Luận án tiến sĩ Vật lí: Thiết kế, tổng hợp một số sensor huỳnh quang từ dẫn xuất của cyanine và coumarin để xác định biothiol và Hg(II)

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:156

Thêm vào BST

Báo xấu

33
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án là nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng sensor L từ dẫn xuất của cyanine dựa trên phản ứng tạo phức và phản ứng trao đổi phức, nhằm phát hiện các biothiol và ion Hg(II). Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng sensor AMC từ dẫn xuất của coumarin phát hiện các biothiol, dựa trên phản ứng cộng Michael.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án tiến sĩ Vật lí: Thiết kế, tổng hợp một số sensor huỳnh quang từ dẫn xuất của cyanine và coumarin để xác định biothiol và Hg(II)

MỞ ĐẦU Glutathione (GSH), cysteine (Cys) và homocysteine (Hcy) là những hợp chất thiol đóng vai trò quan trọng trong các quá trình sinh học. Mức độ bất thường của các biothiol có liên quan đến nhiều loại bệnh như tổn thương gan, tổn thương da, Alzheimer, Parkinson, tim mạch, tiểu đường và HIV. Thủy ngân là một trong những chất gây ô nhiễm nguy hiểm và phổ biến, phát thải thông qua các hoạt động tự nhiên hoặc các hoạt động của con người, gây ảnh hưởng nghiêm trọng về sức khỏe con người bằng cách phá hoại hệ thống thần kinh trung ương và tuyến nội tiết, dẫn đến sự rối loạn về nhận thức và vận động. Vì vậy, việc xác định biothiol trong tế bào, hàm lượng thủy ngân trong các nguồn nước là rất quan trọng trong sự chẩn đoán sớm các bệnh liên quan, bảo vệ môi trường sống và hiện đang thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước. Có nhiều phương pháp đã được áp dụng phát hiện các biothiol và ion Hg(II) như phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp phổ khối lượng (MS), phương pháp sắc ký khí (GC), phương pháp phân tích điện hóa, phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (MAS) - phương pháp phân tích UV-Vis, phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) và phương pháp huỳnh quang… Trong đó, phương pháp huỳnh quang có nhiều ưu điểm hơn, đó là không đòi hỏi thiết bị máy móc đắt tiền, dễ thực hiện, ít tốn kém, và áp dụng phân tích cho nhiều đối tượng, đặc biệt có thể phân tích các chất trong tế bào sống. Phương pháp huỳnh quang được Giáo sư Anthony W. Czarnik ở Đại học Quốc gia Ohio nghiên cứu và đề xuất cách tiếp cận mới trong lĩnh vực sensor quang học vào năm 1992. Với những ưu thế của phương pháp huỳnh quang, nên trong nhiều năm qua, các nghiên cứu về sensor huỳnh quang nhằm phát hiện các ion kim loại, anion, đặc biệt các phân tử sinh học luôn thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học trong và ngoài nước với số lượng các sensor huỳnh quang mới được công bố ngày càng nhiều trên thế giới. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sensor huỳnh quang bắt đầu từ năm 2007 bởi tác giả Dương Tuấn Quang. Các sensor huỳnh quang đã được tác giả Dương Tuấn Quang công bố bao gồm: chemosensor phát 1
hiện ion Fe(III), F-, Cs+ và Cu(II) dựa trên calix[4]arene; chemosensor chứa vòng 1,2,3-triazole phát hiện Al(III) và chemosensor phát hiện ion Hg(II) từ dẫn xuất của chất phát huỳnh quang rhodamine. Để xác định các biothiol, các nghiên cứu đã thiết kế sensor huỳnh quang dựa trên các phản ứng đặc trưng của biothiol như phản ứng tạo vòng với aldehyde, phản ứng cộng Michael, phản ứng ghép nối peptide, phản ứng sắp xếp nhóm thế ở nhân thơm, phản ứng phân tách sulfonamide ester hoặc sulfonate ester, phản ứng phân tách disulfides. Ngoài việc sử dụng phản ứng đặc trưng của biothiol, phản ứng trao đổi phức (phức của chất huỳnh quang với ion Cu(II)…) cũng được sử dụng. Các nghiên cứu về sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II) đã dựa trên các phản ứng đặc trưng của ion Hg(II) như phản ứng tách loại lưu huỳnh và đóng vòng guanidine, phản ứng chuyển đổi nhóm thiocarbonyl thành nhóm carbonyl, phản ứng tách loại thiol,…và dựa trên phản ứng tạo phức giữa ion Hg(II) với các phối tử -O,- N,-S trong vòng hoặc ở mạch hở. Đến nay, nhiều chất phát huỳnh quang khác nhau đã được sử sụng để phát triển các sensor huỳnh quang. Tuy nhiên, từ những đặc tính huỳnh quang vượt trội, nên các dẫn xuất của cyanine và coumarin đã được sử dụng khá nhiều trong nghiên cứu phát triển các sensor huỳnh quang, trong đó có các sensor huỳnh quang phát hiện ion Hg(II), cũng như biothiol. Mặc dù có nhiều nỗ lực phát triển các sensor huỳnh quang để xác định các biothiol và ion Hg(II) nhưng đa phần các sensor này vẫn tồn tại một số hạn chế như sử dụng một lượng lớn dung môi hữu cơ, giới hạn phát hiện còn cao, có bước sóng phát xạ ngắn gây ảnh hưởng đến tế bào, và phản ứng giữa sensor với chất phân tích xảy ra chậm. Hiện nay, các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục nghiên cứu thiết kế các sensor huỳnh quang có độ nhạy và độ chọn lọc cao để phát hiện các biothiol và ion Hg(II). Đây là hướng nghiên cứu đang được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm rất lớn, có nhiều tiềm năng ứng dụng trong phân tích các đối tượng môi trường và trong y sinh học. 2
Với sự phát triển và hỗ trợ mạnh của công nghệ thông tin, vì thế, hoá tính toán đã trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu hoá học nói chung và nghiên cứu sensor huỳnh quang nói riêng. Nhiều tính chất lý, hoá đã được dự đoán chính xác, cũng như được làm sáng tỏ từ quá trình tính toán. Sự kết hợp hóa tính toán với nghiên cứu thực nghiệm là hướng nghiên cứu hiện đại. Bởi vì, tính toán lý thuyết nhằm định hướng cho thực nghiệm về thiết kế, tổng hợp và dự đoán đặc tính của sensor; thực nghiệm kiểm chứng, khẳng định những kết quả tính toán, trong một số trường hợp, kết quả thực nghiệm cũng định hướng cho tính toán trong việc nghiên cứu bản chất, cũng như giải thích rõ hơn cơ chế phản ứng. Sự kết hợp linh hoạt này giúp giảm thiểu thời gian thực nghiệm, tiết kiệm hóa chất và tăng khả năng thành công của nghiên cứu. Tuy nhiên, hiện vẫn còn rất ít sensor huỳnh quang nghiên cứu theo hướng này được công bố. Trước những thực trạng trên, chúng tôi thực hiện đề tài: "Thiết kế, tổng hợp một số sensor huỳnh quang từ dẫn xuất của cyanine và coumarin để xác định biothiol và Hg(II) ". Nhiệm vụ của luận án: - Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng sensor L từ dẫn xuất của cyanine dựa trên phản ứng tạo phức và phản ứng trao đổi phức, nhằm phát hiện các biothiol và ion Hg(II). - Nghiên cứu thiết kế, tổng hợp, đặc trưng và ứng dụng sensor AMC từ dẫn xuất của coumarin phát hiện các biothiol, dựa trên phản ứng cộng Michael. Những đóng góp mới của luận án: - Sensor L mới được thiết kế từ dẫn xuất cyanine đã được công bố, phát hiện chọn lọc ion Hg(II) dựa trên phản ứng tạo phức, hoạt động theo kiểu bật-tắt (ON-OFF); phức chất của Hg(II) với L (Hg2L2) phát hiện chọn lọc Cys dựa trên phản ứng trao đổi phức, hoạt động theo kiểu tắt-bật (OFF-ON). Giới phát hiện và giới hạn định lượng ion Hg(II) bằng L tương ứng là 11,8 μg/L và 39,3 μg/L hay 0,059 μM và 0,19 μM; giới phát hiện và giới hạn định lượng Cys bằng Hg2L2 tương ứng là 0,2 μM và 0,66 μM. 3
- Sensor AMC mới được thiết kế từ dẫn xuất coumarin đã được công bố, phát hiện chọn lọc Cys dựa trên phản ứng cộng Michael, hoạt động theo kiểu dựa trên sự biến đổi tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng. Giới phát hiện và giới hạn định lượng Cys được xác định tương ứng là 0,5 μM và 1,65 μM. - Sensor L và sensor AMC được nghiên cứu bằng sự kết hợp linh hoạt nghiên cứu tính toán hóa lượng tử với nghiên cứu thực nghiệm. Những đóng góp mới của luận án đã được công bố tại: - Dyes and Pigments, 2016, 131, pp. 301-306. - Chemistry Letters, 2017, 46, pp. 135-138. - Dyes and Pigments, 2018, 152, pp. 118-126. - Vietnam Journal of Chemistry, International Edition, 2017, 55, pp.700-707. - Hue Univerity Journal of Science: Natural Science, 2018, Vol.127, No. 1A, pp. 51-59. Cấu trúc của luận án gồm các phần sau: - Mở đầu - Chương 1: Tổng quan tài liệu - Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu - Chương 3: Kết quả và thảo luận - Những kết luận chính của luận án - Định hướng nghiên cứu tiếp theo - Danh mục các công trình liên quan đến luận án - Tài liệu tham khảo - Phụ lục 4
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan nghiên cứu về sensor huỳnh quang 1.1.1. Tình hình nghiên cứu sensor huỳnh quang Trong hóa học phân tích, phương pháp huỳnh quang có ưu điểm hơn các phương pháp quang học khác, đó là độ nhạy cao. Điều này là do sự phát xạ tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ thuận với nồng độ của chất phân tích; trong khi ở phương pháp trắc quang nồng độ của chất tỉ lệ thuận với độ hấp thụ, mà độ hấp thụ lại liên quan đến tỉ lệ giữa cường độ đo trước và sau khi chùm ánh sáng đi qua mẫu. Do đó, đối với huỳnh quang, sự tăng cường độ của chùm tia tới sẽ dẫn đến sự phát ra tín hiệu huỳnh quang mạnh, trong khi đó điều này không xảy ra ở phương pháp đo độ hấp thụ. Các kỹ thuật đo huỳnh quang có thể xác định nồng độ nhỏ hơn một triệu lần so với phương pháp đo độ hấp thụ. Năm 1992, Anthony W. Czarnik lần đầu tiên đưa ra khái niệm chemodosimeter như là phân tử phi sinh học và đề xuất cách tiếp cận mới trong lĩnh vực sensor quang học để nhận dạng chất phân tích. Ông và nnc đã trình bày một chemodosimeter phát hiện ion Cu(II) dựa trên phản ứng mở vòng dẫn xuất rhodamine-B [17]. Thời gian đầu, các công trình nghiên cứu về chemosensor và chemodosimeter (gọi chung là sensor huỳnh quang) chủ yếu được thiết kế để xác định ion kim loại, sau đó chúng được phát triển để xác định các anion. Trong thời gian gần đây, các nhà khoa học đã thiết kế được những chemosensor và chemodosimeter để xác định các phân tử, đặc biệt là phân tử sinh học. Đến nay, trên thế giới hầu như tuần nào cũng có sensor huỳnh quang mới được công bố [138]. Điều này là do các sensor huỳnh quang thường nhạy, dễ thực hiện và ít tốn kém [120] so với các phương pháp truyền thống như phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, phương pháp phổ khối lượng, phương pháp sắc ký khí, phương pháp phân tích điện hóa, phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử - phương pháp phân tích UV-Vis, phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) trong việc phân tích các chất. Các nghiên cứu về sensor huỳnh quang nhằm mục đích phân tích nhiều đối 5
tượng khác nhau. Những nghiên cứu đã công bố có thể phát hiện chọn lọc các ion kim loại như Hg(II), Cu(II), Fe(II), Fe(III), Al(III),…[63], [74], [75], [78], [82], [120]. Một số sensor huỳnh quang có thể phát hiện các ion kim loại trong tế bào sống như ion Fe(III) trong tế bào gan [82], ion Cu(II) trong tế bào HepG2 [63], ion Hg(II) trong tế bào PC3 [78],… Ngoài ra, các sensor huỳnh quang còn có thể phát hiện các anion như bisulfite [111], sulfite [47], acetate, benzoate, cyanide, fluoride [26],…So với ion kim loại và anion, tuy việc phát triển chemosensor và chemodosimeter ứng dụng trong phân tích phân tử, đặc biệt là phân tử sinh học bắt đầu muộn hơn, nhưng số lượng các công trình đặc biệt tăng lên trong thời gian gần đây, kết quả nghiên cứu về chemosensor và chemodosimete cho thấy các sensor huỳnh quang này phát hiện nhanh, nhạy, chọn lọc các biothiol [33], [35], [45], [60], [65], [89], [90], [93], [141], [144], [169], [177], [178],[180], [181],[185], [187]. Các công trình khoa học liên quan đến lĩnh vực chemodosimeter và chemosensor huỳnh quang của các nhà khoa học Việt Nam công bố trên các tạp chí quốc tế còn rất ít. Sensor huỳnh quang đã được tác giả Dương Tuấn Quang nghiên cứu kể từ năm 2007. Đến nay đã có một số tác giả khác nghiên cứu về lĩnh vực này. Các sensor huỳnh quang đã được tác giả Dương Tuấn Quang và nnc công bố bao gồm: chemosensor phát hiện ion Fe(III) dựa trên sự biến đổi tỉ lệ phát xạ monomer/excimer từ các nhóm pyren gắn với calix[4]arene [73]; chemosensor phát hiện ion F(I) và ion Cs(I) dựa trên calix[4]arene với 2,3-naphthocrown-6 và coumarin amide [84]; chemosensor phát hiện ion Cu(II) dựa trên calix[4]arene và coumarin [119]; chemosensor chứa vòng 1,2,3-triazole dùng để phát hiện ion Al(III) [75]; và chemosensor phát hiện ion Hg(II) dựa trên dẫn xuất của rhodamine [121]. Tác giả Nguyễn Khoa Hiền và nnc đã thiết kế và tổng hợp chemosensor huỳnh quang từ dẫn xuất của dimethylaminocinnamaldehyde với aminothiourea để xác định đồng thời ion Ag(I), ion Hg(II) và ion Cu(II) [42] và chemodosimeter dựa trên hệ liên hợp dansyl-diethylenetriamine-thiourea phát hiện chọn lọc ion Hg(II) [43], các sensor này hoạt động theo kiểu ON-OFF; tác giả Phan Tứ Quý và nnc đã thiết kế và tổng hợp chemosensor huỳnh quang từ dẫn xuất của rhodamine phát hiện chọn lọc ion Hg(II) dựa trên phản ứng tạo phức và phản ứng đặc trưng của ion Hg(II) và 6
chemodosimeter từ dẫn xuất của fluorescein phát hiện chọn lọc ion Hg(II) dựa trên phản ứng tạo phức và phản ứng đặc trưng của ion Hg(II), tất cả hoạt động kiểu tắt- bật (OFF-ON) huỳnh quang theo các cơ chế khác nhau. 1.1.2. Nguyên lý hoạt động của sensor huỳnh quang Năm 2010, tác giả Dương Tuấn Quang và Jong Seung Kim trình bày nguyên lý hoạt động của chemosensor và chemodosimeter [120] được mô tả ở Hình 1.1. Theo các tác giả, khi chemosensor tương tác với chất phân tích, đã xảy sự phối trí giữa chemosensor với chất phân tích, kết quả tạo thành một cấu trúc phát tín hiệu duy nhất (Hình 1.1a), hoặc hình thành một cấu trúc phát tín hiệu và một cấu trúc không phát tín hiệu (Hình 1.1b). Các phản ứng này là thuận nghịch. Trong khi đó, khi chemodosimeter tương tác với chất phân tích gây ra phản ứng không thuận nghịch, trong đó chất phân tích liên kết cộng hóa trị với một hay nhiều nguyên tử hình thành một cấu trúc phát tín hiệu và một cấu trúc không phát tín hiệu, các cấu trúc này khác về mặt hóa học so với chemodosimeter ban đầu. Chất phân tích có thể liên kết với một trong hai cấu trúc trên (Hình 1.1c và 1.1d). Hình 1.1. Nguyên lý hoạt động chemosensor (a, b) và chemodosimeter (c, d) [120] Các sensor huỳnh quang hoạt động theo nguyên lý trên đã biến đổi từ trạng thái không phát huỳnh quang sang phát huỳnh quang (hay còn gọi là kiểu “tắt-bật” hoặc “turn on”, “OFF-ON”). Bên cạnh đó, công bố [142] gần đây cho thấy, một số sensor huỳnh quang hoạt động theo kiểu ngược lại (hay còn gọi là kiểu “bật-tắt” hoặc “turn off”, “ON-OFF”). Vì vậy, có thể khái niệm, sensor phân tử (gồm chemodosimeter và chemosensor) dùng để phát hiện các chất phân tích dựa trên sự 7
thay đổi tín hiệu huỳnh quang trước và sau khi phản ứng với chất phân tích. Nếu sensor huỳnh quang phản ứng thuận nghịch với chất phân tích được gọi là chemosensor. Trái lại, sensor huỳnh quang phản ứng không thuận nghịch với chất phân tích được gọi là chemodosimeter. 1.1.3. Cấu tạo của sensor huỳnh quang Hình 1.2 trình bày cấu tạo thông thường của một sensor huỳnh quang. Theo đó, gồm ba thành phần chính “ﬂuorophore-spacer-receptor”. Trong đó, fluorophore là tiểu phần liên quan đến sự thay đổi tín hiệu huỳnh quang; receptor là tiểu phần phản ứng hoặc tạo liên kết với chất phân tích; spacer là tiểu phần cầu nối và truyền dẫn tín hiệu giữa receptor và fluorophore [138]. Các sensor loại này thường hoạt động theo cơ chế PET, FRET. Một ví dụ về sensor huỳnh quang có cấu tạo đầy đủ ba thành phần (Hình 1.3), được Nguyễn Khoa Hiền và nnc báo cáo dùng để phát hiện ion Hg(II) [43]. Hình 1.2. Cấu tạo của một sensor huỳnh quang [138] Hình 1.3. Sensor huỳnh quang kiểu “fluorophore-spacer-receptor” [43] Dựa trên nguyên tắc đó, các sensor huỳnh quang có thể được cấu tạo gồm 8
nhiều fluorophore hoặc nhiều receptor theo kiểu fluorophore-[spacer-receptor]n, [fluorophore-spacer]n-receptor hoặc [fluorophore]n-spacer-[receptor]n…[117], [183]. Ngoài ra, một số sensor huỳnh quang có thể chỉ được cấu tạo bởi fluorophore-receptor [188], các sensor loại này thường hoạt động theo cơ chế ICT. 1.1.4. Nguyên tắc thiết kế các sensor huỳnh quang Để thiết kế các sensor huỳnh quang phù hợp vào việc ứng dụng phân tích các chất thì tính chất huỳnh quang của nó (bao gồm cả hiệu suất lượng tử huỳnh quang, bước sóng và thời gian sống) phải thay đổi sau khi tương tác với chất phân tích. Do đó, cần khảo sát tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất huỳnh quang. Những yếu tố đó chủ yếu dựa trên các nguyên tắc sau (chi tiết được trình bày ở Phụ lục 1) [51], [146], [172]: Mức độ liên hợp của hệ thống electron π; Ảnh hưởng của nhóm thế; Sự chuyển điện tích nội phân tử (ICT); Sự chuyển điện tích nội phân tử xoắn (TICT); Sự chuyển electron do cảm ứng ánh sáng (PET); Sự chuyển proton nội phân tử ở trạng thái kích thích (ESIPT); Sự chuyển năng lượng cộng hưởng Forster (FRET). 1.2. Vai trò của các biothiol trong tế bào và các phương pháp phát hiện 1.2.1. Các biothiol và vai trò của chúng Các hợp chất hữu cơ có chứa nhóm sulfhydryl hay nhóm thiol (nhóm -SH) được gọi là các hợp chất thiol, trước đây thường gọi là mecaptan. Biothiol là các phân tử thiol sinh học, trong đó quan trọng nhất gồm cysteine (Cys), glutathione (GSH) và homocysteine (Hcy) (Hình 1.4). Các biothiol đóng vai trò quan trọng trong các quá trình sinh học. Quá trình trao đổi chất và vận chuyển các hợp chất biothiol trong các hệ thống sinh học có liên quan chặt chẽ đến một loạt các enzyme và protein quan trọng. Sự thiếu hụt hoặc quá mức nồng độ nội sinh các biothiol dẫn đến thay đổi các điều kiện bệnh lý khác nhau. Sự dao động này còn thể hiện trạng thái chức năng của các enzymn tương ứng và có liên quan đến các bệnh lý [13], [24], [75], [96], [162]. Ví dụ, Cys được xem như là một nucleophile lý tưởng trong xúc tác enzyme cho phản ứng (oxy hóa khử) chuyển đổi thuận nghịch để duy trì giữa cấu trúc 9
protein bậc ba và bậc bốn thông qua hình thành disulfide trong điều kiện sinh lý [114]. Sự thiếu hụt Cys có thể gây ra các bệnh lý như tăng trưởng chậm, hôn mê, tổn thương gan, tổn thương da và phá hủy sắc tố tóc [18]; GSH đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì môi trường oxy hóa trong các tế bào sống [52], [122] [177]. GSH có tác dụng bảo vệ tế bào chống lại các chất bài tiết, cũng như các chất độc hại tự nhiên như các gốc tự do và hydroperoxide. Sự suy giảm nồng độ GSH có liên quan đến một số bệnh ở người như bệnh ung thư, thoái hóa thần kinh và bệnh tim mạch [5]; Nồng độ Hcy trong huyết thanh cao là yếu tố dẫn đến nguy cơ cao mắc bệnh Alzheimer, bệnh tim mạch, viêm đại tràng, dị tật bẩm sinh và bệnh suy giảm trí nhớ ở người cao tuổi [124], [134], [147]. (a) (b) (c) (H) (C) (N) (S) (O) Hình 1.4. Hình học bền của Cys (a), Hcy (b) và GSH (c) ở mức lý thuyết B3LYP/LanL2DZ 1.2.2. Phương pháp phát hiện các biothiol Do tầm quan trọng của các phân tử thiol sinh học, việc nghiên cứu các phương pháp mới để phát hiện các biothiol đã và đang được các nhà khoa học quan tâm. Có rất nhiều phương phân tích khác nhau đã được sử dụng để phát hiện các biothiol, chẳng hạn như sắc ký lỏng hiệu năng cao, phổ khối lượng [36], sắc ký khí 10
[14], phân tích điện hóa [44], [103] và phân tích UV-Vis [4], [57]. Ngoại trừ, phương pháp UV-Vis sử dụng máy móc thiết bị đơn giản, rẻ tiền và dễ thực hiện, song thường kém nhạy hơn; các phương pháp còn lại thường dùng máy móc thiết bị hiện đại, đắt tiền và thực hiện bởi những chuyên gia được đào tạo, có kinh nghiệm. Trong khi đó, phương pháp phân tích huỳnh quang thường sử dụng máy móc thiết bị rẻ tiền, đơn giản, dễ thực hiện, đặc biệt có thể tầm soát các chất này trong các tế bào sống [120]. 1.3. Nguồn ô nhiễm, độc tính, phương pháp phát hiện ion Hg(II) 1.3.1. Nguồn ô nhiễm, độc tính của ion Hg(II) Trong số các kim loại nặng độc hại, thủy ngân là mối quan tâm lớn trong các kim loại nặng độc hại và phong phú nhất trong lớp vỏ của Trái Đất [132]. Thủy ngân (Hg) tồn tại trong môi trường gồm các dạng nguyên tố, vô cơ và hữu cơ. Thủy ngân nguyên tố và thủy ngân vô cơ thải vào môi trường chủ yếu từ khai thác mỏ, luyện kim, hoạt động công nghiệp và quá trình đốt cháy nhiên liệu hóa thạch. Thủy ngân hữu cơ trong môi trường chủ yếu là do quá trình vi sinh vật phân giải thủy ngân vô cơ ở trầm tích biển thành methylmercury [6]. Ngoài ra, thủy ngân còn phát thải vào môi trường từ các nguồn khác như hỗn hống nha khoa, mỹ phẩm và dược phẩm [56]. Ở nồng độ mức ppb, các ion thủy ngân có thể gây ra những tác động tiêu cực đến môi trường, động vật, thực vật và con người. Đối với con người, thủy ngân có thể gây ra những thay đổi trong cấu trúc của ADN và gây hại cho não, viêm nướu, viêm miệng, hệ tiêu hóa và rối loạn thần kinh, thậm chí tử vong. Nó cũng được cho là có liên quan với sẩy thai và dị tật bẩm sinh [6]. 1.3.2. Phương pháp phát hiện ion Hg (II) Có nhiều phương pháp phát hiện ion này như phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử [26], phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) [32], phương pháp von-ampe hòa tan [95],… Các phương pháp AAS, von-ampe hòa tan,… thường nhạy, có thể phát hiện ion Hg(II) đến nồng độ ppb. Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi thiết bị đắt tiền và các thao tác mất nhiều thời gian. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử sử dụng máy móc thiết bị đơn giản, rẻ tiền và dễ thực 11
hiện, song thường kém nhạy hơn. Để phát hiện ion Hg(II) ở mức nồng độ ppb bằng quang phổ hấp thụ phân tử thường phải kết hợp với các phương pháp làm giàu như tách chiết [145], hoặc động học xúc tác,… [123]. 1.4. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol 1.4.1. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng tạo vòng với các aldehyde Phản ứng tạo vòng giữa Cys/Hcy với aldehyde tạo thành thiazolidines/ thiazinanes (Hình 1.5) đã được sử dụng để thiết kế các sensor huỳnh quang phát hiện Cys/Hcy trong sự có mặt của GSH. Hình 1.5. Phản ứng giữa fluorophore có chứa aldehyde với Cys/Hcy tạo thành thiazolidines/thiazinanes [92] 1 Huỳnh quang mạnh Huỳnh quang yếu Hình 1.6. Sensor 1 phát hiện Cys/ Hcy dựa trên phản ứng đóng vòng với aldehyde [108] Năm 2004, Strongin và nnc đã thiết kế sensor 1 phát hiện chọn lọc Cys/Hcy so với GSH (Hình 1.6). Sensor 1 được dùng để phát hiện Cys và Hcy trong huyết tương. Khi thêm Cys vào mẫu huyết tương có chứa 1 và một lượng dư GSH, phổ hấp thụ có sự chuyển dời đỏ từ bước sóng 480 nm về bước sóng 505 nm và giảm cường độ huỳnh quang với sự gia tăng nồng độ Cys. Cường độ huỳnh quang của 12
huyết tương chứa sensor 1 có quan hệ tuyến tính chặt chẽ với nồng độ Hcy trong phạm vi từ 2,9 µM đến 2,5 mM) [108]. 2 Huỳnh quang yếu Huỳnh quang mạnh Hình 1.7. Sensor 2 và 3 phát hiện Cys/Hcy dựa trên phản ứng đóng vòng với aldehyde [108] Với cơ chế này, Barbas và nnc đã thiết kế sensor 2 và 3 (Hình 1.7) phát hiện Cys và Hcy. Cys phản ứng với sensor 2 và làm tăng cường độ huỳnh quang của dung dịch ở bước sóng 380 nm, hoạt động theo kiểu OFF-ON, phát hiện Cys ở khoảng nồng độ từ 100 µM đến 5 mM trong sự có mặt của GSH. Ở trạng thái tự do, sensor 3 có sự chuyển dịch điện tử nội phân tử (ICT) mạnh từ tiểu phần phenanthroimidazole giàu electron sang tiểu phần aldehyde thiếu hụt electron, phổ huỳnh quang có bước sóng phát xạ cực đại ở 519 nm. Khi thêm Cys/Hcy vào dung dịch chứa sensor 3, phổ huỳnh quang của sensor 3 có bước sóng cực đại chuyển từ 519 nm về 394 nm (dịch chuyển mạnh đỉnh phát xạ phát 125 nm), hoạt động dựa trên sự biến đổi tỷ lệ cường độ huỳnh quang. Điều này là do phản ứng giữa Cys/Hcy với sensor 3 tạo vòng thiazolidine/thiazinane và loại bỏ nhóm -CHO, dẫn đến dập tắt ICT. Tỷ lệ cường độ huỳnh quang (I394nm/I519nm) có quan hệ tuyến tính tốt với nồng độ Cys từ 6 µM đến 800 µM [163]. 1.4.2. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng cộng Michael Phản ứng cộng Michael giữa Cys/Hcy vào acrylate hình thành thioester với vòng dị tố S, N chứa 7 hoặc 8 nguyên tử (1,4-thiazepane) đã được sử dụng từ năm 13
1966 trong tổng hợp hữu cơ (Hình 1.8). Đến năm 2011, phản ứng này được nhóm Strongin ứng dụng rộng rãi để phát hiện Cys/Hcy, với việc sử dụng acrylic ester của các fluorophore phổ biến như fluorescein, hydroxylated coumarin, naphthalimide và cyanine. Trong sự hiện diện của Cys, Hcy hoặc GSH, một thioester được hình thành bằng phản ứng cộng vào liên hợp acrylic este. Đối với Cys và Hcy, quá trình xảy ra tiếp sau đó là giải phóng fluorophore tự do, ngược lại với GSH thì thioester được hình thành thường bền. Sự khác biệt giữa Cys và Hcy thường được dựa trên thời gian của phản ứng, trong đó Cys thường giải phóng fluorophore nhanh hơn so với Hcy [92]. n=1: nhanh n=2: chậm Hình 1.8. Các sensor phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng cộng liên hợp với acrylic ester [108] Trên cơ sở đó, các nnc đã thiết kế các sensor 4-6 từ dẫn xuất của fluorescein có chứa vòng spirocyclic (không màu và không phát huỳnh quang) để phát hiện Cys (Hình 1.9). Khi bổ sung Cys vào dung dịch chứa sensor 4 hoặc 5, quá trình cộng vào liên hợp acrylic este xảy ra, tiếp theo là sự hình thành vòng dị tố và giải phóng fluorophore tự do. Đó là một hợp chất với cấu trúc mở vòng spirolacton, phát huỳnh quang mạnh mẽ ở bước sóng phát quang 518 nm, bước sóng kích thích 478 nm. Sensor 4 thể hiện sự chọn lọc đối với Cys tốt hơn so với sensor 5, điều này có thể là do sensor 4 trải qua quá trình cộng - tách kép (có hai nhóm thioether với acrylic). Giới hạn phát hiện của sensor 4 đối với Cys là 77 nM [53]. Sau khi sensor 6 phản ứng với Cys, dung dịch trở nên có màu hồng (bước sóng hấp thụ cực đại 550 nm) và phát huỳnh quang mạnh mẽ (bước sóng phát xạ 621 nm), trong khi đó sự có mặt của các amino acids khác và GSH đã không gây ra một sự thay đổi nào trong phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang. Điều này cho thấy sensor 6 có thể sử dụng để phát hiện chọn lọc Cys [165]. 14
hoặc 4 5 Không màu và không phát huỳnh quang λabs=478 nm λem =515 nm 6 Không màu và không phát huỳnh quang λabs=550 nm λem =621 nm Hình 1.9. Sensor 4-6 phát hiện Cys dựa trên phản ứng cộng liên hợp với acrylic ester [53], [165] 1.4.3. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng ghép nối peptide (Native chemical ligation, NCL) Sự trao đổi giữa các dạng thioester Chuyển đổi N→S acyl nội phân tử Hình 1.10. Cơ chế của quá trình Native chemical ligation [92] 15
Trong phương pháp này (Hình 1.10), nhóm thiol (-SH) và cặp electron không liên kết trên nguyên tử N trong tiểu phần cystein ở phần cuối của peptide B không được bảo vệ, tấn công vào nguyên tử C ở nối đôi trong tiểu phần thioester ở phần cuối của peptide A không được bảo vệ, dẫn đến tạo thành một thioester trung gian C. Tiếp đến, thioester trung gian C trải qua quá trình chuyển đổi N→S acyl nội phân tử để tạo nên sản phẩm D với việc hình thành một liên kết peptide [92]. Dựa trên cơ chế này, sensor huỳnh quang 7 hoạt động dựa trên sự biến đổi tỷ lệ cường độ huỳnh quang ở hai bước sóng đã được thiết kế với fluorophore là sự kết hợp giữa coumarin và benzopyrylium (Hình 1.11). Trong đó, nhóm phenyl thioester là nhóm phản ứng với Cys/Hcy do phản ứng NCL của nó nhanh hơn nhiều so với nhóm alkyl thioester. 7 Dạng hở, λem=694 nm Dạng hở, λem=694 nm Spirolactam λem=474 nm Hình 1.11. Sensor 7 phát hiện Cys/ Hcy dựa trên quá trình NCL [27] Khi bổ sung Cys vào dung dịch 7 trong ethanol/phosphate (40/60, v/v, pH= 7,4), dải hấp thụ ban đầu của sensor 7 tự do tại bước sóng 669 nm dần dần giảm, đồng thời xuất hiện và gia tăng một dải hấp hấp thụ mới ở bước sóng 423 nm. Màu của dung dịch đổi dần từ màu xanh đậm đến màu vàng-xanh lá cây, cho phép sử dụng để phát hiện Cys bằng mắt thường. Trong khi đó ở phổ huỳnh quang, dải phát 16
xạ ở bước sóng 694 nm giảm dần, đồng thời xuất hiện và tăng dần một dải phát xạ mới ở bước sóng 474 nm (ứng với đỉnh phát xạ của coumarin). Khoảng cách hai đỉnh phát xạ lên đến 220 nm, thuận lợi trong sử dụng 7 như là một sensor hoạt động dựa trên sự biến đổi tỉ lệ phát xạ huỳnh quang để phát hiện Cys/Hcy. GSH chỉ gây ra sự trao đổi thiol-thioester, dẫn đến không có sự thay đổi trong phổ huỳnh quang. Sự có mặt của các amino acids và ion kim loại hầu như không làm thay đổi đến phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của dung dịch 7. Kết quả, sensor 7 đã được sử dụng như một sensor huỳnh quang hoạt động dựa trên sự biến đổi tỷ lệ cường độ huỳnh quang dùng để phát hiện Cys/Hcy ở tế bào HepG2 trong cơ thể sống [27]. 1.4.4. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng sắp xếp lại nhóm thế ở nhân thơm Phản ứng sắp xếp lại nhóm thế ở nhân thơm đã được nghiên cứu như là một chiến lược trong thiết kế các sensor huỳnh quang dùng để phát hiện chọn lọc Cys/Hcy trong sự có mặt của GSH. Ở cơ chế này, chất huỳnh quang chứa một nhóm thế không ổn định (Leaving group, LG) phản ứng với thiol (Cys/Hcy) để tạo ra một thioether theo cơ chế thế nucleophilic vào nhân thơm (SNAr). Tiếp đến, các nhóm amino và thioether của Cys/Hcy xảy ra quá trình chuyển đổi để hình thành dẫn xuất amine, thông qua một trạng thái chuyển tiếp với vòng 5 hoặc 6 nguyên tử. Sự khác biệt tính chất quang lý giữa chất phát quang ban đầu, sản phẩm thiother thế, amino thế, cho phép phát hiện có chọn lọc GSH, Cys và Hcy (Hình 1.12). n=1: nhanh n=2: chậm LG: nhóm thế không ổn định Hình 1.12. Cơ chế các sensor phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng sắp xếp lại các nhóm thế ở nhân thơm [92] 17
Theo cơ chế này, các sensor 8-10 (Hình 1.13) đã được thiết kế dựa trên fluorophore là chất huỳnh quang boron-dipyrromethene (BODIPY). (a) Sensor phát hiện chọn lọc GSH trong sự có mặt của Cys/Hcy 8-S 8 8-N Huỳnh quang mạnh Huỳnh quang mạnh Huỳnh quang yếu, λem=564 nm λem=588 nm λem=556 nm (b) Sensor phát hiện riêng biệt GSH, Cys và Hcy Cys: nhanh Hcy: chậm 9-M 9a. X=S 9b. X=O Huỳnh quang mạnh Không có huỳnh quang λem=564 nm Huỳnh quang mạnh λem=588 nm (c) Sensor phát hiện đồng thời GSH, Cys và Hcy nhanh Huỳnh quang mạnh 10 λabs=568 nm, λem=588 nm Huỳnh quang mạnh Không có huỳnh quang λabs=443 nm, λem=530 nm Hình 1.13. Sensor 8-10 phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng sắp xếp lại các nhóm thế ở nhân thơm [93], [94] 18
Khi ở trạng thái tự do, trong dung dịch acetonitrile/HEPES (5/95, v/v, pH= 7,4), phổ huỳnh quang của sensor 8 phát xạ cực đại ở bước sóng 556 nm. Sensor 8 phản ứng với GSH tạo ra thioether 8-S phát xạ mạnh mẽ ở bước sóng cực đại là 588 nm. Tỷ lệ cường độ huỳnh quang tại các bước sóng phát xạ cực đại của 8-S và sensor 8 (I588nm/I556nm) có quan hệ tuyến tính chặt chẽ với nồng độ GSH (0 µM -60 µM). Sensor 8 có thể phát hiện định lượng GSH với giới hạn phát hiện là 0,086 µM. Ngược lại, sensor 8 phản ứng với Cys/Hcy tạo ra một amine 8-N với huỳnh quang hầu như không đáng kể ở bước sóng 564 nm. Điều này cho phép nó được sử dụng để xác định GSH trong sự có mặt của Cys/Hcy trong tế bào sống [93]. Các sensor 9a và 9b được thiết kế dựa trên việc thay thế nhóm thế Cl của sensor 8 bằng nitrophenol hoặc nitrothiophenol. Quá trình này dẫn đến dập tắt huỳnh quang của lõi BODIPY thông qua quá trình PET. Các sensor này phản ứng với Cys/Hcy để hình thành các dẫn xuất amine phát huỳnh quang mạnh mẽ ở bước sóng 564 nm. Trong đó, phản ứng với Hcy mất nhiều thời gian hơn so với Cys. Khác với Cys/Hcy, GSH phản ứng và thay thế nhóm nitrophenol, hoặc nitrothiophenol của sensor, hình thành sản phẩm thế phát huỳnh quang mạnh mẽ ở bước sóng 588 nm. Các kết quả này cho thấy có thể sử dụng các sensor 9a và 9b phát hiện riêng biệt GSH, Cys và Hcy [94]. Sensor 10 được thiết kế bằng cách gắn một nhóm rút electron imidazolium vào lõi BODIPY để tăng khả năng phản ứng thế nucleophilic ở vòng thơm. Nhờ đó, phản ứng giữa sensor 10 với Cys và Hcy lần lượt xảy ra chỉ trong vòng 5 giây và 2 phút, phát huỳnh quang mạnh với cường độ ổn định ở bước sóng 530 nm (bước sóng kích thích 443 nm). Trong khi đó, GSH phản ứng và thay thế cả nhóm imidazolium và nhóm nitrophenol/nitrothiophenol của sensor 10, hình thành sản phẩm dithioether phát huỳnh quang mạnh ở bước sóng 588 nm (bước sóng kích thích 568 nm). Sensor 10 có thể sử dụng để phát hiện đồng thời GSH, Cys và Hcy bằng cách sử dụng các bước sóng kích thích khác nhau tương ứng là 568 nm và 443 nm [94]. 1.4.5. Sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng phân tách sulfonamide ester hoặc sulfonate ester bởi thiol 19
Các phản ứng phân tách sulfonamide hoặc sulfonate ester bởi thiol (Hình 1.14) cũng được sử dụng như là một chiến lược quan trọng trong thiết kế các sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol [12], [58], [64], [99], [100], [135]. Đối với các sensor này, thông thường ban đầu khi ở dạng sulfonamide hoặc sulfonate ester thường không màu, không phát huỳnh quang. Quá trình phân tách chúng bởi thiol sẽ tạo ra các hợp chất màu và phát huỳnh quang mạnh mẽ. Hình 1.14. Cơ chế hoạt động của sensor huỳnh quang phát hiện các biothiol dựa trên phản ứng phân tách sulfonamide hoặc sulfonate ester Hình 1.15 trình bày sensor 11 đã được thiết kế dựa trên phản ứng phân tách sulfonate ester bởi thiol. Ở trạng thái tự do trong dung dịch đệm HEPES (10 mM, pH=7,4), sensor 11a và 11b hầu như không phát huỳnh quang, với hiệu suất lượng tử huỳnh quang xác định được lần lượt là 0,0007 và 0,0003 (so với 0,85 của chất chuẩn là X trong NaOH 0,1M). Phản ứng giữa sensor 11a và 11b với GSH, Cys hình thành X xảy ra khá nhanh, khoảng 10 phút. X phát xạ huỳnh quang mạnh mẽ ở bước sóng 560 nm, bước sóng kích thích 460nm. Hiệu suất lượng tử huỳnh quang của các chất Xa, Xb (a: R=H, b: R= CH3) là khá lớn, lần lượt là 0,75 và 0,58. Giới hạn phát hiện GSH, Cys bởi sensor 11 đã được xác định, lần lượt là 2 pM và 2 pM [99]. Sensor huỳnh quang 13 được thiết kế dựa trên phản ứng phân tách sulfonamide dùng để phát hiện các biothiol (Hình 1.16). Ở trạng thái tự do trong dung dịch methanol/nước (4/1, v/v), sensor 13 hầu như không phát huỳnh quang. Cys phản ứng khá nhanh (5 phút) với 13 và giải phóng 14 là một chất phát huỳnh quang mạnh ở bước sóng 562 nm (bước sóng kích thích 441 nm). Sensor 13 đã được nghiên cứu sử dụng để phát hiện Cys trong tế bào sống [58]. 20