Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của protein KOD DNA polymerase tái tổ hợp ở E. coli

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:58

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài "Nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của protein KOD DNA polymerase tái tổ hợp ở E. coli" với mục tiêu tạo ra KOD DNA polymerase tái tổ hợp bằng phương pháp đơn giản, từ đó có thể sản xuất lượng lớn enzyme này, làm chủ về mặt công nghệ ở Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của protein KOD DNA polymerase tái tổ hợp ở E. coli

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Uyên NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PROTEIN KOD DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E. COLI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2019
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thị Uyên NHÂN DÒNG, BIỂU HIỆN, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA PROTEIN KOD DNA POLYMERASE TÁI TỔ HỢP Ở E. COLI Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 8420101.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nguyễn Văn Sáng Hà Nội – Năm 2019
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Sáng, bộ môn Di truyền học, khoa Sinh học, trường Khoa học tự nhiên, người đã hướng dẫn, giúp đỡ và tận tình chỉ bảo tôi. Tôi cũng cảm ơn thầy vì đã cho tôi có cơ hội được làm việc trong nhóm của thầy, giúp tôi học tập được nhiều điều và có niềm đam mê với khoa học. Tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến chị Nguyễn Thị Thu Huyền và anh Lê Tuấn Anh, học viên cao học, phòng thí nghiệm Sinh học phân tử tế bào, trung tâm khoa học sự sống đã luôn giúp đỡ và đồng hành cùng tôi trong quá trình học tập cũng như quá trình làm việc trong phòng thí nghiệm. Tôi cũng xin được cảm ơn tới các thầy cô trong bộ môn Di truyền học, PGS.TS Nguyễn Thị Hồng Vân, TS. Đỗ Thị Phúc, TS. Trần Đức Long, ThS. Trần Thùy Anh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc tại trường. Nghiên cứu này được tài trợ bởi Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) trong đề tài mã số 106-NN 02-2016 58” Nghiên cứu có sự hợp tác và hỗ trợ cung cấp gen mã hóa bởi công ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn bên cạnh, chia sẻ và động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 12 năm 2019 Học viên Nguyễn Thị Uyên i
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i MỤC LỤC ..................................................................................................................ii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... v BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT .....................................................vii MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 Chương 1 - TỔNG QUAN ........................................................................................ 3 1.1. Tổng quan về PCR ............................................................................................ 3 1.1.1. Giới thiệu ....................................................................................................... 3 1.1.2. Ứng dụng của PCR ........................................................................................ 3 1.1.3. Nguyên lý ...................................................................................................... 5 1.1.1. Thành phần phản ứng PCR ............................................................................ 6 1.2. Giới thiệu về DNA polymerase ......................................................................... 7 1.2.1. Giới thiệu chung ............................................................................................ 7 1.2.2. Phân loại DNA polymerase dựa vào trình tự protein .................................... 7 1.2.3. Các loại DNA polymerase thương mại ......................................................... 7 1.2.4. Cấu trúc của DNA polymerase ...................................................................... 9 1.3. KOD DNA polymerase .................................................................................... 10 1.3.1. Tình hình nghiên cứu ................................................................................... 10 1.3.2. Giới thiệu về KOD....................................................................................... 10 1.3.3. Đặc điểm và cấu trúc ................................................................................... 11 1.4. Lựa chọn hệ thống biểu hiện ........................................................................... 12 1.4.1. Vật chủ biểu hiện ......................................................................................... 12 1.4.2. Vector .......................................................................................................... 14 1.5. Phương pháp tinh sạch sử dụng sắc ký ái lực ................................................ 16 1.5.1. Sắc ký ái lực Nickel ..................................................................................... 17 1.5.2. Sắc ký ái lực Glutathione............................................................................. 19 Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 21 2.1. Vật liệu và hóa chất ........................................................................................ 21 2.1.1. Vật liệu ........................................................................................................ 21 2.1.2. Hóa chất ....................................................................................................... 21 ii
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị....................................................................................... 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 23 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu ......................................................................................... 23 2.2.2. Tổng hợp và nhân dòng gen KOD ............................................................... 23 2.2.3. Thiết kế vector biểu hiện mang gen KOD ................................................... 24 2.2.4. Biểu hiện protein tái tổ hợp ......................................................................... 27 2.2.5. Tinh sạch protein sử dụng sắc ký ái lực ...................................................... 27 2.2.6. Thẩm tách protein ........................................................................................ 29 2.2.7. Thử hoạt tính enzyme .................................................................................. 30 Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 31 3.1. Nhân dòng gen KOD ....................................................................................... 31 3.1.1. Tối ưu mã bộ ba và tổng hợp gen KOD ...................................................... 31 3.1.2. Khuếch đại đoạn chèn bằng phản ứng PCR ................................................ 31 3.1.3. Chèn đoạn gen mã hóa KOD vào vector biểu hiện pET-M và pGEX-4T-1.32 3.1.4. Kết quả tách chiết plasmid DNA ................................................................. 34 3.1.5. Giải trình tự plasmid .................................................................................... 35 3.2. Biểu hiện protein tái tổ hợp ............................................................................ 36 3.3. Tinh sạch protein sử dụng sắc ký ái lực ......................................................... 38 3.3.1. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực Nickel ......................... 38 3.3.2. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký ái lực GST............................. 42 3.4. Thẩm tách protein ........................................................................................... 42 3.5. Thử hoạt tính enzyme ...................................................................................... 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 47 iii
DANH MỤC BẢNG Bảng 1: So sánh các đặc tính của một số loại DNA polymerase phổ biến [3] .........11 Bảng 2: Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng..........................................................21 Bảng 3: Thiết bị và dụng cụ ......................................................................................22 Bảng 5: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn .................................................25 Bảng 6: Thành phần phản ứng nối ............................................................................25 Bảng 7: Kết quả phân tích tối ưu mã bộ ba sử dụng GenScript ................................31 iv
DANH MỤC HÌNH Hình 1: Ứng dụng của kỹ thuật PCR [10] ...................................................................4 Hình 2: Nguyên lý nhân bản DNA qua các chu kỳ nhiệt [15] ....................................5 Hình 3: Các thành phần chính trong phản ứng PCR [33] ...........................................6 Hình 4: Cấu trúc chung của một DNA polymerase [36].............................................9 Hình 5: Cấu trúc của KOD DNA polymerase [14] ...................................................12 Hình 6: Cơ chế biểu hiện gen bởi hệ thống pET ở tế bào E. coli BL21 (DE3) [8]...13 Hình 7: Cấu trúc vector biểu hiện pET-32a ..............................................................15 Hình 8: Cấu trúc vector biểu hiện pGEX-4T-1 .........................................................16 Hình 9: Các bước tinh sạch bằng phương pháp sắc ký ái lực ...................................17 Hình 10: Cơ chế tinh sạch của phương pháp sắc ký ái lực với Nickel [25]..............18 Hình 11: Cơ chế của phương pháp sắc ký ái lực với đuôi GST [19] ........................20 Hình 12: Sơ đồ phương pháp nghiên cứu .................................................................23 Hình 13: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen KOD từ vector pUC19-KOD ............32 Hình 14: Kết quả biến nạp sản phẩm lai KOD-pET-M và KOD-pGEX-4T-1 vào tế bào .............................................................................................................................33 Hình 15: Kết quả PCR khuẩn lạc ..............................................................................34 Hình 16: Kết quả điện di plasmid .............................................................................35 Hình 17: Kết quả PCR kiểm tra plasmid...................................................................35 Hình 18: So sánh trình tự axit amin của KOD với trình tự KOD gốc ......................36 Hình 19: Kết quả biểu hiện KOD gắn đuôi 6xHis ở tế bào BL21 ............................37 Hình 20: Kết quả biểu hiện KOD gắn đuôi GST ở tế bào BL21 ..............................38 Hình 21: Kết quả tinh sạch protein KOD-His ...........................................................39 Hình 22: Kết quả tối tinh sạch KOD-His kết hợp với biến tính bằng nhiệt ..............40 Hình 23: Kết quả tinh sạch protein KOD-His ở điều kiện biến tính. ........................41 Hình 24: Kết quả tinh sạch KOD-His ở điều kiện biến tính và không biến tính. .....41 Hình 25: Kết quả tinh sạch KOD-GST. ....................................................................42 Hình 26: Kết quả PCR xác định hoạt độ enzyme KOD-His .....................................43 v
Hình 27: Kết quả PCR xác định hoạt độ enzyme KOD-GST ...................................44 Hình 28: Kết quả PCR thử hoạt tính enzyme KOD-His và KOD-GST với các kích thước gen và đệm PCR khác nhau. ...........................................................................45 vi
BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Kí hiệu Tên đầy đủ APS Ammonium Persulfate Aa Axit amin BSA Bovine serum albumin Bp Base pair DNA Axit deoxyribonucleic DTT Dithiothreitol dNTPs Deoxynucleoside triphosphates EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid E. coli Escherichia coli GST Glutathione S-transferase IMAC Immobilized metal affinity chromatography IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Kb Kilo base pair LB Luria-Bertani PCR Polymerase Chain Reaction RNA Axit ribonucleic SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Điện di polyacrylamide với SDS TAE Tris – acetic EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine vii
MỞ ĐẦU KOD DNA polymerase là enzyme có hoạt tính tốt trong số các DNA polymerase đang được sử dụng hiện nay. KOD DNA polymerase có vai trò quan trọng và được ưu tiên sử dụng trong PCR khuếch đại các sản phẩm gen kích thước lớn, giải trình tự hệ gen, hay nghiên cứu đột biến và tổng hợp gen. Do đó, enzyme này đang được áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh, y học, lĩnh vực pháp y, khoa học hình sự và nông nghiệp như: xét nghiệm sinh học phân tử để chuẩn đoán các bệnh liên quan đến virus, vi khuẩn, phát hiện mầm mống gây ung thư… Trên thị trường hiện nay, KOD DNA polymerase đang được cung cấp bởi công ty TOYOBO Ltd, Nhật Bản hay Millipore, Sigma của Mỹ với các đặc tính ưu việt như tần số đột biến thấp, tính ổn định cao, và tốc độ kéo dài rất nhanh. Tuy nhiên việc nhập khẩu hoàn toàn từ các công ty nước ngoài kèm theo những vấn đề không mong muốn cho người sử dụng khi như (1) giá thành cao, (2) thời gian vận chuyển kéo dài lâu, (3) chất lượng enzyme có thể bị ảnh hưởng do điều kiện bảo quản không đảm bảo trong thời gian vận chuyển. Xuất phát từ thực tiễn nhu cầu enzyme KOD DNA polymerase trong các phòng thí nghiệm cũng như các công ty công nghệ sinh học ở Việt Nam là rất lớn, Việt Nam cần có quy trình sản xuất enzyme DNA polymerase đạt chất lượng tốt và giá thành rẻ hơn, để đảm bảo tính chủ động trong nghiên cứu và làm chủ về mặt công nghệ. Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về DNA polymerase, tuy nhiên số lượng công bố liên quan đến quá trình tinh sạch KOD DNA polymerase tái tổ hợp vẫn còn rất hạn chế. Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất nghiên cứu “Nhân dòng, biểu hiện, tinh sạch và xác định hoạt tính của protein KOD DNA polymerase tái tổ hợp ở E. coli” với mục tiêu tạo ra KOD DNA polymerase tái tổ hợp bằng phương pháp đơn giản, từ đó có thể sản xuất lượng lớn enzyme này, làm chủ về mặt công nghệ ở Việt Nam. 1
Căn cứ vào mục tiêu chính của đề tài, chúng tôi đề ra các mục tiêu cụ thể như sau: 1. Tối ưu hóa được mã bộ ba của gen KOD DNA polymerase bằng công cụ tin sinh. 2. Tổng hợp và nhân dòng gen mã hóa cho KOD DNA polymerase. 3. Chèn đoạn gen mã hóa cho KOD DNA polymerase vào vector biểu hiện pET-M và pGEX-4T-1. 4. Biểu hiện protein KOD tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21 DE3. 5. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng phương pháp sắc ký ái lực với cột Niken hoặc GST. 6. Đánh giá hoạt tính enzyme KOD bằng kỹ thuật PCR. 2
Chương 1 - TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về PCR 1.1.1. Giới thiệu Phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) là kỹ thuật trong sinh học phân tử được sử dụng để khuếch đại một hoặc một vài bản sao của một đoạn DNA theo cấp lũy thừa, tạo ra hàng ngàn đến hàng triệu bản sao của trình tự DNA đó. Quá trình PCR có thể khuếch đại không chỉ những đoạn DNA có kích thước ngắn khoảng vài trăm bp mà còn có thể khuếch đại những đoạn lên tới 10 kb. Đặc biệt, khi sử dụng các DNA polymerase tái tổ hợp phản ứng PCR còn có thể khuếch đại các đoạn có kích thước lên đến 70 kb [2]. Phản ứng PCR được giới thiệu và phát triển trong ống nghiệm bởi một nhà khoa học người Mỹ, Kary Mullis, năm 1985 [28]. Kỹ thuật PCR nguyên thủy của K. Mullis sử dụng enzyme DNA polymerase không chịu nhiệt từ vi khuẩn E. coli [28]. Do đó, việc thực hiện phản ứng còn khó khăn khi phải bổ sung enzyme polymerase vào mỗi chu kỳ phản ứng. Cho đến nay, để trở thành một công cụ không thể thiếu trong phòng thí nghiệm sinh y học, đã có những tiến bộ kỹ thuật đóng góp làm cho kỹ thuật PCR nguyên thủy trở thành kỹ thuật PCR khá đơn giản và hiệu quả. Sự thay đổi đầu tiên phải kể đến việc phát hiện và sản xuất được các enzyme polymerase chịu nhiệt. Năm 1988, lần đầu tiên phân lập được enzyme bền nhiệt, Taq polymerase, đã đơn giản hóa được quá trình PCR và đưa PCR thành phản ứng tự động [27]. Kể từ đó, có rất nhiều ứng dụng được phát triển dựa trên phản ứng PCR. Tiếp sau đó là việc chế tạo được các máy luân nhiệt hoạt động hiệu quả và chính xác hơn. Hiện nay, các máy PCR đều được thiết kế gọn nhẹ hơn, có nhiều chức năng hơn, kể cả chức năng gradient – chức năng thực hiện nhiệt độ gắn mồi thay đổi tuyến tính trên các giếng ủ nhiệt. 1.1.2. Ứng dụng của PCR Kỹ thuật PCR đã được khai thác và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau (Hình 1) [10]. (1) PCR ứng dụng trong công nghệ gen: nhờ có PCR mà việc có được gen mong muốn thực hiện một cách dễ dàng và trong thời gian rất ngắn có thể chỉ trong 3
một vài ngày, thay vì phải cần rất nhiều thời gian như khi chứa có công cụ PCR. Chính vì vậy, hiện nay công nghệ gen đã có nhiều tiến bộ đáng kể qua các sản phẩm protein được sản xuất và đưa vào sử dụng trong y học, dược phẩm hay nông nghiệp [15]. (2) PCR ứng dụng trong y học: Ngoài ra PCR cũng đóng vai trò trong việc phát hiện và sàng lọc các bệnh lý di truyền. Việc phát hiện các bệnh di truyền trong một gen nhất định là một quá trình lâu dài và khó khăn, quá trình này đã được rút ngắn nhờ sử dụng kỹ thuật PCR. Mỗi gen sẽ được khuếch đại và phân tích trình tự xác định đột biến hay những thay đổi gây bệnh di truyền, hoặc còn có thể phát hiện các bệnh do các tác nhân vi sinh vật gây ra bằng phương pháp PCR khuếch đại DNA của virus, vi khuẩn [16]. (3) PCR ứng dụng trong pháp y: PCR cũng là một công cụ hiệu quả trong giám định pháp y để xác định tông tích nạn nhân, xác định thủ phạm qua những dấu vết sinh học để lại tại hiện trường; xác định quan hệ huyết thống qua dấu vân tay di truyền; và xác định hài cốt lâu năm… nhờ có kỹ thuật PCR mà các dấu vết DNA muốn tìm trong các mẫu được khuếch đại và phân tích [10]. (4) PCR ứng dụng trong nông nghiệp: Phản ứng PCR được ứng dụng nhiều trong nông nghiệp, cụ thể, trong việc chọn giống và nhân giống cây trồng vật nuôi, hay giúp phát hiện các tác nhân gây bệnh cho cây trồng, vật nuôi [10] . Hình 1: Ứng dụng của kỹ thuật PCR [10] 4
1.1.3. Nguyên lý Phương pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt, bao gồm các chu kỳ tăng giảm nhiệt độ để biến tính và tái bản DNA. Mỗi chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm ba giai đoạn nhiệt độ (Hình 2): (1) đầu tiên nhiệt độ sẽ được đưa lên 95°C để phá vỡ các liên kết hydro của mạch đôi DNA, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn ( giai đoạn biến tính). Thời gian để biến tính tùy thuộc vào kích thước của khuôn, thường sẽ từ 1 – 5 phút. (2) Tiếp theo, nhiệt độ sẽ được hạ đến 45°C - 65°C, đây là khoảng nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến và bắt cặp bổ sung vào hai đầu của mạch đơn DNA đích (giai đoạn bắt cặp). Nhiệt độ và thời gian gắn mồi phụ thuộc vào thành phần base, độ dài và nồng độ của mồi. Đối với một số loại khuôn và mồi, sự chênh lệch rất nhỏ giữa nhiệt độ gắn mồi từ 1°C – 2°C cũng ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của phản ứng PCR. Với những mồi có nhiệt độ nóng chảy trên 65°C có thể kết hợp giai đoạn gắn mồi và kéo dài thành chu kỳ PCR có hai bước. (3) Cuối cùng, 72°C là nhiệt độ thích hợp để enzyme DNA polymerase tổng hợp mạch bổ sung với DNA đích. Thời gian kéo dài tùy thuộc vào kích thước đoạn gen muốn nhân bản và loại DNA polymerase được sử dụng. Thời gian kéo dài 1 phút thường đủ cho sản phẩm gen có kích thước dưới 2 kb. Qua mỗi chu kỳ nhiệt, một DNA đích được nhân bản thành hai bản sao, với chu kỳ được lặp lại nhiều lần liên tục 30 đến 40 lần thì sẽ có hàng tỷ bản sao được tạo ra. Hình 2: Nguyên lý nhân bản DNA qua các chu kỳ nhiệt [15] 5
1.1.1. Thành phần phản ứng PCR Để thực hiện được phản ứng PCR trong ống nghiệm, cần có điều kiện thích hợp để DNA polymerase có thể thực hiện. Các thành phần chính để thực hiện phản ứng PCR được mô tả trong Hình 3, phản ứng cần có dNTPs, các oligonucleotide mở đầu (primer-mồi), enzyme DNA polymerase và các điều kiện phản ứng khác thích hợp với enzyme. Phản ứng cần có dNTPs bao gồm khoảng 200 µM mỗi loại Adenosine - , Thymidine - , Guanosine - , Cytosine – triphosphate [33]. Hình 3: Các thành phần chính trong phản ứng PCR [33] Mồi (primers) là những đoạn oligonucleotides dài khoảng 18-30 bases mang nhóm 3’–OH tự do và có trình tự bổ sung với hai đầu của đoạn DNA cần được nhân bản. Mồi được bắt cặp bổ sung với khuôn DNA ở điểm khỏi đầu và kết thúc, giúp DNA polymerase có thể nối và tổng hợp sợi đơn DNA mới. Sự lựa chọn chiều dài và trình tự mồi phụ thuộc ba yếu tố. Đầu tiên đó là nhiệt độ nóng chảy (biến tính) của mồi, đây là nhiệt độ mà trên nó thì mồi sẽ tách ra khỏi mạch khuôn DNA. Nhiệt độ nóng chảy của mồi thường khoảng từ 60-75 °C. Thứ hai đó là hàm lượng GC trong mồi, thường thì hàm lượng GC nên trong khoảng từ 40-60%. Ở hàm lượng này, nhiệt độ biến tính của mồi sẽ không quá cao, vì có thể sẽ ảnh hưởng đến hoạt động của DNA polymerase. Nhiệt độ nóng chảy của các mồi nên gần nhau, có thể chênh lệch nhau nhưng không quá 5°C. Yếu tố cuối cùng đó là việc hình thành cấu trúc kẹp tóc, hay tự bắt cặp của các mồi, điều này cũng có thể ảnh hưởng đến chất lượng của phản ứng PCR [6]. 6
Hỗn hợp phản ứng trong môi trường đệm Tris-HCl có pH từ 7.5 – pH 8.8, KCl, 500 – 1000 µg/ml gelatin hoặc BSA, 0.5 – 5.0 mM MgCl2 (MgCl2 là cofactor của DNA polymerase). Ngoài ra cũng có thể bổ sung hàm lượng thấp cho số chất khử như Triton X-100, Tween-20, dimethylsulphoxide (DMSO) để làm tăng tính đặc hiệu của mồi [33]. Cuối cùng, quan trọng nhất là DNA polymerase được sử dụng để tổng hợp lên mạch DNA mới. Các loại DNA polymerase thương mại dùng trong phản ứng PCR đều có tính bền nhiệt, nhưng khác nhau ở khả năng đọc sửa, độ chính xác và hiệu suất [33]. 1.2. Giới thiệu về DNA polymerase 1.2.1. Giới thiệu chung Năm 1956, Arthur Kornberg phát hiện ra DNA polymerase I ở Escherichia coli, đây là enzyme đầu tiên được xác định liên quan đến quá trình nhân đôi DNA. Nguyên lý cơ bản về chức năng của DNA polymerase đó là sao chép một đoạn DNA sử dụng một mạch làm khuôn mẫu và một đoạn DNA hay RNA có kích thước nhỏ làm mồi cho quá trình sao chép và tổng hợp từ đầu 5’ đến đầu 3’-OH. DNA polymerase đóng vai trò tổng hợp chuỗi polydeoxyribonucleotide từ các monodeoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) [30]. 1.2.2. Phân loại DNA polymerase dựa vào trình tự protein Dựa trên trình tự protein tương đồng, DNA polymerase được chia thành 5 họ chính đó là Escherichia coli DNA polymerase I (họ A), DNA polymerase II (họ B), DNA polymerase III (họ C), và những loại khác (họ X) [26]. Các loại DNA polymerase khác nhau có thể tìm thấy ở các sinh vật khác nhau. Ví dụ như DNA polymerase I, II, III được tìm thấy ở E. coli hoặc ở các sinh vật nhân thực có thể tìm thấy cả năm loại DNA polymerase (DNA Pol α, β, γ, δ, ε). 1.2.3. Các loại DNA polymerase thương mại Hiện nay, các DNA polymerase sử dụng trong phản ứng PCR hầu hết là các polymerase tái tổ hợp. Các DNA polymerase thương mại này có nguồn gốc từ các loài khác nhau sẽ có sự khác biệt về cấu trúc, đặc tính như là hiệu suất, độ chính xác do khả năng đọc sửa hay tỉ lệ kéo dài chuỗi polynucleotit. Các loại polymerase 7
thường được sử dụng cho phản ứng PCR được thu nhận từ các vi sinh vật bền nhiệt như Thermus aquaticus (Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu polymerase), Thermococcus litoralis (Tli polymerase), Thermus thermophiles (Tth polymerase) và Thermococcus kodakaraensis (KOD polymerase) [9]. Việc lựa chọn polymerase phụ thuộc vào mục đích, loại phản ứng PCR được thực hiện và kích thước của đoạn gen. Vai trò của DNA polymerase trong việc sao chép, tổng hợp và sửa chữa phụ thuộc vào một số đặc tính enzyme quan trọng của polymerase. Chúng được đánh giá dựa trên các đặc điểm đó là độ đặc hiệu (specificity), tính bền nhiệt (thermostability), hiệu suất (processivity), và độ chính xác (fidelity) [30]. Độ đặc hiệu (specificity) Khuếch đại không đặc hiệu là một trong những trở ngại lớn trong phản ứng PCR, vì nó ảnh hưởng đến năng suất và độ nhạy của việc khuếch đại gen đích. Nếu DNA polymerase có độ đặc hiệu kém thường có thể tạo dimer của mồi hay mồi bám không đặc hiệu trong phản ứng PCR. Để DNA polymerase có độ đặc hiệu tốt hơn nên để enzyme trên đá hoặc bổ sung DNA polymerase ở bước gắn mồi. Tính bền nhiệt (thermostability) Tính bền nhiệt của DNA polymerase là đặc điểm chính cho phép phản ứng PCR lặp đi lặp lại qua các chu kỳ để khuếch đại các đoạn DNA, do đó đây là một đặc tính quan trọng của DNA polymerase. Khả năng chịu nhiệt của enzyme liên quan đến kết quả của phản ứng PCR qua các chu kỳ. Hiệu suất (processivity) Hiệu suất của PCR số nucleotide trung bình được thêm vào bởi DNA polymerase trong một lần enzyme bám vào khuôn. Hiệu suất tổng hợp của mỗi enzyme quyết định thời gian tổng hợp một đoạn DNA của Polymerase đó. Một enzyme được cho là có hiệu suất nếu nó duy trì sao chép được một đoạn khuôn dài mà không bị gián đoạn. Hiệu suất của một enzyme có thể được xác định dựa trên những đặc điểm sau: polymerase trap hay tỉ lệ phản ứng bị giới hạn (Limited reaction rate)[23]. Độ chính xác hay tỉ lệ đột biến (fidelity hay error frequency) 8
Độ chính xác là một trong những đặc tính quan trọng của polymerase, nó ảnh hưởng đến trình tự đoạn DNA được khuếch đại. DNA polymerase có độ chính xác càng cao thì khả năng đột biến trong quá trình tổng hợp mạch DNA mới càng thấp. Độ chính xác của phản ứng PCR phụ thuộc vào hoạt tính của vùng 5’- 3’ exonuclease của DNA polymerase, đây là vùng có chức năng đọc sửa trong quá trình tổng hợp sợi DNA mới. 1.2.4. Cấu trúc của DNA polymerase Hiện nay, rất nhiều loại DNA polymerase đã được khám phá. Tuy có các trình tự axit amin khác nhau nhưng tất cả các loại DNA polymerase đều có một cấu trúc chung giống bàn tay phải (Hình 4) bao gồm ba phần được gọi là palm (lòng bàn tay), thumb (ngón tay cái) và fingers (ngón tay). Trong đó, cấu trúc của vùng fingers và thumb là khác nhau, còn vùng palm lại tương đồng giữa các loại khác nhau [36]. Trình tự bảo thủ ở vùng palm đóng vai trò là trung tâm hoạt động (là vùng liên kết với kim loại hóa trị 2 thường là Mg2+), với cấu trúc bao gồm 2 chuỗi xoắn α gấp chồng lên nhau và chồng lên gấp β [36]. Vùng fingers giúp xác định chính xác vị trí của khuôn ở trung tâm hoạt động, trong khi đó vùng thumb có liên quan đến việc bám của DNA và đóng vai trò trong hiệu suất của enzyme[36]. Hình 4: Cấu trúc chung của một DNA polymerase [36] 9
1.3. KOD DNA polymerase 1.3.1. Tình hình nghiên cứu Hiện nay, trên thị trường đã có nhiều enzyme thương mại được sử dụng rộng rãi như Taq, Pfu, Phusion hay KOD. Trong đó, KOD là enzyme thế hệ mới với nhiều đặc tính ưu việt so với Taq hay Pfu. Trên thị trường, KOD đã được một số hãng hóa chất trên thế giới đưa vào thương mại như Sigma của Mỹ, TOYOBO của Nhật Bản. Tuy nhiên, để nhập khẩu enzyme này về Việt Nam rất khó khăn về việc vận chuyển, hay giá thành cao. Việc lựa chọn KOD để nghiên cứu sản xuất tại Việt Nam giúp chủ động hơn về công nghệ sản xuất và nguồn nguyên liệu phục vụ nghiên cứu. Trên thế giới đã có nghiên cứu về cấu trúc của KOD năm 1997 [32], và một số nghiên cứu tinh sạch enzyme này ở vật chủ E. coli, tuy nhiên kết quả tinh sạch vẫn chưa được công bố cụ thể. Gần đây nhất là nghiên cứu biểu hiện, tinh sạch KOD ở hệ thống biểu hiện nấm men năm 2015 [39]. Như vậy, việc nghiên cứu sản xuất enzyme KOD DNA polymerase ở Việt Nam là nhu cầu cấp thiết và cần được triển khai nghiên cứu. 1.3.2. Giới thiệu về KOD KOD DNA polymerase thuộc họ DNA polymerases B hay còn gọi là α- DNA polymerase vì nó có trình tự axit amin bảo thủ với DNA polymerase α ở sinh vật nhân thực. KOD được tìm thấy ở vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis hay còn có tên khác là Pyrococcus kodakarensis. Loại vi khuẩn này được phân lập từ khu vực hồ nước nóng gần miệng núi lửa, ở đảo Kodakara, Kagoshima, Nhật Bản [21]. Vi khuẩn này là sinh vật biển, sống trong môi trường kỵ khí, dị dưỡng và chịu nhiệt cao (lên đến 95°C). Tương tự như một số loại enzyme họ B khác, ví dụ như Pfu được phân lập từ vi khuẩn Pyrococcus furiosus, thì KOD được sử dụng trong các phản ứng PCR, đặc biệt là đối với việc khuếch đại các đoạn DNA dài. Trên thực tế, hoạt tính của KOD DNA polymerase và khả năng ứng dụng của enzyme này trong phản ứng PCR đã được chứng minh trong rất nhiều công bố [20, 31]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng KOD là polymerase có tính bền nhiệt rất tốt, độ chính xác cao nhờ khả năng đọc sửa của vùng 3’ – 5’ exonuclease [32], điều này giúp KOD có sự vượt trội so với Taq và Pfu DNA polymerase. Cụ thể, qua các số liệu ở Bảng 1 đã cho thấy, KOD có tốc độ kéo dài cao gấp đôi (6-8 kb/phút), số lượng nucleotide trong 1 lần bám của enzyme (>300 base) cao gấp 5 lần so với Taq (50-60 base) và 15 lần so với 10
Pfu (15-20 base). Hơn nữa KOD còn có vùng 3’-5’ exonuclease có khả năng đọc sửa, khiến tỉ lệ đột biến của nó rất thấp giống như ở Pfu đó là 0.38% [32]. Nhiệt độ tối ưu của KOD DNA polymerase là 75°C, tương tự như Pfu [32]. Đặc biệt, KOD DNA polymerase còn có tính bền nhiệt cao hơn gấp khoảng 20 lần so với Taq polymerase ở 95°C. Do vậy, KOD DNA polymerase được sử dụng rộng rãi trong các hệ thống PCR yêu cầu nhanh, độ chính xác cao như các phản ứng PCR tạo đột biến, nhân dòng gen hay PCR phát hiện đột biến gây bệnh. (Ví dụ như TOYOBO Ltd, Nhật Bản hay Millipore, Sigma của Mỹ đã đưa vào sản xuất là enzyme thương mại). Bảng 1: So sánh các đặc tính của một số loại DNA polymerase phổ biến [3] AmpliTaq Pfu KOD Tốc độ kéo dài chuỗi 2-4 kb/phút 2-4 kb/phút 6-8 kb/phút Processivitya 50-60 nu 15-20 nu >300 nu 3’-5’ Exonuclease activityb Không Có Có Terminal transferase activityc Có Không Không Độ chính xácd 98.7% 99.61% 99.62% a Processivity: số nucleotide được kéo dài trong một lần polymerase bám vào khuôn b Khả năng đọc sửa của enzyme c TTA kết quả sự adenyl hóa của đầu 3’của mạch mới tổng hợp d Độ chính xác của enzyme. Một enzyme có độ chính xác là 1.3% sẽ có 1.3 nucleotide trong 100 không đúng. 1.3.3. Đặc điểm và cấu trúc KOD DNA polymerase gồm 774 axit amin, tương tự như cấu trúc chung của các DNA polymerase khác, KOD cũng gồm có các phần của polymerase là palm, thumb và finger. Nghiên cứu của Hashimoto và cộng sự năm 2001 đã chỉ ra cấu trúc của KOD DNA polymerase bao gồm các domain đã biết [13] và các subdomain như mô tả ở Hình 5. Theo đó, KOD bao gồm vùng N-terminal (kí hiệu N-ter gồm aa từ 1-130 và 327-368, màu tím), vùng có chức năng giúp polymerase này đọc sửa là exonuclease (kí hiệu Exo gồm aa từ 131-326, màu xanh), và vùng polymerase (Pol). Vùng Pol này bao gồm subdomain Palm (aa 369-449, 500-587, 11