Luận văn : KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN LÚA (Oryza sativa L.) Ở TÂY NINH part 2

Chia sẻ: Sadfaf Asfsggs | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

93
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

16 syringae là một ví dụ cụ thể cho trường hợp trên và chúng có thể gây bệnh cho nhiều loài thực vật khác nhau [9], [38]. Ngoài ra, có nhiều vi sinh vật gây bệnh khác cũng đã được ghi nhận trên nhiều loài thực vật khác nhau như: nấm Phytophthora, Xanthomonas,…[82]. Tuy nhiên, bên cạnh các vi sinh vật có hại cũng tồn tại nhiều vi sinh vật có lợi cho thực vật. Cơ chế tạo ra ảnh hưởng có lợi của vi sinh vật lên thực vật rất đa dạng. ...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn : KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN LÚA (Oryza sativa L.) Ở TÂY NINH part 2

16 syringae là một ví dụ cụ thể cho trường hợp trên và chúng có thể gây bệnh cho nhiều loài thực vật khác nhau [9], [38]. Ngoài ra, có nhiều vi sinh vật gây bệnh khác cũng đã được ghi nhận trên nhiều loài thực vật khác nhau như: nấm Phytophthora, Xanthomonas,…[82]. Tuy nhiên, bên cạnh các vi sinh vật có hại cũng tồn tại nhiều vi sinh vật có lợi cho thực vật. Cơ chế tạo ra ảnh hưởng có lợi của vi sinh vật lên thực vật rất đa dạng. Trong trường hợp của vi khuẩn sống ở rễ chúng có thể biến dưỡng nitrogen từ khí quyển thành nitrate, ammonia, tạo các chất trung gian để cô lập các chất khoáng cho thực vật, tổng hợp các phytohormone, hay tổng hợp các chất trung gian để cô lập các chất khoáng cần thiết cho vi sinh vật gây bệnh, làm cho vi sinh vật gây bệnh không thể sử dụng được các chất khoáng này hay tổng hợp các chất kháng vi sinh vật gây bệnh cho thực vật như các chất kháng sinh, các enzyme thủy phân vách tế bào, các hydrogen cyanide để ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh hay kích thích tạo tính kháng bệnh của thực vật [19], [33], [50], [74]. Trong đó, nấm Trichoderma là nấm hiện diện trên nhiều thực vật, trên nhiều cơ quan khác nhau và chúng là nấm có lợi, không những chúng có khả năng gia tăng tăng trưởng, gia tăng năng suất mà còn gia tăng khả năng kháng bệnh của cây đối với các bệnh gây hại do Fusarium, Alternaria, Cochliobolus heterostrophus, Rhizoctonia solani,… [17], [35], [44], [56]. Trong mối quan hệ đó, sự cộng sinh giữa cây họ đậu và vi khuẩn đất được cho là nhân tố quan trọng cho môi trường và trong nông nghiệp đã được nghiên cứu từ rất sớm. Vi khuẩn rễ có thể tìm thấy trong hầu hết 18.000 loài của họ đậu Leguminosae (thực vật hai lá mầm), ở rễ cây mía (thực vật một lá mầm) và nhiều loài thực vật khác [9], [70], [87], [97]. Cơ chế ảnh hưởng lên sự phát triển của thực vật bởi vi sinh vật trong điều kiện in vitro cũng đã được nghiên cứu và chứng minh. Một số vi sinh vật có khả năng kích thích sự phát triển hình thái và tăng trưởng của thực vật. Vi khuẩn Methanotrophic là một ví dụ điển hình, có khả năng kích thích sự hình thành callus (mô sẹo) của hạt lúa mì và gia tăng khả năng tạo rễ trong môi trường nuôi cấy, vì vậy làm cho tỷ lệ tái sinh cây cũng đạt hiệu quả và rút ngắn được thời gian. Sự gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo) và tạo rễ cũng được ghi nhận khi thí nghiệm đối với phôi hạt bắp [47], [48]. Từ những cơ sở trên, có thể khẳng định rằng, sự tương tác giữa vi sinh vật với thực vật không những chỉ là mối quan hệ gây hại cho nhau mà đôi khi quan hệ này lại
17 tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của thực vật trong điều kiện in vivo cũng như trong điều kiện in vitro. 2.3.2. Sự tƣơng tác giữa Methylobacterium với thực vật. Vi khuẩn PPFM (pink-pigmented facultative methylotrophic) là nhóm vi khuẩn đặc trưng thuộc chi Methylobacterium được phân lập ở hơn 100 loài thực vật từ rêu, địa y, thực vật hạt trần và thực vật hạt kín. Methylobacterium sp. là loài tồn tại lâu dài và chiếm tỷ lệ lớn nhất trên bề mặt lá được rửa sạch. Holland và ctv (1994), cho rằng việc khử trùng thông thường trong việc chuẩn bị mẫu cho nuôi cấy mô không loại được vi khuẩn Methylobacterium. Đây là nhóm vi khuẩn phong phú và phổ biến trên thực vật, phân bố chủ yếu ở lá, đặt biệt ở lá non. Ngoài ra, Methylobacterium còn sống ở rễ và hạt. Mật độ của PPFM trong khoảng 104 – 107 cfu (colony forming unit) trên mỗi gram trong lượng tươi của mô thực vật và ở hạt đậu nành khô thì mật độ khoảng 105 cfu/gram [40], [59], [60]. Mặc dù vi khuẩn PPFM tăng trưởng rất chậm so với các chủng vi khuẩn khác trên bề mặt lá, nhưng chúng vẫn có khả năng tồn tại với số lượng lớn và có khả năng tạo khuẩn lạc là do chúng sử dụng nguồn dinh dưỡng khác thường – methanol (chỉ thích hợp với một số vi khuẩn). Methanol thường được tạo ra trong quá trình phân hủy pectin từ mô, đặc biệt là ở mô đang hoạt động sinh trưởng [55], [71], [72]. Mối quan hệ giữa vi khuẩn PPFM với thực vật không phải là mối quan hệ một chiều, mà cùng với việc hấp thu các chất tiết ra thực vật thì vi khuẩn PPFM có thể tổng hợp và tiết ra các chất khác nhau có lợi cho quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chủng PPFM đầu tiên được phân lập bởi Basile và ctv (1969), có khả năng kích thích sinh trưởng của cây địa tiền (liverwort, Scapania nemorosa) trong môi trường nuôi cấy in vitro. Sau đó, Corpe và Basile (1982), chứng minh rằng PPFM gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo), gia tăng khả năng tái sinh cây từ mô cây anh thảo (cây báo xuân) Streptocarpus prolixus. Corpe và Basile (1982), cũng chứng minh được rằng vi khuẩn PPFM có khả năng tổng hợp vitamine B12 (cyanocobalamine) và kích thích sinh trưởng, phát triển của cây rêu Jungermannia leiantha và Gymnocolea inflata [39], [40], [51], [84]. Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh được rằng, vi khuẩn PPFM có khả năng tương tác với cây đậu nành trong việc chuyển hóa nicken, PPFM có khả năng gia tăng tỷ lệ nẩy mầm của hạt, cũng như gia tăng năng suất cây đậu nành. Khả
18 năng kích thích tăng trưởng, gia tăng năng suất của thực vật khi xử lý PPFM t rên lá cũng được ghi nhận trên cây bông (Gossypium hirsutum L.) và cây mía (Saccharum officinarum L.). Trong nghiên cứu của Maliti (2000), thì một số chủng PPFM có khả năng gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo) từ phôi hạt lúa, trong khi một số chủng khác lại có khả năng kích thích sinh trưởng và phát triển của các cơ quan như lá, rễ, thân lúa. Nhưng một số chủng khác lại ức chế phát triển của rễ lúa. Trong nghiên cứu của Madhaiyan và ctv (2005), đã chỉ ra rằng tất cả các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. trong nghiên cứu có khả năng kích thích sự nẩy mầm của hạt lúa, kích thích tăng trưởng, gia tăng tỷ lệ tạo nhánh, gia tăng khả năng kháng bệnh và giảm tỷ lệ cây bệnh với Rhizoctonia solani, cũng như góp phần làm gia tăng năng suất lúa (hơn 55,44g/ lỗ) [40], [59], [60], [61]. 2.3.3. Sự tạo các hoạt chất thứ cấp bởi Methylobacterium có lợi cho thực vật Mặc dù có nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng kích thích sinh trưởng của PPFM lên thực vật. Tuy nhiên, cơ chế của khả năng kích thích này chưa được hiểu rõ và thống nhất vẫn còn có nhiều giả thuyết khác nhau đó là: Sự cô lập, chuyển hóa các khoáng dinh dưỡng (bao gồm khoáng vi hay đa - lượng) từ môi trường hoặc từ đất cho cây. Cơ chế cô lập các khoáng dinh dưỡng liên quan đến sự tổng hợp các phân tử có lợi cho quá trình hấp thu những ion. Cơ chế này đã được chỉ ra ở vi khuẩn rễ ở một số thực vật [46], [61], [93]. Sự tổng hợp các phytohormone hay các hợp chất tương tự phyohormone được - phóng thích vào môi trường hay vào hệ thống mạch của thực vật. Cơ chế này bao gồm sự tổng hợp cytokinin, auxin và hợp chất tương tự auxin bởi một vài chủng PPFM [24], [39], [40], [55], [71], [72]. Sự tổng hợp và giải phóng các enzyme tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình - sinh hóa hay sinh lý của mô thực vật. Sự tổng hợp enzyme urease bởi vi sinh vật đã được chỉ ra ở nhiều chủng PPFM. Urease rất cần thiết trong quá trình biến dưỡng nitrogen ở thực vật [40], [61]. Cơ chế thứ tư góp phần gia tăng sự tăng trưởng của cây lúa nói riêng và các cây - trồng khác nói chung có thể là do sự tổng hợp và phóng thích vitamine B 12 hoặc những hợp chất tương tự. Nghiên cứu của Basile và ctv (1985), đã chứng minh rằng việc bổ sung vitamine B12 nồng độ thấp có thể gia tăng sự tăng trưởng của hai loài địa tiền - liverwort in vitro [61], [84].
19 Khả năng tổng hợp các phytohormone không chỉ hiện diện ở thực vật mà còn diễn ra ở cả vi sinh vật. Khả năng tổng hợp các phytohormone đã được xác định ở nhiều vi sinh vật. Những vi khuẩn sống trong đất và vi khuẩn quan hệ với thực vật có khả năng tổng hợp phytohormone bao gồm vi khuẩn gram âm, gram dương, vi khuẩn gây bệnh cho thực vật, vi khuẩn cộng sinh và vi khuẩn biến dưỡng nitrogen. Nhiều loài vi khuẩn trong nhóm này có thể tổng hợp và tiết vào môi trường nuôi cấy nhiều hơn một hormone. Chủng Rhizobium có thể tổng hợp gibberellins (GA) và auxin, Azotobacter spp. có thể tổng hợp GA, auxin và cytokinins, Acetobacter và Herbaspirillum có thể tổng hợp IAA và GA. Nên chúng có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật trong điều kiện in vivo cũng như in vitro [24], [71]. Sự tổng hợp IAA của một số PPFM cũng đã được ghi nhân. Sự tạo indole và dẫn xuất của chúng từ L- tryptophan là môt đặc trưng phân biệt của những vi khuẩn gram âm hiếu khí. Trong nghiên cứu của Ivanova và ctv (2001), bằng cách sử dụng những thuốc thử Salkowski và Van Urk đã chỉ ra rằng 4 loài Methylobacteria là Methylobacterium mesophilicum, Aminobacter aminovorans, Methylovorus mays và Paracoccus kondratievae có thể tạo IAA. Trong nghiên cứu của Omer và ctv (2004), chứng minh rằng vi khuẩn hiếu khí Methylobacteria có thể tổng hợp auxin (chủ yếu là IAA) từ L-tryptophan ngoại bào. PPFM cũng có thể tổng hợp lượng nhỏ IAA trong môi trường với peptone là nguồn cacbon và nitrogen. Trong nghiên cứu khác của Omer và ctv (2004), chỉ ra rằng ba trong số 16 chủng PPFM được kiểm tra trong môi trường nuôi cấy lỏng có thể tổng hợp IAA. Ba chủng tạo IAA đã tích lũy phytohormone với khối lượng biến thiên trong khoảng 6 – 13,3mg/l trong môi trường bổ sung L-tryptophan và 1,1 – 2,4mg/l khi không bổ sung L-tryptophan vào môi trường nuôi cấy, đến 12 ngày sau thì hàm lượng IAA tạo ra trong môi trường có bổ sung L-tryptophan cao gấp 6 lần so với nuôi cấy không có L-tryptophan [24], [26], [71]. Cytokinins được tạo ra bởi vi khuẩn bằng ít nhất hai con đường. Con đường đầu tiên là tổng hợp de novo, là dạng chuyển đổi trực tiếp đồng phân (isopentenylation) của AMP (adenine monophosphate) bởi enzyme dimethylallyl transferase (DMAT), được ghi nhận đầu tiên ở vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Con đường thứ hai của quá trình tạo cytokinins bởi vi khuẩn là quá trình chuyển đổi của tRNA tương tự như
20 cơ chế hoạt động ở thực vật bậc cao. Sự tạo cytokinins bởi vi khuẩn PPFMs đã được Koenig và ctv (2001), kiểm tra. Tất cả các chủng kiểm tra điều tạo được cytokinins ở mức độ đủ đáp ứng và phát hiện được. Lượng cytokinins quan sát được là 15,2 và 19,6ng/mg. Bốn chủng Methylobacterium khác nhau hiện diện trên bề mặt lá và một chủng của Methylobacterium extorquens đều có khả năng tạo cytokinin trans-zeatin với mức độ thấp và tiết vào trong môi trường nuôi cấy [32], [33], [35], [39], [40], [57], [58]. Trong những nghiên cứu về những hợp chất để tạo nên hương dâu tây ( Fragaria ananassa) cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium cần thiết cho quá trình tổng hợp tiền chất của 2,5-dimethyl-4-hydroxy-2Hfuran- 3-one (DMHF) và 2,5-dimethyl-4- methoxy-2H-furan-3-one (mesifuran). Khi callus (mô sẹo) dâu tây đồng nuôi cấy với vi khuẩn PPFM thì hàm lượng DMHF là 5g/860,5g mô tươi và 11g/357,97g ở mesifuran, không gram ở mẫu đối chứng. Sự gia tăng hàm lượng của DMHF và mesifuran là do vi khuẩn PPFM có khả năng oxy hóa 1,2-propanediol thành lactaldehyde. Vì lactaldehyde được tạo ra từ vi khuẩn được sử dụng bởi những tế bào dâu tây trong quá trình sinh tổng hợp hai furanones trên [100]. 2.3.4. Các ứng dụng khác của vi khuẩn Methylobacterium Ngoài khả năng tổng hợp các chất góp phần gia tăng khả năng tăng trưởng của thực vật Methylobacterium sp. còn có khả năng tổng hợp nhựa sinh học PHB (Poly- -Hydroxybutyrate). Khả năng này hiện diện ở nhiều vi sinh vật prokaryote bao gồm cả vi khuẩn Methylotrophic có khả năng tích lũy PHB nội bào như một dạng của nguồn cung cấp carbon và năng lượng. Hàm lượng PHB tạo ra phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy và con đường biến dưỡng của vi sinh vật. Vi khuẩn Methylotrophic sử dụng chu trình serine để khử formaldehyde có thể tích lũy PHB khoảng 80% trọng lượng khô. Trong khi đó, vi khuẩn Methylotrophic sử dụng chu trình Calvin-Benson- Bassham để khử C1 có thể tích lũy PHB khoảng 20% trọng lượng khô. Và ở vi khuẩn sử dụng methanol bắt buộc sử dụng chu trình ribulose monophosphate để khử hợp chất C1 thì không có sự tích lũy PHB được phát hiện. Trong một nghiên cứu khác của Ackermann và ctv (1994), lại cho thấy rằng, vi khuẩn Methylobacterium rhodesianum có thể tổng hợp PHB trong điều kiện giới hạn dinh dưỡng. Trong nghiên cứu này, ông chứng minh được rằng, khi vi khuẩn sinh trưởng trong điều kiện
21 giới hạn nitrogen thì có thể chúng tích lũy PHB lớn 2% trọng lượng thô của sinh khối sau 20 giờ nuôi cấy, còn trong điều kiện bị giới hạn của phosphate thì sự tích lũy PHB ít hơn và trong điều kiện giới hạn của nguồn cacbon thì PHB được tích lũy nhỏ hơn 2% trọng lượng sinh khối khô của vi khuẩn sau 20 giờ nuôi cấy [10], [65]. Ngoài ra, vi khuẩn Methylobacterium có khả năng sử dụng các chất hữu cơ khác nhau gồm các chất gây ô nhiễm môi trường và tổng hợp cá c hợp chất có lợi cho chính vi khuẩn cũng như có lợi cho đời sống của con người. Trong nghiên cứu của Van Aken và ctv (2004), chứng minh rằng vi khuẩn PPFM cộng sinh được phân lập từ môi trường nuôi cấy mô cây dương Populus deltoides nigra DN34. Chủng vi khuẩn thuần thuộc Methylobacterium sp. BJ001 có thể chuyển đổi hoàn toàn chất 25mg/l TNT, 20mg/l RDX, 2,5mg/l HMX sau 55 ngày nuôi cấy để tạo ra CO2. Trong khi đó, trong nghiên cứu của Fournier và ctv (2005), cho rằng chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. JS178 có khả năng phân hủy (sử dụng Nitramine 4-Nitro-2,4- Diazabutanal – NDAB – là sản phẩm phân cắt của hợp chất RDX – hexahydro-1,3,5- trinitro-1,3,5-triazine – là hợp chất độc giàu năng lượng) tạo ra khoáng nitramine trong điều kiện hiếu khí. Methylotrophic đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái do chúng có khả năng sử dụng methan-một loại khí gây hiệu ứng nhà kín. Ngoài ra, vi khuẩn Methylobacterium cũng có khả năng phân hủy nhiều hợp chất hữu cơ gây ô nhiễm khác bao gồm methyl chloride, methyl bromide, methyl iodide, dichloromethane, methyl tert-butyl ether, methylated amines, những hợp chất có chứa ethylated sulfur, và cyanate và thiocyanate [28], [36], [88], [89]. Hình 2.4: Sự nhiễm của vi khuẩn Methylobacterium sp. trên cây dương Poplar (P. deltoides _ nigra DN34) trong nuôi cấy mô [88]. Trong lĩnh vực thực phẩm vi khuẩn Methylobacterium cũng có thể góp phần quan trọng và đầy tiềm năng bởi vì chúng vừa có khả năng sử dụng các nguồn
22 nguyên liệu rẻ tiền vừa có thể tạo ra các sản phẩm có gia trị như protein đơn bào, - carotene, vitamine B12 và nhiều sản phẩm có giá trị khác [27], [90]. Từ những cơ sở này có thể kết luận rằng vi khuẩn PPFM có nhiều tiềm năng ứng dụng không chỉ trong nông nghiệp mà còn trong lĩnh vực môi trường, thực phẩm, Tuy nhiên, không phải tất cả các loài Methylobacterium đều có lợi mà một loài Methylobacterium sp. mới phát hiện có khả năng gây bệnh cho con người như Methylobacterium mesophilicum sống ở thực vật có khả năng gây dị ứng, sốt. Methylobacterium podarium tồn tại trong miệng có thể gây bệnh hôi miệng và cũng có thể gây bệnh hoa chân (foot flora) [11], [12], [83], [101]. 2.4. Phƣơng pháp định danh vi sinh vật 2.4.1. Định danh vi sinh vật bằng phƣơng pháp truyền thống. Là phương pháp phân loại dựa vào đặc điểm về hình thái, đặc diểm sinh lý, đặc điểm biến dưỡng, và đặc điểm sinh thái. Phương pháp này được Ferdinad Cohn thực hiện lần đầu tiên năm 1987. Mặc dù đây là phương pháp không chính xác nhưng phương pháp này có vai trò quan trọng trong bước đầu nghiên cứu định danh vi sinh vật. Đặc điểm hình thái bao gồm: hình dạng, kích thước tế bào, hình dạng màu sắc - khuẩn lạc, khả năng di động, … Đặc điểm sinh lý và biến dưỡng: là khả năng sử dụng các nguồn cacbon, - nitrogen, cách thức biến dưỡng năng lượng, mối quan hệ với oxy, pH, nhiệt độ thích hợp,… Để định danh vi sinh vật theo phương pháp truyền thống thường phải dựa vào các khóa phân loại (bảng sinh hoá). Khóa phân loại prokaryote đầy đủ nhất, phổ biến nhất, được sử dụng là khóa phân loại Bergey`s [4], [41], [77], [97].
23 Bảng 2.3: Đặc điểm sử dụng các nguồn carbon của các loài thuộc chi Methylobacterium [41] Chất 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 – – – Methylamine + + + + + + + + + + + - – – – – – – – – – – – – Trimethylanine + + + – Acetate + + + + + + + + + + + + + + – – – – – – – – Citrate + + + + + + + + + + + + + – – – – – Glutamate + + + + + + + + + + + + + + + + – – – – – – – – – – – – Glucose + + + + + + + + + – – – – – – – – – – – – – – Arabinose + + + + + + + – – – – – – – Fructose + + + + + + + + + + + + + + – – – – – Betaine + + + + + + nd + + + – – – – – Tartrate v V v – – – – – Serbacate + v + + Ethanol + + + + + V + v + – nutrient agar v + + + + + + + – – – – – – – Methane v chú thích: 1: M.suomiense; 2: M. lusitanum; 3: M. extorquens; 4: M. organophilum; 5: M. rhodesianum; 6: M. zatmanii; 7: M. rhodinum; 8: M. radiotolerans; 9: M. mesophilicum; 10: M. aminovorans; 11: M. fujisawaense; 12:M. thiosyanatum; 13: M. chloromethanicum; 14: M. dichloromethanicum;15: M. hispanium; 16: M. aquaticum; 17: M. variable; 18: M. isbiliense; 19: M. populi;20: M. nodulans. 21 :1019. +:có sử dụng; -: không sử dụng; ND: không xác định ; v: biến đổi. 2.4.2. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử (dựa vào vật liệu di truyền) 2.4.2.1. Sơ lƣợc về kỹ thuật sinh học phân tử. Kỹ thuật sinh học phân tử là thuật ngữ dùng để chỉ một nhóm gồm nhiều kỹ thuật mà có chung đặc điểm là sử dụng các vật liệu nghiên cứu có tính chất phân tử (vật liệu di truyền như: DNA, RNA, protein,.... Là phương pháp hiện đại, đạt kết quả nhanh chóng, và hiệu quả cao. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật và trang thiết bị hiện đại. + Sử dụng mẫu dò (probes) Mẫu dò là một trình tự acid nucleic được sử dụng để xác định sự hiện diện của một trình tự nucleotid đặc trưng của một chủng vi sinh vật đã biết trước. Mẫu dò là
24 một đoạn mạch đơn của acid nucleic thường là DNA được gắn với một nhân tố nhận biết là phóng xạ hay chất phát huỳnh quang. + Khuếch đại trình tự đặc trưng bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) [4], [67], [95]. Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các đoạn DNA mà không cần phải qua tạo dòng. Phương pháp này được K. Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Đây là phương pháp được thực hiện hoàn toàn trong ống nghiệm và trong một thời gian ngắn có thể thu rất nhiều bản sao DNA. Nguyên tắc của phương pháp PCR Phương pháp này được thực hiện trong ống nghiệm với sự hiện diện của enzyme DNA-polymerase, theo nguyên tắc bán bảo tồn trong nhân bản DNA. Sự khuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại. Phản ứng xảy ra nhờ enzyme DNA-polymerase. DNA sẽ tách thành hai mạch và từ 2 mạch DNA thành 4 mạch DNA, 4 mạch DNA thành 8 mạch DNA và cứ như thế nhân lên đến vô cùng. + Giải trình tự (sequencing) [5]. Là kỹ thuật xác định tất cả các thành phần nucleotide tạo nên phân tử acid nucleic chuyên biệt nào đó. Phương pháp giải trình tự đầu tiên do Maxam và Gilbert (1977), Sanger và ctv (1977), công bố. Một số phương pháp giải trình tự đang được sử dụng: - Phương pháp Maxam và Gilbert Phương pháp này dựa trên sự phân cắt hóa học tại vi trí đặc biệt của base tạo ra một phân tử DNA có đầu được đánh dấu và hình thành nên một loạt các đoạn DNA có đầu được đánh dấu bằng các loại base khác nhau. - Phương pháp Sanger Là phương pháp dùng một DNA polymerase để tổng hợp một bản sao có tính chất bổ sung từ một dây nền của DNA - Phương pháp giải mã bằng hệ thống tự động (phương pháp PCR trực tiếp) Nguyên tắc dựa vào việc phát hiện tính hiệu huỳnh quang từ những dNTP được đánh dấu. 2.4.2.2. Ứng dụng PCR và giải trình tự để định danh vi sinh vật. Ribosome 70S của prokaryote đóng vai trò chính trong tổng hợp protein, được cấu tạo từ protein và 3 loại phân tử rRNA (5S, 16S, 23S). Chúng đảm nhận chức năng
25 duy nhất ở tất cả các sinh vật, có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng trình tự ribonucleotide khác biệt giữa các loài và trình tự đặc trưng cho từng nhóm sinh vật. Do vậy, rRNA được xem là thước đo tiến hóa ở sinh vật và cũng là công cụ hữu ích cho phân loại và định danh vi sinh vật. Kỹ thuật này không chỉ dựa vào rRNA mà còn dựa vào rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA), vì DNA là vật liệu di truyền dễ thu nhận và có tính bền cao hơn RNA. Trong các loại rRNA thì rRNA 16S thích hợp nhất cho mục tiêu phân loại vì kích thước nó vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotide), một vài vùng trong rRNA 16S của tất cả các prokaryote có tính bảo tồn cao, trong khi đó một số vùng khác lại có một số khác biệt. Sau khi giải mã thì trình tự của đoạn rRNA đã biết được so sánh với các trình tự rRNA của tất cả các sinh vật trên ngân hàng gen nhờ phần mềm BLAST, hay sử dụng kết hợp các phần mềm để so sánh mức độ tương đồng của các trình tự. Từ những cơ sở dữ liệu này, ta có thể vẽ được cây phát sinh loài thể hiện mối quan hệ tiến hóa của các loài và vi trí của loài vi sinh vật cần định danh. Tuy nhiên, khi sử dụng trình tự rDNA 16S để định danh cần chú ý: Kích thước rDNA phải đủ lớn (> 1300nu) - Sự khác biệt giữa hai trình tự rDNA 16S của hai chủng vi sinh vật nhỏ hơn - 0,5%. Sau khi sử dụng các kiểm tra sinh lý, sinh hóa để định danh các loài thuộc chi Methylobacterium thì việc sử dụng trình tự 16S rRNA để dịnh danh vi khuẩn Methylobacterium là rất cần thiết vì các kiểm tra sinh lý, sinh hóa không thể đem lại kết quả chính xác. Phương pháp PCR khuếch đại trình tự 16S rRNA để phát hiện các loài Methylobacterium đã được sử dụng rộng rãi bởi tính chính xác của nó. Ngoài ra, trên ngân hàng gen của NCBI đã lưu trữ tất cả các trình tự gần như nguyên vẹn rDNA 16S (mã hóa cho 16S rRNA). Cho nên chỉ cần so sánh trình tự của chủng vi khuẩn cần định danh với các trình tự có sẵn trên ngân hàng thì có thể định danh được loài vi sinh vật mục tiêu [29], [30], [31], [68].
26 Phần III: Vật liệu và phƣơng pháp 3.1. Vật liệu 3.1.1. Mẫu thí nghiệm  Mẫu lá, đất, nước được lấy ngẫu nhiên trên ruộng lúa ở Tây Ninh  Thời gian tiến hành thí nghiệm từ ngày 06/ 02/ 2006 đến ngày 18/ 06/ 2006.  Tất cả các thí nghiệm được thực hiện tại Trại thực nghiệm Sinh học và Phòng Công nghệ Sinh học Phân tử, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh. 3.1.2. Thiết bị, dụng cụ  Máy hấp vô trùng autolave  Máy lắc tròn 100 vòng/phút  Máy ly tâm Miko 22R (Hettich Zentrifugen)  Máy điều nhiệt theo chu kỳ Techine  Bộ điện di ngang Mupid-EX (Advance)  Máy đo quang phổ RNA/DNA Gene Quantpro  Kính hiển vi (Olympus)  Eppendorf, Pippette,… Và một số dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Vi Sinh. 3.1.3. Hóa chất 3.1.3.1. Môi trƣờng phân lập và làm thuần vi khuẩn Methylobacterium sp.[34]. Thành phần môi trường Methanol Mineral Salts (MMS): - K2HPO4 1,2g - KH2PO4 0,62g - CaCl2.6H2O 0,05g - MgSO4.7H2O 0,2g - NaCl 0,1g - FeCl3.6H2O 1mg - (NH4)2SO4 0,5 g - CuSO4.5H2O 5g - MnSO4.5H2O 10 g - Na2MoO4.2H2O 10 g
27 - H3BO3 10 g - ZnSO4.7H2O 70 g - CoCl2.6H2O 5g Nước cất vừa đủ 1000ml - - pH 7 Môi trường MMS được thanh trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ 1210C trong 20 phút. Sau đó, để nguội và bổ sung methanol vào với nồng độ 0,1 – 0,2%. Đối với môi trường rắn thì bổ sung agar 20g/l trước khi hấp vô trùng. Không cần bổ sung vitamine hay các nhân tố tăng trưởng bởi vì các chủng PPFM hầu như không cần thiết trong quá trình tăng sinh. 3.1.3.2. Môi trƣờng giữ giống vi khuẩn Methylobacterium sp. Thành phần môi trường Glycerol-Peptone Agar:[34]. - Agar 15g - Glycerol 10g - Peptone 10g Nước vất vừa đủ 1000ml - 3.1.3.3. Môi trƣờng khảo sát khả năng sử dụng hợp chất cung cấp nguồn cacbon của vi khuẩn Methylobacterium sp. [4], [6], [34] Môi trường khảo sát là môi trường MMS. Trong đó, methanol được thay thế bằng 1% các chất cung cấp cung cấp nguồn cacbon. 3.1.3.4. Môi trƣờng nhân sinh khối vi khuẩn [4], [6]. Môi trường khoáng MS bổ sung 30g/l sucrose, 1mg/l glycine, 1mg/l B1, 100mg/l meso inositol, 2g/l cao thịt, 2g/l casein hydrolyase ký hiệu: CMS. Môi trường cao thịt – peptone (CP) gồm 0,3% cao thịt, 1% peptone, 0,5% NaCl, pH = 6,5. 3.1.3.5. Bộ thử nghiệm sinh hóa định danh trực khuẩn gram âm IDS14GR.
28 3.2. Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm Lấy mẫu Tăng sinh vi khuẩn Phân lập Làm thuần Xác định hình thái Kiểm tra sinh lý, sinh hóa Chiết tách DNA Thực hiện PCR Giải trình tự Xử lý kết quả Kết luận 3.2.1. Lấy mẫu Mẫu được lấy ngẫu nhiên trên ruộng lúa ở ba xã khác nhau:xã Truông Mít (huyện Dương Minh Châu), xã Gia Lộc (huyện Trảng Bàng), xã Bàu Đồn (huyện Gò Dầu) tỉnh Tây Ninh bao gồm các mẫu lá, nước, đất. Giờ lấy mẫu : sáng từ 7 – 9 giờ. 3.2.2. Tăng sinh vi khuẩn Đối với mẫu lá, dùng hai phương pháp là: Leaf print trực tiếp trên đĩa môi trường, hoặc qua quá trình tăng sinh trên môi trường chọn lọc.
29 Sau khoảng 2 – 3 ngày lấy mẫu dùng pippet hút 100 l môi trường tăng sinh cho vào môi trường rắn để tiến hành phân lập vi khuẩn 3.2.3. Phân lập vi khuẩn Đối với mẫu đất chúng tôi tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau từ 10–1, - 10–2,… 10– 6. Sau đó từ mỗi nồng độ hút 100 l cho vào môi trường rắn. Đối với mẫu nước chúng tôi tiến hành phân lập trực tiếp không qua quá trình - tăng sinh, hút cho vào môi trường rắn mỗi đĩa là 40 l Đối với mẫu lá sau khi tăng sinh dùng pipet vô trùng hút 100 l cấy vào môi - trường rắn Sau khi cấy chuyển vào môi trường rắn đem tất cả các đĩa môi trường đã cấy vi - khuẩn nuôi ở nhiệt độ 300C. Sau 2 – 4 ngày xem kết quả và chọn khuẩn lạc hồng đặt trưng để làm thuần. 3.2.4. Làm thuần. Khuẩn lạc thuần đóng vai trò quan trọng quyết định đến kết quả và độ chính xác trong thử nghiệm sinh hóa cũng như các thử nghiệm khác. Do đó, để có khuẩn lạc thuần phục vụ cho tiến trình thử nghiệm sinh hóa chúng tôi tiến chọn lọc khuẩn lạc có màu hồng đặc trưng trên môi trường phân lập cấy ria trên đĩa môi trường mới nhiều lần (3 – 4 lần), để tạo chủng thuần. 3.2.5. Giữ giống. Để có chủng vi khuẩn tiến hành các nghiên cứu có liên quan nên chúng tôi dùng vi khuẩn thuần cấy sang môi trường giữ giống GPA và bảo quản giống trong glycerol 50% trong điều kiện đông lạnh. 3.2.6. Khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa Được tiến hành với các thử nghiệm chủ yếu sau: 3.2.6.1. Thử nghiệm gram và đo kích thƣớc tế bào [4], [6], [7] Thử nghiệm Gram là thử nghiệm đầu tiên, đơn giản trong các thử nghiệm sinh hóa nhưng thử nghiệm Gram có ý nghĩa quan trọng trong quá trình định danh vi sinh vật. Để xác định Gram các chủng đã phân lập và làm thuần chúng tôi tiến hành theo hai phương pháp: + Phương pháp String test - Thử nghiệm String [15]
30 Phương pháp này dựa vào khả năng tạo nhầy giữa sinh khối của vi khuẩn với dung dịch KOH 3%. Dưới tác dụng của dung dịch kiềm loãng vách tế bào vi khuẩn Gram âm bị phân hủy làm giải phóng DNA và tạo dịch nhầy khi phản ứng với KOH. String dương (dương tính) khi giữa que cấy và dung dịch có sợi nhầy mảnh, tức là vi khuẩn Gram âm, ngược lại khi String âm thì vi khuẩn là Gram dương. + Phương pháp nhuộm Gram Nguyên tắc: Phương pháp nhuộm Gram dựa vào khả năng lưu giữ crystal violet của thành tế bào các dòng vi khuẩn sau khi bị tẩy bằng cồn. Cấu tạo thành tế bào vi khuẩn bắt màu Gram dương gồm các thành phần peptidoglycan nhiều hơn ở thành tế bào vi khuẩn bắt màu Gram âm, ngược lại thành phần lipid của chúng lại thấp hơn. Iod được thêm vào như một chất cắn màu để tạo thành hợp chất crystal violet-iodine bền với cồn. Giai đoạn này là giai đoạn cố định màu. Ở giai đoạn rửa cồn, lớp chất béo ở vi khuẩn gram âm bị cồn hòa tan dẫn đến chất nhuộm ban đầu bị hòa tan vào dung môi. Ngược lại, ở vi khuẩn gram dương chất nhuộm ban đầu bao bọc thành tế bào thành lớp dày và hợp chất violet-iodine không bị phai ra môi trường xung quanh. Do đó, vi khuẩn gram dương vẫn giữ được màu nhuộm ban đầu. Vi khuẩn gram âm sau khi nhuộm có màu hồng đỏ còn vi khuẩn gram dương có màu tím. Tiến hành: Cho sinh khối vi khuẩn lên lam kính sạch để khô tự nhiên. - Hơ mặt dưới của lam trên ngọn lửa 2 – 3 lần (tránh để tiêu bản quá nóng). - Phủ dung dịch Crystal violet lên lam kính trong một phút. - Đổ bỏ dịch Crystal violet và rửa bằng nước cất. - Phủ dung dịch lugol để một phút sau đó đổ bỏ lugol và rửa nhẹ bằng nước. - Tẩy màu bằng cồn trong khoảng 10 – 15 giây. - Rửa lại bằng nước. - Phủ dịch fuschin lên lam kính trong khoảng 30 giây. Đổ bỏ fuschin và rửa bằng - nước. Dùng giấy thấm để thấm hay để khô tự nhiên. - Xem kết quả dưới kính hiển vi độ phóng đại của vật kính 100X với một giọt - dầu
31  Các chủng vi khuẩn trong thí nghịêm được thử nghiệm sau 2, 4, 6, 8 ngày nuôi cấy trên môi trường CMS. + Đo kích thước tế bào Sau khi nhuộm gram, quan sát dưới khính hiển vi độ phóng đại vật kính 100X và đo kích thước tế bào. 3.2.6.2. Mối quan hệ với oxi Được tiến hành qua thử nghiệm catalase và hoạt tính oxidase trong bộ thử nghiệm IDS14GR. + Thử nghiệm catalase Nguyên tắc: Nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase trong vi khuẩn. Phương pháp thử: Thử trên lam: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc thuần đặt lên lam kính sạch. Nhỏ một - giọt H2O2 30% lên vi sinh vật trên lam. Thử trong ống nghiệm: Nhỏ trực tiếp 1ml H2O2 30% lên dòng thuần vi sinh vật - cấy dày đặt trên mặt thạch nghiêng. Kết quả: Thử nghiệm dương tính khi có bóng khí xuất hiện, âm tính khi không có bóng khí. + Thử nghiệm oxidase: Nguyên tắc: nhằm xác định hoạt tính cytochrome oxidase trong các loài sinh vật hiếu khí hay hiếu khí tùy ý. Phương pháp: dàn điều sinh khối vi khuẩn lên đĩa giấy có tẩm dung dịch tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (TMPD) quan sát sự xuất hiện màu xanh dương trong khoảng một phút. 3.2.6.3. Khảo sát khả năng di động Khả năng di động của vi khuẩn được ghi nhận khi thử nghiệm cấy vi khuẩn trong thạch mềm. Nếu vi khuẩn chỉ phát triển xung quanh đường cấy thì vi khuẩn không di động nếu vi khuẩn mọc lan rộng khỏi đường cấy thì vi khuẩn có khả năng di động. Môi trường thử nghiệm là môi trường thạch mềm LDC (trong IDS14GR) 3.2.6.4. Thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn cacbon của vi khuẩn. Nguyên tắc: Trong quá trình biến dưỡng vi khuẩn sử dụng các nguồn cacbon để tăng trưởng, đồng thời tiết ra các chất làm thay đổi pH môi trường. Do đó, khi sử
32 dụng chất chỉ thị pH là bromothymol blue thì khả năng sử dụng các nguồn cacbon của vi khuẩn được ghi nhận bằng sự thay đổi màu của môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Ở pH trung tính thì màu môi trường là xanh lá cây, acid là màu vàng và màu xanh dương khi pH kiềm. Phản ứng dương khi màu môi trường thay đổi so với màu môi trường đối chứng âm (màu xanh lá cây, không cấy vi khuẩn). Mục đích: Nhằm sàng lọc và xác định các nhóm khuẩn lạc đã phân lập theo các đặc tính sinh hóa, tạo tiền đề thuận lợi cho các thử nghiệm định danh sau này nên chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn cacbon của các khuẩn lạc thuần phân lập được. Vật liệu: Các khuẩn lạc thuần đã phân lập. Tiến hành: Pha môi trường MMS hấp vô trùng, sau đó bổ sung 1% chất cung cấp nguồn cacbon và chất chỉ thị pH 2ml/l vào môi trường điều chỉnh pH môi trường ở 7 2 bằng KOH 1N và HCl 1N. Sau đó cho môi trường vào các lổ của microplate 1ml/lỗ, cấy vi khuẩn vào các lỗ ngoài trừ lỗ đối chứng. Các chất cung cấp nguồn cacbon đã thử nghiệm: L-arabinose, fructose, ethanol, L- glutamate, acetate, methylamine, trimethylamine, serbacate, D-glocose, sucrose, manitol, maltose, betaine, citrate, lactose và môi trường nutrient agar tổng hợp (Merk). 3.2.6.5. Các thử nghiệm trong bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR. Để có thể định danh chính xác hơn các dòng vi khuẩn đã phân lập và thử nghiệm ở trên, nên chúng tôi tiếp tục khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác bằng bộ thử nghiệm sinh hóa định danh vi khuẩn gram âm IDS 14GNR của công ty Nam Khoa. Các thử nghiệm trong bộ thử nghiệm IDS 14GNR bao gồm: + Khả năng lên men glucose (MR) Nhằm kiểm tra khả năng của vi sinh vật lên men glucose tạo các sản phẩm cuối mang tính acid và vượt qua khả năng ổn định pH của môi trường. Đây là phép thử định tính về khả năng sinh acid (xác định pH) do một số vi sinh vật sinh acid nhiều hơn các vi sinh vật khác. + Khả năng khử nitrate Xác định sự hiện diện của enzyme nitratreductase ở vi sinh vật, và chúng có khả năng sử dụng nitrate làm nguồn thức ăn nitơ. Ngoài ra, một số vi sinh vật có khả
33 năng sử dụng nitrate làm chất nhận electron hay H+ trong hô hấp kị khí để oxy hóa các hợp chất hữu cơ NO3- + 2e- + 2H+  NO2- + H2O. + Khả năng sinh tổng hợp galactosidase (thử nghiệm ONPG, o-nitrophenyl-β -D- galactopyranoside) Nhằm xác định sự có mặt của enzyme β-galactosidase có ở vi sinh vật nhờ sự hiện diện của cơ chất ONPG. Khi vi khuẩn có enzyme này thì nó sẽ phân cắt ONPG làm giải phóng nitrophenyl làm môi trường xuất hiện màu vàng. Mục đích: Phân biệt vi khuẩn có khả năng sử dụng lactose. + Khả năng tạo urease Xác định khả năng của vi sinh vật phân giải urea tạo ra hai phân tử ammonia do tác dụng của enzyme urease làm kiềm hóa môi trường + Khả năng tạo phenylalanine deaminase (PAD) Nhằm xác định sự hiện diện của enzyme PDA ở vi khuẩn và khử nhóm amine của phenylalanine. + Khả năng sử dụng citrate Nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sử dụng citrate như nguồn cacbon duy nhất cho hoạt động trao đổi chất và làm kiềm hóa môi trường. + Khả năng thủy giải Esculin Nhằm xác định khả năng thủy phân glycoside esculin thành glucose và esculetin của một số vi khuẩn, trong điều kiện có sự hiện diện của 40% muối mật. + Khả năng sinh H2S Xác định khả năng của vi sinh vật có khả năng sinh H2S từ các acid amin chứa lưu huỳnh tạo chất tủa màu đen. + Thử nghiệm Voges – Proskauer Nhằm xác định khả năng của vi sinh vật có khả năng tạo sản phẩm cuối cùng mang tính trung tính là acetoin (acetylmethylcarbinol – AMC) do lên men glucose. + LDC (lysin decarboxylase) Mục đích: Phát hiện vi khuẩn có khả năng phân giải lysin trong môi trường bằng cách khử nhóm carboxyl nhờ enzyme lysin decarboxylase. + Khả năng sử dụng malonate
34 Nhằm khảo sát khả năng của vi khuẩn sử dụng sodium malonate làm nguồn cacbon. Khi vi khuẩn sử dụng malonate sẽ sinh ra phản ứng kiềm, và làm biến đổi màu môi trường. + Khả năng sinh indole Mục đích: Khảo sát khả năng thủy giải tryptophan trong môi trường tạo nhân indole Tất cả các hóa chất của phản ứng sinh hóa được tẩm trong các đĩa giấy, sau đó cho vào các giếng được đánh số. Khi sử dụng lấy sinh khối vi khuẩn trên môi trường thạch, huyền phù vào nước muối sinh lý, sau đó cho 200μl dịch huyền phù này cho vào mỗi giếng ủ 36 giờ và đọc kết quả theo bảng sau: Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả bộ thử nghiệm sinh hoá IDS14GNR. Phản ứng sinh hóa Thuốc thử Dương tính Âm tính Stt Lên men glucose Không vàng Tím 1 Khử nitrate 1 giấy tìm nitrate đỏ Vàng lợt 2 Không Vàng không màu 3 Galactosidase Không đỏ cánh sen Đỏ nhạt/vàng 4 Urease 1 giọt FeCl3 xanh lá đậm Vàng lợt 5 PDA Không xanh biển Xanh lá/vàng 6 Citrate Không Đen Không 7 Esculin Không Đen Không 8 Sinh H2S Chuyển màu Không đổi màu 9 Sinh indole Kovac đỏ Voges – Poskauer 1 giọt KOH, 1 giọt Đỏ Vàng nhạt 10 naphthol Sử dụng malonate Không Xanh biển Vàng/ xanh lá 11 Không Tím Vàng 12 LDC 3.2.6.6. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH Bao gồm các thí nghiệm: + Xác định đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế bào [3], [6], [7] Vi khuẩn nuôi cấy sau 48 giờ sau đó pha loãng thành các độ đục khác nhau có OD lân cận 0,1, 0,2; 0,4; 0,5.
35 Từ các độ đục tiến hành pha loãng đến 10-5; 10-6; 10-7. Từ mỗi độ pha loãng cấy 0,1ml vào mỗi đĩa môi trường rắn CP. Ủ 300C trong 48 giờ đếm khuẩn lạc ở các đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 20 – 300. Tính số lượng tế bào trên ml mẫu bằng công thức: Ndi = A x 10 x di. Trong đó: Ndi: số lượng tế bào ở độ pha loãng di - A: số khuẩn lạc đếm được trên đĩa. - d: số lần pha loãng i. - Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa OD và log(N/ml) bằng phần mềm excel. + Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi khuẩn Mục đích: Nhằm xác định nhiệt độ thích hợp cho sử phát triển của các chủng đã phân lập phục vụ cho những nghiên cứu ứng dụng sau này. Vật liệu: Bốn chủng vi khuẩn đã phân nhóm ở những thí nghiệm trên được nuôi cấy trên môi trường cao-pep lỏng ở 20, 25, 30, 35, và 400C và đo OD ở bước sóng 610nm sau ba ngày. + Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi khuẩn Mục đích: Nhằm xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển của các chủng phân lập được để làm cơ sở cho những nghiên cứu ứng dụng sau này. Tiến hành: Cấy vi khuẩn vào các ống nghiệm chứa môi trường cao thịt-peptone lỏng với các khoảng pH từ 4,0 – 8,5 (cách nhau 0,5). Nuôi cấy lắc 100vòng/phút, sau ba ngày ghi nhận độ đục OD610nm. 3.2.6.7. Xác định đƣờng cong tăng trƣởng của vi khuẩn Nhằm xác định thời gian thích hợp để thu sinh khối và các hoạt chất do vi khuẩn tiết ra. Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy lắc ở 250C trong môi trường CMS và tiến hành đo OD610nm 4 giờ/lần trong vòng 48 giờ. 3.3. Định danh vi khuẩn Mục tiêu này được thực hiện bằng các thí nghiệm sau: 3.3.1. Tính hệ số tƣơng đồng di truyền Hệ số tương đồng di truyền Jaccard (Sj) cho phép xác định mức độ giống nhau của hai loài vi khuẩn. Vì vậy, để xác định mối quan hệ họ hàng của các chủng