intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase reverse transcriptase (hTERT)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:73

Thêm vào BST
Báo xấu
28
lượt xem 5
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là thiết kế thành công vector tái tổ hợp biểu hiện trong tế bào động vật pcDNA3.1(+)/hTERT mang đoạn gen mã hóa cho epitope của kháng nguyên telomerase reverse transcriptase (hTERT). Hệ vector tái tổ hợp này đƣợc bao gói trong nano chitosan.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase reverse transcriptase (hTERT)

  1. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ………………… Hoàng Thị Ngà NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO PHỨC HỆ NANO CHITOSAN MANG GEN MÃ HÓA TELOMERASE REVERSE TRANSCRIPTASE (hTERT) LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội, 2013
  2. ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ………………… Hoàng Thị Ngà NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO PHỨC HỆ NANO CHITOSAN MANG GEN MÃ HÓA TELOMERASE REVERSE TRANSCRIPTASE (hTERT) Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÃ THỊ HUYỀN PGS. TS. NGUYỄN QUANG HUY Hà Nội, 2013
  3. LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tôi xin gửi lời cảm cám ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Lã Thị Huyền, PGS. TS. Nguyễn Quang Huy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Quang Huấn, Trƣởng phòng Phòng Công nghệ tế bào động vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hƣớng dẫn, và tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới NCS. Lê Thị Thùy Dƣơng, NCS. Lê Thị Hạnh, CN. Phạm Văn Phúc và các anh chị tại phòng Công nghệ tế bào động vật đã giúp đỡ rất nhiệt tình và tạo điều kiện tốt nhất trong quá trình học tập tại đây. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy giáo, cô giáo dạy Khoa Sinh học, Bộ môn Sinh lý thực vật và hóa sinh, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã dạy bảo và giúp đỡ trong thời gian học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, ngƣời thân và bạn bè luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày…..tháng…..năm 2013 Học viên Hoàng Thị Ngà
  4. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3 1.1. Giới thiệu về telomerase reverse transcriptase ...............................................3 1.1.1. Giới thiệu chung telomere ở người ............................................................3 1.1.2. Hoạt động telomerase ở người .................................................................5 1.1.3. Tình hình nghiên cứu hTERT .....................................................................7 1.1.4. Vacxin DNA và triển vọng tạo vacxin DNA với kháng nguyên hTERT .....9 1.2. Tổng quan về chitosan ....................................................................................11 1.2.1. Giới thiệu chung chitosan .......................................................................11 1.2.2. Ứng dụng của chitosan ...........................................................................13 1.2.3. Giới thiệu chung về nano chitosan ..........................................................14 1.2.4. Chitosan, chất mang dẫn truyền gen ......................................................16 1.2.5. Các phương pháp tạo nano chitosan .......................................................16 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................22 2.1. Vật liệu ...........................................................................................................22 2.1.1. Vật liệu và hóa chất .................................................................................22 2.1.2. Thiết bị .....................................................................................................22 2.1.3. Môi trường và dung dịch .........................................................................23 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................24 2.2.1. Phương pháp tích hợp đoạn gen hTERT vào vector pcDNA3.1(+) ........24 2.2.2. Phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn .................................................25 2.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose ....................................................26 2.2.4. Phương pháp thu đoạn DNA từ gel agarose ...........................................26 2.2.5. Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào E. coli ..................................27
  5. 2.2.6. Phương pháp lựa chọn E.coli mang plasmid pcDNA3.1 (+) đã tích hợp gen mã hóa hTERT ............................................................................................28 2.2.7. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn .................................28 2.2.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotide của DNA ..............................29 2.2.9. Phương pháp tạo hạt nano chitosan ........................................................29 2.2.10. Phương pháp tạo phức hệ nao chitosan/vector mang hTERT ...............31 2.2.11. Phương pháp chụp kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope – SEM) ...........................................................................................31 2.2.12. Phương pháp đo size, phân bố size và thế zeta .....................................32 2.2.13. Phương pháp xác định hiệu quả đóng gói .............................................36 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................37 3.1. Thiết kế vector pcDNA3.1(+) mang đoạn gen mã hóa cho epitope của telomerase reverse transcriptase (hTERT) .............................................................37 3.1.1. Tổng hợp đoạn gen hTERT ......................................................................37 3.1.2. Chuẩn bị vector pcDNA3.1 mở vòng với hai enzyme BamHI và XbaI ....37 3.1.3. Gắn đoạn gen hTERT vào vector pcDNA3.1(+) và chọn lọc vector pcDNA3.1(+) tái tổ hợp mang đoạn gen hTERT ...............................................39 3.1.4. Xác định trình tự đoạn gen hTERT trong plasmid tái tổ hợp ..................41 3.2. Kết quả tạo hạt nano chitosan .........................................................................42 3.2.1. Tạo chitosan phân tử lượng thấp từ chitosan phân tử lượng trung bình 42 3.2.2. Tạo hạt nano chitosan/TPP .....................................................................43 3.3. Kết quả tạo phức nano chitosan mang plasmid DNA mã hóa cho hTERT ....47 3.3.1. Tạo hạt nano chitosan mang vector tái tổ hợp pcDNA3.1/hTERT ..........47 3.3.2. Đánh giá khả năng mang DNA của hạt nano chitosan ...........................50 KẾT LUẬN ...............................................................................................................53 KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................54 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................55
  6. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt viết tắt APC Antigen presenting cell Tế bào trình diện kháng nguyên bp Base pair Cặp base Chi Chitosan Chitosan Cs Cộng sự CTL Cytotoxic T lymphocyte Tế bào lympho T gây độc DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic EDTA Ethyenediaminetetraacetic acid Axit ethyenediaminetetraacetic E.coli Escherichia coli Vi khuẩn Escherichia coli hTR Human temlate for replication hTERT Human telomerase reverse transcriptase TCR T-cell receptor Thụ thể tế bào T MHC Major histocompatibility Phức hệ phù hợp tổ chức chính complex HLA Human leucocyte antigen Kháng nguyên bạch cầu ngƣời SEM Scanning Electron Microscopy Kính hiển vi điện tử quét PDI polydispersity index Chỉ số phân tán TPP Tripolyphosphate kb Kilo base LB Luria Bertani Môi trƣờng LB RNase Ribonuclease Enzyme phân hủy RNA v/ph Vòng/phút
  7. DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Chiều dài telomere ở hai đầu mỗi nhiễm sắc thể là khác nhau. .................4 Hình 1.2. Phức hợp protein trong cấu trúc T-loop của telomere. ...............................5 Hình 1.3. Tổ chức gen của hTERT .............................................................................6 Hình 1.4. Cơ chế vacxin DNA ..................................................................................10 Hình 1.5. Cấu trúc của chitin và chitosan. ................................................................12 Hình 1.6. Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp khâu mạch nhũ tƣơng ...........................17 Hình 1.7. Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp giọt tụ ...................................................18 Hình 1.8. Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp hợp nhất giọt nhũ tƣơng .......................19 Hình 1.9. Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp mixen đảo .............................................20 Hình 1.10. Sơ đồ tạo hạt bằng phƣơng pháp tạo gel ion ...........................................21 Hình 2.1. Kính hiển vi điện tử quét S-4800 (FE-SEM, Hitachi). .............................32 Hình 2.2. Bề mặt của hạt nano mang điện tích và thế năng zeta ..............................34 Hình 2.3. Sự biến thiên của thế zeta theo giá trị pH của môi trƣờng ........................35 Hình 3.1. Sơ đồ đoạn gen hTERT .............................................................................37 Hình 3.2. Sơ đồ vector pcDNA3.1(+) .......................................................................38 Hình 3.3. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α .........................................................................................................................40 Hình 3.4. Điện đi đồ sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI ............41 Hình 3.5. Trình tự nucleotide và trình tự acid amin suy diễn tƣơng ứng của đoạn gen mã hóa hTERT ...................................................................................................42 Hình 3.6. Cơ chế tƣơng tác giữa chitosan và TPP ....................................................44 Hình 3.7. Kích thƣớc hạt nano chitosan/TPP ............................................................45 Hình 3.8. Thế zeta của hạt nano chitosan/TPP .........................................................46 Hình 3.9. Kích thƣớc hạt nano chitosan-plasmid DNA ............................................47 Hình 3.10. Thế zeta của hạt nano chitosan/plasmid DNA ........................................48 Hình 3.11. Ảnh SEM nano chitosan –plasmid DNA ................................................49 Hình 3.12. Điện di đồ sản phẩm nano chitosan/plasmid DNA .................................50 Hình 3.13. Điện di đồ sản phẩm nano chitosan/plasmid DNA cắt bằng DNaseI .....51
  8. DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. hTERT- epitope gây độc tế bào lympho T [8], [83], [85] ..........................8 Bảng 2.1. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ......................................................22 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng tích hợp gen mã hóa hTERT vào vector pcDNA3.1(+) ............................................................................................................24 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt pcDNA3.1(+) bằng enzyme BamHI và XbaI .25 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng cắt pcDNA3.1(+)/hTERT bằng EcoRI .................25 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng cắt plamid DNA bằng enzyme DNase I ...............25 Bảng 2.6. Sự phụ thuộc độ ổn định của hệ keo vào giá trị thế Zeta .........................34
  9. Luận văn thạc sỹ khoa học MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Ung thƣ là một căn bệnh hiểm nghèo, bệnh nhân mắc bệnh có tỷ lệ tử vong cao và hiện nay số ngƣời mắc bệnh ngày càng tăng. Mặc dù cộng đồng y sinh đã rất nỗ lực nhƣng ung thƣ vẫn là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến cái chết, đau khổ và bệnh tật. Hầu hết các bệnh nhân ung thƣ đƣợc điều trị bởi các liệu pháp: phẫu thuật, xạ trị hoặc hóa trị. Các phƣơng pháp này cũng chỉ ngăn chặn tạm thời không tiêu diệt đƣợc tận gốc khối u nguyên phát. Bên cạnh đó, các phƣơng pháp này không đặc hiệu thƣờng gây ra tác dụng phụ gây suy nhƣợc, đau đớn cho cơ thể ngƣời bệnh, phá hủy các mô khỏe mạnh. Với hy vọng khắc phục những trở ngại trên, nhiều nhà khoa học đang tập trung phát triển liệu pháp miễn dịch để chống lại căn bệnh ung thƣ. Một trong các liệu pháp chính là sử dụng vaccine ung thƣ, vaccine ung thƣ cung cấp các lợi thế khác biệt so với phƣơng pháp tiếp cận thông thƣờng: đặc hiệu, giảm thiểu độc tính, loại bỏ đƣợc tính kháng thuốc, và tiềm năng bền trong điều trị thông qua bộ nhớ miễn dịch,... Với sự phát triển của công nghệ nano, vaccine dạng nano đang đƣợc nghiên cứu. Các vaccine dạng này thƣờng cho tính kích thích sinh miễn dịch, bảo hộ cao. Telomerase là một enzyme ribonucleoprotein cần thiết cho sự sao chép telomere của đầu cuối nhiễm sắc thể trong hầu hết các sinh vật nhân chuẩn. Telomerase ở ngƣời là một phức hệ ribonucleoprotein gồm hTR và hTERT. hTR (hoặc hTERC) (human template for replication) là RNA làm khuôn để sao chép, và hTERT (human telomerase reverse transcriptase) là enzyme phiên mã ngƣợc. Chúng hoạt động trong các tế bào mầm và tế bào ung thƣ, không hoạt động hoặc hoạt động rất thấp trong các tế bào soma. Vì vậy, việc tạo vacxin DNA mang gen mã hóa kháng nguyên hTERT sẽ mang lại nhiều triển vọng ứng dụng trong điều trị ung thƣ. Hiện nay trên thế giới có nhiều nghiên cứu về các epitope của hTERT và nhận thấy rằng chúng có đáp ứng miễn dịch rất tốt với hầu hết các tế bào ung thƣ. Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 1
  10. Luận văn thạc sỹ khoa học Việc tạo vacxin DNA mang gen mã hóa kháng nguyên hTERT trong điều trị ung thƣ là hƣớng nghiên cứu triển vọng, nhƣng để tăng cƣờng quá trình chuyển DNA và tăng hiệu quả của vacxin cần có một chất mang. Cùng với phát triển của công nghệ nano các chất mang có bản chất polymer có khả năng liên kết và bảo vệ DNA đã đƣợc chọn làm chất truyền trung gian. Một trong các polymer đặc biệt đƣợc quan tâm là chitosan, công nghệ nano chitosan hiện nay đã đƣợc sử dụng trong lĩnh vực y học nhƣ để phân phối thuốc và đang đƣợc ứng dụng trong nhiều nghiên cứu làm vật liệu dẫn truyền vacxin DNA. Chitosan là sản phẩm biến tính của chitin, là một loại polymer không độc, có khả năng phân hủy sinh học và tan tốt trong môi trƣờng axit. Vì chitosan tích điện dƣơng nên có thể tạo phức hợp với DNA tích điện âm, do vậy nó hứa hẹn là ứng cử viên tốt cho hệ thống mang gen. Ngoài khả năng chitosan liên kết hiệu quả với DNA chúng còn có thể bảo vệ DNA khỏi phân hủy của nuclease. Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu chế tạo phức hệ nano chitosan mang gen mã hóa telomerase reverse transcriptase (hTERT)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế thành công vector tái tổ hợp biểu hiện trong tế bào động vật pcDNA3.1(+)/hTERT mang đoạn gen mã hóa cho epitope của kháng nguyên telomerase reverse transcriptase (hTERT). Hệ vector tái tổ hợp này đƣợc bao gói trong nano chitosan. 3. Nội dung nghiên cứu - Thiết kế vector tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT mang đoạn gen mã hóa cho epitope của kháng nguyên hTERT. - Tạo hạt nano chitosan/TPP có kích thƣớc mong muốn. - Tạo phức hệ nano chitosan-plasmid tái tổ hợp pcDNA3.1(+)/hTERT. Đánh giá khả năng mang plasmid DNA của hạt nano chitosan/TPP. Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 2
  11. Luận văn thạc sỹ khoa học CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về telomerase reverse transcriptase 1.1.1. Giới thiệu chung telomere ở người Nhiễm sắc thể điển hình có chứa một cấu trúc đặc biệt ở hai đầu, đƣợc gọi là telomere. Telomere là cấu trúc bao gồm một chuỗi lặp đi lặp lại TTAGGG [33], [48]. Ở ngƣời các chuỗi lặp lại của telomere có từ 5000 đến 15000 base. Telomere có nhiệm vụ đảm bảo sự bền vững của nhiễm sắc thể, chống lại thoái hóa có hại, chống lại sự tái tổ hợp sai lạc. Trình tự này sẽ mất dần đi sau mỗi lần phân chia, khi các telomere trở nên quá ngắn thì các nhiễm sắc thể sẽ kém bền vững, chúng không thể bám đƣợc vào màng nhân tế bào, bị dính vào nhau và có hình dạng kì dị và là các dấu hiệu dẫn đến sự thoái hóa của tế bào. Ở ngƣời, sự rút ngắn telomere của nguyên bào sợi từ 50-100 cặp base với mỗi lần tế bào phân chia, và nguyên bào sợi lão hóa sau 50-70 lần phân chia. Vì vậy, có giả thiết rằng telomere rút ngắn đến một chiều dài nhất định sẽ dẫn đến tế bào già và chết [37]. Rút ngắn chiều dài telomere thƣờng dẫn đến sự mất ổn định hệ gen, dẫn đến mất kiểm soát chu kì tế bào, một dấu hiệu của ung thƣ. Sự rút ngắn telomere đƣợc nghiên cứu là có liên quan tới việc tăng nguy cơ một số bệnh ung thƣ của con ngƣời, bao gồm: bàng quang, phổi, thực quản, tụy, buồng trứng và tuyến giáp [14], [17], [42], [60], [73]. Các tế bào chống lại sự rút ngắn này bằng cách sử dụng một enzyme phiên mã ngƣợc gọi là telomerase. Ở các loài, các tế bào khác nhau thì chiều dài telomere là khác nhau, chiều dài này phụ thuộc vào loại mô, độ tuổi và lịch sử nhân lên của tế bào. Chiều dài telomere hai đầu nhiễm sắc thể thay đổi rõ rệt giữa các nhiễm sắc thể khác nhau (Hình 1.1). Ví dụ NST 17p thƣờng có telomere ngắn hơn so với hầu hết các telomere nhiễm sắc thể khác [58]. Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 3
  12. Luận văn thạc sỹ khoa học Hình 1.1. Chiều dài telomere ở hai đầu mỗi nhiễm sắc thể là khác nhau Telomere được hiển thị màu vàng, DNA của nhiễm sắc thể hiện màu xanh [53]. Khi tế bào ở trạng thái không phân chia, tức là từ pha G2 trở đi, thì telomere sẽ liên kết với một số loại protein gắn chuyên biệt lên các trình tự nằm ở ngay gần vùng telomere nhằm tạo nên một cấu trúc phức tạp và vững chắc, đƣợc gọi là T- loop. Cấu trúc T-loop này đóng vai trò quan trọng bảo vệ đầu mút DNA nhiễm sắc thể khỏi tác động của các enzyme hay các đáp ứng không thích hợp gây nguy hại đến DNA, cũng nhƣ hiện tƣợng dung hợp các đầu mút nhiễm sắc thể hay hiện tƣợng tái tổ hợp tƣơng đồng giữa các vùng temomere [26]. - Các protein quan trọng liên quan đến duy trì sự ổn định telomere và điều chỉnh chiều dài telomere. Cấu trúc T-loop của telomere liên quan tới các loại protein bám trên mạch: + POT1 (protection of Telomeres-1) khi hình thành cấu trúc T-loop, một đoạn DNA phía dƣới vòng cung do DNA uốn lại, sẽ tách ra làm 2 mạch đơn, protein POT1 bám vào mạch 3’, làm nhiệm vụ bảo vệ mạch và ngăn không cho 2 mạch bắt cặp lại với nhau [56]. + Các phức hợp TRF1 và TRF2 cùng với các protein tƣơng tác với chúng Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 4
  13. Luận văn thạc sỹ khoa học Hình 1.2. Phức hợp protein trong cấu trúc T-loop của telomere [26]. + Phức hợp protein TRF1 gồm TRF1, Tankyrase ½, PINX1, Tin2, và POT1, có vai trò trong việc kiểm soát sự tăng chiều dài telomere thông qua việc tiếp nhận telomerase lên telomere. Ngoài ra, còn có các enzyme khác nhƣ Ku70/80, DNA- PK, Bloom helicase [56], [78], [89]. + Phức hợp protein TRF2 gồm TRF2, phức hợp (MRE11, RAD50, NBS1), WRN, ERCC1/XPF, kết hợp với POT1 ngăn chặn sự bắt cặp giữa các đoạn cuối NST với nhau. Ngoài ra, TRF2 còn tƣơng tác với yếu tố phát tín hiệu sửa chữa NST để bảo vệ telomere khỏi các enzyme sửa chữa [27]. 1.1.2. Hoạt động telomerase ở người Telomerase là ribonucleoprotein cần thiết cho sự sao chép telomere đầu cuối của nhiễm sắc thể. Chúng hoạt động rất ít ở trong tế bào thƣờng, nhƣng hoạt động phổ biến trong các dòng tế bào ung thƣ ngƣời và tìm thấy khoảng 85% các khối u [47], [70]. Hoạt động của telomerase chống telomere rút ngắn trong quá trình sao chép bằng cách tổng hợp DNA lặp lại telomeric mới ở đầu cuối nhiễm sắc thể. Telomerase ở ngƣời là một phức hệ gồm hTR, hTERT. hTR (hoặc hTERC) (human template for replication) là RNA làm khuôn để sao chép, và hTERT (human telomerase reverse transcriptase) là enzyme phiên mã ngƣợc, giúp thêm telomeric Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 5
  14. Luận văn thạc sỹ khoa học lặp đi lặp lại đầu tận cùng nhiễm sắc thể [11], [87]. Cả hai hTR và hTERT đều biểu hiện rất thấp ở tế bào thƣờng. Protein hTERT bao gồm 1132 axit amin đƣợc mã hóa bởi gen hTERT nằm trên NST 5p15.33 [38], [59], [63]. Tổ chức gen hTERT có tổ chức nhƣ sau: Hình 1.3. Tổ chức gen của hTERT [23] Gen hTERT ở ngƣời gồm 16 exon và 15 intron kéo dài hơn 40 kb [23], nằm trên cánh ngắn của nhiễm sắc thể số 5 (5p15.33), khoảng 2 Mb từ telomere và đƣợc sao chép đến tâm động, miền sao đặc biệt của telomerase (T domain), miền reverse transcriptase (RT domain). Thành phần RNA của telomerase ngƣời có chừng 451 nucleotide (bao gồm cả telomere CAAUCCCAAUC mẫu), mã hóa bởi gen hTR nằm trên NST 3q21-q28 [30]. Trong đó các nucleotide 46-56 là vị trí gắn vào đầu cùng 3’-OH của telomere. Dựa trên quan sát thực nghiệm trong các ống nghiệm nuôi cấy tế bào và động vật, các chất ức chế telomerase có thể ngăn chặn sự phát triển của ung thƣ và di căn [34], [40], [43]. Nghiên cứu gần đây cho thấy rằng telomere là điều cần thiết cho sự tăng trƣởng bền vững của các tế bào bất tử và hoạt tính này xảy ra ở hầu hết các khối u ác tính [46], [77]. Gen hTERT hoạt động trong các tế bào mầm và tế bào ung thƣ, Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 6
  15. Luận văn thạc sỹ khoa học không hoạt động hoặc hoạt động rất thấp trong các tế bào soma [59], [63], [64], [79]. Khối u liên quan đến telomerase reverse transcriptase (hTERT) đƣợc biểu hiện trên 85% khối u ở ngƣời [70]. Vì vậy kháng nguyên này có thể là một công cụ quan trọng để loại bỏ những tế bào mà không dễ dàng bị giết bởi điều trị thông thƣờng. Việc ức chế hoạt động của telomerase trong các khối u dƣơng tính dẫn đến telomere rút ngắn và tế bào chết bởi quá trình apoptosis [82]. 1.1.3. Tình hình nghiên cứu hTERT Ngay sau khi phát hiện nhiễm sắc thể của ngƣời có telomere ở 2 đầu, bao gồm trình tự lặp đi lặp lại chuỗi TTAGGG [33], [48] Morin đã xác định đƣợc hoạt động telomerase trong các tế bào của con ngƣời. Telomerase chỉ hoạt động trong các tế bào mầm và tế bào ung thƣ, không hoạt động ở tế bào soma [59], [63], [64], [79]. Tuy số lƣợng tƣơng đối nhỏ các tế bào ung thƣ đƣợc xác định là không thể hiện hoạt động của telomerase nhƣng vẫn duy trì chiều dài telomere [20]. Mặc dù tế bào ung thƣ cũng sinh ra cùng một mô nhƣng không giống nhƣ các tế bào bình thƣờng, các tế bào ung thƣ có thể phân chia vô hạn đến một khối lƣợng đủ lớn gây nguy hiểm đến bệnh nhân. Nghiên cứu nhiều năm qua cho thấy enzyme phiên mã ngƣợc ở ngƣời - hTERT có khả năng kích thích miễn dịch trong cả ống nghiệm và trong cơ thể. Do vậy, hTERT có thể là mục tiêu đích điều trị ung thƣ bằng miễn dịch [82]. Không phải toàn bộ phân tử kháng nguyên nhận diện và liên kết với kháng thể hoặc TCR (T-cell receptor) mà chỉ có 1 phần nhất định của kháng nguyên gọi là quyết định kháng nguyên hay còn gọi là epitope. Nghiên cứu trong nhiều năm qua đã chứng minh các peptide có nguồn gốc từ hTERT đƣợc xử lý tự nhiên của các khối u và trình diện trên phân tử MHC (major histocompatibility complex) và có thể kích thích chức năng phản ứng của CTL (cytotoxic T lymphocyte). Peptide miễn dịch đầu tiên đƣợc mô tả từ hTERT là I540 (ILAKFLHWL) đƣợc giới hạn trong MHC lớp I alen HLA-A2. Chứng minh độc lập giữa các nhóm cũng thấy rằng TCR (Tế bào lympho T gây độc) đáp ứng miễn dịch với peptide I540 trong ống nghiệm có tác dụng diệt một loạt các dòng tế bào khối u hTERT+ [31], [85]. Trong giai Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 7
  16. Luận văn thạc sỹ khoa học đoạn gần đây, thử nghiệm đáp ứng miễn dịch hTERT đã đƣợc thực hiện ở một số bệnh nhân ung thƣ vú hoặc ung thƣ tuyến tiền liệt, và thấy rằng phản ứng miễn dịch và bằng chứng lâm sàng của các hoạt động chống khối u đƣợc quan sát thấy không có độc tính [84]. Trong một thử nghiệm khác, với những bệnh nhân ung thƣ vú di căn đã đƣợc tiêm vacxin dƣới lớp da với peptide I540 hTERT đƣợc nhũ hóa trong tá dƣợc và đã phân tích cho thấy 68% bệnh nhân đã có phản ứng miễn dịch [88]. Ngoài epitope I540 còn có các epitope- hTERT gây độc tế bào lympho T: Bảng 1.1. hTERT- epitope gây độc tế bào lympho T [8], [83], [85] Epitope Trình tự Phân tử hạn chế I540 ILAKFLHWL HLA-A2 R572 RLFFYRKSV HLA-A2 D988 DLQVNSLQTV HLA-A2 K973 KLFGVLRLK HLA-A3 V324 VYAETKHFL HLA-A24 Trong nghiên cứu này chúng tôi thực hiện tạo vector tái tổ hợp mang gen mã hóa peptide của epitope GV1001 (611-626) tƣơng ứng trình tự axitamin EARPALLTSRLRFIPK của protein hTERT. Peptide GV1001 liên kết chặt chẽ đồng thời với cả phân tử HLA lớp II và phân tử HLA lớp I trƣớc khi gắn vào các APC, vacxin GV1001 gây đáp ứng đồng thời cả tế bào T hỗ trợ CD4 + và tế bào T gây độc CD8+. Nhƣ vậy epitope GV1001 gây đáp ứng tự nhiên và đáp ứng đặc hiệu [51]. Vì vậy, kháng nguyên GV1001 có thể gây kích thích kháng thể hiệu quả đối với các tế bào ung thƣ. Trên thế giới GV1001 đã đƣợc thử nghiệm ở giai đoạn I/II các bệnh nhân ung thƣ tuyến tụy, ung thƣ phổi và khối u ác tính đã đƣợc chứng minh rằng chủng ngừa là an toàn và gây ra phản ứng miễn dịch ở 50-80% bệnh nhân đƣợc tiêm phòng. Và GV1001 đang đƣợc nghiên cứu thử nghiệm giai đoạn III với ung thƣ tuyến tụy [10], [15]. Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 8
  17. Luận văn thạc sỹ khoa học 1.1.4. Vacxin DNA và triển vọng tạo vacxin DNA với kháng nguyên hTERT Theo Hội Ung thƣ Việt Nam, bệnh nhân ung thƣ các loại đang gia tăng nhanh chóng trong nhƣng năm gần đây. Mỗi năm có thêm 150.000 ngƣời mắc bệnh ung thƣ. Do đó, ung thƣ là một trong nhƣng căn bệnh nan y gây nên tỷ lệ tử vong cao nhất ở nƣớc ta nói riêng và trên thế giới nói chung. Vấn đề đặt ra là làm sao tìm kiếm một loại vacxin phòng chống ung thƣ một cách hiệu quả. Một con đƣờng mới đã mở ra đó là cách phòng bệnh ung thƣ bằng vật liệu di truyền hay vacxin DNA đƣợc phát triển từ sự bùng nổ về công nghệ sinh học khi kỹ thuật DNA tái tổ hợp đƣợc đƣa vào năm 1970. Vacxin DNA triển vọng sẽ ngăn chặn đƣợc căn bệnh thế kỉ nhƣ: HIV, ung thƣ…, và những căn bệnh lây nhiễm quy mô toàn cầu. Hiện nay, vacxin có thể chia thành 5 loại: vacxin bất hoạt, vacxin sống giảm độc, vacxin tiểu đơn vị (tiểu đơn vị, polysaccharides và tiếp hợp protein), toxoid (biến độc tố) và vacxin DNA [6]. Trong đó vaccin DNA có rất nhiều ƣu điểm so với các vacxin truyền thống về an toàn, dễ sản xuất và ổn định,... Thử nghiệm lâm sàng cũng cho thấy vacxin DNA gây ít tác dụng phụ nhƣ mẩn đỏ, sƣng tấy, sốt và đau đầu [19]. Hơn nữa, nó cũng đƣợc nghiên cứu là không gây tích hợp vào hệ gen [50]. Vacxin DNA bao gồm một DNA plasmid có chứa gen mã hóa trình tự của một protein mục tiêu từ một tác nhân gây bệnh dƣới sự kiểm soát của một promoter nhân điển hình, cho phép biểu hiện protein trong các tế bào động vật có vú [25]. Bƣớc đầu tiên tạo vacxin DNA phải chọn vector plasmid phù hợp, yêu cầu cơ bản là vector DNA plasmid có một promoter nhân chuẩn, một điểm khời đầu sao chép, một chuỗi polyadenylate, một dấu chuẩn chọn lọc [35]. Mặc dù cơ chế miễn dịch của vacxin DNA trong tế bào vẫn chƣa rõ ràng, sự gia tăng chậm các phản ứng miễn dịch sau đƣa DNA vào cho thấy nó theo một hành trình phức tạp. Một plasmid chứa gen biểu hiện protein quan tâm dƣới sự kiểm soát của promoter thích hợp đƣợc tiêm trực tiếp vào cơ thể qua da hoặc bắp cơ. Sau khi plasmid đƣợc hấp thụ, protein nội sinh sẽ đƣợc sản sinh và một quá trình nội bào sẽ biến nó thành một peptid kháng nguyên. Ngoài ra, protein kháng nguyên có thể đƣợc tiết ra trong và xung quanh các mô bằng cách protein tiết hoạt tính hoặc giải Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 9
  18. Luận văn thạc sỹ khoa học phóng sau quá trình apotosis của tế bào chuyển. Các peptid này sau đó đƣợc đƣa tới lƣới nội chất. Trong lƣới nội chất nó đƣợc gắn với phân tử MHC-I (hệ thống trình diện kháng nguyên). MHC-I sẽ trình diện peptid kháng nguyên trên bề mặt tế bào. Tiếp theo CD8+ - tế bào T kết hợp với phức hệ phù hợp tạo thành CTR (tế bào lympho T gây độc) chúng đƣợc gọi là tế bào miễn dịch trung gian. CTR kích thích sản xuất Cytokin hoạt hóa tế bào B sản sinh kháng thể. Protein ngoại bào đƣợc trình diện bởi MHC-II thông qua APC (tế bào trình diện kháng nguyên) đƣợc CD4+- tế bào T nhận biết dẫn đến kích hoạt tế bào B sản sinh kháng thể [50], [71]. Hình 1.4. Cơ chế vacxin DNA [41] Sự biểu hiện của hTERT trong tế bào ung thƣ có liên quan sự tăng trƣởng, phát triển khối u và sự biểu hiện của hTERT góp phần quan trọng đến sự biến đổi ung thƣ bằng cách cho phép nhân tế bào lên không giới hạn. Ức chế hoạt động của telomerase trong các tế bào khối u – hTERT hoạt động dẫn đến telomere rút ngắn và tế bào chết bởi quá trình apotosis [36], [39]. Vì vậy, việc tạo vacxin DNA mang gen mã hóa kháng nguyên hTERT trong điều trị ung thƣ là hƣớng nghiên cứu triển vọng. Tuy nhiên, một trong nhƣng mối đe dọa của vacxin DNA là nguy cơ hội nhập trình tự một phần hoặc toàn phần plasmid vào hệ gen của vật chủ. Điều đó sẽ dẫn đến đột biết gen, gây bất hoạt gen ức chế khối u hoặc kích thích gen gây ung thƣ Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 10
  19. Luận văn thạc sỹ khoa học hoặc gây mất ổn định nhiễm sắc thể. Tuy nhiên mối lo ngại trên thực nghiệm thấy rằng tỷ lệ thâm nhập plasmid không đáng kể và thấp hơn so với tỷ lệ tự phát các đột biến trong bộ gen động vật có vú [29]. Mối quan tâm nhất đối với vacxin DNA là làm thế nào tăng khả năng hội nhập và duy trì plasmid DNA trƣớc khi biểu hiện trong tế bào. Một vấn đề cần quan tâm nữa là tính lạ của DNA, có thể kích thích sản xuất kháng thể chống lại DNA. Vì vậy, để tăng cƣờng quá trình chuyển DNA và tăng hiệu quả của vacxin, cần phải chọn chất truyền trung gian tạo phức với DNA. Chitosan là polymer có khả năng gắn kết với DNA và đƣợc báo cáo rằng có khả năng bảo vệ DNA khỏi sự thủy phân của DNase. Do vậy, chitosan là chất dẫn truyền gen hiệu quả. Ngoài ra chitosan không độc, có khả năng phân hủy sinh học nên không gây dị ứng và không gây phản ứng phụ [13], [18], [72], [81]. 1.2. Tổng quan về chitosan 1.2.1. Giới thiệu chung chitosan Chitosan là một polysacarit mạnh thẳng, là dẫn xuất deaxetyl hóa của chitin, trong đó nhóm (-NH2) thay thế nhóm (-COCH3) ở vị trí C (2). Chitosan đƣợc cấu tạo từ các mắt xích D-glucozamin liên kết với nhau bởi các liên kết β(1-4) 2-amino- 2-deoxy-β-D-glucoranose. Chitin là một chuỗi polymer dài bao gồm liên kết β(1-4) 2-acedamodo-2- deoxy- β-D-glucose (N-acetylglucosamine), một dẫn xuất của glucose [74]. Đây là polysaccharide có nhiều trong tự nhiên sau xenllulo và nó là thành phần chính của thành tế bào của nấm, các khung xƣơng của động vật chân đốt nhƣ động vật giáp xác và côn trùng [62]. Hoàng Thị Ngà – Trƣờng ĐH Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN 11
  20. Luận văn thạc sỹ khoa học Hình 1.5. Cấu trúc của chitin và chitosan [46]. Chitin và chitosan có giá trị kinh tế rất lớn vì chúng có các đặc tính sinh học nhƣ: không độc, có khả năng phân hủy sinh học nên không gây dị ứng và không gây phản ứng phụ, không gây tác hại đến môi trƣờng [13], [18], [72], [81]. Ngoài ra chúng còn có đặc tính kháng khuẩn, kháng vius nên chitin và chitosan đƣợc ứng dụng rộng rãi trong y học và dƣợc học [44]. Ở pH
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.01: Bộ Luận Văn Thạc Sĩ Quản Trị Kinh Doanh MBA
165 tài liệu
2055 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
4=>1