Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hóa và độc tính tế bào của cây Hồng quân (Flacourtia rukam Zoll. Et Mor.)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:238

Thêm vào BST

Báo xấu

27
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Y học "Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hóa và độc tính tế bào của cây Hồng quân (Flacourtia rukam Zoll. Et Mor.)" trình bày các nội dung chính sau: Xác định tên khoa học nguyên liệu nghiên cứu qua khảo sát hình thái thực vật, vi phẫu và định danh mẫu bằng giải trình tự ADN; Khảo sát hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa và độc tính tế bào của thân cây Hồng quân.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Y học: Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hóa và độc tính tế bào của cây Hồng quân (Flacourtia rukam Zoll. Et Mor.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁI THỊ CẨM NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA CÂY HỒNG QUÂN (FLACOURTIA RUKAM ZOLL. ET MOR.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP. HỒ CHÍ MINH - Năm 2022
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁI THỊ CẨM NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC THEO ĐỊNH HƯỚNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA CÂY HỒNG QUÂN (FLACOURTIA RUKAM ZOLL. ET MOR.) NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 62.72.04.06 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. HUỲNH NGỌC THỤY PGS.TS. ĐỖ THỊ HỒNG TƯƠI TP. HỒ CHÍ MINH - Năm 2022
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố ở bất kỳ nơi nào. Tác giả luận án
i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, Chữ nguyên Ý nghĩa chữ viết tắt ADN Acid desoxynucleic ALT Alanine Aminotransferase AST Aspartate aminotransferase BHA Butylated hydroxylanisol CCl4 Carbon tetraclorid COSY Correlation Spectroscopy d Doublet Đỉnh đôi d Chemical shift Độ dời hóa học DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMF Dimethyl formamid DMSO Dimethyl sulfoxyd dNTP Deoxynucleotid triphosphat DPPH 2,2-Diphenyl Picryl Hydrazyl EAC Ehrilch Ascites Carcinoma ESI-MS Electron Sprayt Ionization mass spectroscopy Lipoprotein tỷ HDL High Density Lipoprotein trọng cao HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HR-MS High Resolution mass. HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation IC Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế J Hằng số ghép Lipoprotein tỷ LDL Low-density lipoproteins trọng thấp LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện Giới hạn định LOQ Limit of Quantification lượng m Multiplet Đỉnh đa Nồng độ ức chế tối MIC Minimal inhibitory concentration thiểu MS Mass Spectrometry Khối phổ NCBI National Center for Biotechnology Information Cộng hưởng từ hạt NMR Nuclear Magnetic Resonance nhân
ii PBS Phosphate Buffered Saline PCR Polymerase Chain Reaction PDA Photodiode Array Dãy diode quang Chỉ số đa hình di PIC Polymorphism Information Content truyền ppm Parts per million Phần triệu q Quartet Đỉnh bốn s Singlet Đỉnh đơn SDS Sodium dodecyl sulfat SKLM Sắc ký lớp mỏng t Triplet Đỉnh ba TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử Sắc ký lỏng siêu UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography hiệu năng UV Ultraviolet Tử ngoại Lipoprotein tỷ VLDL Very-low-density lipoprotein trọng rất thấp VS Vanilin sulfuric
iii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ................................................... i MỤC LỤC ........................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................v DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................................... viii DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ .......................................................................................x MỞ ĐẦU .............................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................4 1.1. Tổng quan về chi Flacourtia ................................................................................4 1.2. Tổng quan về Flacourtia rukam ........................................................................26 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................32 2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................32 2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................57 3.1. Kết quả khảo sát dược liệu Flacourtia rukam ..................................................57 3.2. Kết quả định tính nguyên liệu ..........................................................................70 3.3. Kết quả sàng lọc tác dụng sinh học ..................................................................72 3.4. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc hợp chất ..........................................76 3.5. Xây dựng quy trình định lượng poliothrysosid trong thân Flacourtia rukam bằng UPLC-PDA ................................................................................................... 112 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ................................................................................... 127 4.1. Về mặt thực vật học ....................................................................................... 127
iv 4.2. Về định tính nguyên liệu ............................................................................... 130 4.3. Sàng lọc tác dụng sinh học ............................................................................ 131 4.4. Chiết xuất và phân lập các hợp chất trong F. rukam ...................................... 137 4.5. Về định lượng poliothrysosid trong mẫu dược liệu Hồng quân .................... 142 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 145 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ........... 149 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Điểm khác biệt giữa các loài mang tên Hồng quân ở Việt Nam ........................... 7 Bảng 1.2. Flavon được phân lập từ các loài thuộc chi Flacourtia ......................................... 8 Bảng 1.3. Flavonol được phân lập từ các loài thuộc chi Flacourtia...................................... 9 Bảng 1.4. Các hợp chất phenolic glycosid ........................................................................... 12 Bảng 1.5. Các dẫn chất acid quinic ...................................................................................... 14 Bảng 1.6. IC50 của dịch chiết lá F. indica trong thử nghiệm DPPH và NO ........................ 18 Bảng 1.7. IC50 của 8 chất phân lập từ dịch quả F. inermis trong thử nghiệm DPPH .......... 19 Bảng 1.8. Hoạt tính chống oxy hóa của chi Flacourtia ....................................................... 19 Bảng 1.9. MIC của dịch chiết từ lá F. indica đối với một số loài vi khuẩn........................ 20 Bảng 1.10. MIC của dịch chiết từ lá F. indica đối với một số loài nấm.............................. 21 Bảng 1.11. MIC của dịch chiết MeOH từ rễ F. indica trên một số vi khuẩn ...................... 21 Bảng 1.12. % ức chế gốc tự do và IC50 của dịch chiết quả F. indica .................................. 23 Bảng 1.13. Các chế phẩm có Flacourtia ............................................................................. 25 Bảng 1.14. Hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết và hợp chất từ vỏ thân F. rukam .............. 29 Bảng 1.15. Hoạt tính hạ cholesterol các cao chiết từ vỏ thân F. rukam .............................. 30 Bảng 2.1. Ký hiệu mã hóa các mẫu dùng trong nghiên cứu ................................................ 32 Bảng 2.2. Danh mục thiết bị sử dụng thử nghiệm độc tính trên tế bào và XO .................... 36 Bảng 2.3. Trình tự cặp mồi RbcL sử dụng trong phản ứng PCR ......................................... 38 Bảng 2.4. Thành phần thử tác dụng ức chế XO trong giếng của đĩa 96 .............................. 46 Bảng 3.1. So sánh đặc điểm hình thái F. rukam và F. indica .............................................. 59 Bảng 3.2. So sánh sự khác biệt trình tự gen giữa mẫu HQ275 và HQ2941 ........................ 69 Bảng 3.3. Mức độ tương đồng của 12 mẫu Hồng quân khi BLAST trên NCBI ................. 69 Bảng 3.4. Xác định độ ẩm, độ tro và hàm lượng chất chiết được của cao toàn phần .......... 70 Bảng 3.5. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật F. rukam ................................ 70 Bảng 3.6. Kết quả định lượng của cao toàn phần thân cành F. rukam ............................... 72 Bảng 3.7. Hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn bằng thử nghiệm DPPH ......... 73 Bảng 3.8. Hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn bằng năng lực khử sắt ............ 74 Bảng 3.9. % ức chế dòng tế bào MDA-MB-231 ................................................................. 74 Bảng 3.10. % ức chế dòng tế bào HepG2 ............................................................................ 75
vi Bảng 3.11. % ức chế dòng tế bào RD .................................................................................. 75 Bảng 3.12. Hoạt tính độc tế bào của mẫu thử trên 3 dòng tế bào ung thư ........................... 75 Bảng 3.13. Dữ liệu phổ 1H -NMR và 13C -NMR (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125 MHz) của hợp chất (1) .......................................................................................................................... 83 Bảng 3.14. Dữ liệu phổ 1H -NMR và 13C -NMR (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125 MHz) của hợp chất (2) với acid chaumoogric (CDCl3 399,65 MHz; CDCl3 100,4 MHz) ................... 86 Bảng 3.15. Dữ liệu phổ 1H -NMR và 13C -NMR của hợp chất (3) và poliothrysosid (CDCl3 500 MHz,  CDCl3 125 MHz) ............................................................................................. 88 Bảng 3.16. Dữ liệu phổ 1H -NMR và 13C -NMR ( DMSO-d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125 MHz) của hợp chất (4) với Koabursid ( DMSO-d6: 400 MHz, DMSO-d6: 100 MHz) ....... 90 Bảng 3.17. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C -NMR hợp chất (5) với daucosterol ( DMSO-d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125 MHz) ......................................................................................... 92 Bảng 3.18. Dữ liệu phổ 1H -NMR và 13C -NMR hợp chất (6) (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125 MHz) .................................................................................................................................... 95 Bảng 3.19. Dữ liệu phổ và 1H- NMR và 13C -NMR (DMSO-d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125 MHz) của hợp chất (7) ......................................................................................................... 98 Bảng 3.20. Dữ liệu phổ và 1H- NMR và 13C -NMR (DMSO-d6: 500 MHz, DMSO-d6: 125 MHz) của hợp chất (8) và acid vanilic .............................................................................. 100 Bảng 3.21. Dữ liệu phổ và 1H- NMR và 13C -NMR (DMSO-d6 500 MHz, DMSO-d6 125MHz) của hợp chất (9) với stigmasterol (CDCl3 100 MHz)........................................ 102 Bảng 3.22. Dữ liệu phổ và 1H- NMR và 13C -NMR (CDCl3 500 MHz, CDCl3 125 MHz) của hợp chất (10) và β-sitosterol (CDCl3 với một giọt MeOH-d4 100,06 MHz) ..................... 104 Bảng 3.23. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất (11) ............................................................... 105 Bảng 3.24. Hoạt tính chống oxy hóa các hợp chất bằng thử nghiệm DPPH ..................... 106 Bảng 3.25. Năng lực khử sắt và hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất...................... 107 Bảng 3.26. Giá trị IC50 của các mẫu thử ............................................................................ 108 Bảng 3.27. Kết quả tác dụng in vivo hạ acid uric máu của các mẫu thử ........................... 109 Bảng 3.28. % ức chế và hoạt tính độc tế bào MDA-MB-231 các cao phân đoạn ............. 109 Bảng 3.29. Hoạt tính độc tế bào ung thư vú người MDA-MB-231 của chất phân lập ...... 110 Bảng 3.30. % ức chế hoạt tính độc tế bào HepG2 ............................................................. 110 Bảng 3.31. Hoạt tính độc tế bào ung thư gan người HepG2 của các mẫu thử................... 110 Bảng 3.32. % ức chế hoạt tính độc tế bào RD ................................................................... 111 Bảng 3.33. Hoạt tính độc tế bào ung thư cơ vân người RD của các mẫu thử .................... 111 Bảng 3.34. Kết quả đánh giá độ tinh khiết của poliothrysosid trên UPLC ........................ 113
vii Bảng 3.35. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống ..................................................... 119 Bảng 3.36. Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của poliothrysosid. ................ 120 Bảng 3.37. Kết quả khảo sát độ lăp lại của poliothrysosid ................................................ 122 Bảng 3.38. Kết quả khảo sát độ đúng của poliothrysosid .................................................. 122 Bảng 3.39. Hàm lượng poliothrysosid theo địa điểm thu hái ............................................ 124 Bảng 3.40. Kết quả định lượng poliothrysosid theo bộ phận dùng của cây ...................... 125 Bảng 3.41. Hàm lượng poliothrysosid theo thời điểm thu hái ........................................... 126 Bảng 4.1. So sánh điểm khác biệt trình tự gen giữa F. rukam và F. indica ...................... 129
viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Thân, lá, hoa, quả của Flacourtia indica ............................................................... 6 Hình 1.2. Lá, hoa, quả của Flacourtia jangomas .................................................................. 6 Hình 1.3. Thân, lá, hoa, quả của Flacourtia rukam ............................................................... 6 Hình 1.4. Thân, lá, hoa, quả của Flacourtia montana ........................................................... 6 Hình 1.5. Chế phẩm từ cây Hồng quân ................................................................................ 26 Hình 1.6. Flacourtia rukam ................................................................................................. 27 Hình 2.1. Bố trí thí nghiệm thử tác dụng ức chế XO trên đĩa 96 giếng ............................... 46 Hình 3.1. Hình thái của Flacourtia rukam........................................................................... 58 Hình 3.2. Hoa cắt dọc và bầu noãn cắt ngang của Flacourtia rukam .................................. 59 Hình 3.3. Vi phẫu rễ Flacourtia rukam ............................................................................... 61 Hình 3.4. Vi phẫu thân Flacourtia rukam ........................................................................... 62 Hình 3.5. Vi phẫu cuống lá F. rukam .................................................................................. 63 Hình 3.6. Vi phẫu phiến lá F. rukam ................................................................................... 63 Hình 3.7. Vi phẫu gân giữa Flacourtia rukam .................................................................... 64 Hình 3.8. Các cấu tử trong bột rễ Flacourtia rukam ........................................................... 65 Hình 3.9. Các cấu tử trong bột thân Flacourtia rukam........................................................ 66 Hình 3.10. Các cấu tử trong bột lá F. rukam ....................................................................... 67 Hình 3.11. Phổ điện di ADN 15 mẫu Hồng quân trên gel agarose 1% ............................... 67 Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR 15 mẫu Hồng quân với cặp mồi RbcL trên gel agarose 1%............................................................................................................................ 67 Hình 3.13. Vị trí các đột biến điểm mẫu HQ2941 so với mẫu HQ2975 ............................. 69 Hình 3.14. Sắc ký đồ phân tích các bộ phận dùng của F. rukam......................................... 71 Hình 3.15. Cấu trúc hợp chất (1) ......................................................................................... 82 Hình 3.16. Cấu trúc hợp chất (1) - Rukamtenol .................................................................. 84 Hình 3.17. Công thức hợp chất (2) - Acid chaulmoogric .................................................... 86 Hình 3.18. Cấu trúc hợp chất (3) – Poliothrysosid .............................................................. 89 Hình 3.19. Cấu trúc hợp chất (4) - Koabursid ..................................................................... 91 Hình 3.20. Công thức hợp chất (5) - Daucosterol ................................................................ 93 Hình 3.21. Tương quan HMBC của FRHC12 ..................................................................... 94 Hình 3.22. Tương quan NOESY của hợp chất (6)............................................................... 95
ix Hình 3.23. Công thức hợp chất (6) ...................................................................................... 96 Hình 3.24. Tương quan HMBC của FRE11 ........................................................................ 98 Hình 3.25. Cấu trúc hợp chất (7) ......................................................................................... 99 Hình 3.26. Cấu trúc của hợp chất (8) – Acid vanilic ........................................................ 101 Hình 3.27. Cấu trúc hợp chất (9) - Stigmasterol ................................................................ 103 Hình 3.28. Công thức hợp chất (10) - -sitosterol ............................................................ 105 Hình 3.29. Cấu trúc hợp chất Acid stearic ........................................................................ 106 Hình 3.30. Năng lực khử sắt của 3 hợp chất tinh khiết...................................................... 107 Hình 3.31. Phổ UV của poliothrysosid .............................................................................. 112 Hình 3.32. Sắc ký đồ chất đối chiếu poliothrysosid. ......................................................... 113 Hình 3.33. Phổ 3D của poliothrysosid và độ tinh khiết của poliothrysosid ...................... 113 Hình 3.34. Sắc ký đồ của hợp chất (3) - poliothrysosid .................................................... 114 Hình 3.35. Chương trình pha động và sắc ký đồ khảo sát 1 .............................................. 114 Hình 3.36. Chương trình pha động và sắc ký đồ khảo sát 2 .............................................. 114 Hình 3.37. Chương trình pha động và sắc ký đồ khảo sát 3 .............................................. 115 Hình 3.38. Chương trình pha động và sắc ký đồ khảo sát 4 .............................................. 115 Hình 3.39. Chương trình pha động và sắc ký đồ khảo sát ................................................. 116 Hình 3.40. Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng........................................................................ 116 Hình 3.41. Sắc ký đồ khảo sát nhiệt độ cột........................................................................ 116 Hình 3.42. Sắc ký đồ khảo sát số lần chiết ........................................................................ 117 Hình 3.43. Sắc ký đồ khảo sát tính tương thích hệ thống .................................................. 119 Hình 3.44. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu ........................................................................ 120 Hình 3.45. Đường tuyến tính chuẩn poliothrysosid .......................................................... 121 Hình 3.46. Sắc ký đồ khảo sát tính tuyến tính ................................................................... 121 Hình 3.47. Sắc ký đồ khảo sát độ lặp lại............................................................................ 122 Hình 3.48. Sắc ký đồ khảo sát LOD và LOQ của poliothrysosid ...................................... 123 Hình 3.49. So sánh hàm lượng poliothrysosid trong thân và rễ F. rukam, F. indica ........ 125 Hình 4.1. Phân biệt lá khô loài F. rukam và F. indica ....................................................... 128 Hình 4.2. So sánh trình tự gen giữa các mẫu hồng quân với mẫu đối chứng Flacourtia rukam (Mã KP094960.1) .............................................................................................................. 129
x DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Sơ đồ tiến hành nghiên cứu tác dụng sinh học ................................................... 42 Sơ đồ 3.1. Sơ đồ chiết phân bố lỏng – lỏng ......................................................................... 76 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao cloroform (1-11) ........................................ 77 Sơ đồ 3.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất (3, 7) ..................................................................... 80
1 MỞ ĐẦU Việt Nam có nền y học cổ truyền dân tộc lâu đời với nhiều kinh nghiệm sử dụng các loại dược liệu, các bài thuốc có giá trị để phòng bệnh và chữa bệnh, mặt khác còn là nơi có nhiều dược liệu đặc hữu quý hiếm, cùng các bài thuốc cổ truyền có hiệu quả trị liệu tốt, nhưng một số không nhỏ trong đó lại đang dần bị lãng quên theo thời gian. Xu hướng quay về sử dụng thuốc có nguồn gốc thiên nhiên thay cho thuốc có nguồn gốc tổng hợp là xu hướng phổ biến không chỉ ở Việt Nam mà còn rộng rãi trên toàn thế giới, khiến các nhà khoa học ngày càng hướng tới việc tìm kiếm tác dụng mới của cây thuốc và chứng minh tác dụng cho những bài thuốc dân gian để nâng cao giá trị sử dụng của cây thuốc từ thiên nhiên. Tuy vậy, xu hướng này cũng mang lại những vấn đề lớn, đó là tình trạng ngày càng có nhiều bài thuốc không rõ nguồn gốc, chưa được chứng minh hiệu quả nhưng phổ biến lan truyền rất nhanh trong cộng đồng khiến người dân đổ xô đi tìm kiếm cây thuốc và sử dụng tự phát bừa bãi, tạo sự khan hiếm nguồn nguyên liệu đẩy giá thành dược liệu lên cao và cây Hồng quân là ví dụ điển hình trong những trường hợp đó. Cây Hồng quân – một loài cây ăn quả quen thuộc ở vùng đồng bằng Sông Cửu Long và Nam Trung Bộ, thuộc chi Flacourtia họ Liễu (Salicaceae), là cây thân gỗ, mọc hoang chủ yếu ở vùng nhiệt đới [6], [5], [9]. Tại Việt nam, Hồng quân loài F.rukam được dân gian dùng chữa viêm mi mắt, viêm khớp dạng thấp, gút, rễ chữa tiểu buốt, tiểu dắt, đặc biệt việc sử dụng rễ Hồng quân điều trị phì đại tiền liệt tuyến rất hiệu quả, dẫn đến tình trạng loài cây này đang bị khai thác triệt phá ồ ạt trong dân gian. Trên thế giới, Hồng quân đã được nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa, tác dụng bảo vệ gan, hạ đường huyết, chống sốt rét và kháng khuẩn, chủ yếu nghiên cứu tập trung ở các loài: Flacourtia indica, Flacourtia montana, Flacourtia sepiaria, Flacourtia jangomas.... [62], [71], [133], [135]. Đặc biệt có loài đã được khảo sát tác dụng độc tính tế bào như Flacourtia indica và tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh gút ức chế xanthin oxidase như Flacourtia sepiaria cho kết quả IC50 rất ấn tượng.
2 Gút là bệnh rất phổ biến trên thế giới, một trong những nguyên nhân của bệnh gút là do tăng acid uric máu, xảy ra do rối lọan chuyển hóa acid uric. Xanthin oxidase (XO) là một enzyme đóng vai trò quan trọng trong gút chuyển hóa tạo acid uric. Trong giai đoạn cuối của quá trình trao đổi chất của purin, enzyme này xúc tác cho phản ứng oxy hóa hypoxanthin và xanthin để tạo thành acid uric. Do đó việc tìm kiếm những cây thuốc hay những hợp chất từ cây thuốc có tác dụng ức chế enzyme XO sẽ có tiềm năng rất lớn góp phần hỗ trợ điều trị bệnh gút. Các nghiên cứu in vitro tiến hành cho kết quả tốt thường sẽ được xác nhận kết quả bằng những thử nghiệm in vivo tiếp theo trong các nghiên cứu này. Một vấn đề nổi cộm nữa ở Việt nam hiện nay đó là tỷ lệ bệnh ung thư trong người dân tăng rất nhanh. Theo số liệu được đưa ra tại Hội nghị khoa học phòng chống ung thư thường niên lần thứ 9 – tại Huế năm 2021, tỷ lệ mắc ung thư mới ở Việt Nam đã tăng lên 9 bậc, xếp thứ 90/185 quốc gia. Các loại ung thư thường gặp nhất vẫn là ung thư gan, đại trực tràng, ung thư vú, dạ dày, phổi …[145]. Với lý do đó hiện nay các nhà khoa học cũng đang hướng đến các nghiên cứu tác dụng độc tính trên các dòng tế bào ung thư của các cây thuốc dân gian nhằm mục đích tìm kiếm tác dụng mới của chúng, việc này là rất cấp bách và khả thi. Kinh nghiệm dân gian sử dụng cây Hồng quân trị bí tiểu, tiểu dắt, tiểu khó cũng đã được chứng minh có tác dụng điều trị u xơ lành tính tiền liệt tuyến, thông qua kết quả nghiên cứu của đề tài “Nghiên cứu dịch chiết cao lỏng từ cây Bồ Quân ứng dụng điều trị u xơ lành tính tiền liệt tuyến” thực hiện tại Bệnh viện đa khoa Trung ương Thái Nguyên, kết quả nghiên cứu cho thấy có tác dụng tốt, đã được Hội đồng Khoa học Bộ Y tế nghiệm thu năm 2002 [8]. Nhận thấy Hồng quân là một cây thuốc giàu tiềm năng, không chỉ dừng lại ở một tác dụng mà có thể còn ẩn chứa nhiều hoạt tính tiềm năng như 1 số cây thuốc cùng chi khác. Đặc biệt cây Hồng quân loài Flacourtia rukam tại Việt Nam chưa thấy có nhiều báo cáo nghiên cứu về thành phần hóa học, tác dụng dược lý về loài này qua tham khảo tài liệu trên các tạp chí chuyên ngành có uy tín trong và ngoài nước.
3 Nhằm chứng minh tác dụng dược lý theo y học cổ truyền Việt Nam và tìm kiếm tác dụng mới của cây Hồng quân, đặc biệt là theo hướng chống oxy hóa dập tắt gốc tự do (mô hình DPPH) và ức chế enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa (mô hình ức chế enzyme xanthin oxidase) trong tìm kiếm cây thuốc có tác dụng ức chế acid uric (phương pháp in vitro), làm hạ acid uric máu (phương pháp in vivo) phục vụ cho mục đích tìm kiếm cây thuốc hỗ trợ điều trị bệnh gút, và với mục đích đánh giá tính độc tế bào của Flacourtia rukam mọc tại Việt Nam, từ đó góp phần tạo cơ sở cho việc bảo tồn, phát triển, nghiên cứu sản xuất sản phẩm từ thiên nhiên đạt chất lượng cao, có hiệu quả hỗ trợ điều trị làm tăng giá trị sử dụng cây thuốc dân gian, nhóm nghiên cứu đặt vấn đề “Nghiên cứu thành phần hóa học theo định hướng chống oxy hóa và độc tính tế bào của cây Hồng quân (Flacourtia rukam Zoll. Et Mor.)” với những mục tiêu cụ thể sau: 1. Xác định tên khoa học nguyên liệu nghiên cứu qua khảo sát hình thái thực vật, vi phẫu và định danh mẫu bằng giải trình tự ADN. 2. Khảo sát hóa học theo định hướng tác dụng chống oxy hóa và độc tính tế bào của thân cây Hồng quân.
4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ CHI FLACOURTIA 1.1.1. Thực vật học chi Flacourtia Flacourtia rukam Zollinger et Moritzi là một loài thực vật có hoa trong họ Liễu (Salicaceae), loài này được mô tả khoa học đầu tiên vào năm 1846 [20], [142]. Theo hệ thống phân loại dựa trên cơ sở phát sinh loài phân tử do Angiosperm Phylogeny Group thiết lập (2010), vị trí của họ Salicaceae được phân loại như sau: Giới (Plantae) (Kingdom) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) (Phylum) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) (Class) Bộ Sơ ri (Malpighiales) (Order) Họ Liễu (Salicaceae) (Family) Chi Flacourtia (Genus) Loài Flacourtia rukam (Species) Chi Flacourtia thuộc họ Flacourtaceae được phân loại theo hệ thống phân loại của A. L. Takhtajan (2009) [132]. Họ Mùng quân hay họ Bồ quân (Flacourtiaceae) là một họ thực vật có hoa trong hệ thống Cronquist và một vài hệ thống phân loại thực vật khác. Họ Flacourtiaceae rất đa dạng về chủng loại khi xem xét ở cấp độ họ. Trong phân loại Cronquist, họ này bao gồm 89 chi và trên 800 loài, trong số này, nhiều chi kể cả chi điển hình Flacourtia hiện nay đã được chuyển sang họ Liễu (Salicaceae) trong phân loại dựa trên cơ sở phát sinh loài phân tử do Angiosperm Phylogeny Group thiết lập, được gọi là hệ thống APG II [137]. Trong hệ thống Cronquist cũ thì họ Salicaceae được xếp vào một bộ riêng của chính nó là bộ Liễu (Salicales) chỉ chứa có 3 chi là: Salix, Populus và Chosenia, nhưng APG II lại đưa họ này vào trong bộ Sơ ri (Malpighiales) gồm các chi Azara, Bennettiodendron, Dovyalis, Flacourtia, Idesia, Ludia, Xylosma thuộc họ Salicaeae [20],[137].
5 Salicaceae gồm 55 chi và khoảng 1.210 loài, một số trong những loài này đã được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền, các loài có quả ăn được như Flacourtia indica, Flacourtia inermis, Flacourtia jangomas, Flacourtia rukam. Các loài trong họ Salicaceae chủ yếu là cây thân gỗ thường rụng lá và một số cây bụi, phân bố ở vùng nhiệt đới đến ôn đới và vùng Bắc cực [77], [137]. 1.1.2. Đặc điểm các loài thuộc chi Flacourtia tại Việt Nam Chi Flacourtia có một số loài sau: F. amalotricha, F. cavaleriei, F. degeneri, F. flavescens, F. helferi, F. indica, F. inermis, F. jangomas, F. kinabaluensis, F. latifolia, F. mollipila, F. mollis, F. montana, F. occidentalis, F. oppositifolia, F. rukam, F. subintegra, F. territorialis, F. tomentella, F. vitiensis, F. vogelii, F. zipelli [142] Chi Flacourtia gồm khoảng 15 loài của các vùng nóng châu Phi và châu Á. Cây nhỡ hay cây gỗ thường có gai nhất là lúc còn non. Lá mọc so le, đơn, thường có răng, gân lông chim, cuống ngắn. Lá kèm bên nhỏ, dễ rụng. Cụm hoa chùm hay xim co, hoặc chùy nách tận cùng. Hoa đơn tính, ít khi đa tính, cỡ nhỏ. Có 4-6 lá đài, hơi dính ở gốc, lợp lên nhau. Không có cánh hoa, đĩa mật dạng vòng hoặc nhiều tuyến đối diện với các lá đài, bao quanh nhị và bầu. Hoa đực có nhiều nhị, nhụy lép không có hoặc tiêu giảm. Hoa cái bầu trên 2 - 6 ô. Quả hạch dạng quả mọng có một đến nhiều hạt, hạt hơi dẹp, có vỏ cứng, phôi nhũ nạc bao bởi các hạt mỏng màu đỏ [3], [6]. Phân bố rộng ở các vùng nhiệt đới của châu Phi và châu Á: Campuchia, Lào, Việt Nam, Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ, Myanma và Malaysia. Ở Việt Nam, cây Hồng quân mọc từ Lai Châu, Bắc Kạn vào tới Ninh Thuận, Khánh Hòa, Lâm Đồng. Thường gặp ở những môi trường và độ cao thay đổi từ 0-1200 m, trong rừng thưa quanh các làng, gần các đường đi và các sông [3], [4]. Ở Việt Nam có các loài: Flacourtia indica, Flacourtia inermis, Flacourtia jangomas, Flacourtia rukam [6] .
6 Hình 1.1. Thân, lá, hoa, quả của Flacourtia indica “Nguồn: Võ Văn Chi, 2003 [3], Chatterjee Mousumi, 2015 [29] Hardik, 2010 [51], Lim T., 2013 [73]” Hình 1.2. Lá, hoa, quả của Flacourtia jangomas “Nguồn: Võ Văn Chi, 2003 [3], Lim T., 2013 [74]”. Hình 1.3. Thân, lá, hoa, quả của Flacourtia rukam “Nguồn: Võ Văn Chi, 2003 [3], Lim T., 2013 [75]”. Hình 1.4. Thân, lá, hoa, quả của Flacourtia montana “Nguồn: Võ Văn Chi, 2003 [3]”.
7 Bảng 1.1. Điểm khác biệt giữa các loài mang tên Hồng quân ở Việt Nam Flacourtia Flacourtia Flacourtia Flacourtia indica jangomas rukam montana Thân Cây nhỡ hay cây Cây bụi hay cây Cây nhỡ hay cây Cây gỗ nhỏ, gỗ đỏ, gỗ, có gai đơn hay nhỡ có gai đơn hay gỗ có gai chắc nhánh non có màu phân nhánh. Vỏ phân nhánh. khỏe, đơn hay sét. thân màu nâu đỏ. phân nhánh có thể dài tới 10 cm. Vỏ thân màu trắng xám, dễ bong tróc. Lá Lá nhẵn hay có Lá có hình xoan, Lá thuôn bầu dục, Lá có phiến dày, lông nhung ở cả nhọn dài ở đầu mép hơi lượn thành to, dài đến 20 cm, hai mặt, ngọn lá ngọn lá, mép lượn hình răng, gân con mép có răng to. xoan hình bầu dục, thành răng. thành mạng dày. mép hơi lượn sóng. Hoa Hoa nhỏ màu vàng Hoa trắng hay Hoa nhỏ màu vàng Hoa không có cánh xanh, vàng hồng- trắng lục, cuống lục, đầu nhụy ít hoa. 30 - 50 nhị, đỏ, bầu phình to, ngắn, rất mảnh, 4 - xòe, hoa vô cánh, bầu có 7 vòi nhụy. đầu nhụy xòe ra, 5 lá đài dính nhau ở không mùi, cuống hoa vô cánh. Hoa gốc. Hoa cái có đĩa ngắn, 3 - 4 lá đài có cuống ngắn, mật nguyên hay hơi dính ở gốc. Bầu lông mịn. Hoa đực chia thùy, bầu hình nhụy hình cầu có 4 có đĩa mật gồm cầu với 4 - 6 ô, 4 - - 7 giá noãn mang nhiều tuyến lượn 5 vòi nhụy, đầu 2 noãn, 4 - 7 vòi tai bèo, chỉ nhị có nhụy ngắn. nhụy, rời xếp thành chỉ mảnh. Hoa có vòng ở đỉnh bầu. đĩa mật hầu như nguyên, bầu hình cầu với 4 - 6 giá noãn 2 noãn, 4 - 6 vòi nhụy. Quả Quả mọng. Hạt Quả nạc, có cạnh. Quả mọng. Hạt Quả hạch. Hạt dẹp màu vàng nâu Hạt vàng nâu, hình thận, dẹp, màu vàng phồng hai mặt, vân nhám màu vàng có vân nhám nổi rõ hai mờ. mặt, có rìa và đuôi nhọn. Nhận xét: Có sự khác biệt rõ rệt về hình thái lá, hoa, quả và hạt giữa các loài Flacourtia nên có thể dựa vào đặc điểm hình thái để nhận dạng các loài Hồng quân. 1.1.3. Thành phần hóa học chi Flacourtia Thành phần hóa học chính của các loài thuộc chi Flacourtia chủ yếu chứa các hợp chất chuyển hóa thứ cấp như terpenoid, steroid và các hợp chất phenolic như