Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định từ cây Đảng Sâm nam (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,)

Chia sẻ: Trương Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:69

Thêm vào BST

Báo xấu

37
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định từ cây Đảng Sâm nam (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,) được thực hiện với mục tiêu nhằm xác định được môi trường phù hợp để tạo rễ bất định cây Đảng Sâm in vitro và nhân sinh khối rễ bất định Đảng Sâm trong bình bioreactor. Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định từ cây Đảng Sâm nam (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ---------- HOÀNG NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO RỄ BẤT ĐỊNH TỪ CÂY ĐẢNG SÂM NAM (CODONOPSIS JAVANICA (BLUME) HOOK.F.,) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên – 2017
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ---------- HOÀNG NGỌC HÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO RỄ BẤT ĐỊNH TỪ CÂY ĐẢNG SÂM NAM (CODONOPSIS JAVANICA (BLUME) HOOK.F.,) Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS. Vũ Thị Lan Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên Thái Nguyên - 2017
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS.Vũ Thị Lan. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác. Thái Nguyên, tháng năm 2017 Tác giả Hoàng Ngọc Hà
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Thị Lan giảng viên Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học- Đại học Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Khoa ho ̣c - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học và các thầ y cô giáo, cán bộ trong Khoa, đặc biệt là sự quan tâm, giúp đỡ của các anh chi ̣ kỹ thuâ ̣t viên phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ sinh học. Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo và các anh chi ̣ kỹ thuật viên tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật, Viện nghiên cứu và phát triển Lâm nghiệp, Trường đại học Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình làm luận văn thạc sĩ. Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè luôn bên cạnh ủng hộ, khuyến khích, động viên tạo động lực để tôi hoàn thành luận văn này. Trong quá trình làm luận văn không tránh khỏi những sai sót, tôi mong nhận được sự đóng góp quý báu từ phía thầy cô và bạn bè Xin trân trọng cảm ơn! Thái Nguyên, tháng năm 2017 Tác giả Hoàng Ngọc Hà
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ 3 LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................. 4 MỤC LỤC ....................................................................................................................... 5 MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ................................................................................................................... 1 2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................... 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................................ 3 1.1. Giới thiệu chung về cây Đảng Sâm .......................................................................... 3 1.1.1. Phân loại khoa học................................................................................................. 3 1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh thái của cây Đảng Sâm ..................................................... 3 1.1.3. Giá trị dược liệu của cây Đảng Sâm ...................................................................... 5 1.1.4. Thành phần và công dụng của Đảng sâm .............................................................. 5 1.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................... 7 1.2.2. Điều kiện nuôi cấy ................................................................................................. 8 1.2.3. Môi trường dinh dưỡng ......................................................................................... 8 1.2.4. Sự phát sinh hình thái .......................................................................................... 12 1.3. Tình hình nghiên cứu nhân sinh khối rễ dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô trên thế giới và Việt Nam. ............................................................................................. 14 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới. ..................................................................... 14 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ....................................................................... 15 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 18 2.1. Vật liệu nghiên cứu................................................................................................. 18 2.1.1. Vật liệu thực vật .................................................................................................. 18 2.1.2. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm .......................................................................... 18 2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ....................................................................... 19 2.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 19 2.3. Chỉ tiêu theo dõi và đánh giá .................................................................................. 21 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN........................................... 23 3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền đến khả năng phát triển hệ rễ bất định cây Đảng sâm................................................................................................................. 23
3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo và rễ bất định cây Đảng sâm. .................................................................................. 25 3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4D lên sự tạo mô sẹo từ lá cây Đảng sâm ............ 25 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo cây Đảng sâm........................................................................................ 28 3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo cây Đảng sâm........................................................................................ 29 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất hữu cơ tự nhiên, đường đến sự tăng sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm ...................................................................................... 32 3.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm ....................................................................................................................... 32 3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ cao nấm men đến khả tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm ....................................................................................................................... 34 3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ peptone đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm ....................................................................................................................... 36 3.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm ........................................................................................................................ 38 3.4. Nghiên cứu sự tăng trưởng của rễ bất định khi nuôi cấy trong môi trường lỏng (bình bioreactor)....................................................................................................................... 40 3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm trong bình bioreactor sục khí liên tục ............................................. 40 3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến khả năng nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm trong môi trường lỏng .......................................................................... 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................................... 43 1. Kết luận...................................................................................................................... 43 2. Kiến nghị ................................................................................................................... 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 44
DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT 2,4 D : 2,4 – Dichlophenoxy acetic acid B5 : Gamborg’s Cs : Cs CT : Công thức ĐC : Đối chứng IBA : Indole butyric acid MS : Murashige & Skoog (1962) NAA :  - Naphlene axetic acid TB : Trung bình KL : Khối lượng
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.2. Các nguyên tố đa lượng và dạng sử dụng chính .............................................9 Bảng 2.1. Danh mục thiết bị sử dụng trong đề tài .........................................................18 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát triển hệ rễ bất định cây Đảng sâm sau 4 tuần nuôi cấy .................................................................................................24 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của 2,4 D đến sự hình thành mô sẹo từ mẫu lá Đảng sâm .........26 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến sự hình thành rễ bất định in vitro cây Đảng sâm sau 40 ngày ...................................................................................................28 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến sự hình thành rễ bất định in vitro cây Đảng sâm sau 40 ngày ...................................................................................................29 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm .......................................................................................................................32 Bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm trên môi trường đặc sau 40 ngày ................................34 Bảng 3.7. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ peptone đến khả năng sinh trưởng và phát triển rễ bất định Đảng sâm trên môi trường đặc sau 40 ngày ...........................36 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm sau 40 ngày ...................................................................................................39 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thể tích môi trường đến khả năng nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm trong bình bioreactor sục khí liên tục ...................................................40 Bảng 3.10. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ sục khí đến khả năng nhân sinh khối rễ bất định Đảng sâm trong môi trường lỏng ........................................................41
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Đảng Sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,) ....................................4 Hình 3.1: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng và phát triển hệ rễ bất định Đảng sâm. ...............................................................................................24 Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ 2,4D đến sự hình thành mô sẹo .............................27 Hình 3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng NAA đến khả năng cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo cây Đảng sâm ....................................................................................................29 Hình 3.4. Ảnh hưởng của hàm lượng IBA đến khả năng cảm ứng tạo rễ bất định từ mô sẹo cây Đảng sâm ..........................................................................................................30 Hình 3.5: Ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm trên môi trưởng đặc sau 40 ngày .........................................................33 Hình 3.6: Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm trên môi trường đặc sau 40 ngày ..........................................................35 Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ peptone đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định Đảng sâm trên môi trường đặc sau 40 ngày ..................................................................37 Hình 3.8. Ảnh hưởng một số chất hữu cơ tự nhiên đến khả năng tăng sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm..................................................................................................................38
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Trong nguồn tài nguyên lâm sản ngoài gỗ phong phú của Việt Nam, cây thuốc mọc tự nhiên giữ một vị trí quan trọng về số lượng loài, cũng như về giá trị sử dụng và kinh tế cao. Theo kết quả điều tra nghiên cứu của ngành Y tế, hiện đã biết ở Việt Nam có tới gần 4000 loài thực vật và Nấm có công dụng làm thuốc. Trong đó có tới hơn 90% là cây mọc tự nhiên và tập trung chủ yếu trong các quần xã rừng [19]. Từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên, hàng năm đã khai thác được một khối lượng lớn các loại dược liệu, sử dụng cho nhu cầu làm thuốc trong nước và xuất khẩu [3]. Tuy nhiên, do khai thác liên tục nhiều năm, cùng với nhiều nguyên nhân tác động khác đã làm cho nguồn cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt Nam bị giảm sút nghiêm trọng; một số loài thuộc diện quí hiếm đang lâm vào tình trạng có nguy cơ bị tuyệt chủng cao. Bởi vậy, vấn đề bảo tồn những cây thuốc bị đe dọa được coi là nhóm đối tượng ưu tiên, trong chiến lược bảo tồn và phát triển bền vững nguồn tài nguyên lâm sản ngoài sỗ của Việt Nam [9]. Đảng Sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,) là loài cây dược liệu có giá trị kinh tế cao, là loại thuốc quý có tác dụng bồi bổ sức khỏe, nâng cao thể lực, tăng khả năng miễn dịch cho cơ thể, có tác dụng ích huyết, sinh tân dịch, chống mệt mỏi, giảm stress, dùng làm thuốc bổ trong các trường hợp tỳ vị suy yếu, thiếu máu do mới ốm dậy; chữa đau dạ dày, ho, viêm thận, nước tiểu có albumin...do rễ củ của cây có chứa nhiều saponins, triterpenes, steroid. Ngoài ra ngọn và lá non làm rau ăn [8]. Ở Việt Nam, Đảng sâm phân bố tương đối rộng rãi ở nhiều tỉnh miền núi, nhưng do có giá trị sử dụng và kinh tế cao, cây thuốc này đã bị khai thác liên tục nhiều năm, thậm chí còn được xuất khẩu không chính thức qua biên giới. Hơn nữa, do nạn phá rừng, mở rộng nương rẫy, đã làm cho Đảng sâm mọc tự nhiên ở tất cả các tỉnh trở nên hiếm rõ rệt. Đảng sâm đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam (1996) và Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam (1996, 2001, 2006). Đồng thời cũng có tên trong Nghị định số 32/2006/NĐ 9 CP của Chính phủ (30/3/1006) nhằm tăng cường quản lý và bảo vệ [6]. Việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã làm tăng hệ số nhân giống của thực vật chỉ trong một thời gian ngắn, đồng thời việc nuôi cấy tế bào, mô và cơ quan thực vật đã giúp các nhà nghiên cứu thu nhận được sinh khối hay các hợp chất thứ cấp có giá trị trong y dược với hiệu suất cao khi không thể sản xuất từ tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hoá học [4].
2 Đối với cây Đảng sâm, hiện nay nguồn cung cấp dược liệu vẫn chủ yếu bằng thu hái tự nhiên và nuôi trồng truyền thống. Tuy nhiên, việc nuôi trồng lại phụ thuộc rất nhiều vào các điều kiện sinh thái và trồng trọt. Do cây Đảng sâm có thời gian thu hoạch phải từ 2-3 năm. Hơn nữa, việc phòng trừ các loại dịch bệnh, tồn dư của thuốc bảo vệ thực vật cũng là một vấn đề khó khăn [2]. Với các ưu điểm như nâng cao hàm lượng, chủ động quá trình sản xuất, tối ưu hóa quá trình chiết xuất hợp chất mục tiêu, việc nhân nuôi sinh khối cây dược liệu bằng phương pháp công nghệ sinh học để thu hợp chất thứ cấp là một biện pháp triển vọng để khắc phục những hạn chế của phương pháp nuôi trồng truyền thống. Phương pháp này có thể tạo ra một lượng sinh khối rễ bất định lớn trong thời gian ngắn nhằm phục vụ nhu cầu dược liệu của con người, rút ngắn thời gian sản xuất, cho hiệu quả kinh tế vô cùng lớn đồng thời góp phần đáp ứng nguồn nguyên liệu dùng chế biến sản phẩm sử dụng trong lĩnh vực y dược [4]. Trên đối tượng cây Đảng sâm, hiện nay các nghiên cứu chỉ mới tập trung vào đánh giá tác dụng dược lý, phân tích thành phần hóa học hay nhân giống in vitro [11]. Xuất phát từ thực tiễn này, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng tạo rễ bất định từ cây Đảng Sâm nam (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,)” Mục tiêu nghiên cứu Xác định được môi trường phù hợp để tạo rễ bất định cây Đảng Sâm in vitro và nhân sinh khối rễ bất định Đảng Sâm trong bình bioreactor. 2. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến khả năng phát triển hệ rễ bất định cây Đảng sâm - Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo và rễ bất định. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số hợp chất hữu cơ tự nhiên, đường đến sự tăng trưởng sinh khối rễ bất định cây Đảng sâm - Nghiên cứu sự tăng trưởng của rễ bất định khi nuôi cấy trong môi trường lỏng (bình bioreactor)
3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây Đảng Sâm 1.1.1. Phân loại khoa học Đảng sâm có tên khoa học là Codonopsis javanica (Blume) Hook. f. et Thoms hay còn có tên gọi khác là Sâm leo, Sâm nam, Cây đùi gà, Ngân đằng; Mằn rày cáy (Tày); Co nhả đòi (Thái); Cang hô (H' Mông). Thường mọc ven rừng, nương rẫy bỏ hoang lâu ngày ở độ cao 700m trở lên đối với các tỉnh phía Bắc và độ cao 1300m đối với các tỉnh phía Nam. Là loại cây ưa ẩm, ưa sáng, ưa bóng, mọc nơi đất tốt, nhiều mùn [6],[8]. Đảng Sâm mọc rải rác ở các tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam, phân bố chủ yếu ở các tỉnh Hà Giang (Vị Xuyên, Đồng Văn, Mèo Vạc, Quản Bạ, Yên Minh...). Lào Cai (Sa Pa, Bát Xát, Mường Khương, Văn Bàn); Lai Châu (Sìn Hồ, Phong Thổ, Mường Tè, Than Uyên). Yên Bái (Mù Căng Chải, Văn Chấn); Cao Bằng; Lạng Sơn; Hòa Bình; Sơn La; Nghệ An (Kỳ Sơn); Hải Dương (Chí Linh).., ở các tỉnh phía nam trở nên hiếm dần, chỉ thấy tập trung xung quanh núi Ngọc Linh (Quảng Nam, Kon Tum); vùng Đà Lạt và núi LangBiang (Lâm Đồng). Ngoài ra trên thế giới cây còn xuất hiện ở Trung Quốc, Lào, Ấn Độ, Myanma và Nhật Bản [16]. Phân loại dựa vào đặc điểm hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể, cây Đảng Sâm được phân loại như sau: [6],[29]. Tên Việt Nam: Đảng sâm nam Tên khoa học: Codonopsis javanica (Blume) Hook.f., Họ: Hoa chuông (Campanulaceae) Bộ: Hoa chuông (Campanulales) Lớp (nhóm): Hai lá mầm (Magnoliopsida) Ngành: Hạt kín (Magnoliophyta) Giới: Thực vật (Plantae) 1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh thái của cây Đảng Sâm Theo Sách đỏ Việt Nam [6] và Từ điển cây thuốc Việt Nam [8] đã chỉ ra đặc điểm sinh lý, sinh thái của cây Đảng sâm như sau:
4 Dây leo nhỏ, sống nhiều năm, leo bằng thân quấn. Có rễ bất định (củ) hình trụ, màu ngà vàng, có thể phân nhánh, nạc. Thân leo dài trên 1m, màu xanh hay phớt tím hồng, có lông nhỏ ở ngọn non sau nhẩn. Lá mọc đối, ít khi mọc so le, có cuống; phiến lá hình tim, dài 3 - 8cm, rộng 2 - 4cm, gốc lá chia 2 thùy tròn, đầu hơi nhọn, mép hơi lượn sóng hoặc có răng cưa tù; mặt trên lá xanh, mặt dưới màu hơi xám bạc; có lông nhỏ lúc non. Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá, có cuống dài 2 - 3cm; 5 lá đài thuôn hẹp màu xanh hoặc phớt tía; tràng hình chuông, màu trắng, có các gân màu tía, đầu xẻ thành 5 thùy, họng màu tím đen; 5 nhị, chỉ nhị dẹt, bao phấn đính gốc. Bầu có 5 ô; núm nhụy ngắn, tồn tại ở quả. Quả nang, gần hình cầu, đường kính 1 - 1,6cm; vết tràng hoa còn lại thành 5 gờ nông; khi chín màu tím đen. Hạt nhiều, màu vàng nâu. Toàn cây có nhựa mủ màu trắng. Mùa hoa quả: từ tháng 9 – tháng 12. Cây ưa ẩm, ưa sáng nhưng có thể hơi chịu bóng; thường mọc lẫn với các cây cỏ thấp ở ven rừng, đất sau nương rẫy hoặc trong các hốc đá ở rừng núi đá vôi. Độ cao từ 600m (Bắc Sơn - Lạng Sơn) đến 1.600m (Hà Giang, Lào Cai). Đảng sâm sinh trưởng mạnh trong mùa mưa ẩm. Sau khi quả già, phần trên mặt đất thường tàn lụi và sẽ mọc lại (từ đầu củ) vào mùa xuân năm sau. Song đối với cây còn nhỏ (chưa ra hoa quả năm đầu tiên) không có hiện tượng lụi mùa đông. Cây tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt. Do có củ nằm sâu dưới mặt đất, đảng sâm có thể tồn tại qua đợt cháy rừng hay đốt nương làm rẫy. Hình 1.1: Đảng Sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.,) (Nguồn: https://botanyvn.com/cay-dang-sam-nam)
5 1.1.3. Giá trị dược liệu của cây Đảng Sâm Cây Đảng Sâm có tác dụng và được sử dụng tương tự cây Nhân Sâm trong đời sống nhân dân Việt Nam và được coi là "nhân sâm của người nghèo" [12]. Thành phần quan trọng nhất trong cây Đảng Sâm là bộ phận rễ củ của cây. Rễ đảng sâm được thu hoạch vào năm thứ 3 hay 4 của đời cây và phơi khô trước khi đem bán. Rễ cây Đảng Sâm có chứa các chất như saponin, đường khử, acid amin, chất béo, terpen, hợp chất glycosid, vitamin, các nguyên tố khoáng, alkaloid [11]. Hợp chất được ưu tiên quan tâm nhất trong rễ cây Đảng Sâm là saponin. Nó có nhiều tác dụng to lớn. Đối với các hệ cơ quan trong cơ thể có tác dụng chống mệt mỏi, tăng cường sự thích nghi của cơ thể với môi trường ở nhiệt độ cao. Đối với hệ tiêu hóa, có tác dụng tăng cường trương lực của hối tràng. Đối với tim mạch có tác dụng làm tăng cường độ co bóp của tim, tăng lượng máu cho não, chân và nội tạng. Đối với máu và hệ thống máu giúp làm tăng lượng hồng cầu, huyết sắc tố, làm giảm số lượng bạch cầu, làm tăng nhanh máu đông khô mà không có tác dụng tán huyết. Ngoài ra còn có tác dụng hạ huyết áp, tăng cường miễn dịch của cơ thể, có tác dụng kháng viêm, giảm ho, kháng khuẩn,…[ 23]. 1.1.4. Thành phần và công dụng của Đảng sâm Thành phần hóa học: Lá Ðảng sâm non chứa nước 77,5%, protid 4,2%, glucid 13,1%, xơ 3,3%, caroten 3,6mg%, vitamin C 85,5mg%. Sơ bộ thấy trong rễ cây có đường, chất béo; không chỉ có saponin là thành phần chính còn có anthraglucosid, iridoid glucoside, các sterol, các chất vô cơ như K, Na, Mg, Fe, Cu, Zn…, tinh bột, đường, acid hữu cơ, tinh dầu, vitamin C [11]. Theo Y dược học Trung Hoa [1] và Dược điển Việt Nam [7]. Đảng sâm có rất nhiều công dụng và có nhiều bài thuốc được áp dụng trong dân gian như sau: Công dụng dược lý của Đảng sâm: + Tác dụng tăng sức: Thực nghiệm cho thấy Đảng sâm có tác dụng chống mỏi mệt và tăng sự thích nghi của động vật trong môi trường nhiệt độ cao. Thực nghiệm trên động vật chứng minh rằng Đảng sâm có tác dụng trên cả 2 mặt hưng phấn và ức chế của vỏ não. Thí nghiệm cho thấy dịch chiết xuất thô của Đảng sâm có tác dụng làm tăng sự thích nghi của chuột nhắt trong trạng thái thiếu dưỡng khí (do thiếu dưỡng khí ở tổ chức tế bào, do suy tuần hoàn hoặc do làm tăng sự tiêu hao dưỡng khí…) thuốc đều có tác dụng với mức độ khác nhau [7].
6 + Đối với máu và hệ thống tạo máu [7]: * Nước sắc Đảng sâm có tác dụng làm tăng số lượng hồng cầu, huyết sắc tố. Dịch tiêm Đảng sâm tăng nhanh máu đông mà không có tác dụng tán huyết. * Tiêm mạch máu dung dịch Đảng sâm 20% (4ml/1kg thể trọng) hoặc cho uống (mỗi ngày 20g) đều thấy hồng cầu tăng lên, bạch cầu giảm xuống. + Đối với huyết áp: Tiêm mạch máu dung dịch Đảng sâm 20% (chiết xuất bằng nước và bằng rượu) cho thỏ và chó đã gây mê đều thấy hạ huyết áp. Tác giả có tiêm dung dịch 4,8% glucose và đối chứng là dung dịch đảng sâm không chứa glucose thì không thấy hạ huyết áp, do đó tác giả cho rằng hiện tượng hạ huyết áp không liên quan đến thành phần đường trong Đảng sâm. Tác giả cho rằng hiện tượng hạ huyết áp là do gĩan mạch ngoại vi. Đảng sâm còn có tác dụng ức chế hiện tượng cao huyết áp do Adrenalin gây ra: nếu lượng Adrenalin tiêm thì cao thì hiện tượng ức chế kém, nếu lượng Adrenalin tiêm thấp thì hiện tượng ức chế càng mạnh [7]. + Tăng khả năng miễn dịch của cơ thể: dùng chế phẩm Đảng sâm tiêm bụng, tiêm bắp hoặc tiêm tĩnh mạch chuột nhắt đều có tác dụng làm tăng số lượng thực bào rõ rệt, thể tích tế bào tăng giả túc nhiều hơn, khả năng thực bào cüng tăng. Các thành phần trong tế bào như DNA, RNA, các enzym, acid được tăng lên rõ rệt [7]. + Kháng viêm, hóa đàm, chỉ khái (giảm ho). + Kháng khuẩn: Trên thực nghiệm ‘In Vitro’ thấy Đảng sâm có tác dụng kháng khuẩn ở mức độ khác nhau đối với các loại vi khuẩn sau: Não mô cầu khuẩn, Trực khuẩn bạch hầu, Trực khuẩn và Phó trực khuẩn đại tràng, Tụ cầu khuẩn vàng, Trực khuẩn lao ở người [7]. + Ngoài ra, Đảng sâm còn có tác dụng làm hưng phấn tử cung cô lập của chuột cống, phát triển nội mạc tử cung kiểu Progesteron mức độ nhẹ, gây tăng trương lực cổ tử cung, tiết sữa ở động vật mẹ cho con bú, nâng cao corticosterone trong huyết tương, nâng cao đường huyết [7]. Một số bài thuốc từ Đảng sâm [1]: + Thanh Phế kim, bổ nguyên khí, khai thanh âm, tráng gân cơ: Đảng sâm 640g, Sa sâm 320g, Quế viên nhục 160g. Nấu thành cao, uống. + Trị thần kinh suy nhược: Đảng sâm 12g, Mạch môn 12g, Ngũ vị tử 8g. Sắc uống. + Trị trẻ nhỏ miệng bị lở loét: Đảng sâm 40g, Hoàng bá 20g. Tán bột, bôi.
7 + Trị huyết áp thấp: Đảng sâm 16g, Hoàng tinh 12g, Nhục quế 10g, Cam thảo 6g, Đại táo 10 quả, sắc uống ngày 1 thang. 15 ngày là 1 liệu trình, dùng 1-2 liệu trình. + Trị huyết áp cao ở người bị bệnh cơ tim: Đảng sâm 10g, Vỏ con trai (loại cho ngọc) 16g, Sinh địa 10g, Đương quy 10g, Trắc bá tử (hạt) 16g, Táo 16g, Phục linh 16g, Mộc hương 6g, Hoàng liên 6g. Sắc với 800ml nước, chia làm 3 lần uống liên tục 2 – 2,5 tháng. + Trị Phế quản viêm mạn (thể khí hư huyết ứ): Đảng sâm, Ngũ linh chi, Thương truật, Sinh khương, mỗi thứ 10g, sắc uống. Đã trị 32 trường hợp, mỗi năm uống thuốc từ tháng 11 đến tháng 3 năm sau, mỗi lần 20-30ml (những lúc sốt,cảm, không uống), uống liên tục 1-2 tháng, có kết quả: 93,75%. kết quả tốt 53,13%, không có phản ứng phụ. + Trị thần kinh suy nhược: dùng dung dịch tiêm ‘Phức Phương Đảng Sâm’ (mỗi ml có 1g Đảng sâm, 50mg vitamin B1) tiêm bắp mỗi ngày 1 lần 2ml, liệu trình 15 ngày, có kết quả nhất định. + Trị tử cung xuất huyết cơ năng: dùng độc vị Đảng sâm, mỗi ngày 30-60g, sắc, chia làm 2 lần uống, liên tục 5 ngày trong thời kì kinh nguyệt . + Trị hư lao, ho, cơ thể suy nhược: Đảng sâm 16g, Hoài sơn 12g, dĩ nhân 6g, Cam thảo 2g, Khoản đông hoa 6g, Xa tiền tử 6g. Sắc, chia làm 3 lần uống. + Trị Thận suy, hay đau lưng, mỏi gối, đái lắt nhắt, bồi dưỡng cơ thể: Đảng sâm 16g, Cáp giới 6g, Huyết giác 1,2g, Trần bì 0,8g, Tiểu hồi 6g. Ngâm với 1 xị (250ml) rượu uống trước khi đi ngủ. + Trị cơ thể mỏi mệt, ăn không ngon, đại tiện lỏng: sắc 20 – 40g Đảng sâm uống, hoặc kết hợp các vị thuốc khác như: Bạch truật (sao), Đương quy, Ba kích mỗi thứ 12g, sắc uống hoặc tán bột viên với mật, ngày uống 12-20g. + Trị người già suy yếu lâu ngày, người làm việc nhiều hao sức lao động cüng như trí óc: Đảng sâm 40g, Ngưu tất, Mạch môn, Đương quy, Long nhãn trí óc, mệt tim, ê ẩm: Đảng sâm 40g, Ngưu tất, Mạch môn, Đương quy, Long nhãn 8g + Trị trung khí suy nhược, vị bất hòa: nấu Đảng sâm với đường cát thành cao lỏng Đảng sâm, uống + Trị khí huyết đều suy: Đảng sâm, Chích hoàng, Bạch truật, Long nhãn, Đường cát, nấu thành cao uống. 1.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ thuật được sử dụng để duy
8 trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với những thành phần đã xác định [5]. Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở tính toàn năng và sự phân hóa, phản phân hóa tế bào. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị: phân hóa tế bào tế bào phôi sinh tế bào dãn tế bào chuyên hóa phản phân hóa tế bào 1.2.1. Vật liệu nuôi cấy Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho nuôi cấy mô tế bào thực vật. Vật liệu dùng cho nuôi cấy mô-tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan hay bộ phận của cây (chồi ngọn, chồi bên, phiến lá,…), các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm…), các cơ quan dự trữ (củ, thân rễ…) [5],[26]. Tuy mang cùng lượng thông tin di truyền nhưng các cấu trúc mô khác nhau trên cùng cây có thể phát sinh các hình thái khác nhau trong quá trình nuôi cấy, vì vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy phải căn cứ vào trạng thái sinh lý và tuổi của mẫu, chất lượng cây lấy mẫu, kích thước và vị trí lấy mẫu, mục đích và khả năng nuôi cấy [26]. 1.2.2. Điều kiện nuôi cấy - Điều kiện vô trùng: Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, các thao tác với mẫu cấy được tiến hành trong buồng cấy vô trùng. - Ánh sáng và nhiệt độ: Mẫu nuôi cấy thường được đặt trong phòng ổn định về ánh sáng và nhiệt độ. 1.2.3. Môi trường dinh dưỡng Môi trường dinh dưỡng là điều kiện cần thiết cho mẫu nuôi cấy sinh trưởng và phát sinh hình thái, quyết định đến thành công của quá trình nuôi cấy [10]. Thành phần và nồng độ các chất trong môi trường dinh dưỡng đa dạng tùy thuộc loại mẫu và mục đích nuôi cấy nhưng đều gồm các thành phần chính sau: - Nguồn cacbon Mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị dưỡng mặc dù chúng có thể sống bán dị dưỡng trong điều kiện ánh sánh nhân tạo và
9 lục lạp vẫn có khả năng quang hợp. Vì vậy, việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc. Nguồn cacbon thông dụng nhất hiện nay là saccharose, ngoài ra có thể sử dụng glucose, maltose [5]. - Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng Nguyên tố đa lượng: Quan trọng nhất là các nguyên tố N, P, K, Mg, Ca, Na, S [5]. Bảng 1.2. Các nguyên tố đa lượng và dạng sử dụng chính Nguyên tố Dạng sử dụng Thường được sử dụng ở dạng NO3- hoặc NH4+ , hầu hết các loại thực Nitơ vật sẽ sử dụng nguồn nitơ này để đồng hóa và tổng hợp nên các sản phẩm hữu cơ. Nhu cầu phospho của mô và tế bào nuôi cấy là rất cao, P có tác dụng Phospho như hệ thống đệm giúp ổn định pH môi trường Kali Thường dùng ở dạng KNO3, KH2PO4, KCl.6H2O Canxi Sử dụng chủ yếu là CaNO3.4H2O, CaCl2.6H2O, CaCl2.2H2O Magie Sử dụng chủ yếu là MgSO4 Lưu huỳnh Chủ yếu là SO4- Nguyên tố vi lượng: Chủ yếu là Fe, B, Mn, Cu, Zn, I, Ni… các nguyên tố vi lượng tuy bổ sung với lượng nhỏ vào môi trường nhưng có vai trò quan trọng đối với quá trình trao đổi chất, tổng hợp protein, hoạt động phân bào của mô, tế bào nuôi cấy [5]. - Vitamin Hầu hết các tế bào nuôi cấy có khả năng tổng hợp vitamin nhưng không đủ về lượng nên cần bổ sung, nhất là nhóm vitamin B [5].  Vitamin B1 (Thiaminee HCl): Là chất bổ sung rất cần thiết cho môi trường nuôi cấy, có vai trò trong trao đổi hydratcacbon và sinh tổng hợp amino acid. Vitamin B6 (Pyridocine): Là coenzyme quan trọng trong nhiều phản ứng trao đổi chất. Vitamin B3 (Nicotinic acid): Tham gia tạo coenzyme của chuỗi hô hấp. Myo-inositol: Có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào, màng tế bào, tham gia vận chuyển đường, các nguyên tố khoáng, trao đổi hydratcacbon. - Các chất hữu cơ tự nhiên
10 Nước dừa: Chứa nhiều chất dinh dưỡng như inositol, các amino acid, đường, các chất thuộc nhóm cytokinin, các chất có hoạt tính auxin…. Dịch thủy phân casein: Chứa nhiều amino acid. Dịch chiết nấm men: Có hàm lượng khá cao các vitamin nhóm B. Nước ép các loại củ quả: Nước ép cà chua, cà rốt, nước ép chuối xanh…. - Các thành phần khác Agar: Chiết xuất từ rong biển, thành phần của agar gồm có một số chất hữu cơ như acid hữu cơ, acid béo; cùng 1 số nguyên tố vô cơ như Cu, Fe, Zn… Ngoài tác dụng tạo gel cho môi trường agar cũng cung cấp 1 số chất dinh dưỡng cho tế bào, mô nuôi cấy. Than hoạt tính: Dùng để hấp thụ chất màu, các hợp chất thứ cấp gây ức chế sự sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Ngoài ra, có thể sử dụng 1 số chất chống oxy hóa khác như polyvinyl pyrolodon (PVP), acid ascobic. - pH của môi trường Độ pH của môi trường ảnh hưởng đến khả năng tiếp nhận chất dinh dưỡng của mẫu từ môi trường nuôi cấy. Đa số pH của môi trường được điều chỉnh trong khoảng từ 5,5-6,0. Trong quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm do mẫu nuôi cấy sản sinh ra các acid hữu cơ. - Các chất điều hòa sinh trưởng Theo Nguyễn Như Khanh trong tài liệu về chất điều hòa sinh trưởng thực vật đã chỉ ra [20] : các chất điều hòa sinh trưởng là thành phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật. Hiệu quả của chất điều hòa sinh trưởng phụ thuộc vào: Nồng độ, hoạt tính của chất điều hòa sinh trưởng và yếu tố nội sinh của mẫu cấy. Dựa vào hoạt tính sinh lý phân chất điều hòa sinh trưởng thành 2 nhóm: Nhóm chất kích thích sinh trường và nhóm chất ức chế sinh trưởng. Trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật, nhóm chất kích thích sinh trưởng là nhóm thường được sử dụng [10].  Nhóm Auxin: Được phát hiện lần đầu tiên bởi Charles Darwin và con trai là Francis Darwin khi thử nghiệm tính hướng sáng trên cây yến mạch. Sau đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và dần mở rộng hiểu biết về nhóm chất này. Auxin trong cơ thể thực vật tập trung nhiều ở các chồi, lá non, hạt nảy mầm, trong phấn hoa. Auxin có nhiều tác động tới các hiệu ứng sinh trưởng và phát triển trên cơ thể thực vật. Cụ thể
11 như sau: Auxin có ảnh hưởng tới tính hướng động của thực vật, tiêu biểu là tính hướng sáng và hướng đất. Auxin gây ra hiện tượng ưu thế đỉnh (sự sinh trưởng của chồi đỉnh sẽ ức chế chồi nách). Auxin khởi động việc hình thành rễ bên và rễ phụ do auxin kích thích sự phân chia của tế bào trụ bì, nơi rễ sẽ sinh trưởng xuyên qua vỏ và biểu bì. Ngoài ra, auxin còn có tác động đến việc hình thành chồi hoa, sự phát triển của quả và làm chậm sự rụng lá. Các auxin thường được sử dụng là NAA, IBA, 2,4D (các auxin nhân tạo), IAA (auxin tự nhiên). Hoạt tính của các chất này được xếp theo thứ tự từ yếu đến mạnh như sau: IAA, IBA, NAA và 2,4D. IAA nhạy cảm với nhiệt độ và dễ phân hủy trong quá trình hấp khử trùng do đó không ổn định trong môi trường nuôi cấy mô. NAA và 2,4D không bị biến tính ở nhiệt độ cao. Tuy nhiên chất 2,4D là chất dễ gây độc nhưng có tác dụng nhạy đến sự phân chia tế bào và hình thành callus.  Nhóm Cytokinin: Được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ XX, chất đầu tiên là Kinetin bắt nguồn từ tinh dịch cá trích. Tiếp đó, đến zeatin tách từ nội nhũ của hạt ngô non. Đã phát hiện cytokinin ở vi sinh vật, tảo, tảo silic, rêu, dương xỉ, cây lá kim. Zeatin có nhiều trong thực vật bậc cao và trong một số vi khuẩn. Trong thực vật, cytokinin có nhiều trong hạt, quả đang lớn, mô phân sinh. Cytokinin kích thích hoặc ức chế nhiều quá trình sinh lý, trao đổi chất. Cùng với auxin, cytokinin điều khiển sự phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô. Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích tạo rễ, ngược lại sẽ hình thành chồi. Cytokinin cảm ứng sự hình thành chồi bên và ức chế ưu thế đỉnh. Quá trình sinh trưởng dãn dài của tế bào cũng chịu ảnh hưởng của cytokinin. Ngoài ra, cytokinin còn làm chậm sự già hóa. Trong các chất thuộc nhóm cytokinin thì kinetin và BAP được sử dụng phổ biến vì hoạt tính mạnh: Kinetin (phối hợp cùng auxin với tỷ lệ thích hợp có khả năng kích thích phân chia tế bào), BAP (hoạt tính mạnh, bền với nhiệt), ngoài ra có thể sử dụng TDZ, Diphenylurea….  Nhóm Gibberellin: Được tách chiết lần đầu tiên từ dịch tiết của nấm bởi các nhà khoa học Nhật Bản vào những năm 1935-1938. Gibberellin được tổng hợp trong các mô đỉnh, tồn tại trong cả hạt non và quả đang phát triển. Gibberellin có tác dụng chính trong việc hoạt hóa phân bào của mô phân sinh lóng, kéo dài lóng cây. Nó cũng kích thích sự kéo dài của tế bào, tăng kích thước của chồi nuôi cấy. GA3 là loại gibberellin được sử dụng nhiều nhất.