Luận văn:Nghiên cứu khả năng ứng dụng enzym glucose oxidase cố định trong sản xuất axit gluconic

Chia sẻ: Nguyen Vang | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:26

Thêm vào BST

Báo xấu

137
lượt xem 28
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

iới thiệu chung về enzyme glucose iomerase và enzyme glucose oxidase Cơ chế hoạt tính xúc tác của zyme glucose iomerase và enzyme glucose oxidase Liều lượng sử dụng Ứng dụng trong sản xuất bia, sản xuất siro các công trình nghiên cứu về zyme glucose iomerase và enzyme glucose oxidase

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn:Nghiên cứu khả năng ứng dụng enzym glucose oxidase cố định trong sản xuất axit gluconic

1 B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O Đ I H C ĐÀ N NG Đ NG TH THANH XUÂN NGHIÊN C U KH NĂNG NG D NG ENZYM GLUCOSE OXIDASE C Đ NH TRONG S N XU T AXIT GLUCONIC Chuyên ngành: Công ngh Th c ph m và Đ u ng Mã ngành: 60 54 02 TÓM T T LU N VĂN TH C S K THU T Đà N ng – Năm 2011
2 Công trình ñư c hoàn thành t i Đ I H C ĐÀ N NG Ngư i hư ng d n khoa h c: TS. Đ NG MINH NH T Ph n bi n 1: PGS.TS. Trương Th Minh H nh Ph n bi n 2: TS. Huỳnh Ng c Th ch Lu n văn s ñư c b o v trư c H i ñ ng ch m Lu n văn t t nghi p th c sĩ k thu t h p t i Đ i h c Đà N ng vào ngày 03 tháng 12 năm 2011 Có th tìm hi u lu n văn t i: - Trung tâm Thông tin – H c li u, Đ i h c Đà N ng. - Trung tâm H c li u, Đ i h c Đà N ng.
3 M Đ U 1. TÍNH C P THI T C A Đ TÀI Axít gluconic là s n ph m thu ñư c t quá trình oxy hóa β- D-Glucozơ nh enzym glucose oxidase, ñư c phát hi n l n ñ u tiên vào năm 1870 b i Hasiwetz và Habermann. Trong công nghi p, axít gluconic và các mu i c a nó ñư c ng d ng r ng rãi trong nhi u lĩnh v c như: y dư c, d t, thu c da, s n xu t xi măng, luy n kim và th c ph m. Hàng năm trên th gi i axít gluconic ñư c s n xu t v i s n lư ng ñ t kho ng 100.000 t n/năm. Trong ñó, kho ng 60% s n ph m thu ñư c ch y u b ng các quá trình sinh hoá oxy hóa v i tác nhân enzym glucose oxidase c a n m m c (Asp. niger) hay glucose dehydrogenaza c a vi khu n (Gluconobacter).Tuy nhiên, khi s d ng vi sinh v t ñ lên men s g p h n ch vì th i gian lên men kéo dài, s n ph m không tinh khi t, c n giai ño n tách vi sinh v t… V i vi c s d ng enzym glucose oxidase, 100% glucozơ có th chuy n hóa thành axít gluconic trong th i gian ng n. Tuy nhiên, vi c s d ng enzym hòa tan b gi i h n do s c ch c a s n ph m cu i, giá thành s n ph m cao, không n ñ nh, không có kh năng tái s d ng và khó thu h i. Vì v y, các k thu t c ñ nh enzym trên giá th t o ra các d ng enzym c ñ nh (enzym không hòa tan) ñang ñư c quan tâm nghiên c u. Trên th gi i, ña ph n các nghiên c u c ñ nh enzym glucose oxidase ñ u t p trung vào vi c nghiên c u ng d ng enzym glucose oxidase c ñ nh trong các ngành công nghi p như d t hay làm c m bi n sinh h c. Vi t Nam, quá trình oxy hóa ch n l c glucozơ t o thành axít gluconic v n chưa ñư c quan tâm nghiên c u.
4 Vì v y, tôi ch n ñ tài “Nghiên c u kh năng ng d ng enzym glucose oxidase c ñ nh trong s n xu t axít gluconic” nh m góp ph n nh vào gi i pháp công ngh cho ngành công nghi p s n xu t axít gluconic. 2. M C ĐÍCH NGHIÊN C U Kh o sát hi u qu c a quá trình c ñ nh enzym glucose oxidase, nghiên c u các thông s k thu t thích h p cho quá trình chuy n hóa glucose thành axít gluconic. T ñó, xây d ng quy trình s n xu t axít gluconic quy mô phòng thí nghi m, s d ng enzym glucose oxidase c ñ nh. 3. Đ I TƯ NG VÀ PH M VI NGHIÊN C U - Đ i tương nghiên c u : + Glucozơ + Enzym glucose oxidase + Natri alginat d ng s i - Ph m vi nghiên c u: ch nghiên c u quy mô phòng thí nghi m 4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 4.1. Phương pháp hóa lý + Xác ñ nh pH c a dung d ch b ng pH k . + Xác ñ nh ñ hòa tan c a h t gel 4.2. Phương pháp hóa h c Xác ñ nh hàm lư ng ñư ng kh b ng phương pháp DNS 4.3. Phương pháp hóa sinh Xác ñ nh ho t ñ enzym glucose oxidase 4.4. Phương pháp công ngh + Phương pháp t o gel + Phương pháp oxy hóa glucozơ thành axít gluconic.
5 5. Ý NGHĨA KHOA H C C A Đ TÀI Các s li u trong nghiên c u ñư c phân tích b ng các phương pháp phân tích khoa h c, chính xác và ñáng tin c y. 6. Ý NGHĨA TH C TI N C A Đ TÀI Đ tài m ra kh năng ng d ng enzym glucose oxidase c ñ nh trong công ngh s n xu t axít gluconic và ñ t cơ s cho vi c xây d ng công ngh s n xu t axít gluconic Vi t Nam. 7. K T C U C A LU N VĂN Các ph n chính c a lu n văn bao g m: Chương 1 – T ng quan tài li u Chương 2 – Nguyên li u và phương pháp nghiên c u Chương 3 – K t qu và th o lu n
6 CHƯƠNG 1. T NG QUAN 1.1. D – GLUCOZƠ 1.1.1. C u t o và tính ch t c a D-glucozơ 1.1.2. Quá trình oxy hóa D-glucozơ 1.1.2.1. Phương pháp c ñi n oxy hóa glucozơ 1.1.2.2. Ph n ng oxy hoá glucozơ v i xúc tác enzym 1.2. ENZYM GLUCOSE OXIDASE (GOD) 1.2.1. C u trúc enzym 1.2.2. Cơ ch xúc tác c a enzym glucose oxidase Glucose oxidase có th oxy hóa β-D-glucozơ t o thành D- glucono-1,5-lacton, D-glucono-1,5-lacton sau ñó t ñ ng th y phân ñ t o ra gluconic axít C6H12O6 + H2O + ½ O2 C6H12O7 + H2O2 1.2.3. Các y u t nh hư ng ñ n v n t c ph n ng c a enzym glucose oxidase 1.2.3.1. nh hư ng c a n ng ñ enzym 1.2.3.2. nh hư ng c a cơ ch t 1.2.3.3. nh hư ng c a pH 1.2.3.4. nh hư ng c a nhi t ñ 1.2.3.5. nh hư ng c a cư ng ñ O2 1.2.3.6. nh hư ng c a ch t kìm hãm 1.2.4. ng d ng c a enzym GOD 1.2.4.1. ng d ng GOD trong công nghi p th c ph m 1.2.4.2. ng d ng enzym GOD trong công nghi p s n xu t axít gluconic 1.2.4.3. S d ng glucose oxidase trong phương pháp ño hàm lư ng glucozơ trong máu 1.3. ENZYM C Đ NH
7 1.3.1. Khái ni m, ñ c ñi m c a enzym c ñ nh 1.3.1.1. Khái ni m 1.3.1.2. Đ c ñi m 1.3.2. Ch t mang dùng ñ c ñ nh enzym Ch t mang là ch t ñ enzym g n lên (thư ng là ch t n n làm giá th có tích ñi n ho c có th liên k t b n v i enzym), ch t mang cũng có th là các v t ch t nh t gi enzym trong m t không gian nh t ñ nh. Ch t mang ph i không tan trong môi trư ng ho t ñ ng c a enzym, ph i không ñ c, trơ v i vi sinh v t và hóa ch t (không b phân h y), ph i có nhi u v trí ñ enzym g n vào, d ki m và r . Ngoài ra ch t mang ph i có ñ trương t t, có di n tích b m t ti p xúc l n. 1.3.2.1. Ch t mang là polyme h u cơ Ch t mang là polyme t nhiên - Ch t mang là polysacarit (gluxit) : xenlulozơ, aga, dextran, alginat, caragenan, sephadex và các d n xu t c a chúng. - Ch t mang là protein : Ch t mang là protein thư ng dùng là gelatin, keratin, albumin. Ch t mang là các polyme t ng h p 1.3.2.2. Ch t mang vô cơ 1.3. 3. Các phương pháp c ñ nh enzym 1.3.3.1. Phương pháp h p ph 1.3.3.2. Phương pháp c ng hóa tr 1.3.3.3. Phương pháp b y enzym 1.3.3.4. Phương pháp bao gói (nh t) enzym Đây là phương pháp ñơn gi n, enzym ít b bi n ñ i b i quá trình c ñ nh. Phương pháp này có th c ñ nh nhi u enzym cùng
8 m t lúc. Gi i h n c a phương pháp này là h n ch kh năng ti p xúc gi a enzym và cơ ch t, do ñó ho t ñ enzym thư ng th p, nh t là trong trư ng h p cơ ch t có tr ng lư ng phân t l n. Enzym ñư c bao b c trong m t màng không th m th u ñ i v i enzym và các ch t có tr ng lư ng phân t cao, nhưng l i cho cơ ch t và s n ph m th m th u qua m t cách d dàng. Nh t trong c u trúc m ng gel Phương pháp này bao g m vi c nh t gi phân t enzym gi a các khe c a các c u trúc gel liên k t chéo và không tan trong nư c. Phương pháp nh t gel trong h s i. Phương pháp gói trong bao vi th Phương pháp siêu l c 1.3.4. ng d ng c a enzym c ñ nh 1.3.4.1. Trong công nghi p 1.3.4.2. Trong y h c 1.3.4.3. Trong nghiên c u khoa h c 1.4. ALGINAT 1.4.1. C u trúc c a alginat 1.4.2. Cơ ch t o gel 1.4.2.1. Cơ ch t o gel theo phương pháp t o gel t bên ngoài Nh dung d ch alginat vào dung d ch có ch a cation có kh năng t o gel (thư ng g p nh t là Ca2+). B m t ngoài c a h t alginat s l p t c b gel hóa. Ti p theo ñó, các cation t o gel bên ngoài h t ti p t c khu ch tán vào bên trong làm cho các phân t alginat bên trong ti p t c b gel hóa. Quá trình này x y ra trên b m t h t và phát tri n vào bên trong.
9 1.4.2.2. Cơ ch t o gel theo phương pháp t o gel t bên trong 1.4.3. Ưu, như c ñi m c a vi c c ñ nh enzym trong gel lginat. 1.4.3.1. Ưu ñi m 1.4.3.2. Như c ñi m 1.4.4. Các y u t nh hư ng ñ n ñ b n gel alginate 1.4.4.1. nh hư ng c a thành ph n alginat 1.4.4.2. nh hư ng c a n ng ñ alginat 1.4.4.3. nh hư ng c a pH t o gel 1.4.4.4. nh hư ng c a nhi t ñ t o gel 1.5. AXÍT D-GLUCONIC 1.5.1. Axít D-gluconic và mu i gluconat 1.5.1.1. C u t o c a axít D-gluconic 1.5.1.2. Tính ch t c a axít gluconic và mu i gluconat 1.5.1.3. ng d ng c a axít gluconic và mu i gluconat 1.5.2. S n xu t axít gluconic và mu i gluconat 1.5.2.1. S n xu t t Aspergillus niger và Penicillium luteum 1.5.2.2. S n xu t gluconic axít t vi khu n 1.5.2.3. S n xu t gluconic axít t enzym glucose oxidase 1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN C U C Đ NH ENZYM GLUCOSE OXIDASE VÀ NG D NG ENZYM TRONG S N XU T AXÍT GLUCONIC VI T NAM VÀ TRÊN TH GI I
10 CHƯƠNG 2. Đ I TƯ NG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1. Đ I TƯ NG NGHIÊN C U 2.1.1. Nguyên li u 2.1.1.1. D-Glucozơ 2.1.1.2. Enzym Glucose oxidase Enzym Glucose oxidase t Aspergillus niger ñư c mua t công ty Sigma –Aldrich v i các ñ c tính như sau: - Ho t ñ enzym: 2.000 – 10.000 UI/g - pHopt = 5.1 - topt = 35oC - Đi u ki n b o qu n: -20oC 2.1.1.3. Alginat 2.1.2. Hóa ch t và phương ti n nghiên c u 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.2.1. Phương pháp c ñ nh enzym 2.2.1.1. Quy trình c ñ nh enzym - T o dung d ch sodium alginat . - Tr n ñ u enzym và dung d ch natri alginat theo t l t o ra h n h p enzym glucose oxidase–natri alginat. - Cho h n h p trên nh t ng gi t xu ng dung d ch CaCl2 t kho ng cách 20cm t o thành các h t có kích thư c t 3–4 mm. Đ yên trong 1 gi ñ các h t gel t a l i. Enzym ñã ñư c bao b c bên trong h t gel. - R a h t gel b ng nư c c t (2 l n) ñ lo i b hoàn toàn lư ng enzym chưa ñư c c ñ nh. Sau ñó s y nh 40oC ñ h t gel khô và gi t l nh ñ s d ng cho các thí nghi m v sau.
11 2.2.1.2. Sơ ñ th c hi n 2.2.2. Phương pháp xác ñ nh ñ b n gel alginat Đ b n c a gel alginat là kh năng không b hòa tan trong môi trư ng axít. Công tác xác ñ nh ñ hòa tan c a gel: (2.1) Trong ñó: V: th tích c a gel sau th i gian ngâm trong môi trư ng có pH xác ñ nh Vo: th tích gel ban ñ u. 2.2.3. Phương pháp ñánh giá ho t ñ enzym glucose oxidase Đ xác ñ nh ho t ñ c a enzym glucose oxidase ta d a trên ñ nh lư ng glucozơ tham gia ph n ng v i enzym trong kho ng th i gian xác ñ nh. 2.2.3.1. Đ nh lư ng glucozơ b ng phương pháp DNS *Nguyên lý c a phương pháp: D a trên ph n ng t o màu gi a glucozơ v i thu c th axit dinitrosalicylic DNS. Cư ng ñ màu c a h n h p ph n ng t l thu n v i n ng ñ glucozơ trong ph m vi nh t ñ nh. D a trên ñ th ñư ng chu n ñ i v i glucozơ tinh khi t, ta tính ñư c hàm lư ng glucozơ có trong m u phân tích. Cư ng ñ màu ñư c ño trên máy quang ph k t i bư c sóng 540nm. 2.2.3.2. Xác ñ nh ho t ñ enzym Ho t ñ c a enzym glucose oxidase ñư c tính theo công th c. HñA= (2.2) Trong ñó: Cñc: n ng ñ glucozơ ng ñ i ch ng (µmol/l) (enzym b vô ho t trư ng khi tham gia ph n ng) Ctn: n ng ñ glucozơ ng thí nghi m (µmol/l).. D: ñ pha loãng c a dung d ch m u.
12 t: th i gian th c hi n ph n ng v i enzym (phút) me: kh i lư ng enzym s d ng (mg) Vm: th tích dung d ch glucozơ tham gia ph n ng xúc tác v i enzym (ml) Vpư: th tích dung d ch glucozơ tham gia ph n ng DNS (ml) 2.2.4. Phương pháp kh o sát ho t ñ enzym 2.2.4.1. Kh o sát ho t ñ c a enzym t do (hòa tan) Hòa tan 10mg enzym GOD trong 10ml dung d ch ñ m axetat. Khu y ñ u và hút 1ml dung d ch enzym cho ph n ng v i 1ml dung d ch glucozơ 0.32M. Sau 10 phút ph n ng, hút 1 h n h p trên xác ñ nh hàm lư ng glucozơ còn l i theo phương pháp DNS 2.2.4.2. Kh o sát ho t ñ c a enzym c ñ nh 15 mg enzym GOD ñư c c ñ nh trong gel canxi alginat theo m c 2.2.1. Cho lư ng enzym c ñ nh này xúc tác ph n ng chuy n hóa glucozơ thành axít gluconic. Sau 10 phút ph n ng, l c thu enzym c ñ nh và dung d ch sau ph n ng, xác ñ nh hàm lư ng glucozơ còn l i trong dung d ch. T ñó xác ñ nh ho t ñ enzym c ñ nh. 2.2.4.3. Xác ñ nh hi u su t c ñ nh enzym (2.3) Trong ñó: HñA0: Ho t ñ enzym t do ban ñ u dùng ñ c ñ nh (UI/mg) HñA: Ho t ñ enzym sau khi c ñ nh (UI/mg)
13 CHƯƠNG 3. K T QU VÀ TH O LU N 3.1. XÁC Đ NH HO T Đ C A CH PH M ENZYM Trư c khi ñưa enzym vào nghiên c u tôi ki m tra ho t ñ enzym ñ ñánh giá ch t lư ng c a s n ph m. Ho t ñ enzyme ñư c xác ñ nh d a vào ñư ng chu n glucozơ Hình 3.1. Đư ng chu n Glucozơ Phương trình c a ñư ng chu n glucozơ: y = 2.762x-0.009 2 v i R = 0.998. Ho t ñ enzym GOD ñư c xác ñ nh là 9.7 UI/mg, k t qu này phù h p v i thông s công ngh c a s n ph m do nhà s n xu t công b (2-10UI/mg). Như v y, enzym v n gi ñư c ho t ñ trong th i gian b o qu n và phù h p ñ s d ng cho nghiên c u c a tôi. 3.2. NH HƯ NG C A CÁC Y U T T O GEL Đ N HO T Đ ENZYM GOD C Đ NH 3.2.1. Xác ñ nh ñ b n axít c a gel canxi alginat C ñ nh enzym b ng phương pháp bao gói gel ñư c nghiên c u nhi u nh t b i kh năng c ñ nh cao, enzym không b th t thoát nhi u, s l n tái s d ng cao và quá trình c ñ nh di n ra nhanh, ñơn gi n và an toàn. Tham kh o các nghiên c u so sánh ñ c tính c a các lo i gel, tôi ch n alginat làm ch t mang ñ c ñ nh enzym glucose
14 oxidase và CaCl2 làm ch t h tr t o gel. Gel ñư c t o thành theo phương pháp t o gel t bên ngoài. Đ hòa tan c a h t gel alginat ñư c th hi n b ng 3.1. B ng 3.1. Đ hòa tan c a gel canxi alginat trong môi trư ng axít pH 3 3.5 4 4.5 5 Đ hoà tan 20% 11.76% 3.57% 0.6% 0% pH 4.5 h t gel h u như gi nguyên tr ng thái ban ñ u trong th i gian ngâm. pH
15 lư ng alginat quá cao( >4%) thì h t gel s b n và c ng hơn, c ñ nh ñư c nhi u enzym hơn nhưng hàm lư ng alginat cao cũng ñ ng nghĩa v i ñ nh t c a dung d ch cao, kích thư c l gel càng nh , do ñó ngăn c n s khu ch tán c a cơ ch t vào bên trong h t gel ñ ti p xúc v i enzym cũng như s khu ch tán s n ph m ra ngoài. S n ph m t o thành tích lũy tâm c a h t gel s c ch ho t ñ ng c a enzym c ñ nh bên trong. Do v y, hàm lư ng alginat càng cao, ho t ñ c a enzym càng gi m. Hình 3.3. nh hư ng c a n ng ñ alginat ñ n ho t ñ enzym GOD c ñ nh 3.2.3. nh hư ng c a n ng ñ ion canxi ñ n ho t ñ enzym GOD c ñ nh Ti n hành c ñ nh enzym GOD n ng ñ alginat 3% trong các dung d ch CaCl2 t 0.1 ñ n 0.3M . Ho t ñ c a enzym c ñ nh cao nh t khi s d ng CaCl2 0.2M. Khi thay ñ i n ng ñ CaCl2 thì ho t ñ enzym s gi m xu ng vì n ng ñ CaCl2 thay ñ i thì l c ion c a môi trư ng t i gel cũng thay ñ i theo ñã làm nh hư ng ñ n ho t ñ c a enzym c ñ nh.
16 Hình 3.4. nh hư ng c a n ng ñ ion canxi ñ n ho t ñ enzym c ñ nh Như v y enzym GOD s cho ho t ñ cao nh t khi s d ng alginat có n ng ñ 3% và dung d ch CaCl2 0.2M. Đây cũng là thông s ñ c ñ nh enzym GOD s d ng cho các nghiên c u ti p theo c a tác gi . 3.3. NH HƯ NG C A pH, NHI T Đ Đ N HO T Đ C A ENZYM GOD 3.3.1. nh hư ng c a pH ñ n ho t ñ enzyme GOD 3.3.1.1. nh hư ng c a pH ñ n ho t ñ c a enzym GOD hòa tan. 3.3.1.2. nh hư ng c a pH ñ n ho t ñ c a enzym GOD c ñ nh Khi kh o sát ñ so sánh ho t ñ c a enzym t do và c ñ nh trong môi trư ng pH t 4 ñ n 8, nhi t ñ 35oC trong 10 phút ta th y: c enzym t do và c ñ nh ñ u ho t ñ ng m nh trong kho ng pH 5- 6. Khi tăng pH c a môi trư ng ñ n 8 thì ho t ñ c a enzym r t th p. Tuy nhiên, enzym c ñ nh l i có tính n ñ nh cao hơn so v i enzym hòa tan khi pH c a môi trư ng thay ñ i.
17 Hình 3.7. Ho t ñ tương ñ i c a enzym GOD hòa tan và c ñ nh theo s bi n thiên c a pH môi trư ng. 3.3.2. nh hư ng c a nhi t ñ ñ n ho t ñ enzym GOD 3.3.2.1. nh hư ng c a nhi t ñ ñ n ho t ñ enzym GOD hòa tan Nhi t ñ t i thích cho ho t ñ ng c a enzym là t 35 ñ n o 40 C (cao nh t 35oC). Nhi t ñ càng tăng cao thì enzym ho t ñ ng càng kém. Khi nhi t ñ tăng lên 45oC thì ho t ñ c a enzym gi m d n. 3.3.2.2. nh hư ng c a nhi t ñ ñ n ho t ñ c a enzym GOD c ñ nh Ti n hành c ñ nh enzym trong gel alginat 3%, cho xúc tác ph n ng chuy n hóa glucozơ pH = 5.1, và nhi t ñ thay ñ i trong o kho ng 30-80 C. Enzym GOD có kho ng nhi t ñ ho t ñ ng t i ưu t 30oC ñ n 40oC và cao nh t 40oC, tăng 5oC so v i enzym hòa tan. Nhi t ñ càng tăng thì ho t ñ enzym càng gi m. Enzym GOD khi c ñ nh có kh năng ch u nhi t t t hơn so v i enzym hòa tan. Tăng nhi t ñ lên 80oC, trong khi ho t ñ c a enzym hòa tan gi m còn 27.1% thì enzym c ñ nh ch gi m còn 35.81% (hình 3.10). Vi c duy trì c u trúc b c 3 c a enzym chính là y u t quan tr ng làm tăng tính ch u nhi t c a enzym c ñinh. Như v y, gel alginat không
18 ch làm thay ñ i nhi t ñ t i ưu c a enzym mà còn làm tăng kh năng ch u nhi t c a enzym. Hình 3.10. Ho t ñ tương ñ i c a enzym GOD hòa tan và c ñ nh theo s bi n thiên nhi t ñ 3.4. KH O SÁT HI U QU S D NG C A ENZYM GOD C Đ NH Hi u qu s d ng c a enzym GOD c ñ nh ñư c xác ñ nh thông qua 6 l n s d ng (7 gi /l n). Sau m i l n s d ng, enzym ñư c l y ra kh i dung d ch ph n ng m t cách d dàng, r a s ch và ngâm vào dung d ch ñ m axetat có pH 5.1 ñ ho t hóa tr l i. K t qu cho th y sau m i l n s d ng, ho t ñ c a enzym gi m d n do s th t thoát enzym trong m i l n r a. Ho t d enzym sau 6 l n s d ng b ng 29.64% so v i ho t ñ ban ñ u. Như v y, ch nên tái s d ng enzyme GOD 2 l n ñ ñ m b o hi u su t s n xu t. Hình 3.13. Ho t ñ tương ñ i c a enzym GOD c ñ nh trong
19 quá trình tái s d ng 3. 5. XÂY D NG QUY TRÌNH S N XU T AXÍT GLUCONIC B NG ENZYM GLUCOSE OXIDASE C Đ NH TRONG GEL ALGINAT QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHI M 3.5.1. Kh o sát nh hư ng c a n ng ñ glucozơ ñ n hi u su t chuy n hóa glucozơ Kh o sát th i gian chuy n hóa các dung d ch glucozơ có n ng ñ t 25 – 40% v i t l b sung enzym c ñ nh là 28UI/g glucozơ và theo 2 l n: l n th nh t khi b t ñ u ph n ng và l n th hai sau khi ph n ng x y ra 10 gi , s d ng dung d ch Ca(OH)2 b sung dư hàng 2 gi ñ ñ nh tính kh năng chuy n hóa glucozơ thành axít gluconic v i dung d ch phenolphthalein 1% làm ch t ch th . Th i ñi m k t thúc ph n ng ñư c coi là th i ñi m dung d ch ph n ng (có màu h ng nh t) không b ñ i màu sau 2 gi . Sau khi ph n ng k t thúc, ti n hành xác ñ nh hàm lư ng glucozơ còn l i theo phương pháp DNS và ñư ng chu n. Hi u su t chuy n hóa ñư c xác ñ nh theo công th c sau: Trong ñó: C1: hàm lư ng glucozơ ban ñ u s d ng cho ph n ng (g/l). C2: hàm lư ng glucozơ còn l i sau khi ph n ng k t thúc (g/l) K t qu trên b ng 3.2 cho th y hi u su t chuy n hóa glucozơ c a enzym GOD c ñ nh ñ u nh hơn 100% t i th i ñi m k t thúc ph n ng, ñi u này có nghĩa là v n còn m t hàm lư ng nh glucozơ còn sót l i trong dung d ch, không b oxy hóa b i enzym GOD c
20 ñ nh trong kho ng th i gian 2 gi trư c khi k t thúc ph n ng. T ñó, tôi nh n xét ch quan r ng enzym GOD c ñ nh ñã b vô ho t t i th i ñi m này nên không có kh năng xúc tác chuy n hóa ph n ng. B ng 3.2. Hi u su t chuy n hóa glucozơ thành axít gluconic tương ng v i các n ng ñ glucozơ khác nhau N ng ñ glucozơ 25% 30% 35% 40% Th i gian ph n 22 gi 24 gi 30 gi 38 gi ng hoàn toàn Hi u su t chuy n 99.4% 99.25% 99.32% 99.5% hóa Như v y, th i gian chuy n hóa hoàn toàn glucozơ thành axít gluconic có th ñư c xem là th i gian c n thi t ñ chuy n hóa 99% cơ ch t. ñây, tôi ch n th i gian chuy n hóa hoàn toàn là th i ñi m trư c th i ñi m k t thúc ph n ng 2 gi . K t qu ñư c th hi n b ng 3.3. B ng 3.3. Th i gian chuy n hóa hoàn toàn dung d ch glucozơ thành axít gluconic N ng ñ glucozơ 25% 30% 35% 40% Th i gian chuy n 20 gi 22 gi 28 gi 36 gi hóa hoàn toàn V nguyên t c, n ng ñ cơ ch t th p tương ng v i n ng ñ enzym cao thì t c ñ ph n ng càng cao, th i gian ph n ng càng nhanh. Khi s d ng glucozơ 25% thì enzym m t 20 gi ñ chuy n hóa hoàn toàn, n u s d ng glucozơ 30% thì m t 22 gi . Ti p t c tăng n ng ñ glucozơ lên 35% và 40% thì m t 28 gi và 36 gi ,