Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt

Chia sẻ: Na Na | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:62

Thêm vào BST

Báo xấu

95
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nhằm thu được enzyme có hoạt tính thủy phân lignocellulose hiệu quả thành các đường đơn và đường đôi từ phế phụ liệu nông nghiệp, để rồi từ đó đưa vào ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm có giá trị trong đời sống con người, tác giả đã thực hiện đề tài: “Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt”.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt

MỤC LỤC MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 6 1.1. Cấu trúc của lignocellulose .............................................................................. 6 1.1.1. Cấu trúc thành tế bào thực vật ................................................................... 6 1.1.2. Cellulose ................................................................................................... 9 1.1.3. Lignin ..................................................................................................... 11 1.1.4. Hemicellulose ......................................................................................... 15 1.2. Enzyme thủy phân lignocellulose .................................................................. 17 1.2.1. Enzyme cellulolytic ................................................................................ 18 1.2.2. Enzyme xylanolytic ................................................................................ 20 1.3. Ứng dụng của enzyme lignocellulolytic ......................................................... 22 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................ 24 2.1. Nguyên liệu ................................................................................................... 24 2.1.1. Mẫu đất................................................................................................... 24 2.1.2. Hóa chất ................................................................................................. 24 2.1.3. Thiết bị ................................................................................................... 24 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 24 2.2.1. Sàng lọc và phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt .... 24 2.2.2. Nhận dạng chủng vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt. ........ 25 2.2.2.1. Kiểm tra hình thái tế bào vi khuẩn .................................................... 25 2.2.2.2. Tách chiết ADN tổng số ................................................................... 25 2.2.2.3. Định lượng ADN bằng cách đo độ hấp thụ tử ngoại ở bước sóng 260 nm và 280 nm. ................................................................................................. 26 1
2.2.2.4. PCR nhân bản đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S ................. 27 2.2.2.5. Gắn sản phẩm PCR vào vector p-GEM T ......................................... 27 2.2.2.6. Tách ADN plasmid từ vi khuẩn E.coli DH5α ................................... 28 2.2.2.7. Đọc trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S..................... 29 2.2.3. Thu nhận chế phẩm enzyme .................................................................... 30 2.2.4. Xác định hoạt độ enzyme ........................................................................ 31 2.2.4.1. Xác định hoạt độ enzyme ................................................................. 31 2.2.4.2. Ảnh hưởng của pH đối với hoạt độ và độ bền của enzyme ............... 33 2.2.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt độ và độ bền của enzyme........ 33 2.2.5. Xác định protein ..................................................................................... 33 2.2.6. Thủy phân các chất lignocellulose .......................................................... 33 2.2.7. Tách phức hệ multienzyme từ dịch lỏng của môi trường nuôi cấy ........... 33 2.2.8. Điện di gel và kỹ thuật zymogram .......................................................... 34 2.2.9. Sắc ký bản mỏng (TLC) .......................................................................... 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................... 35 3.1. Sàng lọc và phân lập vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt ........... 35 3.1.1. Sàng lọc các vi khuẩn ưa nhiệt kỵ khí bằng môi trường làm giàu và nuôi cấy ở nhiệt độ cao................................................................................................ 35 3.1.2. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có hoạt tính xylanolytic-cellulolytic ........... 39 3.2. Kết quả nhận dạng vi khuẩn kị khí xylanolytic-cellulolytic ưa nhiệt .............. 40 3.2.1. Xác định hình thái tế bào vi khuẩn .......................................................... 40 3.2.2. Nhận dạng vi khuẩn bằng đọc trình tự đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S ...................................................................................................... 41 3.2.2.1. Tách chiết ADN hệ gen của chủng vi khuẩn NKP13 ........................ 41 2
3.2.2.2. Nhân bản đoạn gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn NKP13 bằng PCR ................................................................................. 42 3.2.2.3. Nhân dòng gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn NKP13 vào vector p-GEM T ........................................................................... 44 3.2.2.4. Giải trình tự gen mã hóa cho ARN ribosome 16S của chủng vi khuẩn NKP13… ......................................................................................................... 47 3.3. Nghiên cứu phức hệ enzyme xylanolytic-cellulolytic của chủng NKP13 ....... 49 3.3.1. Khả năng sinh tổng hợp xylase và CMCase ............................................ 49 3.3.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt độ xylanase và CMCase .............................. 51 3.3.2.1. pH phản ứng tối ưu........................................................................... 51 3.3.2.2. Độ bền pH ........................................................................................ 52 3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzyme xylanase và CMCase và độ bền nhiệt của enzyme .......................................................................................... 53 3.3.3.1. Nhiệt độ phản ứng tối ưu .................................................................. 53 3.3.3.2. Độ bền nhiệt ..................................................................................... 53 3.3.4. Khả năng thủy phân nguyên liệu lignocellulose của enzyme ................... 54 3.3.5. Điện di chế phẩm enzyme trên gel polyacrylamide có SDS..................... 56 KẾT LUẬN ................................................................................................................ 58 KIẾN NGHỊ ............................................................................................................... 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 59 3
MỞ ĐẦU Cùng với sự phát triển của nông nghiệp, hàng năm hàng triệu tấn chất lignocellulose bắt nguồn từ các hoạt động nông nghiệp, được thải ra môi trường. Điều này không chỉ làm tăng thêm gánh nặng môi trường mà còn làm lãng phí về các nguồn sinh khối, do đó cần phải thực hiện nghiêm ngặt các tiêu chuẩn đối với việc thải các chất thải vào môi trường. Các phương pháp xử lý hóa học và sinh học thông thường ngày càng khó đạt được mức độ cần thiết để loại bỏ các chất ô nhiễm này. Vì vậy cần phải triển khai những biện pháp xử lý sao cho vừa nhanh hơn, rẻ hơn, hiệu quả hơn, đáng tin cậy hơn vừa đem lại lợi ích kinh tế. Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, công nghệ sinh học đã được ứng dụng rộng rãi trong xử lý chất thải nông nghiệp. Thế hệ nhiên liệu sinh học đầu tiên dựa trên đường, tinh bột và dầu thực vật, tuy nhiên chưa thực sự có được những ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp. Lignocellulose được xem là thế hệ nhiên liệu sinh học thứ hai. Đối với môi trường và các ngành kinh tế, các chất thải lignocellulose sẽ được sử dụng như một nguồn nguyên liệu để sản xuất các chất hóa học, nhiên liệu và các vật chất tương hợp khác. Bên cạnh đó, các nguồn nguyên liệu này được đặc biệt quan tâm vì giá thành thấp và nguồn cung cấp dồi dào. Quá trình biến đổi sinh học các chất thải thành nhiên liệu có thể mang đến các lợi nhuận về kinh tế cũng như về môi trường [1]. Lignocellulose (sinh khối thực vật) bao gồm các polysaccharide chủ yếu là cellulose, hemicellulose (xylan) và lignin, trong đó cellulose và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao nhất. Cellulose chiếm phần lớn, khoảng từ 35% đến 50% khối lượng khô thực vật, còn hai hợp chất, hemicellulose và lignin lần lượt chiếm khoảng 20-30% và 5-20% khối lượng khô của cơ thể thực vật [23]. Với tính sẵn có lignocellulose trở thành một nguồn năng lượng tái tạo dồi dào [36]. 4
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh khả năng và triển vọng sử dụng enzyme vào việc biến đổi sinh học các chất thải lignocellulose để tạo ra các đường đơn hữu ích từ phế phụ liệu chứa lignocellulose [3]. Nhằm thu được enzyme có hoạt tính thủy phân lignocellulose hiệu quả thành các đường đơn và đường đôi từ phế phụ liệu nông nghiệp, để rồi từ đó đưa vào ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm có giá trị trong đời sống con người, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “ Bước đầu nghiên cứu enzyme xylanolytic và cellulolytic từ một chủng vi khuẩn ưa nhiệt”. 5
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cấu trúc của lignocellulose 1.1.1. Cấu trúc thành tế bào thực vật Trong tự nhiên, các lớp của thành tế bào thực vật được minh họa bằng mô hình của gỗ (Hình 1.1). Ở giữa các tế bào, có một hợp chất đóng vai trò như keo dán gắn kết các tế bào lại với nhau, đó là lớp gian bào (middle lamella). Lớp này cấu tạo từ các chất keo, có bản chất pectin và không có tác động về quang học. Bên trong là thành tế bào sơ cấp (primary wall). Hình 1.1: Cấu trúc thành tế bào thực vật [37] Thành tế bào sơ cấp có thể được chia thành mặt bên trong và mặt bên ngoài. Sự sắp xếp của các vi sợi trong thành tế bào sơ cấp phân tán tăng dần từ mặt trong ra mặt ngoài. Tiếp đến là thành tế bào thứ cấp gồm 3 lớp: lớp ngoài (S1), lớp giữa (S2) và lớp trong (S3). Sự phân chia thành tế bào thứ cấp thành ba lớp S chủ yếu là do sự định hướng khác nhau của các vi sợi trong ba lớp đó. Điển hình các vi sợi định hướng xoắn trong vách tế bào. Lớp ngoài của thành tế bào thứ cấp, các vi sợi được định hướng trong cấu trúc xoắn chéo có độ nghiêng tạo thành một góc lớn với trục dọc của tế bào. 6
Lớp giữa là lớp dày nhất và ở lớp giữa có góc nhỏ và độ nghiêng của sợi xoắn ốc trong khi vi sợi trong lớp 3 được sắp xếp như ở lớp ngoài, với một góc rộng với trục dọc của tế bào. Ngoài ra trong một số trường hợp, trên mặt trong của thành tế bào có lớp sần sùi (W). Chức năng của thành tế bào là chống đỡ cho các cơ quan của cây đặc biệt là các vách dày và cứng. Thành tế bào còn giữ các chức năng quan trọng chính như hấp thụ, thoát hơi nước hay vận chuyển và bài tiết. Lignocellulose là thành phần triển của cây và các điều kiện khác. Thành cấu trúc chính của thực vật thân gỗ phần của lignocellulose được trình bày ở và các thực vật khác như cỏ, lúa, bảng 1.1 [9]. ngô…Trong tự nhiên, chúng ta có thể tìm thấy lignocellulose ở thực vật hay các chất thải nông nghiệp, lâm nghiệp và các chất thải rắn trong thành phố. Thành phần chủ yếu của lignocellulose là cellulose, hemicellulose và lignin (Hình 1.2). Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử cấu tạo từ các gốc đường khác nhau, trong khi lignin là một polymer dạng vòng được tổng hợp từ tiền phenylpropanoid. Thành phần cấu tạo và phần trăm của các polymer này là khác nhau giữa các loài. Hơn nữa, thành phần cấu tạo trong cùng một cây hay các cây khác nhau là khác nhau dựa vào Hình 1.2: Thành phần chủ yếu của độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát lignocellulose 7
Bảng 1.1: Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ liệu nông nghiệp phổ biến [9] Nguồn lignocellulose Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%) Thân gỗ cứng 40-55 24-40 18-25 Thân gỗ mềm 45-50 25-35 25-35 Vỏ lạc 25-30 25-30 30-40 Lõi ngô 45 35 15 Giấy 85-99 0 0-15 Vỏ trấu 32.1 24 18 Vỏ trấu của lúa mì 30 50 15 Rác đã phân loại 60 20 20 Lá cây 15-20 80-85 0 Hạt bông 80-95 5-20 0 Giấy báo 40-55 25-40 18-30 Giấy thải từ bột giấy hóa học 60-70 10-20 5-10 Chất rắn nước thải ban đầu 8-15 - 24-29 Chất thải của lợn 6 28 - Phân bón gia súc 1.6-4.7 1.4-3.3 2.7-5.7 Cỏ ở bờ biển Bermuda 25 35.7 6.4 Cỏ mềm 45 31.4 12.0 Các loại cỏ (trị số trung bình 25-40 25-50 10-30 cho các loại) Bã thô 33.4 30 18.9 8
Lượng lớn lignocellulose được thải ra từ các ngành lâm nghiệp, nông nghiệp, công nghiệp giấy và gây ra ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, lượng lớn các sinh khối thực vật dư thừa được coi là rác thải có thể được biến đổi thành nhiều sản phẩm có giá trị khác nhau như nhiên liệu sinh học, hóa chất, các nguồn năng lượng rẻ cho quá trình lên men, bổ sung chất dinh dưỡng cho con người và thức ăn cho động vật [15]. 1.1.2. Cellulose Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (C6H10O5)n, và là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, gồm nhiều cellobiose liên kết với nhau, 4-O- (β-D- Glucopyranosyl)-D-glucopyranose (Hình 1.3). Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp được khoảng 1011 tấn cellulose (trong gỗ, cellulose chiếm khoảng 50% và trong bông chiếm khoảng 90%). Hình 1.3: Công thức hóa học của cellulose Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là tinh thể và vô định hình. Trong vùng tinh thể, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bị tấn công bởi enzyme cũng như hóa chất. Ngược lại, trong vùng vô định hình, cellulose liên kết không chặt với nhau nên dễ bị tấn công [40]. Có hai mô hình cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mô tả vùng tinh thể và vô định hình như hình 1.4 [29]. 9
Hình 1.4: Mô hình Fringed fibrillar và mô hình chuỗi gập Trong mô hình Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo thẳng và định hướng theo chiều sợi. Vùng tinh thể có chiều dài 500 Å và xếp xen kẽ với vùng vô định hình. Trong mô hình chuỗi gập: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi. Mỗi đơn vị lặp lại có độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và b như trên hình vẽ. Các đơn vị đó được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vô định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng vô định hình, các liên kết β - glycoside giữa các monomer bị thay đổi góc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 180o cho toàn mạch. Vùng vô định hình dễ bị tấn công bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi góc liên kết của các liên kết cộng hóa trị (β - glycoside) sẽ làm giảm độ bền của liên kết, đồng thời vị trí này không tạo được liên kết hydro [2]. Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp như tinh bột và glycogen. Các polysaccharide này đều được cấu tạo từ các đơn phân là glucose. Cellulose là glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucose kết hợp với nhau qua liên kết β- 10
1 4- glycoside, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử carbohydrate phức tạp khác. Giống như tinh bột, cellulose được cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất 500 phân tử glucose. Các chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm. Mỗi chuỗi có nhiều nhóm OH tự do, vì vậy giữa các sợi ở cạnh nhau kết hợp với nhau nhờ các liên kết hidro được tạo thành giữa các nhóm OH của chúng. Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hay còn gọi là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những khoảng trống lớn. Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già thì chứa đầy lignin và hemicellulose. Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thủy phân. Người và động vật không có enzyme phân giải cellulose (cellulase) nên không tiêu hóa được cellulose, vì vậy cellulose không có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, một số nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hòa hoạt động của hệ thống tiêu hóa. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose. Nấm đất cũng có thể phân hủy cellulose. Vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn. 1.1.3. Lignin Lignin là một phức hợp chất hóa học phổ biến được tìm thấy trong hệ mạch thực vật, chủ yếu là giữa các tế bào, trong thành tế bào thực vật. Lignin là một trong các polymer hữu cơ phổ biến nhất trên trái đất. Lignin có cấu trúc không gian 3 chiều, phức tạp, vô định hình, chiếm 17% đến 33% thành phần của gỗ. Lignin không phải là carbohydrate nhưng có liên kết chặt chẽ với nhóm này để tạo nên màng tế bào giúp thực vật cứng chắc và giòn, có chức năng vận chuyển nước trong cơ thể thực vật (một phần là để làm bền thành tế bào và giữ cho cây không bị đổ, một phần là điều chỉnh dòng chảy của nước), giúp cây phát triển và chống lại sự tấn công của côn trùng và mầm bệnh. Thực vật càng già, lượng lignin tích tụ càng lớn. Hơn nữa, lignin đóng vai 11
trò quan trọng trong chu trình carbon, tích lũy carbon khí quyển trong mô của thực vật thân gỗ lâu năm, là một trong các thành phần bị phân hủy lâu nhất của thực vật sau khi chết, để rồi đóng góp một phần lớn chất mùn giúp tăng khả năng quang hợp của thực vật. Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở. Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose. Rất khó để có thể tách lignin ra hoàn toàn. Lignin là polymer, được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình là: guaiacyl (G), trans-coniferyl alcohol; syringyl (S), trans-sinapyl alcohol; p-hydroxylphenyl (H), trans-p-courmary alcohol (Hình 1.5). Hình 1.5: Các đơn vị cơ bản của lignin [14] Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của nó trong gỗ. Ngoài việc được phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin có thể được phân thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringyl lignin. Gỗ mềm chứa chủ yếu là guaiacyl, gỗ cứng chứa chủ yếu syringyl. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng guaiacyl lignin hạn chế sự trương nở của xơ sợi và vì vậy loại nguyên liệu đó sẽ khó bị tấn công bởi enzyme hơn syringyl lignin [29]. Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng lignin hoàn toàn không đồng nhất trong cấu trúc. Lignin dường như bao gồm vùng vô định hình và các vùng có cấu trúc hình thuôn hoặc hình cầu. Lignin trong tế bào thực vật bậc cao không có vùng vô định hình. 12
Các vòng phenyl trong lignin của gỗ mềm được sắp xếp trật tự trên mặt phẳng thành tế bào. Ngoài ra, cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của lignin đều bị ảnh hưởng bởi mạng polysaccharide. Việc mô hình hóa động học phân tử cho thấy rằng nhóm hydroxyl và nhóm methoxyl trong các oligomer tiền lignin sẽ tương tác với vi sợi cellulose cho dù bản chất của lignin là kỵ nước. Hình 1.6: Cấu trúc lignin trong gỗ mềm với các nhóm chức chính 13
Các nhóm chức ảnh hưởng đến hoạt tính của lignin bao gồm nhóm phenolic hydroxyl tự do, methoxyl, benzylic hydroxyl, ether của benzylic với các rượu mạch thẳng và nhóm carbonyl (Hình 1.6). Guaicyl lignin chứa nhiều nhóm phenolic hydroxyl hơn syringyl. Lignin tạo liên kết hóa học với hemicellulose và ngay cả với cellulose (nhưng không nhiều). Độ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản chất liên kết, cấu trúc hóa học của lignin và các gốc đường tham gia liên kết [2]. Carbon alpha (Cα) trong cấu trúc phenyl propane là nơi có khả năng tạo liên kết cao nhất với khối hemicellulose. Ngược lại, các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và acid 4-O-methylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin. Các liên kết có thể là ether, ester (liên kết với xylan qua acid 4-O-methyl-D-glucuronic), hay glycoside (phản ứng giữa nhóm khử của hemicellulose và nhóm OH phenolic của lignin) Cấu trúc hóa học của lignin rất dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp như điều kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nước. Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn 200oC, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose. Những nghiên cứu trước đây cho thấy đối với gỗ cứng, nhóm ether β-O-4 aryl bị phá hủy trong quá trình nổ hơi. Đồng thời, đối với gỗ mềm, quá trình nổ hơi làm bất hoạt các nhóm hoạt động của lignin ở vị trí α như nhóm hydroxyl hay ether, các nhóm này bị oxy hóa thành carbonyl hoặc tạo cation benzylic, cation này sẽ tiếp tục tạo liên kết C-C [29]. Trong dinh dưỡng động vật, lignin rất đáng quan tâm vì nó không bị tiêu hóa bởi enzyme của cơ thể vật chủ. Lignin còn liên kết với nhiều polysaccharide và protein màng tế bào ngăn trở quá trình tiêu hóa các hợp chất gỗ. Gỗ, cỏ khô và rơm rất giàu lignin nên tỷ lệ tiêu hóa thấp trừ khi được xử lý hóa học làm cho các liên kết giữa lignin với các carbohydrate khác bị bẻ gãy. 14
1.1.4. Hemicellulose Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng 70 đến 200 đơn phân. Hemicellulose chứa cả đường 6 carbon gồm glucose, mannose và galactose và đường 5 gồm xylose và arabinose. Thành phần cơ bản của hemicellulose là β – D xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β -(14). Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguyên liệu, tuy nhiên có một vài điểm chung gồm: - Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β -(14). - Xylose là thành phần quan trọng nhất. - Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3. - Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm đơn giản, thông thường là disaccharide hoặc trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với lignin là nhờ các mạch nhánh này. Cũng vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô định hình và vì thế dễ bị thủy phân. Hemicellulose là polysaccharide trong màng tế bào tan trong dung dịch kiềm và có liên kết chặt chẽ với cellulose, là một trong ba sinh khối tự nhiên chính. Cùng với cellulose và lignin, hemicellulose tạo nên thành tế bào vững chắc ở thực vật. Về cấu trúc, hemicellulose có thành phần chính là D-glucose, D-galactose, D-mannose, D- xylose và L-arabinose liên kết với các thành phần khác và nằm trong liên kết glycoside. Hemicellulose còn chứa cả axit 4-O-methylglucuronic, axit D-galacturonic và axit glucuronic. Trong đó, đường D-xylose, L-arabinose, D-glucose và D-galactose là phổ biến ở thực vật thân cỏ và ngũ cốc. Tuy nhiên, khác với hemicellulose thân gỗ, hemicellulose ở thực vật thân cỏ lại có lượng lớn các dạng liên kết và phân nhánh phụ thuộc vào các loài và từng loại mô trong cùng một loài cũng như phụ thuộc vào độ tuổi của mô đó. Tùy theo trong thành phần của hemicellulose có chứa monosaccharide nào mà nó sẽ có những tên tương ứng như manan, galactan, glucan và xylan. Các 15
polysaccharide như manan, galactan, glucan hay xylan đều là các chất phổ biến trong thực vật, chủ yếu ở các thành phần của màng tế bào của các cơ quan khác nhau như gỗ, rơm rạ, v.v… Trong các loại hemicellulose, xylan là một polymer chính của thành tế bào thực vật trong đó các gốc D-xylopyranose kết hợp với nhau qua liên kết β-1,4-D- xylopyranose, là nguồn năng lượng dồi dào thứ hai trên trái đất. Đa số phân tử xylan chứa nhiều nhóm ở trục chính và chuỗi bên [7]. Các gốc thay thế chủ yếu trên khung chính của xylan là các gốc acetyl, arabinosyl và glucuronosyl. Các nhóm này có đặc tính liên kết tương tác cộng hóa trị và không hóa trị với lignin, cellulose và các polymer khác [32]. Cấu tạo, số lượng và vị trí của xylan ở các loài thực vật khác nhau là khác nhau. Xylan tồn tại ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ cứng (Hình 1.7), hay arabino-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ mềm (Hình 1.8) [39], hay thành phần cấu tạo xylan là axit D-glucuronic, có hoặc không có ete 4-O-methyl và arabinose ở các loài ngũ cốc. Hình 1.7: O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ cứng 16
Hình 1.8: Arabino-4-O-methylglucuronoxylan ở cây gỗ mềm 1.2. Enzyme thủy phân lignocellulose Hầu hết những quy trình xử lý rác thải đều sử dụng một trong hai phương pháp hóa lý hoặc sinh học hoặc kết hợp. Phương pháp xử lý bằng enzyme là trung gian giữa hai phương pháp truyền thống, nó bao gồm các quy trình hóa học trên cơ sở hoạt động của các chất xúc tác có bản chất sinh học. Enzyme có thể hoạt động trên các chất ô nhiễm đặc biệt khó xử lý để loại chúng bằng cách kết tủa hoặc chuyển chúng thành dạng khác. Ngoài ra chúng có thể làm thay đổi các đặc tính của chất thải đưa chúng về dạng dễ xử lý hoặc chuyển thành các sản phẩm có giá trị hơn. Phương pháp xử lý bằng enzyme so với phương pháp xử lý thông thường có những ưu điểm vượt trội như: áp dụng được đối với các hợp chất sinh học khó xử lý; tác dụng ở cả vùng nồng độ chất ô nhiễm cao và thấp; một số enzyme riêng biệt có tác dụng trên phạm vi của pH, nhiệt độ, độ mặn…; không gây ra những biến động bất thường; không ảnh hưởng đến cân bằng sinh thái. 17
Dựa trên phương pháp enzyme học về quá trình phân hủy cellulose, hemicellulose và lignin ngày nay đã có một vài phương pháp sinh học thực hiện chu trình xử lý lignocellulose. Trong tương lai gần, các quy trình sử dụng enzyme thủy phân lignocellulose hoặc dựa vào vi sinh vật có thể mang lại cho chúng ta nhiều lợi ích lớn và thân thiện với môi trường. Mối quan hệ giữa cellulose và hemicellulose trong thành tế bào ở thực vật bậc cao chặt chẽ hơn chúng ta tưởng trước đó. Đó có thể là do các phân tử tại các liên kết cellulose-hemicellulose hoặc tại các vùng cellulose tinh thể đòi hỏi phải có các enzyme khác nhau để thủy phân hiệu quả hơn. Mỗi polymer bị thủy phân bởi một số vi sinh vật sản xuất các enzyme hoạt động hỗ trợ nhau. Nếu đúng như vậy, điều này có thể giúp chúng ta giải thích được tại sao vi sinh vật cellulolytic tổng hợp đặc trưng nhiều enzyme cellulase khác nhau có tính đặc hiệu gối nhau và tại sao một số enzyme xylanase lại mang vùng liên kết cơ chất gần với cellulose. Các vi sinh vật cellulolytic và xylanolytic không ở trong môi trường riêng biệt mà chúng tồn tại cùng với các loài khác như nấm và vi khuẩn. Các chủng này sẽ đóng vai trò như trung tâm thủy phân polymer để tạo ra đường và các sản phẩm thủy phân khác. 1.2.1. Enzyme cellulolytic Enzyme thủy phân cellulose có khả năng thủy phân chất thải chứa cellulose, chuyển hóa các hợp chất kiểu lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản phẩm, ethanol, khí sinh học hay các sản phẩm giàu năng lượng khác. Thí dụ như từ các chất thải nhà máy giấy như các sản phẩm từ bột giấy và giấy có thể thu nguồn năng lượng như ethanol [12]. Liên kết chủ yếu trong cấu trúc của cellulose là β-(14) glucoside. Nói chung, để phá hủy hoàn toàn cấu trúc của polysaccharide này cần có các enzyme cellulase với những tác động đặc trưng riêng biệt. Dựa theo nghiên cứu về hệ enzyme cellulase của nấm Trichoderma reesei [36], hệ enzyme thủy phân gồm 3 loại hoạt tính enzyme (Hình 1.9): 18
Endoglycanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) Enzyme nội bào endoglycanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase là enzyme thủy phân nội bào liên kết 1,4-β-D-glucosidic trong phân tử cellulose bởi tác dụng ngẫu nhiên trong chuỗi polymer hình thành các đầu chuỗi khử tự do và các chuỗi oligosaccharide ngắn. Các endoglucanase không thể thủy phân cellulose tinh thể hiệu quả nhưng nó sẽ phá vỡ các liên kết tại khu vực vô định hình tương đối dễ tiếp cận. Exoglucanase Enzyme ngoại bào exoglucanase gồm cả 1,4-beta-D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.74), giải phóng D-glucose từ β-glucan và cellodextrin và 1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) mà giải phóng D-cellobiose. Tỷ lệ thủy phân của enzyme cellobiohydrolase ngoại bào bị hạn chế bởi sự sẵn có các đầu chuỗi cellulose. β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase giải phóng phân tử D-glucose từ đường cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside khác. Hình 1.9: Tác dụng của từng enzyme trong cellulose 19
1.2.2. Enzyme xylanolytic Do tính không đồng nhất của xylan, sự thủy phân của nó đòi hỏi các ảnh hưởng của một hệ thống enzyme phức tạp. Enzyme này thường bao gồm hai loại: enzyme không phân nhánh (β-1,4-endoxylanse, β-xylosidase) và enzyme phân nhánh (α- arabinofuranosidase, α-glucuronidase, esterase xylan acetyl và esterase axit phenolic) (Hình 1.10). Tất cả các enzyme này tác động tương hỗ để chuyển đổi xylan thành cấu tử đường của nó. Hệ thống enzyme xylanolytic đa chức năng như vậy khá phổ biến ở những vi khuẩn và nấm. Các xylan khác loại chứa nhóm thể khác nhau trong mạch chuỗi chính và chuỗi bên. Như vậy, sự phân giải polysaccharide phức tạp như vậy có thể gồm hoạt động hỗ trợ giữa các thành phần khác nhau của hệ thống enzyme xylanolytic [7]. Hình 1.10: (A) Enzyme xylanolytic liên quan đến quá trình phân giải xylan. Ac: nhóm acetyl; α-Araf: α-arabinofuranose; α-4-O-Me-GlcA: α-4-O-methylglucuronic acid. (B) Thủy phân các xylooligosaccharide bởi enzyme β-xylosidase [10] 20