Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene kháng nguyên độc tố không bền nhiệt LTa của E. coli trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) và tối ưu các điều kiện biểu hiện

Chia sẻ: Xedapbietbay Xedapbietbay | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:77

Thêm vào BST

Báo xấu

55
lượt xem 9
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu chung của đề tài là nghiên cứu phân lập gene eltA , tạo dòng, biểu hiện và khảo sát điều kiện thích hợp để sản xuất số lượng lớn kháng nguyên tái tổ hợp LTa, làm cơ sở cho việc sản xuất và ứng dụng kháng thể đặc hiệu trong việc phòng trừ bệnh tiêu chảy do E. coli gây ra ở lợn con sau cai sữa.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene kháng nguyên độc tố không bền nhiệt LTa của E. coli trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) và tối ưu các điều kiện biểu hiện

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu, các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác. Tác giả luận văn Hoàng Thị Thùy Nhung PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Đinh Thị Bích Lân, Nguyên Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện hóa chất, thiết bị, cũng như kinh phí để giúp tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể Bộ môn Miễn dịch học và Vắc xin - Viện Công nghệ sinh học và đặc biệt là Th.S Đặng Thanh Long, Th.S Lê Quốc Việt, đã chỉ bảo, giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá trình thực nghiệm cũng như chia sẽ những kinh nghiệm chuyên môn. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc chuyên ngành Thú Y – Khoa Chăn nuôi Thú y, các thầy cô giáo của Phòng đào tạo sau đại học, Trường Đại học Nông Lâm Huế cùng với Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học – Đại học Huế đã chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi học tập cũng như hoàn thành đề tài nghiên cứu. Công trình này được hoàn thành với kinh phí từ đề tài cấp Đại học Huế do BSTY. Lê Công Thịnh – Bộ môn Miễn dịch học và Vắc xin - Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Huế làm chủ nhiệm: “Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gen độc tố không chịu nhiệt và độc tố chịu nhiệt, tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vắc xin phòng bệnh do E. coli ở lợn”. Mã số: DHH2016-15-05. Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn đặc biệt tới gia đình, người thân và bạn bè đã giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn! Huế, ngày 20 tháng 05 năm 2016 Tác giả luận văn Hoàng Thị Thùy Nhung PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
iii TÓM TẮT Tiêu chảy là một bệnh gây thiệt hại kinh tế không nhỏ cho ngành chăn nuôi, đặc biệt là trong chăn nuôi lợn. Trong các nguyên nhân gây nên tiêu chảy ở lợn, vi khuẩn E. coli với các yếu tố độc lực của nó đóng vai trò vô cùng lớn. Độc tố LTa là một độc tố đường ruột do E. coli tiết ra, có tác dụng kích thích lớp niêm mạc bên dưới biểu mô ruột tiết ion Cl vượt quá mức bình thường và ngăn cản sự hấp thu NaCl, kéo theo sự di chuyển thụ động của nước từ tế bào vào lòng ruột, gây tiêu chảy. Nghiên cứu phân lập gen eltA , tạo dòng, biểu hiện và khảo sát điều kiện thích hợp để sản xuất số lượng lớn kháng nguyên tái tổ hợp LTa, là cơ sở cho việc sản xuất và ứng dụng trong việc phòng trừ bệnh tiêu chảy do E. coli gây ra ở lợn con sau cai sữa. Trong nghiên cứu này, đoạn gen eltA mã hóa cho kháng nguyên LTa được tạo dòng vào plasmid pGEM®-T easy và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli TOP10. Thể biến nạp được sàng lọc trên thạch đĩa LB+Ampicilin+IPTG+Xgal. Những khuẩn lạc có màu trắng chứng tỏ phản ứng gắn tạo dòng đã thành công, đoạn gene mong muốn đã được chèn vào vector tạo dòng, những khuẩn lạc màu xanh là âm tính. Tách chiết plasmid từ các dòng khuẩn lạc dương tính, chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu của gene eltA và cặp mồi M13 (được thiết kế sẵn trên vector pGEM®-T easy). Tiến hành giải trình tự nucleotid và trình tự amino acid, so sánh với trình tự đã công bố trên ngân hàng Gene. Tinh sạch ADN từ gel agarose 1% (từ sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu gene eltA). ADN tinh sạch được gắn vào vector biểu hiện pET200/D-TOPO và biến nạp vào vi khuẩn E. coli BL21(DE3). Tìm điều kiện tối ưu về môi trường nuôi cấy, mật độ tế bào ban đầu, nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ IPTG, thời gian biểu hiện trong biểu hiện etlA. Sản phẩm của biểu hiện này được kiểm chứng bằng điện di biến tính trên gel polyacrylamid (SDS - PAGE). Kết quả: đã tạo dòng thành công gene eltA trong vi khuẩn E. coli TOP10, chứng minh được sự biểu hiện gen eltA bằng phương pháp SDS - PAGE; Tìm được các điều kiện tối ưu trong biểu hiện eltA: môi trường nuôi cấy YJ; mật độ tế bào ban đầu OD600 0,8; nhiệt độ nuôi cấy 250C; nồng độ IPTG là 0,8 mM; thời gian nuôi cấy 6 giờ. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. ii TÓM TẮT...................................................................................................................... iii MỤC LỤC ......................................................................................................................iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................... vii DANH MỤC CÁC BẢNG .............................................................................................ix DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................... x MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ....................................................................................................................1 2. Mục đích của đề tài ......................................................................................................2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ....................................................................................2 1) Ý nghĩa khoa học: .......................................................................................................2 2) Ý nghĩa thực tiễn: ........................................................................................................2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ........................................3 1.1. VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI ..........................................................................3 1.1.1. Hình thái ................................................................................................................3 1.1.2. Đặc tính nuôi cấy ...................................................................................................3 1.1.3. Đặc tính sinh hóa ...................................................................................................4 1.1.4. Phân loại ................................................................................................................4 1.1.5. Sức đề kháng .........................................................................................................4 1.1.6. Các yếu tố độc lực cơ bản của E. coli ...................................................................5 1.1.7. Vai trò của vi khuẩn E. coli trong hội chứng tiêu chảy ở lợn ............................. 17 1.2. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ GENE ĐỘC TỐ LT CỦA VI KHUẨN E. COLI ...17 1.2.1. Những nghiên cứu ở trong nước..........................................................................17 1.2.2. Những nghiên cứu trên thế giới ...........................................................................18 1.3. TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GENE TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN E. COLI ..19 1.3.1. Chủng E. coli TOP10 .......................................................................................... 22 1.3.2. Chủng E. coli BL21 (DE3) ..................................................................................22 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
v 1.3.3. Hệ thống vector tạo dòng pGEM®-T easy........................................................... 23 1.3.4. Hệ thống vector biểu hiện pET ............................................................................25 1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN CỦA GENE TÁI TỔ HỢP TRONG TẾ BÀO VẬT CHỦ ........................................................................27 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 29 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ......................................................29 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................... 29 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ............................................................................................. 29 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................................................29 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................29 2.3.1. Thu thập mẫu phân lợn tiêu chảy ........................................................................29 2.3.2. Tách chiết ADN tổng số ......................................................................................30 2.3.3. Phân lập gene eltA bằng phản ứng PCR .............................................................. 30 2.3.4. Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gene ..................................................32 2.3.5. Biểu hiện gen trong vector pET200/D-TOPO .....................................................34 2.3.6 Điện di SDS- PAGE ............................................................................................. 35 2.3.7. Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp ...36 2.3.8. Nghiên cứu Ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp ....................................................................................... 36 2.3.9. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng biểu hiện của kháng nguyên LTa ....................................................................................................................38 2.3.10. Phương pháp sắc ký lọc gel bằng cột Ni-NTA..................................................39 2.3.11. Xử lí thống kê ....................................................................................................39 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................................40 3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ VI KHUẨN E. COLI ................40 3.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP GENE eltA BẰNG PHẢN ỨNG PCR ............................ 40 3.3. KẾT QUẢ TẠO DÒNG GENE eltA VÀO VECTOR PGEM®-T EASY VÀ BIẾN NẠP VÀO TẾ BÀO VẬT CHỦ E. COLI TOP10 ........................................................ 41 3.4. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GENE eltA .............................................................. 43 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
vi 3.5. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN GENE eltA MÃ HÓA TẠO KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LTa TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN E. COLI BL21 (DE3) .................................45 3.6. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG E. COLI BL21 (DE3) TÁI TỔ HỢP ............................................................................................ 47 3.7. KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA CHỦNG E. COLI BL21 (DE3) TÁI TỔ HỢP ...................................48 3.7.1. Ảnh hưởng của các môi trường khác nhau .......................................................... 48 3.7.2. Ảnh hưởng của các tỷ lệ tiếp giống khác nhau ...................................................49 3.7.3. Ảnh hưởng của các tốc độ lắc khác nhau ............................................................ 49 3.8. KẾT QUẢ ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN CỦA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP LTa TRONG CHỦNG E. COLI BL21(DE3) ....................................................................................................................51 3.8.1. Kết quả thăm dò thời gian cảm ứng tối ưu .......................................................... 51 3.8.2. Kết quả thăm dò nồng độ chất cảm ứng IPTG tối ưu ..........................................51 3.8.3. Kết quả thăm dò thành phần các môi trường tối ưu ............................................52 3.8.4. Kết quả thăm dò thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu ....................................53 3.8.5. Kết quả thăm dò nhiệt độ cảm ứng tối ưu ........................................................... 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................................... 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 57 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
vii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT µl Microliter 6xHis Homooligohistidine APS Ammonium persulphate Bp Cặp bazơ (Base pair) BSA Bovine serum albumin Cs Cộng sự DAEC E. coli bám dính phân tán (Diffusely adherent Escherichia coli) AND Deoxyribonucleic acid Dntp Deoxyribonucleotid EAEC E. coli đường ruột (Enteroaggregative Escherichia coli) EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Acid EHEC E. coli gây xuất huyết ruột (Enterohaemorrhagic Escherichia coli) EIEC E. coli xâm nhập ruột (Enteroinvasive Escherichia coli) EPEC E. coli gây bệnh đường ruột (Enteropathogenic Escherichia coli) ETEC E. coli sinh độc tố ruột (Enterotoxigenic Escherichia coli) IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid kDa Kilo Dalton LB Luria-Broth LT Độc tố không chịu nhiệt (Labile toxin) MAEC E. coli gây viêm màng não (Meningitidis-associated Escherichia coli) Ml Milliliter mM Millimol nm Nanometer OD Mật độ quang (Optical density) PCR Chuỗi phản ứng trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SOB Super Optimal Broth PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
viii SOC Super Optimal broth ST Độc tố chịu nhiệt (Stabile toxin) TAE Tris-acetate-EDTA Taq Thermus aquaticus TB Terrific Broth TE Tris EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine TNE Tris HCL-NaCl-EDTA UPEC E. coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu (Uropathogenic Escherichia coli) VT Độc tố gây độc tế bào Vero (Verocytocin) YJ Yang Jijian PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. So sánh hệ thống tế bào vật chủ trong sản xuất protein tái tổ hợp ...............20 Bảng 1.2. Thành phần chính của plasmid pGEM®-T easy...........................................25 Bảng 2.1. Trình tự nucleotid của cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA ................................ 31 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR phân lập gene eltA của E. coli .......................... 31 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn .............................................................................33 Bảng 2.4. Công thức gel polyacrylamide 15% .............................................................. 35 Bảng 3.1. Sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên LTa ở các môi trường khác nhau ......................................................................48 Bảng 3.2. Sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên LTa ở các tỷ lệ tiếp giống khác nhau ................................................................ 49 Bảng 3.3. Sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên LTa ở các tốc độ lắc khác nhau ........................................................................50 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
x DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. E. coli ..............................................................................................................3 Hình 1.2. Cấu trúc của độc tố LT ....................................................................................6 Hình 1.3. Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố LT ................................................................ 7 Hình 1.4. Cấu trúc bậc 1 của độc tố ST ...........................................................................8 Hình 1.5. Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố STa .............................................................. 9 Hình 1.6. Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố STb ............................................................ 10 Hình 1.7. Cấu trúc bậc 1 của độc tố EAST1 .................................................................11 Hình 1.8. Cơ chế tác động của độc tố VT .....................................................................13 Hình 1.9. Cấu trúc kháng nguyên O .............................................................................14 Hình 1.10. Cơ chế biểu hiện của hệ thông pET trong tế bào E. coli BL21 (DE3) .......22 Hình 1.11. Trình tự và cấu trúc vector pGEM®-T easy.................................................24 Hình 1.12. Cấu trúc Vector pET200/D-TOPO .............................................................. 26 Hình 1.13. Tương tác giữa protein dung hợp chứa 6xHis và giá thể gắn Nikel ...........26 Hình 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ................................................................ 31 Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm về khả năng sinh trưởng của E. coli tái tổ hợp .................37 Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tối ưu sự biểu hiện của các kháng nguyên LTa ................38 Hình 2.4. Sơ đồ Tinh chế protein dung hợp với thể 6xHis trên hệ thống cột sắc ký ái lực Ni-NTA....................................................................................................................39 Hình 3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số từ vi khuẩn E. coli .....................................40 Hình 3.2. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA trên gel agarose 1%. ..............................................................................................................40 Hình 3.3. Kết quả biến nạp trên môi trường chọn lọc ...................................................41 Hình 3.4. Ảnh điện di sản phẩm plasmid từ các dòng dương tính và kết quả PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gene eltA từ khuôn mẫu ADN plasmid tái tổ hợp thu được trên gel agarose 1%. ..............................................................................................................42 Hình 3.5. Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi M13 trên gel agarose 1%. .......................................................................................................................................43 Hình 3.6. Mức độ tương đồng giữa gene eltA do nhóm đề tài phân lập với gene eltA đã được công bố (K01995.1 ) ............................................................................................. 44 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
xi Hình 3.7. Mức độ tương đồng của trình tự amino acid của kháng nguyên LTa do nhóm đề tài phân lập và kháng nguyên LTa đã được công bố (AEE59980.1) ....................... 45 Hình 3.8. Kết quả biến nạp trên môi trường chọn lọc LB đặc + kanamycin 100 µg/ml. .......................................................................................................................................46 Hình 3.9. Ảnh điện di thăm dò khả năng biểu hiện của kháng nguyên tái tổ hợp LTa và khả năng liên kết giữa đuôi 6xHis với phối tử Ni2+ trên gel SDS – PAGE 15%. ........47 Hình 3.10. Đường cong sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên LTa .........................................................................................................47 Hình 3.11. Ảnh điện di thăm dò thời gian cảm ứng biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel 15%. ..........................................................................................................51 Hình 3.12. Ảnh điện di thăm dò nồng độ chất cảm ứng IPTG lên biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel 15%. .............................................................................52 Hình 3.13. Ảnh điện di thăm dò thành phần các môi trường tối ưu lên biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel 15%.. ..............................................................................53 Hình 3.14. Ảnh điện di thăm dò thời điểm bổ sung chất cảm ứng tối ưu lên biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel SDS 15% ........................................................... 54 Hình 3.15. Ảnh điện di thăm dò nhiệt độ cảm ứng tối ưu lên biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp LTa trên gel SDS 15%. .................................................................................55 PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Tiêu chảy ở lợn con luôn là mối lo đối với người chăn nuôi, không những làm giảm tăng trọng, giảm tỉ lệ nuôi sống, mà còn dễ dàng làm xuất hiện các bệnh kế phát và làm giảm hiệu quả kinh tế. Bệnh do nhiều nguyên nhân gây ra, trong đó vai trò của E. coli là quan trọng nhất, chiếm tỷ lệ cao nhất trong số các vi khuẩn đường ruột gây tiêu chảy (Đào Trọng Đạt và cs, 1996). Vi khuẩn E. coli gây bệnh thông qua các yếu tố độc lực mà bản thân chúng có. Phần lớn các chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh đường ruột (ETEC) được phân lập từ lợn tiêu chảy có khả năng sản sinh một hoặc nhiều yếu tố bám dính bám vào thụ thể trên bề mặt biểu mô ruột như F4, F5, F6, F18 và F41; và một hay nhiều độc tố ruột (enterotoxin), bao gồm độc tố chịu nhiệt (STa, STb, EAST1) và độc tố không chịu nhiệt (LT) (Gyles and Faibrother, 2010). Độc tố không chịu nhiệt ( Labile toxin) là một protein có tính kháng nguyên cao, quyết định tới khả năng gây tiêu chảy của ETEC. LT do một plasmid mã hóa, có liên quan đến độc tố tả (CT) (Guidry và cs, 1997). LT bao gồm một tiểu đơn vị A có khối lượng 25 kDa và 5 tiểu đơn vị B, mỗi đơn vị có khối lượng 11,5 kDa. Sau khi phần B giúp độc tố bám vào tế bào biểu mô ruột thì phần A được đẩy vào bên trong tế bào, làm hoạt hóa enzyme adenylate cyclase. Khi enzyme adenylate cyclase hoạt hóa thì AMPc vòng nội bào tăng lên dẫn đến ức chế hấp thu Na+ ở tế bào niêm mạc ruột, tăng bài tiết Cl- vào lòng ruột, làm cho áp lực thẩm thấu trong lòng ruột tăng nhanh. Hậu quả là một lượng lớn nước từ trong tế bào được kéo ra ngoài lòng ruột để cân bằng áp lực thẩm thấu giữa trong và ngoài tế bào, gây tiêu chảy. (Giannella và cs, 1974). Trong thực tế hiện nay, việc phòng trị tiêu chảy do E. coli chủ yếu dựa vào thuốc kháng sinh, liệu pháp này đang bộc lộ những hạn chế như hiện tượng đề kháng kháng sinh và có thể ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng. Nghiên cứu tìm kiếm một chế phẩm sinh học trong chẩn đoán và phòng trị tiêu chảy trên lợn do E. coli là hết sức cần thiết. Xuất phát từ tình hình đó, tôi tiến hành đê tài: "Nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene kháng nguyên độc tố không bền nhiệt LTa của E. coli trong tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3) và tối ưu các điều kiện biểu hiện". Đây là bước quan trọng cho nghiên cứu tiếp theo nhằm mục đích sản xuất kháng thể đặc hiệu để phục vụ trong công tác phòng tránh dịch bệnh tiêu chảy do E. coli gây ra ở lợn. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
2 2. Mục đích của đề tài Nghiên cứu phân lập gene eltA , tạo dòng, biểu hiện và khảo sát điều kiện thích hợp để sản xuất số lượng lớn kháng nguyên tái tổ hợp LTa, làm cơ sở cho việc sản xuất và ứng dụng kháng thể đặc hiệu trong việc phòng trừ bệnh tiêu chảy do E. coli gây ra ở lợn con sau cai sữa. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1) Ý nghĩa khoa học: Trong những năm gần đây, kháng nguyên tái tổ hợp đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và ứng dụng ở một số nước trên thế giới, nhưng ở Việt Nam hầu như có rất ít nghiên cứu được thực hiện. Kết quả nghiên cứu sẽ giúp chúng ta có thể chủ động sản xuất một lượng lớn protein kháng nguyên tái tổ hợp LTa theo mong muốn tạo nguồn nguyên liệu cho nhiều hướng ứng dụng khác nhau. 2) Ý nghĩa thực tiễn: - Nội dung nghiên cứu của đề tài giúp chúng ta tiếp cận và ứng dụng được các kỹ thuật hiện đại của Công nghệ sinh học. - Các kết quả này sẽ là cơ sở cho phép nghiên cứu tạo các vaccine tái tổ hợp hoặc sản xuất kit chẩn đoán để phục vụ trong công tác phòng tránh dịch bệnh tiêu chảy do E. coli gây ra ở lợn. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI Vi khuẩn E. coli được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1885 do nhà khoa học người Đức Theodore Escherich phân lập được từ phân của một bệnh nhân nhi (Neil và cs, 1994). 1.1.1. Hình thái Là trực khuẩn ngắn, kích thước 2 - 3 × 0,6 μm, hiếu khí và yếm khí tùy tiện. Vi khuẩn bắt màu gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu. Một số chủng E. coli có khả năng di động do có lông ở xung quanh thân (Nguyễn Như Thanh và cs, 1997). 1.1.2. Đặc tính nuôi cấy Hình 1.1. E. coli (Nguồn: Internet) E. coli phát triển tốt trên các loại môi trường thông thường với phổ nhiệt khá rộng ( 5-400C) và hình thành nên những khuẩn lạc điển hình có thể phân biệt được với các vi khuẩn khác (Nguyễn Như Thanh và cs, 1997). Ở 370C, E. coli phát triển nhanh, khoảng cách thế hệ khoảng 20-30 phút. - Môi trường thạch thường: hình thành những khuẩn lạc dạng S tròn, ướt, bóng láng không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2 - 3mm. Nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R và M. - Môi trường thạch máu: khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu xám nhạt, một số chủng có khả năng gây dung huyết. - Môi trường nước thịt: phát triển rất nhanh, tốt, môi trường đục đều có lắng cặn màu tro nhạt dưới đáy, đôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân thối. - Môi trường MacConkey: khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường. - Môi trường CT-SMAC: khuẩn lạc tròn nhỏ, hơi lồi, rìa gọn, màu hồng cánh sen (lên men đường Sorbitol) hoặc màu trắng đục (không lên men đường Sorbitol). - Môi trường Simmon citrate: khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục. - Môi trường Endo, SS: khuẩn lạc màu đỏ. - Môi trường EMB: khuẩn lạc màu tím đen. PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
4 1.1.3. Đặc tính sinh hóa - Vi khuẩn E. coli lên men sinh hơi các loại đường Lactose, Fructose, Glucose, Levulose, Galactose, Xylose, Manitol; lên men không chắc chắn các loại đường Duncitol, Saccarose và Salixin. Hầu hết các chủng vi khuẩn E. coli đều lên men đường Lactose nhanh và sinh hơi, đây là đặc điểm quan trọng để dựa vào đó phân biệt vi khuẩn E. coli và Samonella. - Phản ứng Indol, Catalase và MR dương tính; phản ứng H2S, VP, Urea, Oxidase, Citrat âm tính. - Đặc tính khác: Vi khuẩn làm đông vón sữa sau 24 - 72 giờ nuôi cấy ở 370C; không làm tan chảy gelatin (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2012). 1.1.4. Phân loại + Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E. coli được chia thành các type huyết thanh. Với sự tổ hợp của các yếu tố kháng nguyên O, K và H sẽ có rất nhiều type huyết thanh khác nhau (Lior, 1996). + Dựa vào vị trí gây bệnh các E. coli có khả năng gây bệnh ở người được chia thành 2 nhóm: thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC-intestinal pathogenic E. coli) hay E. coli gây tiên chảy (DEC-Dierrheagenic E. coli), thứ hai là nhóm gây bệnh ngoài đường ruột (ExPEC-extraintestinal pathogenic E. coli) (Kaper và cs, 2004). - Các loại E. coli gây bệnh đường ruột (IPEC) đã được biết gồm:  EPEC (Enteropathogenic Escherichia coli): E. coli gây bệnh đường ruột  ETEC (Enterotoxigenic Escherichia coli): E. coli sinh độc tố ruột  EIEC (Enteroinvasive Escherichia coli): E. coli xâm nhập ruột  EAEC (Enteroaggregative Escherichia coli): E. coli bám dính kết tập ruột  DAEC (Diffusely adherent Escherichia coli): E. coli bám dính phân tán  EHEC (Enterohaemorrhagic Escherichia coli): E. coli gây xuất huyết ruột - Hai loại E. coli gây bệnh ngoài đường ruột quan trọng nhất là:  MAEC (Meningitidis-associated Escherichia coli): E. coli gây viêm màng não  UPEC (Uropathogenic Escherichia coli): E. coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu 1.1.5. Sức đề kháng Vi khuẩn E. coli bị bất hoạt khi đun 50°C trong 1giờ, 60°C trong 30 phút và chết ngay ở 100°C. Dễ bị tiêu diệt với các thuốc sát trùng thông thường (formol 0,2%, axít phenic, biclorua thủy ngân, hydroperoxit 1‰ diệt vi khuẩn sau 5 phút) (Nguyễn Như Thanh và cs, 1997). PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
5 1.1.6. Các yếu tố độc lực cơ bản của E. coli 1.1.6.1. Giáp mô Bản chất hóa học là polysaccharide mang tính acid, chúng tạo ra trên bề mặt vi khuẩn điện tích âm gây nên một lực hút với lớp màng trong tế bào biểu mô ruột mang điện tích dương. Hiện tượng trên giúp cho vi khuẩn bám dính, xâm nhập tế bào vật chủ một cách thuận lợi. Giáp mô còn được coi là một yếu tố bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào bằng cách ngăn trở quá trình hoạt hóa bổ thể, đặc biệt là thành phần bổ thể C3b. 1.1.6.2. Thành tế bào Lipopolysaccharide (LPS) và protein màng ngoài của E. coli là các yếu tố làm tăng độc lực của vi khuẩn. Lipid A (một thành phần của LPS) kích thích tế bào đại thực bào và một số tế bào khác sản sinh các hoạt chất sinh học thuộc nhóm cytokine gây nên những biến đổi đáng kể ở cơ thể vật chủ. Protein màng ngoài tế bào vi khuẩn E. coli liên quan đến khả năng đề kháng với hoạt động diệt khuẩn của huyết thanh. 1.1.6.3. Yếu tố kháng khuẩn Nhiều chủng vi khuẩn E. coli có khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn, có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác, gọi là ColicinV. Vì vậy, yếu tố này cũng được coi là một trong các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli gây bệnh (Smith.H.W và Halls.S, 1967). 1.1.6.4. Độc tố đường ruột (Enterotoxin) Các chủng ETEC có khả năng sản sinh hai loại độc tố đường ruột: Độc tố không bền nhiệt (heat labile enterotoxin - LT) và độc tố bền nhiệt (heat stable enterotoxin - ST).  Độc tố không bền nhiệt (LT) Độc tố LT có trọng lượng phân tử cao, tác động kích thích lên niêm mạc ruột, ảnh hưởng đến quá trình trao đổi nước và chất điện giải. Kết quả là làm xung huyết niêm mạc ruột, tăng tính thấm thành mạch, hút nước từ mạch quản vào lòng ruột gây ra tiêu chảy. * Cấu trúc của độc tố LT: Độc tố LT gồm 1 tiểu đơn vị A (A-subunit) với 240 axít amin và 5 tiểu đơn vị B (B-subunit) với 103 axít amin (hình 1.2). Tiểu đơn vị A mang hoạt tính enzyme của độc tố và gồm 2 chuỗi peptide A1, peptide A2. Hai chuỗi peptide này liên kết nhau bởi cầu nối disulfide giữa A1- axit amin Cystein (Cys) 187 và A2-Cys199. Chuỗi A2 tạo thành cái móc liên kết không đồng hóa trị giữa tiểu đơn vị A và lỗ hổng giữa của vòng 5 tiểu đơn vị B. Năm tiểu phân tử B trong cấu trúc của LT sắp xếp thành vòng nhẫn 5 cạnh bền vững. Mỗi tiểu phân tử B có một vị trí gắn với thụ thể tiếp nhận độc tố của tế bào vật chủ (O’Bien và Holmes, 1996). PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
6 Quá trình sinh tổng hợp các tiểu phân tử của độc tố LT được thực hiện trong tế bào chất, sau đó được vận chuyển qua lớp màng trong (inner membrane) đến chu chất và quá trình hoàn thiện độc tố được thực hiện tại đây. Gene mã hóa cho tiểu đơn vị A và B của LT là eltA và eltB nằm trên plasmid và được phiên mã thành một mRNA đơn (O’Bien và Holmes, 1996). Sau khi quá trình sinh tổng hợp kết thúc, LT có thể được giải phóng ra môi trường bên ngoài hoặc chỉ giải phóng lên trên bề mặt tế bào vi khuẩn (Tauschek và cs, 1995). Hình 1.2. Cấu trúc của độc tố LT (Robert và cs, 2002) * Cơ chế tác động của độc tố LT: Sau khi bám lên các thụ thể tiếp nhận của tế bào biểu mô ruột, độc tố LT được chuyển qua màng và đi vào nội bào. Bên trong tế bào, độc tố di chuyển nhờ hệ thống vận chuyển của Golgi. Sau khi tiểu phân tử A và B phân cắt ở Golgi, tiểu phân tử A được chuyển đến màng lưới nội chất, tiểu phân tử B được tái sử dụng từ Golgi cho đến cuối endosome và lysosome. Theo Lencer, tiểu phân tử B cũng có thể là đơn vị vận chuyển cho tiểu phân tử A và sự phân cắt A-B chỉ xẩy ra khi gặp màng lưới nội chất. Tiểu phân tử B được gắn với lớp màng liên kết, di chuyển đến lớp màng basolateral và được chuyển ra khỏi tế bào (Lencer và cs, 1995). Đích của độc tố LT trong tế bào là enzyme Adenylate cyclase ở lớp màng ngoài của tế bào biểu mô ruột (Nataro và Kaper, 1998). Do đó, sau khi chuyển đến bào tương, chuỗi peptide A1 bám lên phức hợp protein Gsαβγ. Chuỗi peptide A1 có hoạt tính như enzyme ADP-ribosyltransferase chuyển phần ADP-ribosyl từ NAD đến protein của liên kết GTP (GTP-binding protein) là Gsα. Quá trình bám của GTP lên Gsα làm cho Gsα tách khỏi phức hợp protein Gsβγ và gây hoạt hóa enzyme Adenylate cyclase, làm gia tăng cAMP (cyclic adenosine monophosphate) trong tế bào. Vì vậy, PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
7 cAMP sẽ hoạt hóa enzyme cAMP-dependent protein kinase (A kinase) dẫn đến sự phosphoryl hóa kênh ion chloride (Cl-) ở màng tế bào biểu mô vượt quá mức bình thường. Kết quả dây chuyền là kích thích tế bào bên dưới tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thụ NaCl bởi những tế bào lông nhung. Hàm lượng ion Cl- trong lòng ruột gia tăng kéo theo sự di chuyển thụ động của nước từ tế bào vào lòng ruột, gây tiêu chảy (hình 1.3) (Nataro và Kaper, 1998). Hình 1.3. Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố LT (Bloch, 2006) Mặc dù sự kích thích của Cl- do sự gia tăng lượng cAMP trong tế bào là cách giải thích cổ điển về cơ chế gây tiêu chảy của độc tố LT. Tuy nhiên, ngày càng có nhiều bằng chứng cho thấy rằng đáp ứng tăng tiết đối với những độc tố này có cơ chế phức tạp hơn. Một cơ chế tác động khác của độc tố có liên quan đến prostaglandin E (PGE1 và PGE2) và yếu tố hoạt hóa tiểu cầu. Sự tổng hợp và phóng thích những chất chuyển hóa của axít arachidonic như prostaglandin và leukotriene có thể kích thích sự vận chuyển các chất điện giải và kích thích nhu động ruột. Cơ chế tác động khác thứ hai có liên quan đến hệ thần kinh ruột (enteric nervous system) điều hòa nhu động và sự tiết ion ở ruột (Nataro và Kaper, 1998).  Độc tố bền nhiệt (ST) ST có trọng lượng phân tử lớn hơn 90.000 dalton, có khả năng chịu được nhiệt độ 1000C trong 15 phút, bị phá huỷ nhanh khi hấp cao áp và bền vững ở nhiệt độ thấp. Độc tố chịu nhiệt (độc tố ST) là những đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ, được sản sinh bởi các chủng vi khuẩn thuộc nhóm ETEC. Độc tố ST được chia thành 2 nhóm là STa và STb, khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động (Sherman và cs, 1983). PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
8 * Cấu trúc độc tố ST: Độc tố STa là một peptide với trọng lượng phân tử khoảng 2 kDa với khoảng 18-19 axít amin. Trong đó, có 6 axít amin Cystein tạo thành 3 cầu nối disulfide bên trong cấu trúc phân tử của STa là Cys6 - Cys11, Cys7 - Cys15 và Cys10 - Cys18 (hình 1.4). Đầu tận cùng carbon (14 axít amin) chính là phần mang hoạt tính của độc tố. Độc tố STa có 2 biến thể là STp phát hiện trên các chủng ETEC phân lập được trên lợn và STh phát hiện trên các chủng ETEC phân lập ở người. Sự khác nhau giữa 2 biến thể chỉ xuất hiện ở đầu tận cùng N- với 4-5 axít amin (Nataro và Kaper, 1998). Hình 1.4. Cấu trúc bậc 1 của độc tố ST (Sukumar và cs, 1995). Tương tự độc tố STa, độc tố STb cũng là chuỗi polypeptide được sản sinh chủ yếu bởi các chủng vi khuẩn ETEC phân lập từ lợn (Nataro và Kaper, 1998). Độc tố STb gồm có 48 axít amin, trong đó có 4 axít amin Cystein tạo thành 2 cầu nối disulfide giữa Cys10 – Cys48 và Cys21 – Cys36. Gene mã hóa cho độc tố STa, STb lần lượt là estA và estB. Gene estA được tìm thấy chủ yếu trên plasmid cùng mang nhiều gene mã hóa các yếu tố độc lực khác của các chủng ETEC như yếu tố xâm nhiễm, kháng kháng sinh, sản sinh colicin (Nataro và Kaper, 1998). Tương tự, gene estB được tìm thấy trên plasmid cùng mang nhiều yếu tố độc lực khác như độc tố LT, STa, kháng kháng sinh, yếu tố xâm nhiễm. Độc tố ST được tổng hợp trong trong tế bào chất như là tiền polypeptide. Đoạn tiền peptide mang tín hiệu vận chuyển sẽ bị phân cắt khi chuỗi polypeptide vận chuyển từ tế bào chất đến periplasm thông qua hệ thống vận chuyển SecA. Trong periplasm, các cầu nối disulfide của độc tố sẽ được hình thành trước khi độc tố được giải phóng khỏi tế bào vi khuẩn qua hệ thống TolC dưới tác động của protein DsbA (periplasmic oxidoreductase protein) (Dubreuil và Daniel, 1997). * Cơ chế tác động của độc tố ST: - Độc tố STa: Sau khi được giải phóng ra khỏi tế bào vi khuẩn, độc tố STa bám vào các thụ thể tiếp nhận trên lớp tế bào lông nhung biểu mô ruột là enzyme Guanylate cyclase C (GC-C). Sự kết hợp này làm tăng hoạt tính của GC-C, do đó tăng lượng cGMP (cyclic guanosine monophosphate) nội bào (hình 1.5). Sự gia tăng nồng độ cGMP làm hoạt PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma
9 hóa PKGII (cGMP-dependent protein kinase II). PKGII sẽ tác động lên yếu tố điều khiển quá trình tiết và hấp thụ Cl- là CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) có mặt trên lớp màng lông nhung tế bào biểu mô ruột. Kết quả sự tương tác này là kích thích sự phosphoryl hóa kênh Cl- ở màng tế bào biểu mô vượt mức bình thường làm cho lớp tế bào bên dưới tăng tiết Cl- vào trong lòng ruột và/hoặc ngăn cản sự hấp thụ NaCl (Forte và cs, 1992). Hơn nữa, cGMP có khả năng ức chế PDE3 (phosphodiesterase 3) - đây là enzyme thủy phân cAMP. Vì thế, cAMP được tích lũy trong tế bào và gây hoạt hóa enzyme protein kinase A (PKA). Cùng với tác động của PKGII, PKA cũng có tác kích thích tăng tiết Cl- vào lòng ruột. Bên cạnh đấy, PKA ức chế quá trình tái hấp thụ Cl- thông qua kênh trao đổi ion NHE3 (Na+/H+ exchanger 3). Kết quả cuối cùng của quá trình này là sự tích lũy nước trong lòng ruột và gây tiêu chảy. Quá trình xâm nhập tế bào biểu mô ruột và gây tiêu chảy của STa xẩy ra rất nhanh. Độc tố STa kích thích giải phóng cGMP đạt nồng độ sau 5 phút. Tuy nhiên, quá trình này duy trì trong thời gian ngắn (Hitotsubashi và cs, 1992). Hình 1.5. Cơ chế gây tiêu chảy của độc tố STa (Michael Field, 2003) - Độc tố STb: STb cũng là độc tố tác động nhanh nhưng với cấp độ vừa phải. Tuy nhiên, cơ chế gây tiêu chảy của STb vẫn chưa được làm sáng tỏ. Bằng phương pháp thắt nút ruột non chuột, xác định được rằng STb không làm thay đổi nồng độ của cAMP và cGMP trên lớp tế bào biểu mô ruột (Hitotsubashi và cs, 1992). Năm 1995, Fujii và cs nhận thấy sự gia tăng nồng độ của PGE2 trong dịch ruột chuột có liên quan đến sự có mặt của STb. Hơn nữa, nồng độ PGE2 tương quan thuận với sự tích lũy chất lỏng trong lòng ruột. Nồng độ axít arachidonic và axít phosphatidic cũng được kích thích tăng dưới tác động của độc tố STb (Fujii và cs, 1995). PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterma