Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết Dengue và chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:240

Thêm vào BST

Báo xấu

2
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Y học "Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết Dengue và chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA" trình bày các nội dung chính sau: Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue điều trị tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175 năm 2022; Chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp và đánh giá kết quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết Dengue và chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA

\ỉ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG -----------------*------------------- HOÀNG XUÂN CƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG NGƯỜI BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE VÀ CHẾ TẠO KHÁNG NGUYÊN NS1 TÁI TỔ HỢP GỘP 4 TÝP PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ KHÁNG VI RÚT DENGUE BẰNG KỸ THUẬT ELISA LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2024
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG -----------------*------------------- HOÀNG XUÂN CƯỜNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG NGƯỜI BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE VÀ CHẾ TẠO KHÁNG NGUYÊN NS1 TÁI TỔ HỢP GỘP 4 TÝP PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ KHÁNG VI RÚT DENGUE BẰNG KỸ THUẬT ELISA Chuyên ngành: Bệnh Truyền nhiễm và các bệnh nhiệt đới Mã số: 972 01 09 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Võ Thị Bích Thủy 2. TS. Trần Tất Thắng HÀ NỘI – 2024
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi. Một phần số liệu sử dụng trong luận án thuộc đề tài nghiên cứu có tên “Nghiên cứu chế tạo que thử sắc ký miễn dịch nano từ tính để phát hiện nhanh kháng nguyên NS1 của virut Dengue gây bệnh sốt xuất huyết trên địa bàn Hà Nội”. Mã số: 01C-08/01-2020-3”. Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tập thể mà tôi là Chủ nhiệm đề tài. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác./. Hà Nội, tháng 6 năm 2024 Tác giả Hoàng Xuân Cường
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được công trình nghiên cứu này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân, tổ chức. Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng cám ơn sâu sắc tới Đảng ủy, Ban Giám đốc Học viện quân y; Lãnh đạo, Chỉ huy Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương; cán bộ, nhân viên Phòng Khoa học và đào tạo, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương; Đảng ủy, Ban Giám đốc và cán bộ, nhân viên Khoa Truyền nhiễm, Khoa Vi sinh, Phòng Kế hoạch tổng hợp, Phòng Khoa học Quân sự, Trung tâm đào tạo và huấn luyện Bệnh viện Quân y 175; Đảng ủy, Ban Giám đốc và cán bộ, nhân viên Khoa Truyền nhiễm, Khoa Vi sinh, Phòng Kế hoạch tổng hợp, Ban Khoa học Quân sự Bệnh viện Quân y 103; Cán bộ, nhân viên Phòng Hệ gen học vi sinh, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam; Cấp ủy, Chỉ huy và cán bộ, nhân viên phòng Khoa học quân sự, Học viện Quân y; Đảng ủy, Ban Giám đốc và cán bộ, nhân viên Phân hiệu Phía Nam Học viện Quân y, ... đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện thu thập số liệu, triển khai và hoàn thành số liệu luận án. Đặc biệt, Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS.TS. Võ Thị Bích Thủy, Trưởng phòng Hệ gen học vi sinh, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam và PGS.TS. Cao Bá Lợi, Trưởng phòng Khoa học và đào tạo, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương, những người thầy cô đã tận tình, trực tiếp định hướng, chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận án này. Em xin chân thành cảm ơn: Các thầy, cô, các GS, PGS, TS trong các Hội đồng đánh giá chất lượng luận án đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp em sửa chữa và hoàn thiện luận án. Em xin gửi lời cảm ơn đến: PGS. TS. Hoàng Vũ Hùng – Nguyên Chủ nhiệm Bộ môn Truyền nhiễm, Bệnh viện Quân y 103; Trung tá PGS.TS. Đỗ
Như Bình, Phó Trưởng phòng Khoa học quân sự, Học viện Quân y và Trung tá TS. Vũ Tùng Sơn, Phó Chủ nhiệm Khoa Dịch tễ học Quân sự, Học viện Quân y – là những người thầy đã nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận án. Tôi xin cảm ơn chân thành tới Đề tài cấp Sở KH&CN Hà Nội “Nghiên cứu chế tạo que thử sắc ký miễn dịch nano từ tính để phát hiện nhanh kháng nguyên NS1 của virut Dengue gây bệnh sốt xuất huyết trên địa bàn Hà Nội”. Mã số: 01C-08/01-2020-3” đã tài trợ một phần kinh phí cho tôi thực hiện luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến: Bạn bè, đồng chí, đồng đội, đồng nghiệp đã giúp đỡ và động viên tôi rất nhiều trong quá trình học tập. Đặc biệt là Đại tá Lê Thế Hoạt (Cục Cán bộ, Tổng Cục Chính trị) – anh là người đầu tiên động viên, khích lệ, tạo mọi điều kiện và đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới Cha, Mẹ - người đã vất vả sinh thành và nuôi tôi khôn lớn để tôi có được kết quả như ngày hôm nay. Cảm ơn toàn thể gia đình anh em, họ hàng đã luôn sát cánh, động viên, giúp đỡ, chia sẻ khó khăn và truyền nhiệt huyết cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án; đặc biệt là vợ và các con tôi, là những người thân yêu nhất đã dành tất cả sự hy sinh chăm sóc, động viên, là động lực không nhỏ giúp tôi đạt được kết quả này. Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, tháng 6 năm 2024 Tác giả Hoàng Xuân Cường
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Phần viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt AST Aspartate transaminase ALT Alanine Transaminase Activated partial Thời gian thromboplastin APTT thromboplastin time được hoạt hoá từng phần Acquired Immune Deficiency Hội chứng suy giảm miễn AIDS Syndrome dịch mắc phải BV Bệnh viện NB Người bệnh BVQY Bệnh viện Quân y BSA Bovine Serum Albumin Huyết thanh bò CRP C-reactive protein Protein phản ứng C CS Cộng sự DHCB Dấu hiệu cảnh báo DENV Vi rút Dengue DNA Deoxyribonucleic Acid E.coli Escherichia coli Enzyme – linked Kỹ thuật miễn dịch gắn ELISA Immunosorbent Assay enzym HCT Hematocrit Indirect Immunofluorescence Xét nghiệm miễn dịch IFA Assay huỳnh quang Isopropyl β-D-1- Chất cảm ứng biểu hiện IPTG thiogalactopyranoside protein LB Luria Bertani Broth Môi trường nuôi cấy vi
Phần viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt khuẩn NS1 Nonstructural Protein 1 Protein không cấu trúc 1 OD Optical Density Mật độ quang PBS Phosphate – Buffered saline Dung dịch đệm Quantitative Reverse Phản ứng chuỗi qRT-PCR Transcription Polymerase polymerase phiên mã Chain Reaction ngược định lượng RNA Ribonucleic Acid rNS1 Recombinant NS1 NS1 tái tổ hợp SDS Sodium Dodecyl Sulfate SXHD Sốt xuất huyết Dengue WHO World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới
MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN ................................................................................. 4 1.1. Tổng quan bệnh sốt xuất huyết Dengue.................................................. 4 1.1.1. Khái niệm ........................................................................................ 4 1.1.2. Dịch tễ học ...................................................................................... 4 1.1.3. Cơ chế bệnh sinh sốt xuất huyết Dengue ........................................ 6 1.2. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng sốt xuất huyết Dengue ...................... 7 1.2.1. Các triệu chứng lâm sàng thường gặp ............................................ 7 1.2.2. Biểu hiện cận lâm sàng ................................................................. 12 1.3. Chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue ........................................................ 15 1.3.1. Diễn biến lâm sàng sốt xuất huyết Dengue .................................. 15 1.3.2. Chẩn đoán mức độ bệnh................................................................ 18 1.3.3. Chẩn đoán phân biệt ..................................................................... 20 1.4. Vi rút Dengue ........................................................................................ 20 1.4.1. Vai trò gây bệnh ............................................................................ 20 1.4.2. Cấu trúc vi rút Dengue .................................................................. 22 1.4.3. Cấu trúc của protein NS1 ............................................................. 26 1.5. Sử dụng kháng nguyên trong chẩn đoán sốt xuất huyết Dengue.......... 27 1.5.1. Quy trình sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp ................................ 27 1.5.2. Các kỹ thuật sử dụng kháng nguyên trong chẩn đoán ................... 29 1.6. Tình hình ứng dụng kháng nguyên NS1 trong chẩn đoán xác định kháng thể IgM/IgG sốt xuất huyết Dengue và tiềm năng kết hợp NS1 và IgM trong chẩn đoán nhanh .......................................................................... 32
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 36 2.1. Mục tiêu 1 ............................................................................................. 36 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................... 36 2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................... 36 2.1.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................. 37 2.1.4. Nội dung nghiên cứu ..................................................................... 37 2.1.5. Các tiểu chuẩn và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu .................. 37 2.2. Mục tiêu 2. ............................................................................................ 42 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................... 42 2.2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................ 42 2.2.3. Thiết kế nghiên cứu ...................................................................... 43 2.3. Các biến số trong nghiên cứu................................................................ 55 2.4. Sai số trong nghiên cứu......................................................................... 59 2.5. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu ................................................ 59 2.6. Đạo đức trong nghiên cứu ..................................................................... 61 2.7. Sơ đồ nghiên cứu .................................................................................. 63 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 63 3.1. Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue điều trị tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175 năm 2022 .............................................................................................. 63 3.1.1.Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu ................................... 63 3.1.2. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết Dengue64 3.1.3. Một số yếu tố liên quan với mức độ bệnh sốt xuất huyết Dengue 81 3.2. Tổng hợp kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp và đánh giá hiệu quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA .......... 84 3.2.1. Thiết kế tạo kháng nguyên tái tổ hợp NS1 ................................... 84 3.2.2. Tách dòng và biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp NS1 gộp 4 týp vi rút Dengue 1, 2, 3 và 4 trên vi khuẩn E.coli ........................................... 89
3.2.3. Đánh giá hiệu quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue của kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp bằng phương pháp ELISA ...... 95 Chương 4. BÀN LUẬN .................................................................................. 99 4.1. Đánh giá đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue điều trị tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175 năm 2022. ............................................................................................. 99 4.1.1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu .................................................... 99 4.1.2. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết Dengue .............................................................................................................................100 4.2. Tổng hợp kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp và đánh giá hiệu quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA ...... 110 4.2.1. Về thiết kế kháng nguyên tái tổ hợp NS1 ................................... 110 4.2.2. Tách dòng và biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp NS1 gộp 4 týp vi rút Dengue 1, 2, 3 và 4 trên vi khuẩn E.coli ......................................... 114 4.2.3. Đánh giá hiệu quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue của kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp bằng phương pháp ELISA .... 117 KẾT LUẬN ................................................................................................... 123 KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 125 TÍNH KHOA HỌC, TÍNH MỚI ................................................................... 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Số lượng axit amin và trọng lượng phân tử của các protein cấu trúc và phi cấu trúc của vi rút Dengue ................................................................... 24 Bảng 2.1. Xây dựng đường chuẩn phát hiện màu braford .............................. 49 Bảng 2.2. Trình tự mồi khuếch đại các đoạn gen xác định týp huyết thanh của vi rút Dengue ................................................................................................... 55 Bảng 2.3. Các biến số trong nghiên cứu ......................................................... 55 Bảng 3.1. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo nhóm tuổi .............................. 63 Bảng 3.2. Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới, nghề nghiệp ................... 64 Bảng 3.4. Số lượng triệu chứng cơ năng trên một người bệnh ....................... 66 Bảng 3.5. Tình trạng sốt ở đối tượng nghiên cứu trước khi vào viện ............. 66 Bảng 3.6. Đặc điểm sốt từ khi khởi phát bệnh theo giới tính ......................... 67 Bảng 3.7. Đặc điểm sốt ở đối tượng nghiên cứu theo nhóm tuổi ................... 68 Bảng 3.8. Triệu chứng thực thể ở đối tượng nghiên cứu ............................... 69 Bảng 3.9. Đặc điểm xuất huyết theo giới tính ............................................... 69 Bảng 3.10. Đặc điểm dạng xuất huyết theo nhóm tuổi ................................... 70 Bảng 3.11. Số lượng dạng xuất huyết kết hợp ................................................ 71 Bảng 3.12. Đặc điểm tràn dịch trên siêu âm theo giới tính ............................ 71 Bảng 3.13. Đặc điểm tràn dịch trên siêu âm theo nhóm tuổi .......................... 72 Bảng 3.14. Xét nghiệm công thức máu theo giới tính .................................... 72 Bảng 3.15. Xét nghiệm chỉ số đông máu theo giới tính ................................. 74 Bảng 3.16. Xét nghiệm chỉ số đông máu theo nhóm tuổi ............................... 75 Bảng 3.17. Xét nghiệm chức năng gan theo giới tính..................................... 75 Bảng 3.18. Xét nghiệm chức năng gan theo nhóm tuổi .................................. 76 Bảng 3.19. Xét nghiệm điện giải đồ của đối tượng nghiên cứu ..................... 77 Bảng 3.20. Xét nghiệm sinh hóa khác của đối tượng nghiên cứu .................. 78
Bảng 3.21. Mối liên quan giữa giới tính, tuổi, nghề nghiệp và mức độ bệnh sốt xuất huyết Dengue........................................................................................... 81 Bảng 3.22. Mối liên quan giữa số ngày mắc bệnh trước khi vào viện và mức độ bệnh sốt xuất huyết Dengue ............................................................................ 81 Bảng 3.23. Mối liên quan giữa tiền sử bệnh và mức độ bệnh sốt xuất huyết Dengue ............................................................................................................ 82 Bảng 3.24. Mối liên quan giữa mức độ bệnh với biến đổi các chỉ số tiểu cầu ..... 82 Bảng 3.25. Mối liên quan giữa mức độ bệnh với biến đổi các chỉ số Hematocrit .83 Bảng 3.26. Mối liên quan giữa mức độ bệnh với biến đổi các chỉ số Hemoglobin .83 Bảng 3.27. Mối liên quan giữa mức độ bệnh với biến đổi các chỉ số hồng cầu ... 83 Bảng 3.28. Mối liên quan giữa mức độ bệnh với biến đổi các chỉ số bạch cầu .....84 Bảng 3.29. Độ nhạy, độ đặc hiệu của xét nghiệm ELISA phát hiện kháng thể kháng NS1 bằng rAgNS1-DENV1-4 .............................................................. 97
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Các giai đoạn lâm sàng của SXHD ................................................ 18 Hình 1.2. Muỗi Ae. aegypti – Trung gian truyền bệnh sốt xuất huyết Dengue......22 Hình 1.3. Cấu trúc của hạt vi rút Dengue ....................................................... 23 Hình 1.4. Cấu trúc hệ gen và protein của vi rút Dengue ................................ 23 Hình 1.5. Cấu trúc 3D của dimer và hexamer NS1 DENV ............................ 26 Hình 1.6. Quy trình sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp. .................................. 28 Hình 2.1. Kít Dengue Duo phát hiện NS1và IgG/IgM của vi rút Dengue ..... 40 Hình 2.2. Sơ đồ tạo, sàng lọc và kiểm tra dòng tái tổ hợp pJET-rNS1 ở tế bào E.coli DH5α..................................................................................................... 45 Hình 2.3. Sơ đồ tạo, sàng lọc và kiểm tra dòng tái tổ hợp pET22b+ và rNS1 ở tế bào E.coli BL21........................................................................................... 46 Hình 2.4. Sơ đồ phản ứng miễn dịch ELISA gián tiếp ................................... 51 Hình 3.1. Tiền sử bệnh của đối tượng nghiên cứu .......................................... 64 Hình 3.2. Mức độ sốt xuất huyết Dengue ở Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175 ...................................................................................................... 79 Hình 3.4. Vị trí của 4 đoạn trình tự trên protein NS1. .................................... 85 Hình 3.5. A: Cấu trúc mô phỏng của đoạn peptit 112-260 B ......................... 86 Hình 3.6. Kết quả docking giữa peptit 112-260 và kháng thể 1G5.3 A: ........ 87 Hình 3.7. Kết quả docking giữa peptit 112-260 và kháng thể 2B. ................. 88 Hình 3.8. Sàng lọc tế bào E.coli BL21 sau biến nạp ...................................... 89 Hình 3.9. Kết quả giải trình tự Sanger cho khuẩn lạc số 2 ............................ 90 Hình 3.10. Kiểm tra sự biểu hiện của NS1 ở E. coli BL21 trong các điều kiện nhiệt độ nuôi cấy cảm ứng khác nhau. ............................................................ 91 Hình 3.11. Tối ưu nồng độ chất cảm ứng IPTG ở các nồng độ khác nhau. ... 92 Hình 3.12. Tối ưu thời gian biểu hiện protein NS1 ........................................ 92 Hình 3.13. Phương trình đường chuẩn Bradford ............................................ 94
Hình 3.14. Kết quả phản ứng Western blot giữa kháng nguyên tái tổ hợp NS1 gộp 4 và kháng thể NS1 thương mại và kháng thể đơn dòng NS1 gộp 4 tự sản xuất .................................................................................................................. 94 Hình 3.15. Tối ưu hóa ELISA gián tiếp sử dụng protein tái tổ hợp NS1 mang các điểm epitop nhận biết bốn týp huyết thanh DENV1-4.. ........................... 95 Hình 3.16. Kết quả ELISA xác định mẫu dương tính sốt xuất huyết Dengue trong 2 nhóm nghiên cứu. Giá trị cut-off = 0,353........................................... 96 Hình 3.17. Đường cong ROC đánh giá độ tin cậy của kháng nguyên tái tổ hợp NS1 trong xét nghiệm ELISA ......................................................................... 97
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) là bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi rút Dengue (DENV) gây ra. Vi rút được truyền từ người sang người qua muỗi Aedes spp. Hiện nay, thế giới có hơn một phần ba dân số đang sống trong các khu vực có nguy cơ lây nhiễm và SXHD đóng vai trò quan trọng trong gây bệnh và tử vong ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới [1], [2]. Sốt xuất huyết Dengue đã trở thành một vấn đề sức khỏe toàn cầu nghiêm trọng. Số ca nhiễm tăng lên 30 lần sau 50 năm và tỷ lệ tử vong chung khoảng 2,5% [3]. Theo ước tính, có 390 triệu người bị ảnh hưởng bởi nhiễm vi rút Dengue với hơn 25.000 ca tử vong/năm trên toàn cầu, trong đó 96 triệu (67–136 triệu) có biểu hiện lâm sàng. Khu vực Đông Nam Á trải qua dịch bệnh tái phát và mang tính chu kỳ sốt xuất huyết quanh năm. Vị trí địa lý, thời gian cũng chỉ ra mức độ phổ biến của bệnh [4]. Theo WHO, 10 trong số 11 quốc gia thành viên của Đông Nam Á là nơi lưu hành dịch SXHD. Đặc biệt, Ấn Độ, Indonesia, Myanmar, Sri Lanka và Thái Lan nằm trong số 30 quốc gia có mức độ lưu hành cao nhất trên thế giới [5]. Tại Việt Nam, trước năm 2020, tình hình dịch SXHD diễn biến phức tạp theo chu kỳ 4 - 5 năm. Năm 2016, cả nước có 109.399 trường hợp mắc SXHD tại 56 tỉnh thành phố, trong đó có 36 ca tử vong. Năm 2019, có 335.056 ca, trong đó có 55 ca tử vong [6]. Thống kê của Bộ Y tế cho thấy SXHD đứng thứ ba trong số các bệnh truyền nhiễm gây dịch của năm 2020, với 137.470 trường hợp mắc, 29 trường hợp tử vong [7]. Năm 2022 cả nước ghi nhận 367.729 ca SXHD và 140 ca tử vong [8]; tính tới 17/12/2023, cả nước ghi nhận 166.619 ca nhiễm, trong đó có 42 ca tử vong [9]. Bệnh SXHD được gây ra bởi bốn týp huyết thanh là: DENV1, DENV2, DENV3 và DENV4 của vi rút Dengue, có sự lưu hành khác nhau trong các khu vực mà bệnh SXHD phổ biến [10]. Bốn kiểu huyết thanh này có độ tương đồng
2 trong trình tự bộ gen từ 60 – 80%, chúng gây ra các bệnh có biểu hiện giống cúm hoặc nghiêm trọng hơn như xuất huyết dẫn đến sốc có thể gây tử vong [11]. Bộ gen cấu trúc của vi rút Dengue mã hóa cho 3 protein cấu trúc (C, prM/M và E) và 7 protein phi cấu trúc (NS1, NS2A/B, NS3, NS4A/B và NS5) [12]. Protein NS1 là protein phi cấu trúc duy nhất được phát hiện trong máu người bệnh SXHD trong giai đoạn cấp tính nhiễm trùng, thường là trước khi xuất hiện các triệu chứng. Trong khi đó các protein khác chủ yếu ở nội bào hoặc liên kết với các hạt vi rút và thường không được giải phóng vào máu với số lượng có thể phát hiện được trong quá trình nhiễm trùng cấp tính. Một yếu tố nữa cũng khiến NS1 trở thành mục tiêu nghiên cứu của nhiều nhà khoa học do khả năng tạo miễn dịch cao có thể phát hiện bằng các kháng thể đặc hiệu với độ nhạy và độ đặc hiệu tốt nhất. Ngược lại, các protein khác được nhận định tạo ra các phản ứng miễn dịch kém hơn hoặc bị cô lập trong tế bào bị nhiễm bệnh hoặc các hạt vi rút khiến chúng khó được phát hiện trong máu [13]. Việc chẩn đoán phân biệt dựa trên các triệu chứng là một thách thức do các triệu chứng không đặc hiệu của bệnh sốt xuất huyết như sốt, đau nhức và mệt mỏi thường trùng lặp với các bệnh nhiễm trùng lưu hành khác. Tỷ lệ tử vong liên quan đến sốt xuất huyết có thể giảm từ 20–30% trong các trường hợp nặng xuống dưới 1% nhờ chẩn đoán sớm, sử dụng thuốc hợp lý và chăm sóc hỗ trợ thích hợp [14]. Các phương pháp truyền thống để chẩn đoán SXHD bao gồm sử dụng phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược (RT-PCR) để phát hiện RNA của vi rút Dengue hoặc phân lập vi rút, và sau đó sử dụng xét nghiệm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFA). Cả hai phương pháp này đều hiệu quả trong năm ngày đầu tiên khi bị nhiễm mầm bệnh, nhưng độ nhạy của các xét nghiệm này giảm theo thời gian khi lượng vi rút trong máu giảm dần [15], [16]. Hơn nữa, các phương pháp truyền thống này cần hệ thống phòng thí nghiệm chuyên sâu và kĩ thuật viên giàu kinh nghiệm để thực hiện nên khó triển khai rộng rãi ra cộng đồng. Trong số các protein tham gia cấu tạo hạt của vi rút Dengue và tham gia vào quá trình gây
3 bệnh của của vi rút, protein NS1 là kháng nguyên kết hợp bổ thể, có vai trò quan trọng nhất trong phản ứng đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi bị nhiễm vi rút, do vậy protein này thường được sử dụng như chỉ thị phân tử protein trong chẩn đoán sốt xuất huyết do nhiễm vi rút Dengue. Một số xét nghiệm kháng nguyên NS1 khác cũng đã được báo cáo là có hiệu quả trong việc phát hiện vi rút Dengue trong quần thể. Điều này đồng nghĩa với việc sử dụng xét nghiệm kháng nguyên NS1 không chỉ cải thiện khả năng chẩn đoán mà còn đóng vai trò quan trọng trong quản lý nguồn bệnh và giám sát véc tơ [17]. Tuy nhiên, chưa có kháng nguyên NS1 gộp đủ cả 4 týp vi rút Dengue nào được sử dụng, điều này có thể bỏ sót một số trường hợp nhiễm vi rút Dengue. Việc có thêm một phương pháp chẩn đoán SXHD vừa đảm bảo độ nhạy, độ chính xác và tiện dụng là rất cần thiết, vì vậy đề tài “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng người bệnh sốt xuất huyết Dengue và chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA” được thực hiện với hai mục tiêu: 1. Mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở người bệnh sốt xuất huyết Dengue điều trị tại Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Quân y 175 năm 2022. 2. Chế tạo kháng nguyên NS1 tái tổ hợp gộp 4 týp và đánh giá kết quả phát hiện kháng thể kháng vi rút Dengue bằng kỹ thuật ELISA.
4 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan bệnh sốt xuất huyết Dengue 1.1.1. Khái niệm Sốt xuất huyết Dengue là bệnh truyền nhiễm cấp tính do vi rút Dengue gây nên. Vi rút truyền từ người bệnh sang người lành do muỗi đốt. Muỗi Aedes aegypti và Aedes albopictus là trung gian truyền bệnh chủ yếu [18]. Bệnh có đặc trưng bởi sốt, xuất huyết và thoát huyết tương có thể dẫn đến sốc và tử vong nếu không được điều trị đúng và kịp thời [19]. 1.1.2. Dịch tễ học 1.1.2.1. Trên thế giới Sốt xuất huyết Dengue là bệnh truyền nhiễm cấp tính do muỗi có tốc độ lây truyền nhanh nhất thế giới, trong 50 năm qua diện tích vùng có dịch tăng lên 30 lần. Các trường hợp được báo cáo cho WHO đã tăng từ 505.430 trường hợp vào năm 2000 lên 5,2 triệu vào năm 2019. Nghiên cứu cũng cho thấy ước tính có 390 triệu ca nhiễm SXHD mỗi năm, trong đó 96 triệu ca có biểu hiện lâm sàng [20]. Hiện nay, vi rút Dengue lưu hành và gây dịch ở trên 100 quốc gia và vùng lãnh thổ, chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Á Thái Bình Dương, Châu Phi, Châu Mỹ, Địa Trung Hải [21]. Châu Á Thái Bình Dương là khu vực chịu ảnh hưởng của SXHD nhiều nhất, theo WHO, riêng tại khu vực này có khoảng 1,8 tỷ người sống trong vùng dịch tễ SXHD, tập trung nhiều tại vùng Đông Nam Á và Tây Thái Bình Dương. Từ năm 2001 đến 2008, 4 quốc gia có tỷ lệ mắc và tử vong do SXHD cao nhất khu vực Tây Thái Bình Dương là Việt Nam, Campuchia, Malaysia và Philippines với 1.020.333 ca bệnh [19]. Năm 2023, tại Bangladesh, Thái Lan, Campuchia, Lào và Philippin với số mắc (tử vong) lần lượt là 308.167 (1598), 136.655 (147), 35.390 (99); 32.109 (20); 195.603 (657) [5], [9].
5 1.1.2.2. Tại Việt Nam Vụ dịch sốt xuất huyết Dengue lần đầu tiên xảy ra tại miền Bắc vào năm 1958 và ở khu vực phía Nam năm 1960 với 68 bệnh nhi đã được ghi nhận tử vong. Những đợt bùng phát của SXHD được ghi nhận ở nước ta thường xảy ra với chu kì khoảng 10 năm (1987, 1998, 2009, 2017). Các ca mắc thường gia tăng vào mùa mưa - mùa sinh sản của muỗi truyền bệnh, miền Bắc vào khoảng tháng 4 đến tháng 11, miền Nam vào khoảng tháng 6 đến tháng 11 [22]. Theo báo cáo của Bộ Y tế, số ca mắc SXHD ở khu vực Miền Nam cao nhất chiếm 57%, tiếp theo là miền Trung chiếm 33% và chủ yếu ở đối tượng từ 15 tuổi trở lên chiếm từ 57%-85% tuỳ theo khu vực. Số mắc tích luỹ chỉ trong 8 tháng đầu năm 2020 của thành phố Hồ Chí Minh là 13.322 ca, chiếm tỷ lệ cao nhất cả nước, đứng thứ hai là Phú Yên với 4.898 ca. Hà Nội ở vị trí thứ 10 với 1.993 ca. Giám sát huyết thanh trong 8 tháng đầu năm 2020 cũng cho thấy týp DENV2 chiếm 51%, týp DENV1 chiếm 39% và týp DENV4 chiếm 10% [23]. Trong giai đoạn từ 1998 - 2020 tại miền Bắc Việt Nam, trung bình mỗi năm ghi nhận 8.683 trường hợp mắc, trong đó chỉ có từ 1 - 2 trường hợp tử vong. Năm 2017 có số mắc cao nhất trong lịch sử ghi nhận của hệ thống giám sát với 55.531 trường hợp mắc, 7 trường hợp tử vong. Số mắc và tử vong do SXHD chủ yếu tại khu vực Đồng bằng sông Hồng (chiếm 72,6% ca mắc toàn khu vực) [24]. Từ năm 2001 đến 2020, tại khu vực phía Nam, số mắc SXHD trung bình hàng năm là 64.153 ca SXHD/năm; số ca tử vong trung bình hàng năm trong giai đoạn này là 53 ca/năm và giảm dần qua các năm [25]. Hà Nội là một trong các địa phương lưu hành bệnh SXHD có diễn biến phức tạp do sự ảnh hưởng của các yếu tố nguy cơ bao gồm đô thị hóa, mật độ dân số cao, vệ sinh môi trường kém, thời tiết khắc nghiệt. Vào các năm 2009, 2015 và 2017 đã ghi nhận các đợt dịch lớn tại miền Bắc trong đó 90% các trường hợp tập trung tại Hà Nội. Týp DENV1 là căn nguyên chính gây ra các vụ dịch sốt xuất huyết tại Hà Nội vào các năm 2009 và 2015. Đợt dịch SXHD gần nhất xảy ra tại
6 Hà Nội vào năm 2017 đã có 37.651 ca mắc và 7 ca tử vong [26]. Giai đoạn 1999-2020 có tổng số 1.844.407 trường hợp mắc SXHD, trong đó có 1.250 trường hợp tử vong. Tỷ lệ mắc SXHD/100.000 dân tại Việt Nam có xu hướng tăng lên, mức tăng trung bình hằng năm trong giai đoạn1999-2020 bằng 9,6% [27]. Năm 2020, cả nước có 133.321 trường hợp mắc SXHD, trong đó có 27 trường hợp tử vong [28]. Năm 2022 cả nước ghi nhận 367.729 ca SXHD và 140 ca tử vong [8]; so với cùng kỳ năm 2021 (72.880 ca mắc và 27 ca tử vong), số ca mắc cộng dồn cao gấp 5 lần. Tính tới 17/12/2023, cả nước ghi nhận 166.619 ca mắc SXHD, trong đó có 42 ca tử vong [9]. 1.1.3 . Cơ chế bệnh sinh sốt xuất huyết Dengue Sau khi muỗi đốt, vi rút Dengue xâm nhập vào cơ thể, nằm trong các tế bào đơn nhân lớn. Các đại thực bào này tập trung nhiều ở hạch bạch huyết khu vực, trong các tế bào Kupffer, hạch bạch huyết và mảng Payer [19]. Có bằng chứng cho thấy các tế bào đích bao gồm các tế bào lưới đuôi gai, bạch cầu đơn nhân, tế bào lympho, tế bào gan và các tế bào nội mô mạch máu. Sự sao chép của vi rút dường như xảy ra ở các tế bào gai, bạch cầu đơn nhân, và có thể lưu hành các tế bào bạch huyết và các tế bào đích khác xảy ra thông qua các cơ chế miễn dịch trung gian liên quan đến kháng thể chéo và cytokine được giải phóng bởi tế bào đuôi gai, bạch cầu đơn nhân và tế bào nội mô mạch máu. Có bằng chứng về sự kích hoạt tế bào đồng thời cũng ức chế miễn dịch trong quá trình nhiễm trùng. Việc kích hoạt các tế bào T của bộ nhớ dẫn đến các chuỗi cytokine gây viêm, bao gồm yếu tố hoại tử khối u, interleukin (IL-2, IL-6, IL-8) và các chất trung gian hóa học khác làm tăng tính thấm nội mô mạch máu hoặc gây chết tế bào thông qua cơ chế apoptosis [29]. Tình trạng giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch gây thoát huyết tương, chủ yếu là albumin qua thành mạch đến khoang gian bào. Khi thoát huyết tương nhiều dẫn đến hiện tượng giảm protein trong huyết thanh, cô đặc máu, giảm khối lượng tuần hoàn và nặng hơn là tình trạng sốc. Nếu kéo dài sẽ dẫn đến thiếu oxy ở các mô, toan