Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tinh sạch và đánh giá tính chất của xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:70

Thêm vào BST

Báo xấu

21
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của đề tài là tinh sạch được enzyme xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp; đánh giá các tính chất lý hóa của xylanase tái tổ hợp; thử nghiệm khả năng thủy phân của enzyme xylanase tái tổ hợp và enzyme xylanase tự nhiên.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu tinh sạch và đánh giá tính chất của xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN THỊ KIM THU NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA XYLANASE TỪ CHỦNG Aspergillus niger TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2020
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- NGUYỄN THỊ KIM THU NGHIÊN CỨU TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT CỦA XYLANASE TỪ CHỦNG Aspergillus niger TÁI TỔ HỢP Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Đỗ Thị Tuyên PGS.TS Nguyễn Quang Huy Hà Nội – Năm 2020
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin trân thành cảm ơn TS. Đỗ Thị Tuyên, Trưởng phòng CNSH Enzyme, Viện Công nghệ sinh học đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, lên kế hoạch, tận tình theo sát hướng dẫn thí nghiệm, thường xuyên chỉ dạy kiến thưc chuyên môn và tạo điều kiện tốt nhất để em có thể học tập và thực hiện luận văn tại phòng Công nghệ sinh học Enzym – Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Quang Huy. Người thầy, không những chỉ bảo tận tình cho em về mặt kiến thức, mà thầy còn cho em những lời khuyên bổ ích và định hướng giúp đỡ cho em trong suốt quá trình làm luận văn. Em xin chân thành cảm ơn các anh chị phòng Công nghệ sinh học enzyme – Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi và tận tình hướng dẫn em trong quá trình học tập, nghiên cứu. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn bên cạnh, động viên và tiếp thêm niềm tin, động lực cho em để em vững bước và hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 3 tháng 12 năm 2019 Học viên Nguyễn Thị Kim Thu
MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3 1.1. Sơ lược về enzyme xylanase……………………………………………………………………3 1.1.1. Định nghĩa .............................................................................................. 3 1.1.2. Phân loại ................................................................................................. 4 1.1.3. Cấu trúc .................................................................................................. 4 1.1.4. Đặc điểm cơ chất, cơ chế xúc tác ........................................................... 6 1.2. Ứng dụng của enzyme xylanase ........................................................................ 10 1.2.1. Các chế phẩm xylanase trên thị trường quốc tế .................................. 10 1.2.2. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc ....................................... 11 1.2.3. Trong công nghiệp thực phẩm ............................................................. 11 1.2.4. Trong công nghiệp giấy và bột giấy .................................................... 12 1.2.5. Các ứng dụng khác .............................................................................. 13 1.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất xylanase.................................................... 13 1.3.1. Trên thế giới ........................................................................................ 13 1.3.2. Tại Việt Nam ....................................................................................... 18 CHƢƠNG II. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................ 20 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị............................................................................. 20 2.1.1. Chủng giống ........................................................................................ 20 2.1.2. Hóa chất ............................................................................................... 20 2.1.3. Môi trường ........................................................................................... 22 2.1.4. Thiết bị thí nghiệm .............................................................................. 23 2.2. Phương pháp ................................................................................................... 24 2.2.1. Nuôi cấy sinh tổng hợp enzym xylanase ............................................. 24 2.2.2. Xác định hoạt tính enzym xylanase ..................................................... 24 2.2.3. Xác định hàm lượng protein ................................................................ 26 2.2.4. Tinh sạch xylanase .............................................................................. 27 2.2.5. Điện di SDS-PAGE ............................................................................. 30
2.2.6. Xác định tính chất lý hóa của xylanase ............................................... 31 2.2.7. Xử lý số liệu ........................................................................................ 34 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................... 36 3.1. Nuôi biểu hiện và tinh sạch enzyme xylanase từ chủng tái tổ hợp sinh tổng hợp xylanase .......................................................................................................... 36 3.2. Đánh giá tính chất lý hóa của enzyme xylanase tái tổ hợp ........................... 39 3.2.1. Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt độ ...................................................... 39 3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền pH .................................. 40 3.2.3. Dung môi hữu cơ ................................................................................. 41 3.2.4. Chất tẩy rửa ......................................................................................... 42 3.2.5. Ion kim loại .......................................................................................... 43 3.3. Khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme tự nhiên và tái tổ hợp ......... 43 3.3.1. Tinh sạch enzyme tự nhiên .................................................................. 44 3.3.2. Khả năng thủy phân arabinoxylan của enzyme tự nhiên và tái tổ hợp 45 3.3.3. Khả năng phân giải cơ chất của xylanase tự nhiên và tái tổ hợp ........ 46 KẾT LUẬN .............................................................................................................. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 52 CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ .............................................................................. 61
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các vi sinh vật sinh tổng hợp xylanase ..................................................14 Bảng 1.2: Đặc tính của một số xylanase từ vi sinh vật ...........................................15 Bảng 2.1: Các hóa chất sử dụng ...............................................................................20 Bảng 2.2: Thành phần các loại đệm và dung dịch ...................................................21 Bảng 2.3: Các thiết bị sử dụng .................................................................................23 Bảng 2.4: Thành phần gel cô và gel tách .................................................................31 Bảng 3.1: Bảng tóm tắt quá trình tinh sạch của enzyme xylanase tái tổ hợp từ chủng A. niger VTCC017/ pANXlG2 .................................................................39 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của các chất tẩy rửa lên hoạt tính xylanase tái tổ hợp ..........42 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt tính của xylanase .........................43 Bảng 3.4: Tóm tắt quá trình tinh sạch xylanase từ chủng gốc A. oryzae VTCC-F-187 ...45
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Vị trí xúc tác của xylanase và các enzym khác trong quá trình thủy phân xylan .............................................................................................................3 Hình 1.2: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 10 từ Bacillus haloduran ..........5 Hình 1.3: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11 .......................................6 Hình 1.4: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ cứng ..............................................................7 Hình 1.5: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ mềm ..............................................................7 Hình 1.6: Vị trí tấn công của các enzyme vào xylan của cỏ ......................................8 Hình 1.7: Mô hình hoạt động của xylanase .............................................................10 Hình 2.1: Đường chuẩn xylose ................................................................................26 Hình 2.2: Đường chuẩn protein sử dụng BSA làm chất chuẩn ................................27 Hình 2.3: Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ chủng A. niger tái tổ hợp ....28 Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tinh sạch xylanase tái tổ hợp từ chủng A. oryzae tự nhiên ....28 Hình 3.1: Điện di đồ protein tổng số của các mẫu protein và hoạt tính xylanase tái tổ hợp trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất xylan 0,5% ................................36 Hình 3.2: Hình ảnh hoạt tính enzyme xylanase từ (A) chủng tự nhiên A. oryzae VTCC-F187; (B) chủng A. niger VTCC017/pANXlnG2 tái tổ hợp .........37 Hình 3.3: Điện di đồ sản phẩm tinh sạch sau khi qua cột histag xylanase G2 ........38 Hình 3.4: Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính (A) và lên độ bền (B) của xylanase tái tổ hợp .....................................................................................39 Hình 3.5: Ảnh hưởng của pH phản ứng lên hoạt tính (A) và lên độ bền (B) của xylanase tái tổ hợp .....................................................................................40 Hình 3.6: Ảnh hưởng của các dung môi hữu cơ hữu cơ methanol (MtOH), ethanol (EtOH), acetone (Act), isopropanol (IsOH) và n-butanol (n-BtOH) lên hoạt tính xylanase tái tổ hợp, ĐC (mẫu đối chứng) ...................................41 Hình 3.7: (A) Sắc kí đồ trên cột Sephadex G200, (B) Điện di đồ SDS-PAGE của A. oryzae VTCC F187 sau khi qua cột sephadex G200, (C) Điện di đồ SDS- PAGE của A. oryzae VTCC F187 sau khi qua cột sắc kí trao đổi ion DEAE ......................................................... Error! Bookmark not defined. Hình 3.8: Sắc ký bản mỏng về khả năng thủy phân arabinoxylan lần lượt thương mại và hãng của enzyme xylanase tự nhiên và enzyme tái tổ hợp với hệ dung môi n-butanol: acid acetic: H2O = (3:1:1) ........................................46
Hình 3.9: Sắc ký bản mỏng về khả năng thủy phân cơ chất của enzyme xylanase tự nhiên và enzyme tái tổ hợp sạch với hệ dung môi n-butanol : acid acetic : H2 O = (3:1:48)…………………………………………………………………..……49
BẢNG KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ APS Ammonium persulfate ARN Acid ribonucleic BLAST Basic local alignment search tool BSA Bovine serum albumin (albumin huyết thanh bò) Bp Base pairs cDNA Complement DNA DNA Acid Deoxyribonucleic dNTP 2’ Deoxynucleoside 5’ triphosphate ĐC Đối chứng EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid kDa Kilo dalton M Marker (thang chuẩn) μg Microgam μl Microliter OD Optical density SDS Sodium dodecyl sulfate SDS- PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine TTH Tái tổ hợp VTCC Vietnam Type Culture Collection (Trung tâm bảo tàng giống VTCC) v/v Volume/ volume w/v Weight/ volume
MỞ ĐẦU Xylan một loại polysacharid chiếm phần lớn trong thành phần hemicellulose của thành tế bào thực vật. Để phân giải hoàn toàn xylan thành xylose cần có sự phối hợp của nhiều loại xylanase khác nhau với các chức năng khác nhau (endo-β-1,4-D- xylanase, EC 3.2.1.8; β-D-xylosidase, EC3.2.1.37; α-L-arabinofuranosidase, EC 3.2.1.55; α-D-glucuronidase, EC 3.2.1.1; acetyl xylan esterase; EC 3.1.1.6). Endoxylanase có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Xylanase dùng cho công nghiệp bột giấy, hỗ trợ quy trình tẩy trắng, giúp giảm hóa chất độc (chlorine) thường dùng để tẩy lignin trong giấy [14], làm trong nước hoa quả, rượu vang, bia, tạo đường xylitol cho công nghiệp bánh kẹo [67]. Xylanase thủy phân hemicellulose tạo arabinoxylan (AX) và chuỗi oligosaccharid arabinoxylan ngắn hơn (arabinoxylanoligosaccharid-AXOS). Arabinoxylan (AX) là một thành phần chất xơ chính được tìm thấy trong một loạt các loại ngũ cốc, được dùng cho chế độ ăn kiêng có tác dụng tốt đối với sức khỏe con ngườ. Nên arabinoxylan được định hướng dùng làm phẩm chức năng [71, 61, 57]. Rất nhiều chủng vi sinh vật tự nhiên từ vi khuẩn, nấm men, nấm sợi được công bố có khả năng sản xuất xylanase, trong đó nấm mốc là sinh vật tiềm năng có khả năng tổng hợp xylanase hoạt tính cao [38]. Vì những lý do ứng dụng khác nhau, rất nhiều loại xylanase được sản xuất từ chủng Bacillus [14] và chủng nấm Aspergillus như Aspergillus awamori, Aspergillus ficuum, Aspergillus giganteus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger và Aspergillus sydowii đã được tinh sạch và đánh giá một số tính chất lý hóa của xylanase [33, 34, 49, 57, 62, 85]. Các nghiên cứu trong nước cũng như trên thế giới đã tạo ra chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp xylanase như E. coli [88], Bacillus [85], Pichia pastoris [16]. Chủng Aspergillus niger VTCC017/pANXlnG2 đã được tạo ra từ việc nhân đoạn gen xylanase từ chủng Aspergillus oryzae VTCC F187, gen mã hóa xylanase được chèn vào vector biểu hiện pAN7.1GluA với cặp mồi đặc hiệu, plasmid tái tổ hợp được đưa vào A. niger VTCC 1
017 với chất cảm ứng hygromycin sau 72 giờ nuôi cấy chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase cao. Với mong muốn ứng dụng chủng vào thực tế sản xuất enzyme xylanase tái tổ hợp định hướng nghiên cứu khả năng thủy phân arabinoxylan và các chế phụ phẩm nông nghiệp chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tinh sạch và đánh giá tính chất của xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp” với mục tiêu sau: 1. Tinh sạch được enzyme xylanase từ chủng Aspergillus niger tái tổ hợp 2. Đánh giá các tính chất lý hóa của xylanase tái tổ hợp 3. Thử nghiệm khả năng thủy phân của enzyme xylanase tái tổ hợp và enzyme xylanase tự nhiên. 2
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sơ lƣợc về enzyme xylanase 1.1.1. Định nghĩa Theo Hội hóa sinh và sinh học phân tử thế giới (the International Union of Biochemistry and Molecular Biology) enzym có mã số EC 3.2.1.8 có [67]: Tên được công nhận là: endo-β-1,4-xylanase Các tên khác gồm có: endo-β-1,4-xylan 4-xylanohydrolase; endo-1,4- xylanase; xylanase; β-1,4-xylanase; endo-1,4-xylanase; endo-β-1,4- xylanase; endo-1,4-β-D- xylanase; 1,4-β-xylan xylanohydrolase; β- xylanase; β-1,4-xylan xylanohydrolase; endo-1,4-β-xylanase; β-D- xylanase Tên hệ thống: 4-β-D-xylan xylanohydrolase Phản ứng: thủy phân phía trong của các liên kết β-1,4-D-xylosidic trong xylan tạo thành các oligosacharid ngắn (oligoxylose) và xylose (Hình 1.1) [67]. Hình 1.1: Vị trí xúc tác của xylanase và các enzym khác trong quá trình thủy phân xylan [67] 3
1.1.2. Phân loại Enzyme xylanase thường được tìm thấy ở thực vật và vi sinh vật. Chúng được phân chia thành hai nhóm dựa vào sự tương đồng về đặc tính lý hóa như là khối lượng phân tử, điểm đẳng điện và các đặc tính xúc tác khác nhau của chúng: Enzyme endo-xylanase họ 10 gồm các enyzyme có nguồn gốc từ thực vật, nấm mốc và vi khuẩn có khối lượng phân tử cao với giá trị pI thấp (trước đây gọi là họ F). Enzyme endo-xylanse họ 11 gồm các enzyme có nguồn gốc từ nấm mốc và vi khuẩn có khối lượng phân tử thấp với giá trị pI cao được (trước đây gọi là họ G) [52, 73]. Sự khác biệt về đặc tính xúc tác giữa các họ xylanase là endo-xylanase của họ 10 có khả năng thủy phân các liên kết glycozit cạnh các điểm nhánh và hướng về đầu không khử còn endo-xylanase thuộc họ 11 không có khả năng đó [41]. Trong khi endo-xylanase của họ 10 cần hai gốc xylopyranosyl không thay thế giữa các nhánh thì endo-xylanase của họ 11 cần có ba gốc xylopyranosyl liên tiếp không thay thế. Ngoài việc phân loại enzyme xylanase làm 2 nhóm lớn, nhiều nhà khoa học cũng đã tiến hành nghiên cứu, phân chia enzyme xylanase thành những nhóm nhỏ hơn. Sapag và cộng sự (2002) chia xylanase họ 11 thành 6 nhóm chính. Nhóm I, II và III chứa chủ yếu các enzyme của nấm mốc. Các enzyme nhóm I và II thường là các enzyme có khối lượng khoảng 20 kDa được sinh tổng hợp từ các họ Ascomyceta và Basidiomyceta. Các enzyme nhóm I có giá trị pI bazơ trong khi đó nhóm II có giá trị pI ở phía axit. Các enzyme của nhóm III chủ yếu được tạo ra bởi các nấm yếm khí. Trong khi đó, các xylanase của vi khuẩn được chia thành ba nhóm là A, B và C. Nhóm A là các xylanase được sinh tổng hợp bởi họ Actinomycetaceae và Acillaceae, hoàn toàn là những vi khuẩn hiếu khí gram dương. Nhóm B và C thì chứa các enzyme chủ yếu từ các vi khuẩn yếm khí gram dương, những loài thường sống trong dạ cỏ [73]. 1.1.3. Cấu trúc 4
Cấu trúc bậc ba của endoxylanase họ 10 và 11 được xác định cho hàng loạt các enzyme [81], từ cả vi khuẩn và nấm mốc. Endo-xylanase 1BCX từ Bacillus circulans có nét đặc trưng của họ 11 [41]. Nếp gấp domain xúc tác là do hai nếp gấp β tạo thành (A và B) chủ yếu là bởi các mặt β đối song và một chuỗi xoắn α ngắn và tương tự như một phần bàn tay phải được đóng lại [73]. Sự khác nhau trong hoạt động xúc tác của các endo-xylanase của họ 10 và 11 được cho là do sự khác nhau trong cấu trúc bậc ba của chúng. Cấu trúc bậc 3 của endo-xylanase chủ yếu được sắp xếp từ các mảnh β. Cấu trúc toàn thể của domain xúc tác của xylanase họ 10 như là một cái thùng hình trụ được tạo thành từ 8 mảnh. Hình 1.2: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 10 từ Bacillus haloduran [39] Các thành viên của họ F11 có dạng domain xúc tác từ các mảnh nếp gấp β cái mà làm thành một vùng lõm hai lớp xung quanh vị trí xúc tác. Vũng lõm này được so sánh với lòng bàn tay và các ngón tay trong khi cái vòng giống như ngón cái của tay phải. Cái vòng (loop) nhô ra thành vùng lõm và giới hạn trong một phân tử isoleusin [41]. 5
Hình 1.3: Cấu trúc không gian 3 chiều của xylanase họ 11 [Jeffries1996] Xylanase có thể liên kết với từ ba đến năm vòng xylopyranose ở gần vị trí xúc tác. Meagher và cộng sự (1998) nhận thấy rằng Xyn 2 của Trichoderma reesei có thể liên kết với năm vòng xylopyranose, trong khi đó thì Xyn 1 chỉ có thể liên kết với 3 vòng xylopyranose ở gần vị trí xúc tác [59]. Các vị trí cho các gốc xylopyranose liên kết được xác định bởi sự có mặt của tyrosine chứ không phải bởi tryptophan [21, 80]. 1.1.4. Đặc điểm cơ chất, cơ chế xúc tác 1.1.4.1. Đặc điểm cơ chất Xylanase chủ yếu thủy phân xylan và một phần nhỏ cellulose. Xylan là thành phần chính cấu tạo hemicellulose tập trung chủ yếu ở cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thực vật, và là một trong số polysaccharid quan trọng trong tự nhiên [48]. Ở cây gỗ cứng, xylan tồn tại ở dạng O-acetyl-4-O-methylglucuronoxylan (Hình 1.4), còn ở cây gỗ mềm là arabino-4-O-methylglucuronoxylan (Hình 1.5). Ở các loài ngũ cốc, thành phần cấu tạo xylan là acid D-glucuronic, có hoặc không có liên kết ete 4-Omethylvà arabinose. 6
Hình 1.4: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ cứng [48] Hình 1.5: Dạng tồn tại của xylan ở gỗ mềm [48] 1.1.4.2. Phức hệ enzyme phân cắt xylan Có nhiều phương pháp có thể được sử dụng để thủy phân hoàn toàn xylan. Sử dụng kiềm mạnh hoặc axit mạnh là những biện pháp đang được sử dụng phổ biến hiện nay bởi hiệu quả thủy phân và giá trị kinh tế. Nhưng vấn đề ô nhiễm môi trường đang ngày càng gia tăng, đòi hòi các nhà khoa học phải tìm tòi, nghiên cứu ra phương pháp thủy phân polysaccharide nói chung và xylan nói riêng bằng enzyme sinh học. Phân huỷ sinh học xylan là sự kết hợp hoạt động của nhiều loại enzyme [68], trong đó endo- β-1,4-xylanase (β-1,4-D-xylanxylanohydrolase, EC 3.2.1.8) thực hiện nhiệm vụ phân cắt mạch chính xylan bằng việc thủy phân ngẫu nhiên khung xylan tạo ra các oligosaccharide. Sau đó exo-β-1,4-D-xylosidase (β- 1,4-D-xylan xylohydrolase EC 3.2.1.37) thủy phân các oligosaccharide thành các monomer. Các nhóm bên có mặt trong xylan được giải phóng bởi α-L-arabinofuranosidase, α-D-glucuronidase, galactosidase và acetyl xylan esterase. 7
Hình 1.6: Vị trí tấn công của các enzyme vào xylan của cỏ [68] Exo-β-1,4-D-xylosidase (EC 3.2.1.37) xúc tác thủy phân β-1,4-D-xylo- oligosaccharide bằng cách loại bỏ xylose từ đầu không khử. Sự thủy phân liên kết α- 1,2 -glycosidic bền vững đóng vai trò quan trọng trong thủy phân xylan. Tương tự như liên kết giữa cacbonhydrat và lignin, dạng liên kết 4-O-methyl-glucuronidase với xylose là hàng rào trong sự phá hủy gỗ. Có nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp α-glucuronidase [39]. Để thủy phân hoàn toàn xylan tự nhiên cần có các esterase để loại bỏ liên kết của các axit acetic và axit phenolic với xylose. Esterase phá vỡ liên kết của xylose với axit acetic (acetyl xylan esterase (EC 3.1.1.6), các gốc chuỗi bên arabinose với axit ferulic (feruloyl esterase) và gốc chuỗi bên arabinose với axit p-coumaric (p- coumaroyl esterase). Phân cắt các nhóm acetyl, feruloyl và p-coumaroyl từ xylan thì thuận lợi cho sự loại bỏ lignin. Chúng có thể góp phần làm hòa tan lignin bởi sự phân cắt các liên kết este giữa lignin và hemicellulose. Nếu sử dụng cùng với xylanase và các enzym 8
phân hủy xylan khác trong tẩy trắng bột giấy, các esterase có thể phá vỡ và làm lỏng lẻo một phần cấu trúc của thành tế bào [19]. Enzyme quan trọng nhất trong hệ thống enzyme thủy phân cơ chất xylan là enzyme xylanase [67]. Vì nó là enzyme khởi đầu cho hệ thống phản ứng phân cắt các liên kết của xylan. 1.1.4.3. Cơ chế xúc tác Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế xúc tác của xylanase [23, 41, 50, 53]. Một cách tổng quát, cơ chế hoạt động xúc tác của xylanase được sơ đồ hóa qua Hình 1.7: (a) Xylanase nhận diện xylan và liên kết nó bằng cách thay đổi cấu hình ở phần cánh trái (cuộn xoắn lại 3 lần); cơ chất xylan hình xoắn ốc được đặt ở vị trí đối diện với khe giữa Tyr 65 và Tyr 69 (a); [41] (b) Hai gốc glutamat (Glu) được định vị cho phù với vị trí hoạt động (khoảng 5,5 Å). Glu 172 là chất xúc tác acid/base, Glu 78 là chất cho điện tử [41]; (c) Gốc xylosyl ở vị trí thứ nhất bị vặn méo và hút về phía gốc xúc tác (Glu 78), liên kết glycosidic bị kéo căng và bẻ gãy tạo thành dạng trung gian đồng hóa trị enzyme – cơ chất (b) [53]; (d) Dạng trung gian bị tấn công bởi một phân tử nước hoạt động, nó tách thành ion 𝐻+ gắn vào gốc glycosyl vừa được tách ra trong khi 𝑂𝐻− gắn vào đầu khử của mạch xylan vừa tạo theo cơ chế thủy phân glycosyl, nhờ đó sản phẩm được giải phóng (c), (d) [50]; (e) Enzym dịch chuyển đến vị trí tiếp theo trên cơ chất nhờ sự phân tách và phân tán các đường (xylose) [41]. 9
Hình 1.7: Mô hình hoạt động của xylanase 1.2. Ứng dụng của enzyme xylanase 1.2.1. Các chế phẩm xylanase trên thị trƣờng quốc tế Enzym xylanase được sử dụng thương mại trong một số ngành công nghiệp như tẩy trắng bột giấy, thực phẩm, thức ăn và sản xuất bia. Ứng dụng chính của xylanase là tẩy trắng bột giấy và được sản xuất bởi các công ty khác nhau trên thế giới với nhiều tên thương mại khác nhau như Bleachzyme (Biocon, Ấn Độ), Cartzyme (Sandoz, US), Cartzyme MP (Clarient, UK), Ecozyme (Thomas Swan, UK), Ecopulp (Alko Rajamaki, Phần Lan…. Xylanase được sản xuất thương mại bởi một số ngành công nghiệp quốc tế để ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Sankyo từ Nhật Bản, Ciba Giegy từ Thụy Sĩ sản xuất xylanase với tên thương mại lần lượt là Sanzyme và Albazyme-10A, và đã được sử dụng thương mại 10
trong ngành công nghiệp thực phẩm và làm bánh. Một công ty Đan Mạch Novo Nordisk, 2017) [82]. Một công ty Mỹ Alltech, Inc., sản xuất thương mại xylanase với tên thương mại Allzym PT và Fibrozyme và đã được sử dụng để nâng cấp thức ăn chăn nuôi. Hầu hết các xylanase thương mại được sản xuất bởi nguồn nấm do tiềm năng sản xuất cao. 1.2.2. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc Xylanase đóng vai trò quan trọng trong thức ăn chăn nuôi bằng cách phá vỡ thành phần thức ăn arabinoxylan và làm giảm độ nhớt của nguyên liệu thô. Chủng A. japonicus C03 với khả năng sản xuất endoxylanase và cellulase tốt với độ ổn định cao trong môi trường dạ cỏ dê, cho thấy các ứng dụng đối với động vật nhai lại [32]. Một số nghiên cứu đã cho thấy sự sẵn có xylanase trong các sản phẩm chưng cất hạt khô có thể hòa tan (DDGS) được sử dụng trong thức ăn chăn nuôi và sử dụng xylanase ngoại sinh trong chế độ ăn của gia cầm để xử lý hàm lượng chất xơ cao hơn [66, 83]. Bổ sung xylanase cho thấy sự cải thiện cân nặng và tăng tỷ lệ chuyển đổi thức ăn vì sự cải thiện khả năng tiêu hóa arabinoxylan trong chế độ ăn của động vật [78]. ECONASE XT một quảng cáo nổi tiếng endo -1,4-xylanase đã được sử dụng làm phụ gia thức ăn cho gà vỗ béo, heo con cai sữa và vỗ béo cho lợn [72]. 1.2.3. Trong công nghiệp thực phẩm Xylanase tìm thấy ứng dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm như công nghiệp bánh mì. Bánh mì được tạo thành từ lúa mì bao gồm hemicelluloses như arabinoxylan. Xylanase có thể hòa tan arabinoxylan không thể tách rời thành arabinoxylan chiết xuất được trong nước [24]. Điều này giúp phân phối nước đồng đều và cải thiện sự hình thành mạng gluten bột trong suốt. Butt et al. (2008) đã chứng minh vai trò của GH11 endoxylanase từ B. subtilis trong việc hòa tan arabinoxylan [22]. Điều này làm tăng độ nhớt và khối lượng bột và giảm sự kết tụ gluten và độ cứng của bột làm cho các mảnh vụn đồng đều và mịn. GH11 xylanase (0,12 U/g bột) từ Penicillium constitanis Pol6 cải thiện quá trình sản xuất bánh mì như giảm sự hấp thụ nước (8%) và tăng bột nhào (36,8%), khối lượng (17,8%), cụ thể khối lượng 11