luận văn: NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHẤT HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ CỦA NGƯỜI TRONG VI KHUẨN Echerichia coli

Chia sẻ: Nguyễn Thị Bích Ngọc | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:65

Thêm vào BST

Báo xấu

179
lượt xem 47
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bắt đầu từ những năm đầu thập niên 1970, các thành tựu về sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền giúp chúng ta có thể hiểu rõ bản chất phân tử của các bệnh xuất hiện trên động vật, thực vật và đặc biệt là trên người. Giáo sư Paul Berg thuộc trường đại học Stanford (Hoa Kỳ), người được nhận giải Nobel hóa học năm 1980, là người đầu tiên tạo ra DNA tái tổ hợp (recombinant DNA- rDNA) vào năm 1972...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: luận văn: NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHẤT HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ CỦA NGƯỜI TRONG VI KHUẨN Echerichia coli

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -------------------------------------------- HOÀNG PHÚ HIỆP NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHẤT HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ CỦA NGƯỜI TRONG VI KHUẨN Echerichia coli LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên – 2008
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -------------------------------------------- HOÀNG PHÚ HIỆP NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHẤT HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ CỦA NGƯỜI TRONG VI KHUẨN Echerichia coli Chuyên ngành : Di truyền học Mã số : 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. LÊ THỊ THU HIỀN Thái Nguyên - 2008
MỤC LỤC Trang Bảng viết tắt ............................................................................................................. 1 Danh mục các hình ................................................................................................... 2 Mở đầu .................................................................................................................... 3 Chương 1: Tổng quan tài liệu ............................................................................... 5 1.1. Bệnh tim mạch ............................................................................................. 5 1.2. Chất hoạt hóa plasminogen.......................................................................... 5 1.3. Chất hoạt hóa plasminogen mô người ......................................................... 9 1.4. Vai trò của chất hoạt hóa plasminogen mô trong quá trình làm tan máu đông ............................................................................................. 12 1.5. Nghiên cứu ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô người ......................................................................................................... 14 1.6. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ............................................................... 18 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ................................................ 19 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị ........................................................................ 19 2.1.1. Vật liệu ..................................................................................................... 19 2.1.2. Hóa chất .................................................................................................... 20 2.1.3. Thiết bị ...................................................................................................... 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 20 2.2.1. Điện di DNA trên gel agarose .................................................................. 20 2.2.2. Điện di protein trên gel polyacrylamide ................................................... 21 2.2.3. Phản ứng dây chuyền polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR) ........................................................................................ 22 2.2.4. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế ............................................................ 23 2.2.5. Ghép nối DNA .......................................................................................... 23 2.2.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt .............................................................................. 24 2.2.6.1. Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli ............................................................ 24 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.6.2. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli............................................. 24 2.2.7. Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid ...................................................... 25 2.2.8. Xác định trình tự gen ................................................................................ 26 2.2.9. Biểu hiện protein trong vi khuẩn E. coli................................................... 27 Chương 3: Kết quả và thảo luận ........................................................................... 28 3.1. Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa h-tPA................................. 28 3.1.1. Nhân đoạn cDNA mã hóa h-tPA bằng kỹ thuật PCR ............................... 28 3.1.2. Ghép nối cDNA mã hóa h-tPA vào vector pGEX6p1 và pET21a(+) ..................................................................................................... 30 3.1.2.1. Xử lý sản phẩm PCR cDNA mã hóa h-tPA bằng enzyme hạn chế .......................................................................................................... 30 3.1.2.2. Xử lý vector pGEX6p1 và pET21a(+) bằng enzyme hạn chế ..................... 31 3.1.2.3. Ghép nối cDNA mã hóa h-tPA vào vector pGEX6p1 và pET21a(+) ..................................................................................................... 32 3.1.3. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hóa h-tPA ................. 32 3.1.3.1. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E. coli bằng phương pháp sốc nhiệt ................................................................................................ 32 3.1.3.2. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hoá h-tPA ............................................................................................................. 33 3.1.4. Xác định và phân tích trình tự cDNA mã hóa h-tPA ............................... 37 3.2. Biểu hiện gen ............................................................................................... 43 3.2.1. Tổng hợp protein h-tPA tái tổ hợp ........................................................... 43 3.2.2. Kiểm tra protein bằng phương pháp điện di trên SDS-PAGE ................. 43 Kết luận và đề nghị ................................................................................................ 47 Tài liệu tham khảo ................................................................................................. 48 Phụ lục ..................................................................................................................... 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
BẢNG VIẾT TẮT Amp Ampicillin kb Kilo base Bp Cặp bazơ (Base pair) LB Luria – Bertani Calf Intestinal Alkaline Vùng serine protease (Serine CIAP P Phosphatase protease) Dideoxynucleoside Chất hoạt hóa plasmingen ddNTP PA triphosphate (Plasminogen activator) Chất ức chế chất hoạt hóa DNA Deoxyribonucleic acid PAI plasminogen (Plasminogen activator inhibitor) Phản ứng dây chuyền Deoxynucleoside dNTP PCR polymerase (Polymerase Chain triphosphate Reaction) DNA tái tổ hợp (Recombinant E. coli Escherichia coli rDNA DNA) Ethylene Diamine Tetra- EDTA RNA Ribonucleic acid acetic Acid Vùng nhân tố sinh trưởng EGF biểu bì (Epidermal growth RNase Ribonuclease factor region) Chất hoạt hóa urokinase sợi đơn EtBr Ethidium bromide scuPA (single chain urokinase - type plasminogen activator) F Vùng “ngón tay” (Finger) SDS Sodium Dodecyl Sulphate GST Glutathione S-transferase SK Streptokiase Chất hoạt hóa plasminogen h- tPA mô người (Human tissue TAE Tris-acetate- EDTA plasminogen activator) Chất hoạt hóa plasminogen mô IPTG Isopropyl b-D thiogalactoside tPA (Tissue - type plasminogen activator) Chất hoạt hóa urokinase K1 Vùng Kringle 1 uPA (Urokinase - type plasminogen activator) K2 Vùng Kringle 2 v/p Vòng/ phút Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc của tPA và uPA 7 Formatted: Font: Bold 1.2 Các vùng của tPA 10 Formatted: Font: Bold 1.3 Cấu trúc h-tPA 11 Formatted: Font: Bold 1.4 Quá trình phân hủy huyết khối 13 Formatted: Font: Bold 1.5 Con đường phân giải tơ máu (Fibrin) 13 Formatted: Font: Bold 2.1 Bản đồ vector pET21a(+) và pGEX6p1 19 Formatted: Font: Bold 3.1 Sản phẩm PCR nhân cDNA mã hóa h-tPA 30 Kết quả xử lý cDNA mã hóa h-tPA và các vector biểu hiện Formatted: Font: Bold 32 3.2 bằng enzyme hạn chế Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt Chọn dòng pGEX6p1 Formatted: Font: Bold 3.3 34 mang cDNA mã hóa h-tPA (pGEX6p1/h-tPA) Chọn dòng pET21a(+) Formatted: Font: Bold 3.4 35 mang cDNA mã hóa h-tPA (pET21a(+)/h-tPA) Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA 3.5 36 bằng enzyme hạn chế Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA 3.6 37 bằng kỹ thuật PCR So sánh trình tự nucleotide của h-tPA trong pGEX6p1/h- Formatted: Font: Bold 3.7 42 tPA và pET21a(+)/h-tPA với NM_000930 Formatted: Font: Bold 3.8 Kiểm tra kiểm tra protein h-tPA trong pGEX6p1/h-tPA p3 44 3.9 Kiểm tra protein h-tPA trong pET21a(+)/h-tPA p1 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 http://www.lrc-tnu.edu.vn
MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Bắt đầu từ những năm đầu thập niên 1970, các thành tựu về sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền giúp chúng ta có thể hiểu rõ bản chất phân tử của các bệnh xuất hiện trên động vật, thực vật và đặc biệt là trên người. Giáo sư Paul Berg thuộc trường đại học Stanford (Hoa Kỳ), người được nhận giải Nobel hóa học năm 1980, là người đầu tiên tạo ra DNA tái tổ hợp (recombinant DNA- rDNA) vào năm 1972. Kể từ đó đến nay, công nghệ rDNA và những ứng dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm đã thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của các công ty công nghệ sinh học và các dược phẩm tạo ra nhờ công nghệ rDNA (dược phẩm sinh học) nhằm phục vụ và bảo vệ sức khỏe con người [44]. Trong lĩnh vực nghiên cứu tạo các loại dược phẩm làm tan các cục máu đông để điều trị huyết khối và các rối loạn huyết khối tắc mạch, cuối những năm 1980, thông qua công nghệ rDNA, các nhà khoa học đã nghiên cứu và tạo ra một số loại dược phẩm sinh học là các protein tái tổ hợp có khả năng làm tan các cục máu đông “đặc hiệu”. Một trong những protein đó, chất hoạt hóa plasminogen mô của người (human tissue plasminogen activator- h-tPA) đã được nhiều nhóm tác giả trên thế giới nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong y dược. DNA bổ sung (complementary DNA- cDNA) của gen mã hóa h-tPA đã được phân lập, tạo dòng, biểu hiện ở nhiều loại tế bào như tế bào trứng chuột đồng (Chinese hamster ovary- CHO), tế bào thận chuột chưa trưởng thành... và sản xuất dưới dạng dược phẩm tái tổ hợp [39]. Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo các dược phẩm bằng công nghệ sinh học đang bắt đầu được tiếp cận. Việc nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen mô trong vi khuẩn Escherichia coli tiến tới sản xuất dược phẩm sinh học phục vụ bảo vệ sức khỏe con người có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Xuất phát từ các lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen mô của ngƣời trong vi khuẩn Escherichia coli”. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 http://www.lrc-tnu.edu.vn
2. Mục tiêu nghiên cứu Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ rDNA để thiết kế vector và biểu hiện gen mã hóa h-tPA trong vi khuẩn E. coli nhằm tiến tới sản xuất protein h-tPA tái tổ hợp có giá trị sử dụng trong y dược. 3. Nội dung nghiên cứu - Tạo dòng gen mã hóa h-tPA trong các vector biểu hiện thích hợp. - Biểu hiện gen mã hóa h-tPA trong vi khuẩn E. coli. 4. Những điểm mới của đề tài Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học để tiếp tục nghiên cứu nhằm tiến tới ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô của người - một dược phẩm công nghệ sinh học có giá trị hoàn toàn chưa được nghiên cứu và sản xuất ở nước ta. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Bệnh tim mạch Bệnh tim mạch là các bệnh liên quan đến những rối loạn ảnh hưởng tới tim và các mạch máu bao gồm bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não, bệnh mạch máu ngoại biên và tăng huyết áp. Bệnh tim mạch là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên thế giới. Mỗi năm, bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong cho 17,5 triệu người và dự đoán sẽ có khoảng 25 triệu người bị bệnh tim mạch tử vong vào năm 2020. Bệnh tim mạch cũng được dự đoán sẽ là nguyên nhân lớn nhất gây tàn phế cho người vào năm 2020. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), cứ mỗi 2 giây có 1 người chết vì bệnh tim mạch. Cứ mỗi 5 giây thì có 1 trường hợp nhồi máu cơ tim và mỗi 6 giây thì có một trường hợp đột quỵ. Hiện có đến 300 yếu tố nguy cơ kết hợp với bệnh mạch vành và đột quỵ sẽ dẫn đến bệnh tim mạch [60]. Một trong những nguyên nhân sinh lý quan trọng dẫn tới các bệnh tim mạch là do thành mạch bị tổn thương, dẫn tới hình thành huyết khối bên trong mạch máu. Do vậy, điều trị huyết khối là một trong những phương pháp hiệu quả giúp làm giảm nguy cơ tử vong và các biến chứng ở các bệnh nhân mắc bệnh tim mạch, đặc biệt là ở các bệnh nhân đột quỵ và nghẽn mạch máu. Trong phác đồ điều trị huyết khối và bệnh tim mạch, chất hoạt hóa plasminogen (plasminogen activator, PA) đóng vai trò quan trọng và được xem là thuốc điều trị có hiệu quả cao. Chất hoạt hóa plasmminogen có vai trò biến đổi plasminogen thành plasmin- là chất phân hủy huyết khối (thrombolytic). Plasmin sau đó sẽ hòa tan dần fibrin và fibrinogen từ đó làm tan huyết khối. Bằng công nghệ gen, các PA đã được nghiên cứu và đưa vào sản xuất nhằm tạo ra thuốc đặc hiệu trong điều trị huyết khối và bệnh tim mạch. Tuy nhiên, do quy trình sản xuất phức tạp nên giá thành của sản phẩm này khá cao. 1.2. Chất hoạt hóa plasminogen Chất hoạt hóa plasminogen có tác dụng quan trọng trong quá trình làm tan khối máu đông. Chất hoạt hóa plasminogen là nhóm enzyme duy nhất chuyển chất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 http://www.lrc-tnu.edu.vn
xúc tác plasminogen từ dạng bất hoạt sang dạng hoạt động - plasmin. Vì đặc tính này, một vài loại plasminogen khác nhau đã được sử dụng nhằm điều trị các chứng bệnh tim mạch. Chất hoạt hóa plasminogen gồm bốn nhóm chính. Một nhóm là chất hoạt hóa plasminogen urokinase (urokinase- type plasminogen activator, uPA). Chất này có liên quan đến kháng thể urokinase và không kết hợp với tơ máu. Bởi vậy chất hoạt hóa này được cho rằng có thể có liên quan đến hoạt hóa plasminogen trong pha lỏng của huyết thanh. Loại thứ hai là chất hoạt hóa plasminogen mô (tissue-type plasminogen activator, tPA), có khả năng tương tác với kháng thể chất hoạt hóa mô và kết hợp với tơ máu. Loại thứ ba là streptokinase (SK). SK hoạt hóa plasminogen bằng cơ chế trực tiếp. Cuối cùng là enzyme phân hủy tơ máu (fibrinolysis) được giải phóng nhanh khi huyết tương bị tổn thương và giải phóng một số chất hoạt hóa vào thành mạch [18], [47]. Chất hoạt hóa plasminogen urokinase là sản phẩm chính của thận, tồn tại dưới dạng phân tử chất hoạt hóa urokinase sợi đơn (single chain urokinase - type plasminogen activator - scuPA) không hoạt động. Chất hoạt hóa plasminogen urokinase được phân lập có hai dạng: dạng có trọng lượng phân tử cao (khối lượng 54,7kDa) và dạng có trọng lượng phân tử thấp (khối lượng 31,5kDa) [18]. Chúng có hai chức năng: chức năng chính là tham gia trong phân giải protein mô liên kết và chức năng thứ hai được biết đến với vai trò điều khiển của tPA như chất hoạt động sinh lý trong máu [30]. Sự hoạt hóa của scuPA do sự phân hủy xung quanh bởi plasmin trong cấu trúc hai sợi dẫn tới việc tăng hoạt tính của plasminogen lên. Thông qua quá trình này, một số lượng nhỏ của plasmin có thể xúc tác sản phẩm uPA hoạt động, ảnh hưởng tới hình dạng của nhiều plasmin. Chất hoạt hóa plasminogen urokinase có thể chỉ hoạt hóa plasminogen với sự có mặt của fibrin. Tuy nhiên, nó sẽ không kết hợp với fibrin và sẽ không phân hủy fibrin. Trong huyết tương người, nồng độ kháng thể uPA từ 2 đến 7ng/ml. Giá trị cao nhất thường được tìm thấy trong bệnh nhân gan mãn tính và ung thư gan [9]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 1.1. Cấu trúc của tPA và uPA [9] Gen mã hóa tPA và protein này đã được nhiều nhóm tác giả trên thế giới nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong y- dược [31], [40]. Những nghiên cứu gần đây cho thấy tPA còn đóng vai trò quan trọng trong hệ thống thần kinh [49], [56]. Ở người và các động vật khác, tPA đóng vai trò quan trọng trong hệ thống tiêu hủy fibrin [53], [54]. Đối với các trường hợp mắc bệnh huyết khối, sau khi tPA được đưa vào cơ thể, dưới tác dụng của tPA, plasmin sẽ được tạo ra chủ yếu tại vị trí hình thành huyết khối, nên tránh được tình trạng phân hủy ở những vùng khác trong cơ thể, tuy nhiên hoạt tính chọn lọc này chỉ là tương đối [21]. Streptokinase là một chất hoạt hóa plasminogen ngoại sinh có khối lượng 47kDa. Hiện nay, Streptokinase được thu chủ yếu từ nuôi cấy vi khuẩn Streptococci B-hemolytic. Streptokinase có chức năng tương tự với plasminogen ở người. Chức năng chính là phụ thêm vào thay đổi cấu trúc trong phân tử plasminogen, làm trung tâm hoạt động của phân tử plasminogen này hoạt động để hoạt hóa phân tử plasminogen thứ hai bằng cách cắt phân tử plasminogen thứ hai tại vị trí Agr 560- Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 http://www.lrc-tnu.edu.vn
Val561. Tiếp theo, plasminogen trong hỗn hợp Streptokinase- plasminogen sẽ được chuyển thành plasmin, cuối cùng, hỗn hợp tách nhau hình thành dạng Streptokinase và plasmin tự do. Cả hai loại của hỗn hợp Streptokinase đều ảnh hưởng ngang nhau tới sự hoạt hóa của plasminogen: Streptokinase + plasminogen → Streptokinase-plasminogen Streptokinase- plasminogen + plasminogen → streptokinase- plasmin + plasmin Streptokinase- plasmin + plasminogen → streptokinase- plasmin + plasmin Streptokinase là một chất hoạt hóa plasminigen không đặc hiệu. Việc dùng Streptokinase dẫn tới tình trạng phân hủy hệ thống. Một tác dụng không mong muốn của việc dùng Streptokinase là gây cảm ứng việc đáp ứng của chất trợ đông thông qua việc tăng giải phóng thrombin. Mặc dù đáp ứng trợ đông xảy ra với tất cả các thuốc tan huyết khối, nhưng các số liệu in vitro cho thấy tác dụng này lớn nhất với Streptokinase. Tương ứng với các nhóm hoạt hóa plasminogen, hiện nay trên thị trường có 5 loại thuốc tan huyết khối được phép lưu hành: Alteplase tương ứng với chất hoạt hóa plasminogen mô, có nguồn gốc từ DNA tái tổ hợp do hãng Genentech sản xuất [8]; Streptase tương ứng với streptokinase có nguồn gốc từ cầu khuẩn tan máu beta được sản xuất bởi hãng Aventis Pharma; Urokinase biết đến với tên là Abbokinase được sản xuất bởi hãng ImaRx Therapeutics, urokinase có nguồn gốc từ chất chiết tế bào thận người; phức chất hoạt hóa Streptokinase plasminogen anisoylat hóa (APSAC); và Tenecteplase, một dạng biến đổi của chất hóa hóa plasminogen mô người gắn với fibrin và làm biến đổi plasminogen thành plasmin. Tất cả các dạng thuốc này được dùng để điều trị nhồi máu cơ tim, huyết khối tĩnh mạch sâu, nghẽn mạch phổi, tái thông mạch. Tuy nhiên, tùy từng trường hợp, các loại thuốc khác nhau được sử dụng để điều trị một cách hiệu quả và ít tốn kém nhất. Ví dụ, Streptase là thuốc rẻ nhất nhưng chỉ được dùng cho những trường hợp đặc biệt vì nhiều lý do như thiếu tính đặc hiệu với sợi huyết, hiệu quả thấp, thời gian dùng thuốc kéo dài... Còn Alteplase được sử dụng nhiều hơn trong điều trị nghẽn động mạch phổi lớn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 http://www.lrc-tnu.edu.vn
1.3. Chất hoạt hóa plasminogen mô ngƣời Chất hoạt hóa plasminogen mô người là dạng chủ yếu của dạng hoạt động nội sinh của plasminogen trong máu. Nó được tạo ra dưới dạng phân tử sợi đơn ở tế bào thành mạch trong và được giữ trong huyết tương một cách liên tục hoặc giải thoát một cách nhanh chóng bằng phản ứng kích thích của chất cảm ứng của tế bào thành mạch máu [39]. Dạng hoạt động plasminogen được sử dụng làm tan huyết khối về phương diện lâm sàng cho các quá trình điều trị tắc mạch phổi và chứng nhồi máu cơ tim [9], [27], [46]. Không giống như nhiều protease serine khác, h-tPA hoạt động dưới dạng sợi đơn, đặc biệt khi có mặt của fibrin hoặc fibrinogen. Ở người, gen mã hóa h-tPA là một gen đơn bản có vị trí ở 8p12 nằm trên nhiễm sắc thể số 8 [20]. Ở chuột, gen này cũng nằm trên nhiễm sắc thể số 8 và có vị trí 24p22. Cấu trúc và chức năng của gen mã hóa cho h-tPA được xác định bằng kết hợp nhân bản invitro của DNA hồng cầu từ những cá thể riêng biệt và phân lập được các dòng từ thư viện gen người. Những dòng này được xác định bằng bản đồ enzyme hạn chế, lai Southern blot và giải trình tự DNA [13], [23]. Kết quả xác định và phân tích trình tự gen cho thấy, gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen có chiều dài 36.594bp, bao gồm 32.720bp từ vị trí khởi đầu đến vị trí đuôi polyadenyl, có thêm khoảng 353 và 344 bp của hai đầu 5’ và 3’, mười ba intron xen giữa mười bốn exon, kích thước trung bình của các exon là 914bp, trong khi của intron từ 111 đến 14.257bp [20], [37 ], [41]. Thành phần base và tần suất dinucleotide trong mRNA của gen như sau: A:26,4%; C:23,6%; G:25,3% và T:24,8% và trong trình tự ngược: A:24,8%; C:26,3%; G:22,1% và T:26,9%. Trình tự cặp nucleotide như sau: AA(7,5%), AC(5,2%), AG(8,1%), AT(5,6%), CA(7,7%), CC(6,8%), CG(1,9%), CT(7,3%), GA(6,8%), GC(5,8%), GG(7,6%), GT(5,1%), TA(4,3%), TC(5,8%), TG(7,7%) và TT(6,9%) [20]. Các kết quả phân tích cho thấy cấu trúc protein h-tPA bao gồm 5 vùng thuộc hai chuỗi: chuỗi nặng của h-tPA (hay còn gọi chuỗi A, có khối lượng 39.000 kDa) được xác định ở đầu amino, còn chuỗi nhẹ (hay còn gọi chuỗi B, khối lượng 33.000 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 http://www.lrc-tnu.edu.vn
kDa) ở đầu carboxyl. Trong đó, chuỗi nặng chứa ba vùng: vùng “ngón tay” (F - vùng finger ) gồm 47 amino acid từ vị trí acid amin thứ 4 - 50, người ta cũng thấy cấu trúc tương tự trong fibronectin; vùng nhân tố sinh trưởng biểu bì (epidermal growth factor region - EGF) từ amino acid có vị trí 51 - 87; vùng thứ ba bao gồm hai cấu trúc kringle, vùng kringle 1 (K1 - kringle one region) từ amino acid 88 - 176, vùng kringle 2 (K2 - kingle two region) từ vị trí amino acid 177 đến 262. Các cấu trúc đó cũng được tìm thấy trong prothrombin, plasminogen, urokinase và nhân tố XII [14], [19], [20], [23], [38], [45], [52]. Chuỗi nhẹ của h-tPA, chứa vị trí tâm hoạt động (gồm năm exon được ngăn cách bởi bốn intron), vùng serine protease (P - serine protease domain) có vị trí từ amino acid 267 đến 527 và tương đồng với chuỗi xúc tác của enzyme phân hủy protein serine khác [38], [45]. Formatted: Font: 13 pt Hình1.2. Các vùng của tPA Các vùng này có thể nằm kế tiếp nhau hoặc được ngăn cách với nhau bởi các vùng nối ngắn. Các vùng này góp phần tạo nên các đặc tính sinh học đặc hiệu của cả phân tử. Vùng F đóng vai trò chủ yếu tạo nên tính ái lực cao với tơ máu. Hoạt tính này thể hiện tính đặc hiệu cao của h-tPA trong quá trình phân giải các khối máu đông giàu tơ máu. Vùng EGF thể hiện hoạt tính gắn h-tPA với bề mặt tế bào, chức năng này được Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 http://www.lrc-tnu.edu.vn
bảo thủ trong rất nhiều protein tPA ở động vật có vú. Vùng EGF chứa 6 cysteine, đây là thành phần tạo nên cầu disulfide trong domain. Vùng kringle trong protease serine rất quan trọng trong mối tương tác protein-protein trong quá trình hoạt hóa plasminogen và phân giải tơ máu, hoặc quá trình chuyển đổi prothrombin-thrombin. Vùng kringle 2 của h-tPA cũng liên quan chặt chẽ với quá trình gắn tơ máu và có khả năng kích thích hoạt tính h-tPA đối với fibrin nên có vai trò quan trọng trong sự kết hợp giữa h-tPA và tơ máu [16], [55]. Vùng kringle 1 không được xem như có liên quan đến trong đặc tính kết hợp với tơ máu của h-tPA mặc dù trình tự amino acid của kringle 1 và kringle 2 có tính tương đồng cao [52]. Vùng P đảm nhiệm chức năng phân cắt plasminogen bằng enzyme để tạo ra plasmin [37]. Hình 1.3. Cấu trúc h-tPA [38] Protein h-tPA được tổng hợp và tồn tại trong tế bào màng trong mạch dưới dạng chuỗi polypeptide sợi đơn, tuy nhiên h-tPA trưởng thành là một sợi đơn glycoprotein có 530 amino acid; 32 amino acid trình tự đầu sẽ được cắt khỏi h-tPA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 http://www.lrc-tnu.edu.vn
trước khi h-tPA được đưa ra bên ngoài tế bào. Plasmin, kallikrein huyết tương, hoặc nhân tố Xa hoạt hóa h-tPA bằng cách cắt h-tPA ở vị trí Arg 275- Ile 276 thành hai sợi (A và B), hai sợi này liên kết với nhau bởi cầu disulfide [15], [20], [28], [34], [45], [52]. Trong tự nhiên, h-tPA tồn tại ở dạng sợi đơn. Dạng hai sợi đã quan sát được trong nuôi cấy tế bào ung thư tế bào hắc tố ở người. Nghiên cứu cho thấy h-tPA dạng một sợi hoạt động có hiệu quả hơn dạng hai sợi. Điện di trên SDS (sodium dodecyl sulfate) cho thấy, h-tPA dạng một sợi được chuyển thành dạng hai sợi trong quá trình phân giải huyết khối [45]. Theo Berg, khi bị glycosyl hóa ở vị trí Asn- 184 sẽ gây ức chế trung gian đối với plasmin để chuyển h-tPA từ phân tử dạng sợi đơn sang dạng sợi đôi, và khi glycosyl hóa ở vị trí Asn- 117 và/hoặc Asn- 448 sẽ làm giảm kích thích hoạt hóa của h-tPA kết hợp với tơ máu và hoạt động phân giải huyết khối [11]. 1.4. Vai trò của chất hoạt hóa plasminogen mô trong quá trình làm tan máu đông Sự đông máu là một quá trình phức tạp qua đó hạn chế quá trình mất máu của cơ thể. Khi thành mạch máu bị tổn thương, máu được cầm nhờ chỗ tổn thương được che phủ bởi huyết khối chứa tiểu cầu và sợi huyết. Cơ chế đông máu được bảo thủ khá bền vững trong tiến hóa; ở lớp thú, hệ thống đông máu bao gồm hai thành phần: tế bào (tiểu cầu) và protein (các yếu tố đông máu). Phản ứng đông máu được kích hoạt ngay sau chấn thương làm tổn hại đến nội mạc mạch máu. Tiểu cầu lập tức tạo nút chặn cầm máu tại vết thương; đây chính là quá trình cầm máu ban đầu. Quá trình cầm máu thứ phát diễn ra đồng thời; các yếu tố đông máu trong huyết tương đáp ứng trong một chuỗi phản ứng để tạo các sợi huyết có vai trò củng cố nút chặn tiểu cầu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 1.4. Quá trình phân hủy huyết khối [9] Thành phần quan trọng nhất trong hệ thống phân giải tơ máu là glycoprotein plasminogen, là chất do gan sinh ra và có mặt trong huyết tương và có mặt hầu hết ở ngoài thành mạch. Plasminogen là dạng tiền enzyme (zymogen), là chất có vùng dễ phân chia, dưới tác dụng của chất hoạt hóa plasminogen sẽ được chuyển đổi thành dạng hoạt động và là dạng phân giải protein, plasmin. Mục tiêu đầu tiên của plasmin là tơ máu, nhưng plasmin có thể làm giảm một vài thành phần của hỗn hợp ngoài thành mạch và chuyển một số tiền hormone và tiền cytokine thành dạng hoạt động của chúng. Plasmin thường liên quan đến sự di căn của bệnh ung thư. Sự phát sinh của plasmin xảy ra trước tiên trên bề mặt tơ máu, thường có điểm kết hợp cho plasminogen và yếu tố cơ bản hoạt hóa của nó trong máu, tPA [59]. Quá trình làm giảm và phân hủy tơ máu sẽ được cân bằng trong quá trình sửa chữa thành mạch máu bị tổn thương. Tế bào thành mạch máu bị tổn thương sẽ giải phóng chất hoạt hoá plasminogen Hình1.5. Con đƣờng phân giải tơ máu (Fibrin) [58] (tPA, uPA), hoạt hóa hệ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 http://www.lrc-tnu.edu.vn
thống phân giải tơ máu. Chất hoạt hóa plasminogen cắt plasminogen tạo thành plasmin, là chất phân hủy huyết khối. Nguyên tắc phân hủy tơ máu: bản thân quá trình phân hủy tơ máu được điều hòa bởi các chất ức chế chất hoạt hoá plasminogen (plasminogen activator inhibitors - PAIs) và chất ức chế plasmin (α2-antiplasmin), đây là những chất làm chậm quá trình phân giải tơ máu. PAI-1, một chất quan trọng của PAI, làm cho tPA và uPA không hoạt động và được giải thoát khỏi tế bào thành mạch và hoạt hóa tiểu cầu. Chất ức chế tiền plasmin là α2-antiplasmin, rất nhanh giải phóng plasmin tự do không hoạt hóa thoát khỏi huyết khối. Một vài α2- antiplasmin thường liên kết với nhân tố XIIIa với tơ máu trong quá trình hình thành cục máu đông, nó có thể ngăn ngừa quá mức plasmin hoạt động trong cục máu. Cả tPA và uPA đều nhanh chóng được phân hủy bởi thận, một bộ phận của ngăn ngừa phân hủy huyết khối quá mức. 1.5. Nghiên cứu ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô ngƣời Như đã trình bày, chất hoạt hóa plasminogen mô người đã được thương mại hóa với tên gọi là Alteplase do hãng Genentech sản xuất. Đây là thuốc làm tan huyết khối đặc hiệu (nghĩa là chúng kết hợp chọn lọc với plasminogen đã gắn với tơ máu) [43], [44]. Dược phẩm này đã được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration - FDA) công nhận như là một dạng thuốc chữa bệnh đột quỵ vào năm 1996. Về phương diện lâm sàng, h-tPA được xem là thuốc tan huyết khối đặc hiệu (chúng kết hợp chọn lọc với plasminogen đã gắn với tơ máu) và được lựa chọn để điều trị nhồi máu cơ tim, tắc mạch phổi, đột quỵ, tắc động mạch ngoại biên và các bệnh khác liên quan đến tan huyết khối [36], [40]. Trong những năm từ cuối 1990 đến đầu năm 2000, tỷ lệ bệnh nhân bị đột quỵ được điều trị bằng h-tPA chỉ chiếm 2%. Khoảng 9 năm trở lại đây, tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh tim mạch và bị đột quỵ được điều trị bằng h-tPA tăng lên đáng kể, chiếm khoảng 10- 20%. Thuốc này có ưu điểm là không có tác dụng phụ, không gây chảy máu hệ thống và hiện đang thuộc loại có doanh thu rất cao trên thị trường. Từ năm 1998 đến năm 2003, doanh thu mỗi năm đạt khoảng 200 triệu USD. Dự kiến, tới năm 2010 doanh thu đạt được lên tới 600 USD [22], [58]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 http://www.lrc-tnu.edu.vn
Trong những nghiên cứu ứng dụng đầu tiên về h-tPA, các tế bào u nuôi cấy được sử dụng làm nguồn sản sinh h-tPA cho các mục đích trị bệnh [26]. Tuy nhiên, các ứng dụng lâm sàng đòi hỏi quy trình sản xuất protein thích hợp với sản lượng và độ tinh sạch cao. Vì vậy, nghiên cứu tạo h-tPA tái tổ hợp sử dụng các tế bào động vật có vú cũng được triển khai. Các tế bào buồng trứng của chuột đồng Trung Quốc (Chinese hamster ovary - CHO) đã được chuyển gen h-tPA để tổng hợp protein h- tPA tái tổ hợp [17]. Các sản phẩm DNA tái tổ hợp tạo ra từ hệ thống lên men môi trường nuôi cấy tế bào động vật có vú cũng được thu nhận và làm sạch. Những nỗ lực xây dựng quy trình đơn giản tạo h-tPA tái tổ hợp hiệu quả với giá thành hạ từ vi sinh vật, đặc biệt là từ vi khuẩn, và cụ thể hơn là từ E. coli, rất được quan tâm nghiên cứu [23], [40]. Vi khuẩn E. coli: Gen mã hóa h-tPA đã được nghiên cứu và biểu hiện trên vi khuẩn E. coli từ những năm 1983 [23], [40]. Trong nghiên cứu của Pennica và đồng tác giả (đtg), lượng h-tPA thu được chỉ đạt khoảng 50- 80 µg/l dịch nuôi, tương đương với 1500- 2400 phân tử h-tPA có hoạt tính/ tế bào [40]. Đến năm 1998, sau khi tinh sạch, hàm lượng protein h-tPA thu được vào khoảng 180 µg/l dịch nuôi [42]. Gần đây, Zhu và đtg đã biểu hiện thành công protein h-tPA trong vi khuẩn E. coli với hàm lượng protein h-tPA chiếm 30% tổng số protein của vi khuẩn [57]. Nấm men: Để khắc phục những nhược điểm của vi khuẩn nói chung và E. coli nói riêng, người ta cũng có thể dùng hệ thống biểu hiện là các sinh vật nhân chuẩn bậc thấp làm vật chủ tách dòng, như nấm men (ví dụ, Saccharomyces cerevisiae, Hansenulla polymorpha, Pichia pastoris) hay tảo. Ưu điểm của nấm men là chúng có thể tiến hành rất nhiều dạng biến đổi (cấu trúc) protein và giống như vi khuẩn, chúng có tốc độ sinh sản tương đối nhanh, nhu cầu dinh dưỡng khá đơn giản, không sản sinh nội độc tố và có khả năng thích ứng cao với sản xuất quy mô lớn. S. cerevisiae là nấm men được sử dụng rộng rãi nhất nhằm sản xuất các protein tái tổ hợp. Hiện nay, nấm P. pastoris cũng được sử dụng rộng rãi, hơn 120 protein tái tổ hợp đã được biểu hiện ở tế bào chủ này trong đó rất nhiều gen có nguồn gốc từ người và động vật. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chất hoạt hóa plasminogen mô người là một trong những protein động vật được tổng hợp trên nấm Aspergillus nidulans [51], S. cerevisiae [35] và Aspergillus niger. Đối với nấm A. niger, hàm lượng h-tPA được tổng hợp khoảng 0,07mg/g sinh khối và tăng lên 1,9mg khi bổ sung peptone. Chất hoạt hóa plasminogen mô người được tạo ra trong A. niger bị cắt thành dạng hai sợi có trọng lượng phân tử giống với dạng h-tPA hai sợi của khối u người, dạng hai sợi này thường xuất hiện sau 16h nuôi cấy tế bào. Tuy nhiên, thông thường chỉ dưới 1% sản phẩm h-tPA tạo ra trong A. niger có hoạt tính, và dạng h-tPA hoạt hoá không bị mất khỏi dịch trong suốt quá trình nuôi cấy. Dạng h-tPA hoạt hoá không xuất hiện bề mặt trong giai đoạn tĩnh của bể nuôi cấy, có thể do quá trình tổng hợp không đúng hoặc do quá trình phân hủy protein đã xảy ra ở vùng phân hủy protein của protein h-tPA. Tế bào động vật có vú: Do yêu cầu đa số các sản phẩm protein tái tổ hợp cần sự biến đổi về cấu trúc nên các tế bào prokaryote không đáp ứng được. Các tế bào eukaryote bậc thấp như nấm men hay tế bào côn trùng cũng không đáp ứng được đối với các quá trình biến đổi tương tự ở động vật có vú như phân giải protein, liên kết các tiểu đơn vị hoặc nhiều phản ứng kết hợp khác nhau như glycosylation, methylation, carboxylation, amidation, hình thành các cầu nối disulfide hoặc phosphoryl hóa các gốc amino acid, cho nên hệ thống tế bào động vật có vú như tế bào trứng chuột đồng Trung Quốc (Chinese hamster ovary - CHO) và tế bào thận chuột chưa trưởng thành (baby hamster kidney - BHK) thường được lựa chọn để sản xuất các protein trị liệu cho người. Khoảng 60% protein tái tổ hợp dùng làm dược phẩm được sản xuất từ các hệ thống tế bào vật chủ này. Tuy nhiên, việc sử dụng tế bào động vật làm tế bào chủ có một số nhược điểm như: Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật, vì thế, sản lượng của chúng khá thấp và việc duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong một thời gian dài thường gặp nhiều khó khăn hơn. Các tế bào động vật được bao bọc bởi màng huyết tương, mỏng hơn nhiều so với thành tế bào dày chắc thường thấy ở vi sinh vật hoặc tế bào thực vật và kết quả là chúng rất dễ bị biến dạng và vỡ. Trong khi đó nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một cách đầy đủ, và môi trường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết thanh máu rất đắt tiền. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn