệt côn trùng là rất cần thiết. Chitinase (EC 3.2.1.14) thuộc nhóm enzym thủy phân, xúc tác quá trình phân hủy cơ chất chitin không tan trong nước thành các sản phẩm chitin-oligosaccharide hòa tan trong nước thông qua quá trình thủy phân liên kết β-(1,4)- glucoside giữa C- 1 và C4 của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Hiện nay, chitinase được ứng dụng chủ yếu trong sản xuất chitooligosaccharide, nano-chitin, N-acetyl-D-glucosamine. Đây là những sản phẩm giá trị ứng dụng cao và được sử dụng trong thực phẩm, nông nghiệp, y dược. Ngoài ra, chitinase đ c biệt là endochitinase còn được sử dụng như thuốc tr sâu sinh học trong nông nghiệp nhờ khả năng phân hủy chitin cấu trúc trong thành tế bào của nấm, côn trùng gây bệnh và xử lý các chất thải giàu chitin... Do kiểu phân cắt mà endochitinase phân cắt cơ chất chitin và vách tế bào nấm chứa chitin tốt hơn so với chitobiosidase và N – acetylglucosaminidase. Vì vậy, việc phân lập tìm ra chủng Bt sinh endochitinase
2 cao và qui trình tạo ra endochitinase có hoạt tính cao bằng công nghệ gen nhằm góp phần tăng hiệu quả của chế phẩm sinh học là rất cần thiết. Xuất phát t những lý do trên, chúng tôi tiến hành lựa chọn đề tài luận án: “Tách d ng, biểu hiện và nghiên cứu tính chất c a endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập ở Việt Nam”. 2. M c tiêu nghiên cứu 2.1. M c tiêu chung Tuyển chọn được chủng vi khuẩn B. thuringiensis bản địa có khả năng sinh chitinase cao và biểu hiện được chitinase tái tổ hợp trong E. coli phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗ trợ khả năng diệt côn trùng của chế phẩm BT và ức chế nấm hại cây trồng. 2.2. M c tiêu c thể (1) Sàng lọc và thu nhận được chủng vi khuẩn B. thuringiensis Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao và xác định được trình tự nucleotide của gen mã hóa chitinase t chủng vi khuẩn Bt đã tuyển chọn. (2) Biểu hiện và tinh sạch được chitinase tái tổ hợp (rChiA) trong E. coli BL21 (DE3). (3) Đánh giá được tác dụng tương hỗ của chitinase tái tổ hợp với protein tinh thể Cry trong diệt côn trùng và khả năng ức chế nấm gây bệnh thực vật. 3. Nội dung nghiên cứu (1) Phân lập và nghiên cứu đ c điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn B. thuringiensis Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao; (2) Nghiên cứu một số điều kiện ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng B. thuringiensis tuyển chọn; (3) Nghiên cứu tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa chitinase phân lập t chủng B. thuringiensis tuyển chọn; (4) Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chitinase t chủng B. thurigiensis tuyển chọn được và tinh sạch chitinase tái tổ hợp; (5) Nghiên cứu một số tính chất hóa lý của chitinase tái tổ hợp;
3 (6) Nghiên cứu khả năng ức chế nấm gây bệnh thực vật của chitinase tái tổ hợp và tác dụng hỗ trợ của chitinase đối với khả năng diệt côn trùng của protein tinh thể Cry. 4. Nh ng ng g p mới c a luận án (1) Tuyển chọn được 36 chủng vi khuẩn B. thuringiensis Việt Nam có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao. (2) Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống về endochitinase (tự nhiên và tái tổ hợp) t chủng B. thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 của Việt Nam có khả năng bảo vệ kép (Dual control) - v a kháng nấm Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani gây bệnh thực vật v a tăng hoạt tính diệt côn trùng của chế phẩm BT nhằm phục vụ cho phát triển thuốc tr sâu bệnh sinh học thế hệ mới. (3) Bổ sung cơ sở dữ liệu nguồn gen chitinase của các chủng B. thuringiensis Việt Nam phục vụ cho nghiên cứu, đào tạo và ứng dụng sau này. 5. Ý nghĩa khoa học và th c tiễn c a ề tài 5.1. Ý nghĩa khoa học Bổ sung thêm cơ sở dữ liệu về gen mã hóa chitinase t các chủng vi khuẩn phân lập ở Việt Nam, làm cơ sở khoa học và nguyên liệu di truyền để tạo các chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp và thu hồi chitinase cao hơn so với chủng tự nhiên, có thể ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. Kết quả của luận án còn góp phần phát triển công nghệ lên men vi sinh vật tái tổ hợp sản xuất chitinase có hiệu suất cao. Công trình đã làm phong phú thêm thông tin trong lĩnh vực công nghệ enzym nhờ những nghiên cứu về sinh tổng hợp, tinh sạch, đ c tính lí hóa và định hướng ứng dụng của chitinase. 5.2. Ý nghĩa th c tiễn Kết quả luận án góp phần khai thác có hiệu quả tiềm năng nguồn gen vi sinh vật trong nước nói chung và gen chiA nói riêng nhằm tạo ra các sản phẩm enzym công nghiệp có giá trị ứng dụng trong các lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp,
4 hướng tới phát triển công nghệ sạch và sản phẩm sạch có ích cho sức khỏe con người, không gây ô nhiễm môi trường. Tạo được chủng E. coli tái tổ hợp biểu hiện cao chitinase t chủng B. thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 của Việt Nam và bước đầu nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học BT diện côn trùng và nấm gây bệnh nhằm hỗ trợ và thay thế thuốc tr sâu hóa học.
5 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi khu n Bacillus thuringiensis l c v B. thuringiensis Bacillus thuringiensis (Bt) là vi khuẩn đất thuộc chi Bacillus, môi trường sống chính của Bt gồm đất, côn trùng, hạt ngũ cốc, bề m t thực vật. B. thuringiiensis có dạng hình que, gram dương, hô hấp hiếu khí ho c kị khí không bắt buộc, sinh bào tử, bào tử hình oval, trong quá trình hình thành bào tử hầu hết các chủng Bt đều tổng hợp protein tinh thể. Tinh thể có kích thước 0,6 - 2 µm, có hình dạng không cố định có thể là hình lập phương, hình lưỡng tháp ho c hình cầu. Tinh thể có thể chiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào. Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm coomassie brilliant blue và quan sát dưới kính hiển vi, tinh thể Bt bắt màu xanh đậm còn bào tử bắt màu xanh nhạt. Trong môi trường lỏng Bt có khả năng chuyển động nhờ các lông roi trên bề m t tế bào (Hình 1.1) (Ngô Đình Bính, 2011). Bt có khả năng sinh trưởng, phát triển trong khoảng nhiệt độ 20 - 40ºC, nhiệt độ tối ưu là 28 - 32ºC, Bt phát triển tối ưu ở pH = 7. Bt được phân loại theo nhiều phương pháp khác nhau: dựa trên đ c điểm hình thái và đ c điểm sinh hoá, theo ngoại hình enzym lipase, theo typ huyết thanh kháng nguyên - O, theo typ huyết thanh kháng protein tinh thể, theo typ huyết thanh kháng nguyên - H, theo nguồn bệnh và theo gen mã hóa protein độc tố diệt côn trùng. Trong đó, phương pháp phân loại theo de Barjac và Bonnefoi dựa trên nguyên lý của phản ứng kháng nguyên - kháng thể được sử dụng rộng rãi (khi kháng nguyên tiêm mao kết hợp với kháng thể xảy ra phản ứng ngưng kết tạo c n lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm có thể quan sát bằng mắt thường. Dưới kính hiển vi quang học ho c đối pha có thể quan sát thấy các tế bào bị cố định lại không chuyển động được (Hình 1.2). Đến năm 1999, đã phát hiện được 69 typ huyết thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác nhau của Bt (de Barjac và Bonnefoi, 1962).