Luận án tiến sĩ Sinh học: Ứng dụng công nghệ sinh học xử lý rác hữu cơ phục vụ sản xuất nông nghiệp, tỉnh Sóc Trăng

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:151

Thêm vào BST

Báo xấu

69
lượt xem 16
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án là phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn bản địa để xử lý sinh học rác hữu cơ và sử dụng thành phẩm sau xử lý trong sản xuất nông nghiệp. Để hoàn thành các mục tiêu của luận án, các kỹ thuật truyền thống cũng như kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại đã được sử dụng để phân lập và định danh các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein từ rác hữu cơ, ruột con sùng đất và trùn đất.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Sinh học: Ứng dụng công nghệ sinh học xử lý rác hữu cơ phục vụ sản xuất nông nghiệp, tỉnh Sóc Trăng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC MAI THI ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC XỬ LÝ RÁC HỮU CƠ PHỤC VỤ SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP TỈNH SÓC TRĂNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 62 42 01 07 2018
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC MAI THI ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC XỬ LÝ RÁC HỮU CƠ PHỤC VỤ SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP TỈNH SÓC TRĂNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 62 42 01 07 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS. TS. Nguyễn Hữu Hiệp 2018
LỜI CÁM ƠN Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cám ơn PGS. TS Nguyễn Hữu Hiệp đã tận tình hướng dẫn và giúp tôi hoàn thành luận án tiến sĩ. Thầy là người truyền cho tôi lòng nhiệt huyết và thổi lên ngọn lửa đam mê khoa học; khơi dậy trong tôi sự nỗ lực, tự tin, ý chí kiên cường, cố gắng không ngừng và không nản lòng trước những khó khăn và thử thách trong suốt tiến trình thực hiện luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Trường Đại học Cần Thơ, Khoa Sau Đại học, thầy PGS. TS. Mai Văn Nam, cô Nguyễn Hữu Giao Tiên, cô Châu Kim Khuyến đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu hoàn thành luận án. Trong tiến trình 5 năm nghiên cứu, tôi đã luôn được sự quan tâm, hỗ trợ của Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Cần Thơ. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy PGS. TS. Trần Nhân Dũng, PGS. TS. Nguyển Văn Thành, PGS. TS. Ngô Thị Phương Dung, PGS. TS. Nguyễn Minh Chơn, PGS. TS. Trương Trọng Ngôn, TS. Nguyễn Đắc Khoa, TS. Trương Thị Bích Vân đã hỗ trợ chuyên môn và giúp tôi có thêm nhiều nghị lực để hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy PGS. TS. Trần Kim Tính và các anh chị em phòng thí nghiệm chuyên sâu - Trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ tôi các phân tích chuyên sâu về sinh hóa, cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh vật Nguyễn Thị Thúy Duy và cán bộ phòng Sinh học phân tử Trần Văn Bé Năm thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học - Trường đại học Cần Thơ đã hổ trợ tôi về kỹ thuật vi sinh và sinh học phân tử. Anh chị Nghiên cứu sinh, Thạc sĩ Cao Mỹ Phượng, Thạc sĩ Chế Minh Ngữ, Thạc sĩ Nguyễn Diệp Minh Tân và các em sinh viên đã đồng hành cùng tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tôi xin được gởi lời biết ơn đến Lãnh đạo Sở Nội Vụ, Sở Tài nguyên và Môi trường, Trung tâm Quan Trắc tài nguyên và Môi trường tỉnh Sóc Trăng đã sắp xếp công việc và tạo điều kiện thuận lợi về thời gian để tôi hoàn thành kế hoạch học tập toàn khóa trong chương trình đào tạo tiến sĩ. Xin cảm ơn gia đình yêu thương, Ba Má, Ông xã Nguyễn Đăng Khoa, hai con Khánh, Khanh và các em đã dành cho tôi tất cả tình yêu và sự khuyến khích, ủng hộ tôi trong những chặn đường cam go để hoàn thành luận án này. Chân thành cám ơn./. Cần Thơ, ngày …… tháng …… năm 2018
TÓM TẮT Mục tiêu của luận án là phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn bản địa để xử lý sinh học rác hữu cơ và sử dụng thành phẩm sau xử lý trong sản xuất nông nghiệp. Để hoàn thành các mục tiêu của luận án, các kỹ thuật truyền thống cũng như kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại đã được sử dụng để phân lập và định danh các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein từ rác hữu cơ, ruột con sùng đất và trùn đất. Kết quả có 213 dòng vi khuẩn đã được phân lập. Khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đa số có dạng tròn hoặc không đều, độ nổi mô hay lài, bìa nguyên hay răng cưa, màu trắng hay trắng sữa; tế bào vi khuẩn phần lớn hình que ngắn, chuyển động và Gram dương. Hai mươi dòng vi khuẩn triển vọng có hoạt tính enzyme cellulase, amylase và protease mạnh được chọn để giải trình tự gen 16S rRNA bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Tất cả các dòng vi khuẩn đều thuộc chi Bacillus gồm Bacillus subtilis (6 dòng), Bacillus megaterium (5 dòng), Bacillus cereus (2 dòng), Bacillus flexus (2 dòng), Bacillus aquimaris (2 dòng), Bacillus aryabhattai (1 dòng), Bacillus licheniformis (1 dòng) và Bacillus sp (1 dòng). Mối quan hệ di truyền của những dòng vi khuẩn này đã được xác lập. Các dòng vi khuẩn triển vọng của luận án và 3 chế phẩm sinh học ngoại nhập đã được sử dụng để xử lý rác thải hữu cơ (ủ phân hữu cơ vi sinh) tại bãi rác xã Đại Ngãi, huyện Long Phú, tỉnh Sóc Trăng. Sự biến động về mật số vi khuẩn phân hủy, độ pH, nhiệt độ cho thấy sự hoạt động tích cực của vi khuẩn trong các mẻ ủ. Thành phần của phân hữu cơ vi sinh thành phẩm đáp ứng được các yêu cầu về hàm lượng C, N, K và chỉ số C/N khi tham chiếu với tiêu chuẩn quy định về chất lượng phân hữu cơ vi sinh của Việt Nam TCVN 7185.2002. Phân hữu cơ vi sinh của luận án được dùng để bón cho dưa leo (Cucumis sativus L.) và giúp giảm 50% phân hóa học trong khi các chỉ tiêu như chiều dài trái, đường kính trái, trọng lượng trái, số trái/cây, ngày ra hoa và ngày thu hoạch khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với cách bón phân truyền thống ở địa phương (100% phân hóa học). Từ khóa: Bacillus, Cellulose, phân hủy sinh học, protein, tinh bột. i
ABSTRACT The purpose of this thesis is isolation and selection of indigenous bacterial strains for the bio-degradation of organic waste and application of its products for agricultural production. The traditional techniques as well as modern molecular techniques were used for the isolation and identification of cellulose, starch or protein degrading bacterial strains from organic waste samples, liquid samples of organic waste, gut of Holotrichia parallela and Lumbricus terrestris. Two hundred and thirteen bacterial strains were isolated. Most of bacterial colonies were round or irregular, convex or raised elevation, entire margin and white color. Bacterial cells were almost short rods, motile and Gram positive. Twenty promising strains which had good cellulase, amylase and protease activity were chosen for 16S rRNA gene sequencing using molecular biology technique. All of them belonged to Bacillus genus including Bacillus subtilis (6 strains), Bacillus megaterium (5 strains), Bacillus aquimaris (2 strains), Bacillus cereus (2 strains), Bacillus flexus (2 strains), Bacillus aryabhattai (1 strain), Bacillus licheniformis (1 strain) and Bacillus sp. (1 strain). The phylogenetic relationship of these bacterial strains was analysed. The promising strains and 3 imported bio-products were applied in organic waste treatment (composting bio-fertilizer) at organic waste collection station at Dai Ngai commune, Long Phu district, Soc Trang province. The fluctuation of beneficial bacteria density, pH, temperature of the compost showed that bacteria effectively worked during composting. The final product of bio-fertilizer containing carbon, potassium, nitrogen content and C/N met the requirement of Vietnamese standard of quality of biofertilizer (TCVN 7185.2002). Our bio-fertilizer was then applied in growing cucumber (Cucumis sativus L.) and helped to reduce 50% of chemical fertilizer while the parameters such as fruit length, fruit diameter, fruit weight, fruits/tree, flowering dates and harvesting dates were not significantly different from traditional local fertilizering (100% of chemical fertilizers). Key words: Bacillus, bio-fertilizer, cellulose, protein, starch. ii
MỤC LỤC TÓM TẮT ........................................................................................................... i ABSTRACT ...................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................ vi DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................... vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................... ix CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU ............................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu của đề tài ....................................................................................... 1 1.3 Nội dung của luận án ................................................................................... 1 1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án .............. 2 1.5 Cách tiếp cận và giả thuyết khoa học .......................................................... 2 1.6 Kết cấu của luận án ...................................................................................... 3 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4 2.1 Tình hình rác thải ......................................................................................... 4 2.1.1 Tình hình rác thải trên thế giới......................................................... 4 2.1.2 Tình hình rác thải ở Việt Nam ......................................................... 4 2.1.3 Tình hình rác thải ở Sóc Trăng ........................................................ 4 2.2 Sự phân hủy chất thải hữu cơ ...................................................................... 6 2.2.1 Sự phân hủy cellulose ...................................................................... 6 2.2.2 Sự phân hủy tinh bột ........................................................................ 8 2.2.3 Sự phân hủy protein ......................................................................... 9 2.3 Vi sinh vật trong xử lý chất thải hữu cơ .................................................... 11 2.3.1 Nấm ................................................................................................ 11 2.3.2 Xạ khuẩn ........................................................................................ 12 2.3.3 Vi khuẩn ......................................................................................... 12 2.3.4 Vi khuẩn trong ruột côn trùng ........................................................ 14 2.4 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus ....................................................................... 15 2.4.1 Đặc điểm hình thái ......................................................................... 15 2.4.2 Những chỉ tiêu sinh hóa dùng để định danh vi khuẩn Bacillus ..... 16 2.4.3 Vai trò của vi khuẩn Bacillus ......................................................... 17 2.5 Phân hữu cơ vi sinh ................................................................................... 17 2.5.1 Các quá trình sinh hóa trong quá trình ủ phân hữu cơ vi sinh ....... 17 2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng quá trình ủ phân hữu cơ vi sinh ................ 18 2.5.3 Lợi ích của phân hữu cơ vi sinh ..................................................... 20 2.6 Đặc tính sinh học cây dưa leo và kỹ thuật trồng dưa leo ........................... 21 2.6.1 Đặc tính sinh học............................................................................ 21 iii
2.6.2 Kỹ thuật trồng cây dưa leo (Cucumis sativus L.)........................... 21 CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP .................................... 23 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................. 23 3.2 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................. 23 3.2.1 Vật liệu ........................................................................................... 23 3.2.2 Dụng cụ .......................................................................................... 23 3.2.3 Thiết bị ........................................................................................... 23 3.2.4 Hóa chất và môi trường.................................................................. 24 3.3 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 26 3.3.1 Phân lập vi khuẩn ........................................................................... 26 3.3.2 Quan sát đặc điểm hình thái và sinh hóa của vi khuẩn .................. 27 3.3.3 Khảo sát khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein ........... 29 3.3.4 Xác định hoạt tính cellulase ........................................................... 29 3.3.5. Xác định hoạt tính amylase ........................................................... 31 3.3.6 Xác định hoạt tính protease ............................................................ 32 3.3.7 Khuếch đại đoạn gene 16S rRNA .................................................. 33 3.3.8 Giải trình tự đoạn gen 16S rRNA .................................................. 35 3.3.9 Ứng dụng vi khuẩn xử lý rác hữu cơ ............................................. 35 3.3.10 Phương pháp xác định mật số vi khuẩn hiếu khí ......................... 35 3.3.11 Phương pháp xác định C, N, P, K trong phân hữu cơ................. 36 3.2.12 Ứng dụng phân hữu cơ trồng dưa leo .......................................... 36 3.3.13 Xử lý kết quả thí nghiệm.............................................................. 37 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 38 4.1 Vi khuẩn phân hủy cellulose từ rác và nước rỉ rác .................................... 38 4.1.1 Kết quả phân lập ............................................................................ 38 4.1.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa ...................................................... 38 4.1.3 Khả năng phân hủy CMC của các dòng vi khuẩn .......................... 42 4.1.4 Kết quả định danh .......................................................................... 43 4.2 Vi khuẩn phân hủy cellulose từ ruột sùng đất và trùn đất ......................... 45 4.2.1 Kết quả phân lập ............................................................................ 45 4.2.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa ...................................................... 45 4.2.3 Khả năng phân hủy CMC của các dòng vi khuẩn .......................... 49 4.2.4 Kết quả định danh .......................................................................... 52 4.3 Vi khuẩn phân hủy tinh bột từ rác và nước rỉ rác ...................................... 53 4.3.1 Kết quả phân lập ............................................................................ 53 4.3.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa ...................................................... 53 4.3.3 Khả năng phân hủy tinh bột của các dòng vi khuẩn ...................... 57 4.3.4 Kế t quả định danh ......................................................................... 58 4.4 Vi khuẩn phân hủy tinh bột từ ruột sùng và trùn đất ................................. 59 iv
4.4.1 Kết quả phân lập ............................................................................ 59 4.4.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa ...................................................... 60 4.4.3 Khả năng phân hủy tinh bột của các dòng vi khuẩn ...................... 63 4.4.4 Kết quả định danh .......................................................................... 64 4.5 Vi khuẩn phân hủy protein từ rác và nước rỉ rác ....................................... 66 4.5.1 Kết quả phân lập ............................................................................ 66 4.5.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa ...................................................... 66 4.5.3 Khả năng phân hủy protein của các dòng vi khuẩn ....................... 69 4.5.4 Kết quả định danh .......................................................................... 70 4.6 Vi khuẩn phân hủy protein từ ruột sùng và trùn đất .................................. 72 4.6.1 Kết quả phân lập ............................................................................ 72 4.6.2 Đặc điểm hình thái và sinh hóa ...................................................... 72 4.6.3 Khả năng phân hủy protein của các dòng vi khuẩn ....................... 77 4.6.4 Kết quả định danh .......................................................................... 78 4.7 Thảo luận chung ........................................................................................ 80 4.8 Đánh giá khả năng phân hủy rác thải của các chế phẩm sinh học............. 82 4.8.1 Mật số vi khuẩn trong quá trình ủ .................................................. 82 4.8.2 Nhiệt độ và pH trong quá trình ủ nguyên liệu ............................... 82 4.8.3 Hàm lượng (%) C, N, P, K và tỷ lệ C/N của mẻ ủ ......................... 83 4.9 Kết quả ứng dụng phân hữu cơ vi sinh trồng dưa leo ............................... 84 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................... 86 5.1 Kết luận ...................................................................................................... 86 5.2 Kiến nghị ................................................................................................... 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 87 PHỤ LỤC ........................................................................................................ 97 v
DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1: Sự phân cắt cellulose bởi enzyme cellulase ...................................... 7 Hình 2.2: Cấu trúc phân tử amylose và amylopectin ........................................ 8 Hình 2.3: Cơ chế phân hủy tinh bột ................................................................... 9 Hình 2.4: Sự hình thành chuỗi polypeptide ..................................................... 10 Hình 2.5: Cấu trúc của protein......................................................................... 10 Hình 2.6: Cơ chế phân hủy protein .................................................................. 11 Hình 2.7: Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis..................................................... 16 Hình 4.1: Đĩa trải mẫu nước rỉ rác trên môi trường CMC 1% ....................... 38 Hình 4.2: Khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột ................. 39 Hình 4.3: Vòng sáng phân hủy CMC .............................................................. 42 Hình 4.4: Phổ điện di sản phẩm PCR của hai dòng vi khuẩn triển vọng ........ 44 Hình 4.5: Khuẩn lạc của hai dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột ....................... 46 Hình 4.6: Vòng sáng phân hủy CMC .............................................................. 50 Hình 4.7: Phổ điện di sản phẩm PCR của bốn dòng vi khuẩn triển vọng ....... 52 Hình 4.8: Khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột ................. 54 Hình 4.9: Vòng sáng phân hủy tinh bột ........................................................... 58 Hình 4.10: Phổ điện di sản phẩm PCR của hai dòng vi khuẩn triển vọng ...... 58 Hình 4.11: Khuẩn lạc của hai dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột ..................... 60 Hình 4.12: Vòng sáng phân hủy tinh bột ......................................................... 64 Hình 4.13 Phổ điện di sản phẩm PCR của các dòng vi khuẩn triển vọng ....... 64 Hình 4.14: Đĩa trải mẫu nước rỉ rác trên môi trường peptone 1% .................. 66 Hình 4.15: Khuẩn lạc của hai dòng vi khuẩn phân hủy protein ...................... 67 Hình 4.16: Vòng sáng phân hủy skim milk ..................................................... 70 Hình 4.17: Phổ điện di sản phẩm PCR của các dòng vi khuẩn triển vọng ...... 71 Hình 4.18 Đĩa thạch trải ruột sùng đất (A) và ruột trùn đất (B) ...................... 72 Hình 4.19: Khuẩn lạc của dòng vi khuẩn TPs40 ............................................. 73 Hình 4.20: Vòng sáng phân hủy skim milk ..................................................... 78 Hình 4.21 Tỷ lệ các loài vi khuẩn đã được định danh ..................................... 80 Hình 4.22: Mối quan hệ di truyền giữa 20 dòng vi khuẩn triển vọng ............. 81 Hình 4.23: Kết quả phân tích haplotype của 20 dòng vi khuẩn đã định danh . 82 vi
DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Sự phát sinh và thu gom rác thải nông thôn ở tỉnh Sóc Trăng .......... 5 Bảng 2.2: Tổng hợp phân loại rác thải ở chợ trung tâm TP. Sóc Trăng ............ 5 Bảng 2.3: Tổng hợp phân loại rác thải tại chợ thị trấn Mỹ Xuyên .................... 6 Bảng 2.4: Tổng hợp phân loại rác thải tại chợ thị trấn Trần Đề ........................ 6 Bảng 2.5: Thành phần hóa học của xác thực vật nông nghiệp thường gặp ..... 18 Bảng 3.1: Thành phần các chất trong một phản ứng PCR .............................. 34 Bảng 3.2: Các giai đoạn của phản ứng PCR.................................................... 34 Bảng 4.1: Đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn .......................................................... 39 Bảng 4.2: Đặc điểm tế bào của 26 dòng vi khuẩn ........................................... 40 Bảng 4.3: Khả năng sinh catalase và đổi màu Methyl red .............................. 41 Bảng 4.4: Khả năng phân hủy CMC của 22 dòng vi khuẩn ............................ 43 Bảng 4.5: Hoạt tính enzyme endoglucanase và exoglucanase ........................ 43 Bảng 4.6: Kết quả so sánh trình tự với dữ liệu NCBI ..................................... 45 Bảng 4.7: Đặc điểm khuẩn lạc của 50 dòng vi khuẩn ..................................... 46 Bảng 4.8: Đặc điểm tế bào của 50 dòng vi khuẩn ........................................... 47 Bảng 4.9: Đặc tính sinh hóa của 50 dòng vi khuẩn ......................................... 49 Bảng 4.10: Khả năng phân hủy CMC của các dòng vi khuẩn ......................... 50 Bảng 4.11: Khả năng phân hủy bột giấy của 10 dòng triển vọng ................... 51 Bảng 4.12: Hoạt tính endoglucanase và exoglucanase .................................... 51 Bảng 4.13: Kết quả so sánh trình tự với dữ liệu NCBI ................................... 53 Bảng 4.14: Đặc điểm khuẩn lạc của 30 dòng vi khuẩn ................................... 54 Bảng 4.15: Đặc điểm tế bào của 30 dòng vi khuẩn ......................................... 55 Bảng 4.16: Đặc điểm sinh hóa 30 dòng vi khuẩn ............................................ 56 Bảng 4.17: Khả năng phân hủy tinh bột của 30 dòng vi khuẩn....................... 57 Bảng 4.18: Hoạt tính enzyme amylase của hai dòng triển vọng ..................... 58 Bảng 4.19: Kết quả so sánh trình tự với dữ liệu NCBI ................................... 59 Bảng 4.20: Đặc điểm khuẩn lạc của 28 dòng vi khuẩn ................................... 60 Bảng 4.21: Đặc điểm tế bào của 28 các dòng vi khuẩn ................................... 61 Bảng 4.22: Đặc tính sinh hóa 30 dòng vi khuẩn.............................................. 62 Bảng 4.23 Khả năng phân hủy tinh bột của 27 dòng vi khuẩn ........................ 63 Bảng 4.24: Hoạt tính enzyme amylase các dòng vi khuẩn .............................. 64 Bảng 4.25: Kết quả so sánh trình tự với dữ liệu NCBI ................................... 65 Bảng 4.26: Đặc điểm khuẩn lạc của 29 dòng vi khuẩn ................................... 67 Bảng 4.27: Đặc điểm tế bào của 29 dòng vi khuẩn ......................................... 68 Bảng 4.28: Đặc điểm sinh hóa của 29 dòng vi khuẩn ..................................... 69 Bảng 4.29: Khả năng phân hủy protein của 29 dòng vi khuẩn........................ 70 Bảng 4.30: Hoạt tính enzyme protease các dòng RPp9, RPs19 và RPg15 ..... 70 Bảng 4.31: Kết quả so sánh trình tự với dữ liệu NCBI ................................... 72 vii
Bảng 4.32: Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn .................................. 73 Bảng 4.33: Đặc điểm tế bào của 35 dòng vi khuẩn ......................................... 75 Bảng 4.34: Đặc điểm sinh hóa của 50 dòng vi khuẩn ..................................... 76 Bảng 4.35: Khả năng phân hủy skim milk của 35 dòng vi khuẩn ................... 77 Bảng 4.36: Hoạt tính protease của 3 dòng triển vọng ..................................... 78 Bảng 4.37 Kết quả so sánh trình tự với dữ liệu NCBI .................................... 79 Bảng 4.38 Tỷ lệ vi khuẩn phân lập theo cơ chất hữu cơ ................................. 80 Bảng 4.39 Mật số vi khuẩn phân hủy rác (CFU/g) .......................................... 82 Bảng 4.40 Sự biến động nhiệt độ (oC) trong quá trình ủ phân ........................ 83 Bảng 4.41 Sự biến động pH trong quá trình ủ ................................................. 83 Bảng 4.42 Sự biến động thành phần (%) C,N , P, K và tỷ lệ C/N của mẻ ủ ... 84 Bảng 4.43 Ảnh hưởng của phân hữu cơ vi sinh lên cây dưa leo ..................... 85 viii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ANOVA Analysis of variance ARN Acid ribonucleic BOD Biochemical oxygen demand CMC Carboxymethyl cellulose COD Chemical oxygen demand CTR Chất thải rắn CV Coefficient of variation DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid LB Luria broth LSD Least significant difference NCBI National Center for Biotechnology Information OD Optical density PCA Plate count agar PCR Polymerase chain reaction TCA Trichloroacetic acid TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam USA United States of America UV Ultraviolet ix
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Cùng với sự gia tăng số lượng và quy mô các ngành nghề sản xuất, sự hình thành các khu dân cư tập trung, nhu cầu tiêu dùng hàng hoá, nguyên vật liệu và năng lượng ngày càng tăng. Những sự gia tăng đó đã tạo điều kiện kích thích các ngành sản xuất, kinh doanh và dịch vụ mở rộng và phát triển nhanh chóng, đóng góp tích cực cho sự phát triển kinh tế - xã hội của đất nước. Tuy nhiên, song song với sự phát triển mạnh mẽ là sự phóng thích một lượng lớn chất thải vào môi trường, đặc biệt là chất thải rắn như chất thải sinh hoạt, chất thải công nghiệp, chất thải y tế, chất thải nông nghiệp, chất thải xây dựng, chất thải nguy hại… Hiện nay, ô nhiễm môi trường đang là vấn đề cấp bách trên mỗi quốc gia và có rất nhiều phương án để khắc phục, giảm thiểu hậu quả của ô nhiễm môi trường. Rác thải sinh hoạt tại Việt Nam, nhất là tại các thành phố lớn chủ yếu được xử lý thô sơ bằng cách vùi tại các bãi chôn lấp, có nguy cơ gây ô nhiễm không khí và nguồn nước ngầm. Tỉnh Sóc Trăng hàng ngày có hơn 248,2 tấn rác thải; hiện nay tỉnh chưa có quy trình công nghệ xử lý rác đạt yêu cầu mà chủ yếu chỉ đổ vào bãi rác hở chờ phân hủy tự nhiên, vừa chiếm diện tích lớn vừa mất vệ sinh tạo nên những điểm nóng ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Chính điều này tác động lớn đến môi trường xung quanh, là nguy cơ tiềm ẩn những dịch bệnh cho con người và làm cho môi trường ngày càng ô nhiễm. Từ những lý do trên, đề tài nghiên cứu “Ứng dụng công nghệ sinh học xử lý rác hữu cơ phục vụ sản xuất nông nghiệp, tỉnh Sóc Trăng” góp phần bảo vệ môi trường hướng đến phát triển bền vững kinh tế - xã hội đi đôi với bảo vệ môi trường đã được thực hiện. 1.2 Mục tiêu của đề tài Phân lập và chọn lọc được các dòng vi khuẩn bản địa để xử lý rác hữu cơ và ứng dụng phân hữu cơ vi sinh trong sản xuất nông nghiệp tỉnh Sóc Trăng. 1.3 Nội dung của luận án Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein triển vọng từ ruột con sùng đất, trùn đất và các bãi rác trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng để chế tạo chế phẩm sinh học xử lý rác. Thử nghiệm xử lý rác thải hữu cơ bằng vi khuẩn của luận án và so sánh đối chiếu với một số chế phẩm ngoại nhập tại bãi rác Đại Ngãi thuộc bàn tỉnh Sóc Trăng. Rác thải hữu cơ sau xử lý được dùng làm phân hữu cơ vi sinh và bón thử nghiệm trên cây dưa leo ở Sóc Trăng. 1
1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 1.4.1 Những đóng góp mới Hai trăm mười ba dòng vi khuẩn bản địa đã được phân lập có khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein. Trong đó, hai mươi dòng có khả năng phân hủy cellulose, tinh bột và protein triển vọng nhất được định danh dựa vào đặc điểm hình thái, sinh hóa và kỹ thuật sinh học phân tử và đều thuộc chi Bacillus. Việc sử dụng những dòng vi khuẩn triển vọng của luận án thử nghiệm xử lý rác thải hữu cơ tại bãi rác Đại Ngãi cho kết quả khả quan và hiệu quả xử lý không thua kém những chế phẩm ngoại nhập. Việc thử nghiệm bón phân hữu cơ vi sinh trên cây dưa leo cho thấy phân hữu cơ vi sinh sau khi ủ với các dòng vi khuẩn triển vọng của luận án có hiệu quả ứng dụng nhất định. 1.4.2 Ý nghĩa khoa học Tuyển chọn được các dòng vi khuẩn bản địa có khả năng phân hủy cellulose, tinh bột, protein triển vọng từ các bãi rác, ruột con sùng đất và trùn đất thuộc tỉnh Sóc Trăng. Xây dựng được cây phả hệ, mô tả mối quan hệ di truyền giữa các dòng vi khuẩn đã giải trình tự. Các kết quả khoa học của luận án có thể sử dụng bổ sung tài liệu tham khảo về nhóm vi khuẩn phân hủy cellulose, tinh bột và protein và có thể bổ sung giáo trình giảng dạy vi sinh vật môi trường cho Đại học, Cao học và Nghiên cứu sinh. 1.4.3 Ý nghĩa thực tiễn Luận án đã phân lập được nhiều dòng vi khuẩn phân hủy cellulose, tinh bột và protein triển vọng có thể dùng để xử lý rác hữu cơ. Bón phân hữu cơ vi sinh của luận án cho cây dưa leo giúp giảm lượng phân hóa học so với cách trồng cũ ở địa phương. Phân hữu cơ vi sinh từ luận án có thể được sử dụng trong thực tiễn vì có hiệu quả nhất định và thân thiện với môi trường. 1.5 Cách tiếp cận và giả thuyết khoa học Vi khuẩn phân hủy cellulose, tinh bột và protein được phân lập trên môi trường của Shengwei et al. (2012) và được kiểm tra các đặc điểm hình thái và sinh hoá theo mô tả của Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2002). Hoạt tính enzyme endoglucanase, exoglucanase và amylase được xác định bằng phương pháp Nelson-Somogyi (Nelson, 1944). Hoạt tính protease được xác định bằng phương pháp của Cupp-Enyard (2008). 2
Các kỹ thuật sinh học phân tử dùng trong định danh loài vi khuẩn gồm ly trích DNA (Carr and Kaguni, 2001), phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA (Lane, 1991), điện di và giải trình tự. Cây phả hệ được xây dựng dựa trên khoảng cách tiến hóa bằng phần mềm phân tích MEGA.5 (Tamura et al., 2011). Hàm lượng C, N, P, K trong phân hữu cơ vi sinh được đánh giá dựa theo tiêu chuẩn của TCVN 7185:2002 về chất lượng phân hữu cơ vi sinh thành phẩm. Sử dụng phân hữu cơ vi sinh trồng dưa leo, so sánh năng suất và chất lượng trái dưa leo với cách trồng ở địa phương (Trần Thi Lệ và Nguyễn Hồng Phương, 2009). Số liệu được xử lý thống kê với phần mềm Minitap 17 với phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) và kiểm định Fisher (LSD). 1.6 Kết cấu của luận án Luận án có 3 phần: - Phần đầu (Tóm tắt, abstract, mục lục, ...): 10 trang. - Phần chính luận án gồm 5 chương: + Chương 1: Giới thiệu: 3 trang; + Chương 2: Tổng quan tài liệu: 19 trang; + Chương 3: Phương tiện và phương pháp nghiên cứu: 15 trang; + Chương 4: Kết quả và thảo luận: 48 trang; + Chương 5: Kết luận : 1 trang. - Phần cuối: + Tài liệu tham khảo: 11 trang; + Phụ lục: 40 trang. 3
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình rác thải 2.1.1 Tình hình rác thải trên thế giới Trên thế giới, việc xử lý rác thải được các nước rất quan tâm và thực hiện một cách nghiêm ngặt phải đáp ứng các tiêu chuẩn đối với môi trường. Một số nước tiên tiến đã đưa ra các biện pháp tối ưu, áp dụng nhiều kỹ thuật khoa học tiên tiến để tái chế, tái sử dụng các loại rác thải thành sản phẩm có giá trị sử dụng thực tế. Thêm vào đó, với sự phát triển của Công nghệ sinh học, đặc biệt là vi sinh vật học, các nhà nghiên cứu đã ứng dụng thành công nhiều vi sinh vật trong việc xử lý môi trường. Các loại vi sinh vật có khả năng tạo ra các hệ enzyme giúp chúng lên men phân hủy rác thải. 2.1.2 Tình hình rác thải ở Việt Nam Theo báo cáo hiện trạng môi trường tỉnh Sóc Trăng (2016), ở Việt Nam, rác thải được xử lý bằng biện pháp đơn giản phổ biến là tái chế, đốt, chôn lấp hoặc ủ phân tùy loại rác. Các loại rác như nylon, bìa giấy, chai nhựa, …là các loại rác khó phân hủy được tái chế để dùng làm nguyên liệu cho quá trình sản xuất các sản phẩm giấy và nhựa thứ cấp, còn các loại rác vô cơ được tái chế thành vật liệu xây dựng nhẹ cấp thấp được dùng cho các công trình cảnh quan đô thị. Đối với những loại rác hữu cơ dễ phân hủy và đồng nhất thì thường được ủ phân làm phân bón hữu cơ dùng cho cây trồng. 2.1.3 Tình hình rác thải ở Sóc Trăng Rác thải sinh hoạt tập trung chủ yếu tại thành phố Sóc Trăng, thị trấn và thị tứ thuộc các huyện trên địa bàn tỉnh và chiếm tỷ lệ khoảng 22% với khoảng 248,2 tấn/ngày. Do còn nhiều khó khăn như thiếu kinh phí đầu tư, thiếu trang thiết bị thu gom và thiếu công nghệ xử lý nên vấn đề ô nhiễm môi trường từ rác thải diễn ra thường xuyên, tạo áp lực cho quá trình phát triển kinh tế - xã hội, ảnh hưởng xấu tới sức khỏe dân cư và mỹ quan đô thị. Rác thải thải sinh hoạt phát sinh từ nhiều nguồn khác nhau như đời sống của dân cư, các khu dịch vụ, các khu vực chợ, trung tâm thương mại, các địa điểm du lịch, các cơ sở tiểu thủ công nghiệp, hoạt động sản xuất nông nghiệp và các làng nghề. Tổng lượng rác thải sinh hoạt phát sinh trên địa bàn tỉnh khoảng hơn 6.169.258,3 tấn/năm và hơn 80% là rác hữu cơ dễ bị phân hủy (Bảng 2.1, Bảng 2.2, Bảng 2.3 và Bảng 2.4). 4
Bảng 2.1: Sự phát sinh và thu gom rác thải nông thôn ở tỉnh Sóc Trăng Dân số Chỉ số phát sinh Khối lượng Khối lượng Tỷ lệ thu Huyện, thị xã nông rác thải2 phát sinh3 thu gom4 gom5 thôn1 (kg/người/ngày) (tấn/ngày) (tấn/ngày) (%) Vĩnh Châu 78.105 0,3 23,4 15,2 (3) 64,9 Ngã Năm 31.670 0,3 9,5 1,7 (4) 17,9 Kế Sách 128.785 0,3 38,6 2,7 7,0 Long Phú 79.690 0,3 23,9 1,0 4,2 Mỹ Xuyên 122.288 0,3 36,7 10,3 28,1 Thạnh Trị 56.522 0,3 16,9 2,4 14,2 Trần Đề 99.398 0,3 29,8 7,6 25,5 Châu Thành 83.377 0,3 25,0 9,7 38,8 Mỹ Tú 92.375 0,3 27,7 1,0 3,6 Cù Lao Dung 55.584 0,3 16,7 0,6 3,6 Tổng cộng 52,2 21,0 Ghi chú: (1) Số liệu của Cục thống kê tỉnh Sóc Trăng, năm 2015; (2) Chỉ số phát sinh rác thải sinh hoạt nông thôn: Tính theo Báo cáo môi trường quốc gia Chất thải rắn, 2011; (3) Số liệu của Xí nghiệp quản lý công trình đô thị thị xã Vĩnh Châu; (4) Số liệu của Xí nghiệp quản lý công trình đô thị Thị xã Ngã Năm. Bảng 2.2: Tổng hợp phân loại rác thải ở chợ trung tâm TP. Sóc Trăng Thành phần rác Mẫu phân loại Tỷ lệ tính trên giá trị trung bình (%) Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Giấy 15,0 20,0 23,0 0,42 Chai nhựa 12,0 18,0 12,0 0,30 Xương 10,0 22,0 20,0 0,37 Bọc nilon 280,6 439,4 432,4 8,26 Thủy tinh 10,0 16,0 15,0 0,29 Bao bì 15,0 18,0 22,0 0,39 CTNH 0,4 0,8 0,8 0,01 Rác hữu cơ (rau củ, trái cây hư,…) 3.659,6 4.390,4 4.493,8 89,92 Lông (heo, gà, vịt), đầu tép 1,0 1,5 1,8 0,03 Tổng rác (kg) 4.003,6 4.926,1 5.020,8 100,00 Nguồn: Báo cáo hiện trạng môi trường chợ tỉnh Sóc Trăng 2016. 5
Bảng 2.3: Tổng hợp phân loại rác thải tại chợ thị trấn Mỹ Xuyên Mẫu phân loại Tỷ lệ tính trên Thành phần rác Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 gía trị trung bình (%) Giấy 16,6 15,5 18,0 1,33 Chai nhựa 6,0 7,5 10,0 0,62 Xương 2,4 3,2 3,6 0,24 Bọc nilon 101,2 115,8 110,0 8,68 Thủy tinh 5,5 4,5 5,0 0,40 Bao bì 15,0 14,8 13,0 1,14 CTNH 0,6 0,8 0,6 0,05 Rác hữu cơ (rau củ, trái cây 1.100,8 1.032,4 1.109,5 86,08 hư,…) Lông (heo, gà, vịt), đầu tép 18,2 20,0 16,5 1,45 Tổng rác (kg) 1.266,3 1.214,5 1.286,2 100,00 Nguồn: Báo cáo hiện trạng môi trường chợ tỉnh Sóc Trăng 2016. Bảng 2.4: Tổng hợp phân loại rác thải tại chợ thị trấn Trần Đề Mẫu phân loại Tỷ lệ tính trên Thành phần rác Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 giá trị trung bình (%) Giấy 12.0 14,0 13,5 1,55 Chai nhựa 3,8 4,5 3,5 0,46 Xương 2,0 1,6 1,8 0,21 Bọc nilon 74,5 86,6 80,8 9,47 Thủy tinh 2,0 4,4 3,0 0,37 Bao bì 7,0 12,5 10,0 1,15 CTNH 0,4 0,5 0,4 0,05 Rác hữu cơ (rau củ, trái cây hư,…) 711,5 740,4 725,3 85,22 Lông (heo, gà, vịt), đầu tép 12,4 15,0 11,5 1,52 Tổng rác (kg) 825,6 879,5 849,8 100,00 Nguồn: Báo cáo hiện trạng môi trường chợ tỉnh Sóc Trăng 2016 Rác thải sinh hoạt từ nơi phát thải được thu gom và vận chuyển đến bãi rác Sóc Vồ, phường 7, thành phố Sóc Trăng, tỉnh Sóc Trăng để phân loại và xử lý. Rác hữu cơ dễ phân hủy được xử lý bằng phương thức phun trực tiếp chế phẩm sinh học được các phòng Tài nguyên và Môi trường các huyện trong tỉnh Sóc Trăng cung cấp. Tuy nhiên công suất và hiệu quả xử lý từ các chế phẩm đó chưa đáp ứng được nhu cầu xử lý. 2.2 Sự phân hủy chất thải hữu cơ 2.2.1 Sự phân hủy cellulose Cellulose là đơn vị cấu thành của sinh khối thực vật, được tìm thấy trong tự nhiên, nhiều nhất là vách tế bào thực vật. Cellulose trong sinh khối thực vật có thể chiếm 35-50% khối lượng khô (Lynd et al., 1999). Cellulose là một chất đa phân tử có thể có đến 10.000 đơn phân β-D-glucose, nối với nhau bằng 6
cầu nối β-1,4-glycoside tạo thành chuỗi thẳng, nhóm hydroxyl của chuỗi thứ nhất tạo liên kết hydro với phân tử oxy của chuỗi bên cạnh, sự liên kết chặt chẽ giữa những chuỗi bên cạnh nhau hình thành cấu trúc tinh thể (crystalline) chắc chắn, rất khó phân hủy. Vì cấu trúc mạng lưới vững chắc nên không có một enzyme đơn lẻ nào có thể phân hủy hoàn toàn mà phải có sự phối hợp của một hệ thống enzyme (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2007). Theo Nguyễn Đức Lượng và ctv. (2004), một phân tử cellulose có cấu trúc không đồng đều gồm vùng kết tinh và vùng vô định hình. Đối với vùng kết tinh, cellulose có cấu trúc trật tự rất cao và rất bền vững. Endoglucanase chỉ có tác dụng trên bề mặt hệ sợi này. Còn đối với vùng vô định hình, cellulose có cấu trúc không bền và dễ bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài. Exoglucanase có thể phân hủy vùng này dễ dàng và làm thay đổi toàn bộ cấu trúc phân tử cellulose (Hình 2.1). Cellulose được phân hủy hoàn toàn nhờ sự phối hợp của các loại cellulase khác nhau gồm endoglucanase (1,4-β-D-glucan-4 glucanohydrolase), exoglucanase (1,4-β-D-glucan glucohydrolase) và cellobiase (β-glucosidase) (Teeri, 1997). Trong đó, endoglucanase chứa 418 acid amine, có trọng lượng phân tử 42-49 kDa, chúng tham gia phân hủy một cách ngẫu nhiên các liên kết β-1,4-glycoside trong phân tử cellulose để tạo ra các đoạn oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Exoglucanase cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose và giải phóng từng đơn vị glucose hoặc cellobiose. Trọng lượng phân tử của enzyme này từ 53-75 kDa. Enzyme cellobiase có trọng lượng phân tử khoảng 50-98 kDa, họat động ở pH 4,4-4,8, phân cắt cellobiose thành glucose (Saha et al., 2006) (Hình 2.1). Hình 2.1: Sự phân cắt cellulose bởi enzyme cellulase Nguồn: Saha et al. (2006) 7