Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phân tích đồng thời các dạng Dimethyldiselenite, Selenomethioline, Selenit and Selenat trong mẫu thủy- hải sản

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:84

Thêm vào BST

Báo xấu

10
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung chính của luận văn là phân tích đồng thời các dạng Dimethyldiselenite, Selenomethioline, Selenit and Selenat trong mẫu thủy- hải sản. Để hiểu rõ hơn, mời các bạn tham khảo chi tiết nội dung luận văn này.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Phân tích đồng thời các dạng Dimethyldiselenite, Selenomethioline, Selenit and Selenat trong mẫu thủy- hải sản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Hoàng Thị Dung PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI CÁC DẠNG DIMETHYLDISELENITE, SELENOMETHIOLINE, SELENIT AND SELENAT TRONG MẪU THỦY- HẢI SẢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2013
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Hoàng Thị Dung PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI CÁC DẠNG DIMETHYLDISELENITE, SELENOMETHIOLINE, SELENIT AND SELENAT TRONG MẪU THỦY- HẢI SẢN Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Tạ Thị Thảo Hà Nội - 2013
LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Tạ Thị Thảo đã tận tình hƣớng dẫn, động viên và tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn NCS. Phạm Hồng Chuyên đã tận tình giúp đỡ, động viên, chỉ bảo, truyền đạt lại nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong thời gian tôi thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Hóa Phân tích- ĐHKHTN ĐHQG Hà Nội đã dạy dỗ, trang bị kiến thức, trong quá trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn gia đình và các bạn học viên, sinh viên bộ môn Hóa Phân tích đã giúp tôi trong thời gian làm luận văn. Hà Nội, ngày 25 tháng 12 năm 2013 Học viên Hoàng Thị Dung
MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH VẼ DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................2 1.1. Trạng thái tự nhiên và tính chất phân tích của selen ......................................2 1.1.1. Các dạng tồn tại của selen và sự chuyển hóa của Selen trong môi trƣờng và thực phẩm ........................................................................................................2 1.1.2. Tác động của selen đối với sức khỏe con ngƣời ........................................5 1.2. Xác định tổng hàm lƣợng selen bằng phƣơng pháp phổ nguyên tử ..............6 1.3. Các phƣơng pháp phân tích dạng ..................................................................11 1.3.1. Phƣơng pháp phân tích trắc quang ...........................................................11 1.3.2. Nhóm phƣơng pháp phân tích điện hóa. ..................................................12 1.3.3. Các phƣơng pháp ghép nối .......................................................................13 1.3.4. Phƣơng pháp phân tích kết hợp với sử dụng chemometric ......................15 1.4. Phƣơng pháp xử lý mẫu phân tích có chứa selen .........................................23 1.4.1. Xử lý mẫu phân tích dạng ........................................................................23 1.4.2. Bảo quản mẫu để phân tích dạng selen ....................................................26 CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM ................................................................................27 2.1. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu............................................................27 2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................27 2.1.2. Nguyên tắc phƣơng pháp xác định dạng Selen bằng HVG-AAS ............27 2.1.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................28 2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm .......................................................28 2.2.1. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm.................................................................28 2.2.2. Hoá chất ....................................................................................................29
2.2.3. Các phần mềm tính toán và xử lí số liệu phân tích ..................................30 2.3. Tiến hành thí nghiệm ......................................................................................30 2.3.1. Quy trình phân tích ...................................................................................30 2.3.2. Thuật toán và câu lệnh tính toán phƣơng trình hồi quy đa biến...............32 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................36 3.1. Chuẩn hóa lại các điều kiện xác định tổng hàm lƣợng selen bằng phƣơng pháp HVG-AAS.....................................................................................................36 3.1.1. Điều kiện đo phổ AAS xác định Se(IV) ...................................................36 3.1.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất khử đối với quá trình khử các dạng selen thành selennua ...........................................................................................37 3.1.3. Hiệu suất khử các dạng selen phụ thuộc vào môi trƣờng ........................38 3.2. Chuẩn hóa lại mô hình hồi quy đa biến ..........................................................38 3.2.1. Xây dựng đƣờng chuẩn đa biến................................................................38 3.2.2. Đánh giá tính phù hợp của phƣơng trình hồi qui thông qua mẫu tự tạo ..40 3.2.3. Xác định nồng độ các dạng selen trong mẫu tự tạo theo mô hình PCR. ..40 3.3. Nghiên cứu sự chuyển dạng và mất chất phân tích khi bảo quản mẫu...........41 3.3.1. Ảnh hƣởng của pH và vật liệu bình chứa .................................................41 3.3.2. Ảnh hƣởng của oxi ...................................................................................44 3.3.3. Ảnh hƣởng của ion Fe3+ và cách loại trừ .................................................47 3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng các yếu tố đi kèm trong nền mẫu thực phẩm ............50 3.4.1. Ảnh hƣởng của chất béo stearin và cách loại trừ. ....................................50 3.4.2. Ảnh hƣởng của protein abumin đến tín hiệu đo .......................................52 3.4.3. Loại trừ ảnh hƣởng chất béo bằng cột SPE ..............................................54 3.5. Phân tích mẫu thực tế .....................................................................................59 3.5.1. Khảo sát tỉ lệ dung môi chiết ....................................................................59 3.5.2. Khảo sát ảnh hƣởng thời gian rung siêu âm .............................................60 3.5.3. Ảnh hƣởng của số lần chiết lặp ................................................................61 3.5.4. Hiệu suất thu hồi ......................................................................................61 3.5.5. Lấy mẫu thủy-hải sản và xử lí sơ bộ mẫu ................................................62
3.5.6. Phân tích mẫu thực ...................................................................................63 KẾT LUẬN ...............................................................................................................66 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................68
DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Một số dạng tồn tại của selen đã đƣợc tìm thấy .........................................2 Bảng 3.1: Tóm tắt các điều kiện tối ƣu xác định Se(IV) bằng phƣơng pháp HVG- AAS ...........................................................................................................................36 Bảng 3.2: Hiệu suất khử các dạng Se bằng NaBH4 trong môi trƣờng HCl 6M.......37 Bảng 3.3: Hiệu suất khử(%) các dạng Se bằng NaBH4 trong các môi trƣờng phản ứng ............................................................................................................................. 38 Bảng 3.4: Ma trận nồng độ 40 dung dịch chuẩn ......................................................39 Bảng 3.5: Hệ số của các PC tính theo hàm SVD .....................................................39 Bảng 3.6: Ma trận nồng độ các mẫu kiểm chứng phƣơng pháp .............................. 40 Bảng 3.7: Kết quả tính nồng độ các chất trong mẫu tƣ tạo theo phƣơng pháp PCR ...................................................................................................................................41 Bảng 3.8: Sự ảnh hƣởng của pH đến sự chuyển dạng của Selen .............................. 42 Bảng 3.9: Sự hấp thụ các dạng Se của vật liệu teflon ...............................................44 Bảng 3.10: Ảnh hƣởng của oxi có trong dung dịch đến sự chuyển dạng Se ............45 Bảng 3.11: Sự chuyển dạng Se khi không có oxi .....................................................46 Bảng 3.12: Ảnh hƣởng của ion Fe3+ đến quá trình chuyển dạng Se .........................48 Bảng 3.13: Khả năng loại trừ ảnh hƣởng của Fe3+ bằng EDTA ............................... 49 Bảng 3.15: Kết quả xác định hàm lƣợng và hiệu suất thu hồi các dạng Se khi có mặt protein .......................................................................................................................52 Bảng 3.16: Nồng độ các dạng Selen khi đi qua cột chiết pha rắn C18 ......................54 Bảng 3.17: Ảnh hƣởng của tốc độ nạp mẫu tới quá trình phân tích dạng Selen.......55 Bảng 3.18: Ảnh hƣởng của tốc độ dung môi rửa giải đến quá trình phân tích dạng Selen ..........................................................................................................................56 Bảng 3.19: Ảnh hƣởng tỷ lệ dung môi rửa giải trong quá trình phân tích dạng Selen ...................................................................................................................................58 Bảng 3.20: Hiệu suất thu hồi của dung môi chiết (methanol:H2O 9:1) ....................62 Bảng 3.21: Kết quả phân tích mẫu thực ....................................................................64 Bảng 3.22: Hàm lƣợng tổng 4 dạng Se và Selen tổng ở khu vực Pháp Vân- Thanh Trì- Hà Nội ................................................................................................................64
DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 1.1: Các dạng tồn tại của selen trong môi trƣờng nƣớc theo pH .......................4 Hình 1.2: Sơ đồ các bƣớc tiến hành của phƣơng pháp hồi qui cấu tử chính (PCR) .17 Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn sự ảnh hƣởng của pH tới quá trình chuyển dạng của Selen ..........................................................................................................................43 Hình 3.2: Sự chuyển dạng Se khi có mặt của oxi .....................................................45 Hình 3.3: Sự chuyển dạng Se khi không có oxi ........................................................46 Hình 3.4: Sự chuyển hóa các dạng Se khi có mặt ion Fe3+ .......................................48 Hình 3.5: Đánh giá khả năng loại trừ ảnh hƣởng của Fe3+ bởi EDTA .....................50 Hình 3.6: Hiệu suất thu hồi các dạng Se và tổng dạng Se khi có mặt Stearin ..........52 Hình 3.7: Hiệu suất thu hồi các dạng Se trong dung dịch có chứa protein ...............53 Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng tốc độ nạp mẫu tới quá trình phân tích dạng Selen ..........................................................................................................................55 Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng tốc độ dung môi rửa giải đến quá trình phân tích dạng selen ...........................................................................................................57 Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng tỷ lệ dung môi rửa giải đến quá trình phân tích dạng selen ...........................................................................................................58 Hình 3.11: Ảnh hƣởng tỉ lệ Methanol/H2O đến khả năng chiết các dạng Se ...........59 Hình 3.12: Ảnh hƣởng của thời gian rung siêu âm đến khả năng chiết dạng selen ..60 Hình 3.13: Ảnh hƣởng của số lần chiết lặp đến khả năng chiết dạng Selen .............61 Hình 3.14: Khu vực Pháp Vân – Thanh Trì – Hà Nội (Nguồn Googlemap). ...........62
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ILS : Bình phƣơng tối thiểu nghịch đảo (inverse least squares) PCR : Hồi qui cấu tử chính (Principal component regression) PC : Cấu tử chính (Principal component) Phƣơng pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng kĩ thuật hidrua HVG - AAS : hoá AES : Phƣơng pháp phổ phát xạ HTNT : Hấp thụ nguyên tử GF-AAS : Phƣơng pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa HPLC : Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao MS : Phƣơng pháp phổ khối lƣợng CCS : Các cộng sự
MỞ ĐẦU Selen là một nguyên tố vi dƣỡng rất thiết yếu đối với sức khỏe con ngƣời, chúng thƣờng có trong các thực phẩm nhƣ ngũ cốc, tỏi, tôm, cá… selen bổ sung dinh dƣỡng cho con ngƣời và có vai trò quan trọng trong quá trình sinh sản, tham gia quá trình trao đổi chất trong nội tiết tố, tổng hợp DNA. Ngoài ra, selen thể là độc tố môi trƣờng, khoảng nồng độ Se đƣợc phép có mặt trong cơ thể ngƣời mà không gây độc hại là rất hẹp và tùy thuộc vào dạng tồn tại của Se. Lƣợng Se nên đƣa vào cơ thể ngƣời hàng ngày khoảng 50-200µg/ngày [65].Trong cơ thể ngƣời, Se có thể tham gia vào các quá trình sinh hóa, cần thiết cho chức năng tế bào, tạo thành trung tâm hoạt hóa một số enzym [68]. Nếu sử dụng quá liều lƣợng giới hạn, Se có thể gây độc cho ngƣời… Selen tồn tại ở nhiều dạng hợp chất khác nhau nhƣng chủ yếu là hai dạng chính selen vô cơ (selenat, selenite…) và selen hữu cơ (selenocysteine, selenomethionine…) [71], mỗi dạng hợp chất có vai trò riêng, thƣờng thì selen ở dạng hữu cơ có ích hơn ở dạng vô cơ. Chính vì vậy, xác định hàm lƣợng các dạng selen hữu cơ, vô cơ sẽ góp phần vào đánh giá chất lƣợng thực phẩm tốt hơn. Hiện nay, số lƣợng công trình nghiên cứu xác định các dạng selen còn hạn chế và chủ yếu tập trung ở các nghiên cứu trên hệ kết hợp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết nối với bộ phận phát hiện nhƣ AAS, AES, AFS, MS,.... Các hệ đo này cho phép tách và định lƣợng đồng thời các dạng selen một cách hiệu quả trên nhiều đối tƣợng, đặc biệt là đối tƣợng sinh học. Nhƣng chi phí cho quá trình phân tích khá lớn do đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền nên không phải phòng thí nghiệm nào cũng có thể trang bị đƣợc. Vấn đề đặt ra trong thực tế thí nghiệm Việt Nam hiện nay là cần nghiên cứu một phƣơng pháp có thể sử dụng các thiết bị phổ biến hơn, giá thành hợp lý mà vẫn đảm bảo độ chọn lọc, độ chính xác và tin cậy cao để định dạng selen. Xuất phát từ những lý do đó, chúng tôi đã chọn đề tài luận văn “Phân tích đồng thời các dạng Dimethyldiselenite, Selenomethioline, Selenit and Selenat trong mẫu thủy- hải sản”. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Trạng thái tự nhiên và tính chất phân tích của selen 1.1.1. Các dạng tồn tại của selen và sự chuyển hóa của Selen trong môi trường và thực phẩm Selen ít phổ biến trong tự nhiên, có nguồn gốc từ việc phun núi lửa, có trong sunphua kim loại nhƣ đồng, niken, sắt, chì và trong các khoáng vật hiếm nhƣ Cu2Se, PbSe và As2Se. Selen là nguyên tố chiếm thứ 17 trên vỏ trái đất về khối lƣợng. Hàm lƣợng của selen trên bề mặt trái đất là không đồng đều [1]. Sự có mặt của selen trong sinh học và môi trƣờng rất đa dạng. Ví dụ, selen trong đất đá khoảng từ 0,1 ppm (các khu vực thiếu Se của New Zealand) đến 1200 ppm (một vùng ở Ireland). Khoảng nồng độ rộng cũng đƣợc tìm thấy trong trong các loại nƣớc không chứa muối, chiếm từ khoảng 0,1 µg/l đến 9 mg/l [1]. Selen trong nƣớc biển khoảng 0,05-0,5 µg/l. Selen trong thực vật chiếm khoảng 0,1 mg/kg khô và trong động vật khoảng 0,1-vài mg/kg ƣớt [68]. Các dạng tồn tại chủ yếu của Selen đƣợc liệt kê trong bảng 1.1: Bảng 1.1: Một số dạng tồn tại của selen đã đƣợc tìm thấy Selenous acid, selenite H2SeO3, SeO32- Selenic acid, selenate H2SeO4,SeO42- Selenocyanate SeCN- Methylseleninic acid anion MeSe(O)O- Methylselenenic acid anion MeSeO- Dimethylselenide Me2Se Dimethyldiselenide Me2Se2 Methylselenol MeSeH Trimethylselenonium cation Me3Se+ Selenocysteine H3N+–CH(COO−)–CH2–SeH H3N+–CH(COO-)–CH2–Se–Se– Selenocystine CH2CH(COO−)–NH3+ 2
Selenomethionine H3N+–CH(COO−)–CH2–CH2–Se–Me Se-methylselenocysteine H3N+–CH(COO−)–CH2–Se–Me γ-glutamyl-Se- H3N+–CH(COO−)–CH2–CH2–CO–NH– methylselenocysteine CH(COO−)CH2–SeMe H3H+–CH(COO−)–CH2–CH2–Se–CH2– Selenocystathionine CH(COO−)–NH3+ Selenohomocysteine H3N+–CH(COO−)–CH2–CH2–SeH NH2CH(COOH)CH2CH2 Se-adenosylselenohomocysteine SeCH2C4H5O3C5H4–NH2 Trong tự nhiên, selen tồn tại chủ yếu ở ba trạng thái ôxy hóa: Se +4, Se+6, Se-2.Selen vô cơ tồn tại chủ yếu trong đất và nƣớc [1,15], tuy nhiên chúng cũng đƣợc tìm thấy trong các cơ thể sống (động, thực vật và vi sinh vật) [68,15]. Mặt khác, các dạng selen hữu cơ nhƣ dimetyl selenua (CH3)2Se, dimetyl diselenua (CH3)2Se2 và dimetylselenon (CH3)2SeO2 đƣợc tạo ra từ nƣớc thải, bùn, đất đá và cũng đƣợc tìm thấy trong một số nƣớc tự nhiên và trong các cơ thể sống.Trong cơ thể sống, selen chủ yếu tồn tại ở dạng aminoaxit, nhƣ selencytin, selencystein, selenmethionin, selenglutathion, ... và các selen protein [68,63,47]. Trong đất, các dạng Se vô cơ chính đƣợc tìm thấy là Se(IV) và Se(VI), Độc tính của selen trong đất phụ thuộc vào mức độ oxi hóa. Se(IV) bị hấp phụ mạnh trên mặt đất, còn Se(VI) bị hấp phụ yếu, hoặc dễ dàng bị rửa trôi trên bề mặt. Selenmethionin có rất nhiều trong các loại cây trồng nhƣ ngũ cốc, đậu nành….Mặc dù cây cối không hấp thụ selen nhƣng chúng tích trữ một lƣợng lớn Selen từ đất. Ở vùng Brassica, thực vật có thể tích lũy 1000 mg Se/kg trong tế bào của lá. Tại Nonaccumulators, các loại ngũ cốc, cỏ cây không tích lũy nhiều hơn 50mg Se/kg [58]. Hàm lƣợng selen trong cỏ tƣơi thay đổi từ 1mg/ kg đến 4mg/kg. Cỏ ngừ từ 3mg/ kg đến 4mg/kg, cỏ nục 1,4 mg/kg, cỏ thu 1,2 mg/kg [2]. Các động vật không xƣơng sống dƣới nƣớc, động vật có vú, bò sát là những động vật đầu tiên xác định đƣợc chứa các dạng Selen có trong tế bào [69]. 3
Tiếp theo đó, đã phát hiện ra thủy-hải sản có chứa hàm lƣợng lớn selen [68,76]¸ các dạng selen đƣợc tìm thấy dƣới dạng selen vô cơ nhƣ selenit, selenat và selen hữu cơ nhƣ selenmethionin, selencystein, selencystin, selenprotein, selenua, selenomethionin, methylselenocystein, selenocystein [65,68,44,74,76]. Selen tập trung nhiều nhất ở da và gan cá, đặc biệt là cá ngừ. Vì thế mỡ cá và dầu gan cá có hàm lƣợng selen lớn. Các loài động vật khác có hàm lƣợng selen ít và không ổn định. Hàm lƣợng selen trong một số loài cá lên đến 370 ppm [66]. Trong nƣớc, các dạng tồn tại của selen phụ thuộc vào pH biểu diễn tại (hình 1.1), trong khoảng pH thấp từ 0- 3,8 thì tồn tại các dạng H 2Se, H2SeO30, HSeO41-; các dạng SeO42-, HSe- nằm trong vùng tuyến tính rất rộng pH từ 2,5- 14; dạng HSeO31- tồn tại chủ yếu trong khoảng pH từ 2,5-7, nếu môi trƣờng có từ trung tính đến bazơ thì selen tồn tại ở dạng SeO 32-. Quan sát hình 1.1 ta thấy đƣợc Selenate chiếm phần lớn trong môi trƣờng nƣớc tự nhiên Hình 1.1: Các dạng tồn tại của selen trong môi trƣờng nƣớc theo pH Căn cứ vào giản đồ, trong khoảng pH thấp từ 0- 3,8 thì tồn tại các dạng H2Se, H2SeO30, HSeO41-; các dạng SeO42-, HSe- nằm trong vùng tuyến tính rất rộng pH từ 2,5- 14; dạng HSeO31- tồn tại chủ yếu trong khoảng pH từ 2,5-7, nếu môi trƣờng có từ trung tính đến bazơ thì selen tồn tại ở dạng SeO 32-. Thấy đƣợc 4
rằng selenate chiếm phần lớn trong môi trƣờng nƣớc tự nhiên. Hàm lƣợng selen cho phép trong nƣớc là 50 mg/ml [59]. 1.1.2. Tác động của selen đối với sức khỏe con người Ở ngƣời, selen là chất dinh dƣỡng vi lƣợng. Selen với chức năng tham gia tạo các enzym chống ôxy hoá nhƣcác glutathion peroxyđaza (GSHPx) và một vài dạng nhất định của thioredoxyn reductaza. Selen tham gia xúc tác trong phản ứng chuyển hóa thứ cấp, ức chế các gốc tự do sinh ra từ quá trình perôxyt hóa lipit và cũng ức chế khả năng gây độc của các kim loại nặng: Hg, Pb, As, Cd và Sn [68,15,37]. Những nghiên cứu gần đây cho thấy nhiều tác dụng của selen đối với con ngƣời: Những ngƣời tiêu thụ 54-90µg selen hàng ngày sẽ giảm nguy cơ mắc hen (suyễn) xuống một nửa so với những ngƣời tiêu thụ 23-30µg. Selen có tác dụng làm ức chế các khối u gây ung thƣ tiền liệt tuyến, tăng cƣờng khả năng chống phóng xạ và tia tử ngoại. Ngƣỡng có lợi của selen trong khoảng 50-200µg/ngày cho mỗi ngƣời [62,56]. Theo khuyến cáo, lƣợng selen nam giới nên dùng hằng ngày là 80µg và nữ giới là 55µg [56]. Nguồn dinh dƣỡng selen đến từ các loại quả hạch, củ họ hành, tỏi, ngũ cốc, thịt, cá và trứng. Ngoài ra còn nhiều dạng thực phẩm khác cung cấp nhiều selen nhƣ các loại hải sản [1,15] . Tổ chức Y tế thế giới (WHO) tính toán, hàm lƣợng selen trong máu ngƣời trung bình phải đạt trên 0,15 µg/ml thì mới đủ lƣợng cần thiết cho cơ thể. Những kết quả nghiên cứu của WHO khẳng định nguyên tố selen có vai trò sinh học rất lớn đối với sức khoẻ con ngƣời. Điều tra dịch tễ học tại Mỹ và Bắc Âu cho thấy sự liên hệ giữa thiếu hụt selen và sự gia tăng mắc bệnh tim mạch, huyết áp cao, não, dẫn đến tử vong đối với con ngƣời. Thiếu hụt selen có thể dẫn tới các bệnh có liên quan tới chức năng tim mạch đƣợc gọi là bệnh Keshan. Sự thiếu hụt selen cũng đóng góp (cùng với thiếu hụt iot) vào bệnh Kashin-Beck, là loại bệnh tạo ra sự teo dần, thoái hoá và chết hoại của các mô chất sụn. Nếu thiếu hụt selen có thể sinh ra các triệu chứng của giảm hoạt động tuyến giáp, bao gồm sự mệt mỏi, bƣớu cổ, chứng ngu độn và xảy thai [1]. 5
Bên cạnh những tác dụng có lợi thì selen cũng là một độc độc tố khi ở nồng độ cao. Selen nguyên tố và phần lớn các selenua kim loại có độc tính tƣơng đối thấp do chúng có hiệu lực sinh học thấp. Ngƣợc lại, các selenat và selenit lại cực độc hại. Các hợp chất hữu cơ chứa selen nhƣ dimetyl selenua, dimetyl diselenua, selenmethionin, selencystein, selencystin và metylselencystein,... tất cả các chất này đều có hiệu lực sinh học cao và độc hại khi ở liều lƣợng lớn [1]. Chính vì những ƣu điểm của selen và ranh giới giữa tác dụng tích cực và tiêu cực của selen có liên quan chặt chẽ tới sức khoẻ con ngƣời, cho nên việc nghiên cứu thiết. 1.2. Xác định tổng hàm lƣợng selen bằng phƣơng pháp phổ nguyên tử Để xác định tổng hàm lƣợng các dạng Selen chúng ta có thể dùng dùng các phƣơng pháp khác nhau nhƣ: Phƣơng pháp quang phổ phát xạ nguyên tử(AES), phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử, phƣơng pháp trắc quang, phƣơng pháp điện hóa.... Tuy nhiên, phƣơng pháp tiêu chuẩn hiện nay xác định tổng hàm lƣợng selen trong dung dịch nƣớc là phƣơng pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử, sử dụng kỹ thuật hidrua hóa theo TCVN [3]. - Phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử (AES) xác định selen dựa trên ba vạch phổ đặc trƣng 196,1 nm; 204 nm; 206,3 nm. Khi sử dụng nguồn năng lƣợng là ngọn lửa đèn khí, hồ quang điện hoặc tia lửa điện, độ nhạy của phép xác định đạt tới µg/ml, phân tích nhanh, có độ chính xác bảo đảm và độ nhạy khá cao. Phƣơng pháp quang phổ phát xạ nguyên tử AES sử dụng kỹ kĩ thuật tạo hợp chất hidrua đƣợc ứng dụng rộng rãi khi phân tích các hợp chất dễ tạo hợp chất hidrua nhƣ As, Se, Hg….hoạt động dựa trên việc sử dụng các chất khử mạnh trong môi trƣờng axit để khử các chất phân tích về dạng hidrua dễ bay hơi, sau đó hơi hidrua đƣợc dẫn vào buồng nguyên tử hóa để sinh phổ phát xạ. Khi sử dụng kĩ thuật này đối với máy AES phân tích selen đạt đƣợc giới hạn phát hiện 3µg/ml [19]. Mặc dù giới hạn này là khá nhỏ nhƣng để hạ thấp hơn giới hạn phát hiện thì quá trình làm giàu trƣớc là cần thiết. Thomson và cộng sự 6
làm giàu bằng phản ứng đồng kết tủa với lantan hidroxit khi đó giới hạn phát hiện là 0,06µg/ml. Wang sử dụng kĩ thuật bay hơi cho giới hạn phát hiện là 0,5µg/ml. [27,50,16]. Tuy nhiên, phƣơng pháp quang phổ chỉ cho chúng ta biết tổng hàm lƣợng của Se trong mẫu, mà không chỉ ra đƣợc các dạng selen tồn tại ở trong mẫu.. - Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS có rất nhiều ƣu điểm so với các phƣơng pháp phân tích khác cho độ nhạy và có một số điểm mạnh khác nhƣ: khả năng phân tích đƣợc gần 60 nguyên tố hoá học, ngoài các nguyên tố kim loại còn có thể phân tích đƣợc một số á kim (lƣu huỳnh, clo…) và một số chất hữu cơ; lƣợng mẫu tiêu tốn ít; thời gian tiến hành phân tích nhanh, đơn giản… Ngày nay trong phân tích hiện đại, phƣơng pháp HTNT đƣợc sử dụng rất có hiệu quả đối với nhiều lĩnh vực nhƣ y học, dƣợc học, sinh học, phân tích môi trƣờng, phân tích địa chất, … đặc biệt phân tích lƣợng vết các nguyên tố kim loại. Khi phân tích mẫu thực tế, trong mẫu có rất nhiều nguyên tố ảnh hƣởng với Selen là nguyên tố rất dễ tạo hợp chất hidrua nên để tránh ảnh hƣởng của nền mẫu ngƣời ta kết hợp kỹ thuật hidrua hóa. Trên thế giới: Năm 1955 ông Walsh đã giới thiệu phƣơng pháp HTNT, sau đó kĩ thuật phân tích này đã đƣợc sử dụng rất phổ biến ở các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới. Tuy nhiên ban đầu việc xác định nguyên tử bằng HTNT còn gặp rất nhiều khó khăn trong việc mù hoá (sol khí hoá) dung dịch mẫu nhất là đối với các nguyên tố As, Se, Sb, Te… Mặt khác bƣớc sóng hấp thụ của các nguyên tố này lại nằm xa vùng tử ngoại (nhỏ hơn 230nm), tại đó sự hấp thụ nền là lớn khi sử dụng ngọn lửa thông thƣờng. Việc sử dụng ngọn lửa hydro – argon cho nhiệt độ thấp hơn giảm bớt đƣợc sự hấp thụ nền tới 15%, nhƣng ngọn lửa này có đặc điểm hoá hơi mẫu kém, gây ra sai số do sự hấp thụ nền và sự hoà tan muối không hoàn toàn. Sự phát triển kĩ thuật nguyên tử hoá cho HTNT nhƣ nguyên tử hoá bằng lò graphit thì tránh đƣợc các khó khăn của HTNT bằng ngọn lửa. Tuy vậy, việc sử dụng thiết bị này gặp một số vấn đề khác nhƣ: Tại bƣớc sóng ngắn sự khuếch tán hạt (nhƣ hạt cacbon) gây ra sự nhiễu nền lớn, bên cạnh 7
đó đối với nguyên tố dễ bay hơi nhƣ As, Se có thể bị mất trong quá trình nguyên tử hoá nên phép đo kém ổn định. Năm 1969, Holak đã sử dụng kĩ thuật tạo hidrua kết hợp với HTNT. Ông dùng hỗn hợp kim loại và axit (kẽm và axit clohydric) đểthực hiện phản ứng khử, kẽm và axit HCl đƣợc đựng trong một ống nghiệm có nitơ lỏng, trƣớc tiên ống nghiệm đƣợc làm nóng lên rồi dẫn dung dịch có chứa As đi qua, khi As sinh ra đƣợc dẫn vào ngọn lửa không khí–axetylen trong môi trƣờng nitơ. Bằng phƣơng pháp này khắc phục đƣợc đáng kể nhƣợc điểm của sự mù hoá, nâng cao đƣợc độ nhậy. Chất khử dùng cho phản ứng tạo hidrua là hidro mới sinh: Zn + 2HCl => ZnCl2 + H. 2H∙ + Em+ => EHn + H2 E là nguyên tố phân tích, m, n có thể giống hoặc khác nhau. Một số tác giả dùng nhôm hoặc magiê thay thế cho kẽm. Cũng có thể sử dụng clorua thiếc (II) hoặc KI làm chất khử và về sau ngƣời ta sử dụng natri tetrahydro borat (NaBH 4) có nhiều thuận tiện hơn. Khí hidrua đƣợc đẩy ra khỏi dung dịch chuyển đến buồng nguyên tử hoá nhờ dòng khí mang là khí trơ (Argon, Nitơ hoặc Heli). Thiết bị HG–AAS có thể dùng bộ nguyên tử hoá lò graphit hoặc bộ nguyên tử hoá ngọn lửa. Hệ nguyên tử hoá bằng ngọn lửa, để nguyên tử hoá hợp chất hidrua khí đƣợc dẫn vào ống thạch anh hình chữ T. Ban đầu ngƣời ta dùng ngọn lửa Ar-H2 để đốt nóng ống thạch anh, Holak dùng ngọn lửa C2H2 – không khí có nhiều ƣu điểm hơn và đƣợc sử dụng nhiều hơn. Cũng có thể đốt nóng ống thạch anh bằng lò điện và sự phân huỷ AsH3 xảy ra trong môi trƣờng khí trơ (Ar hoặc Ne, H2). Groulden và Brookband đã sử dụng loại thiết bị này. Ƣu điểm của việc đốt nóng ống thạch anh bằng lò điện là có thể điều khiển để đạt đƣợc nhiệt độ tối ƣu nhất, nhiệt độ phân bố cho ống thạch anh đều hơn, độ nhiễu nền thấp hơn [39]. Bằng kĩ thuật hidrua hoá độ nhậy của phƣơng pháp tăng lên rất nhiều so với kĩ thuật mù hoá dung dịch thông thƣờng. Dùng nguồn năng lƣợng là ngọn lửa và không khí thì độ nhạy phép xác định là 1µg/ml theo vạch 196nm, còn khi dùng ngọn lửa axetilen–không khí thì độ nhạy là 0,25µg/ml. Kĩ thuật nguyên tử hoá 8
không ngọn lửa xác định Se trong máu và serum, giới hạn phát hiện là 0,8µg/ml, còn khi nối với cột Cellex làm giàu thì giới hạn phát hiện tƣơng ứng là 2,1 và 2,4 ng/ml. Trên thế giới, rất nhiều nhà nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp để xác định hàm lƣợng selen đạt đƣợc giới hạn phát hiện thấp nhƣ: Denise Bohrer và CCS xác định hàm lƣợng Se trong thịt gà bằng phƣơng pháp HG-AAS và GF-AAS, đâu tiên thịt gà đƣợc sấy khô ở nhiệt độ 65 oC trong 24h, chất béo đƣợc loại bỏ bằng hỗn hợp axit HNO3 và HClO4. Sau khi phá mẫu, selen đƣợc đo bằng phƣơng pháp HG-AAS và GF-AAS trong môi trƣờng HCl 4-6 M. Kết quả cho thấy phần lớn lƣợng chất béo trong thịt gà đã đƣợc chiết ra. Phƣơng pháp HG-AAS và GF- AAS cho độ lệch chuẩn lần lƣợt là 0,8% và 6,5%, giới hạn phát hiện tƣơng ứng của 2 phƣơng pháp này là 0,6 µg/l và 1 µg/l [18]. William R. Mindak và CCS sử dụng phƣơng pháp HG-AAS xác định Se trong thức ăn với giới hạn định lƣợng 0,02 mg/kg [53]. Norooz Maleki và CCS định lƣợng Se trong nƣớc và trong đất bằng phƣơng pháp HG-AAS sử dụng chất NaBH4 và axit tartaric để chuyển Selen (IV) về Selen (VI) thu đƣợc độ lệch chuẩn tƣơng đối của Selen là 1,93% và giới hạn phát hiện là 10,6 ng/ml [58]. Ondrej Hegedus và CCS đã xác định hàm lƣợng Selen trong rau bằng phƣơng pháp Hg – AAS, dùng bƣớc sóng 196,0 nm, cƣờng độ dòng của đèn là 10mA, chất khử là NaBH 4 0,6% /NaOH 0,5%, thu đƣợc kết quả là 0,001-0,034 mg/kg trong mẫu rau tƣơi, với giới hạn phát hiện là 0,49 µg/l. Rau nhiều đƣờng và tinh bột thì chứa ít selen, khoai tây và cà rốt chứa nhiều Selen (0,034 mg/kg và 0,02 mg/kg) [34]. Magda A.Akl đã xác định đƣợc Selen trong một số mẫu thức ăn nhƣ: sữa trâu tƣơi là 0,053 µg/g; sữa bột là 0,071 µg/g; thịt bò hun khói là 0,47 µg/g; cá hồi là 0,81µg/g [48]. Hisatake Narataki xác định Selen trong nƣớc sông đạt giới hạn phát hiện là 0,04 µg/ml [57]. Miller HJ xác định selen có trong thực phẩm bằng cách lẫy 3 gam mẫu đem vô cơ hóa bằng hỗn hợp HNO 3-HClO4-H2SO4, dùng NaBH4 để hidrua hóa mẫu giới hạn phát hiện của selen là 25ng [36] .William R.Mindak và Scott P.Dolan đã xác định tổng hàm lƣợng selen trong các mẫu thức ăn nhƣ: thịt bò, gấu, bánh mỳ, 9
ngũ cốc, trứng, sữa, hoa quả, nƣớc chanh, lạc. Nồng độ giới hạn phát hiện của selen là 0,09 ng/ml, giới hạn định lƣợng là 0,02 mg/kg [53]. Kỹ thuật FI- HVG- AAS cũng đƣợc dùng để xác định hàm lƣợng selen có trong mẫu thực phẩm. Mẫu thực phẩm (sữa bò, thịt bò, thịt gà, cơ cá, cá đóng hộp, trứng, gạo, bột mì và mì ống). Các mẫu này đƣợc xay và trộn đều, sau đó đông khô, rồi hòa tan trong dung dịch HNO3 nung nóng ở 90oC trong 2h, sau đó thêm tiếp HNO 3 và HClO4 dung dịch thu đƣợc đem đo ở bƣớc sóng λ= 296 nm thu đƣợc hàm lƣợng Selen trong các mẫu thực phẩm là nhƣ sau: bột mỳ 0,01770 mg/l; gạo 0,01713 mg/l; sữa 0,01699 mg/l; thịt bò 0,01694 mg/l; trứng 0,01580 mg/l với % RSD là 4% cho bột mì, gạo và thịt bò, 3% đối với thịt gà và trứng, 2% đối với bột mỳ, sữa, thịt bò. Phƣơng pháp này cho hiệu suất thu hồi là 96% [17]. Gần đây, ở Việt Nam, phƣơng pháp HVG-AAS để xác định hàm lƣợng các dạng Selen có trong mẫu máu và nƣớc tiểu bằng cách sử dụng HNO 3, H2SO4, thêm HClO4, để phá mẫu, định mức dung dịch mẫu sau đó đem đo độ hấp thụ quang bằng HVG-AAS và xác định hiệu suất thu hồi thì nồng độ Selen trong mẫu máu và nƣớc tiểu là 0,41 ng/ml. Tác giả [5] cũng xác định tổng hàm lƣợng selen trong mẫu thực phẩm bằng cách cho mẫu thực phẩm (ngao, tôm ) đã sấy khô, nghiền mịn, thêm 15,0 – 20,0 ml dung dịch axit HNO 3 đặc 65%, ngâm khoảng 2h, đem đun trên bếp cách cát đến cạn, thêm vài giọt H 2O2 đun tiếp đến hết khói nâu. Lấy ra để nguội, thêm 12,0ml dung dịch axit HCl đặc 37%, sóc trộn đều dung dịch, đem đun trên bếp cách thủy trong 40 phút, lấy ra để nguội chuyển vào bình định mức 25 ml, thêm nƣớc cất đến vạch mức đem đo độ hấp thụ quang kết quả hàm lƣợng selen trong mẫu thực phẩm là mẫu tôm là 25,00 µg/g, mẫu ngao là 100,69 µg/g. Phƣơng pháp này đƣợc dùng sử dụng rãi để xác định hàm lƣợng các kim loại khác nhƣ As, Sb... Qua phân tích các công trình đã công bố, chúng tôi thấy rằng selen tồn tại trong mẫu ở những dạng hợp chất hóa trị khác nhau. Nhƣng hầu hết cần chuyển những dạng này về dạng khí H2Se để nguyên tử hóa. Trƣớc hết cần vô cơ hóa chúng về Se(VI) và DMDSe bằng các phƣơng pháp xử lý mẫu khác nhau sau đó 10
khử Se(VI) về Se(IV), DMDSe về SeMt bằng các hợp chất thích hợp. Chất khử thƣờng đƣợc dùng là HCl, hỗn hợp KBr/HCl, KI đun nóng, còn với phản ứng hidrua hóa thì dùng chất khử là NaBH 4 trong môi trƣờng NaOH. Trong luận văn này, chúng tôi sẽ sử dụng phƣơng pháp HVG-AAS có thể xác định đƣợc các dạng selen trong các mẫu thực phẩm khác nhau. 1.3. Các phƣơng pháp phân tích dạng 1.3.1. Phương pháp phân tích trắc quang Phƣơng pháp trắc quang để xác định Se(IV) dựa trên phản ứng tạo màu của Se(IV) với các o-diamin thơm. Thuốc thử hay đƣợc sử dụng nhất là 3,3’diaminobenzidin. Trong môi trƣờng axit, thuốc thử này đƣợc tạo với selen phức piazoseol có màu vàng. Đo độ hấp thụ quang của phức màu trong pha nƣớc ở 490nm (hay sau khi chiết bằng toluen ở 420nm). Khoảng tuân theo định luật Lamber - Beer là 0,25 µg/ml đến 2,5 µg/ml [2,12,75]. Cũng có thể xác định dạng Selen bằng phản ứng tao phức của Se(IV) với 2,3-diaminonaphtalen ở pH=1, sau đó phức đƣợc chiết vào dung môi cyclohexan và đo huỳnh quang ở 520 nm sau khi kích thích ở 380 nm (ở các dung dịch mà nồng độ Selen là quá nhỏ thì selen đƣợc làm giàu bằng phản ứng tạo phức với amino pyrolidin dithiocacbamat ở pH=4,2 và sau đó đƣợc giải chiết bằng HNO3) [2,12,75]. Phƣơng pháp cho phép xác định selen đến nồng cỡ nm. S. Forbes và CCS đã sử dụng phƣơng pháp ghi đo quang phân tử hợp chất phức màu của selen với 2,3-diaminonaphtalen để xác định hàm lƣợng Se trong đất và cây trồng [32]. Phƣơng pháp trắc quang đã xác định selen trong cây trinh nữ bằng cách chuyển các dạng selen về Se(VI) sau đó sử dụng thuốc thử triôxyazobenzen để tạo phức với Se(VI) hấp thụ mật độ quang của phức tại bƣớc sóng λ= 610 nm [11]. Phƣơng pháp trắc quang cho độ tin cậy cao, thực hiện rất nhanh, thuận lợi, trang thiết bị đơn giản và tự động hóa, tuy nhiên bên cạnh đó còn một số mặt hạn chế ở phƣơng pháp này là độ chính xác không cao, không loại đƣợc ảnh hƣởng của nền mẫu nên không thể dùng phƣơng pháp này phân tích hàm lƣợng selen 11