Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đặc điểm di truyền quần thể sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:78

Thêm vào BST

Báo xấu

40
lượt xem 10
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn cung cấp cơ sở khoa học cho các nhà quản lý cập nhật thông tin về hiện trạng di truyền của quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam và Kon Tum. Kết quả của luận văn là cơ sở khoa học giúp cho công tác bảo tồn và chọn giống có những chiến lược hợp lý trong công tác bảo tồn và phát triển bền vững loài sâm quý hiếm này của Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Đặc điểm di truyền quần thể sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ----o0o---- NGUYỄN THỊ HỒNG MAI ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) LUẬN VĂN THẠC SĨ Hà Nội - 2018
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ----o0o---- NGUYỄN THỊ HỒNG MAI ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM NGỌC LINH (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Nguyễn Thị Phương Trang Hà Nội - 2018
LỜI CẢM ƠN Luận văn được hoàn thành tại phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học và giúp đỡ tận tình của TS. Nguyễn Thị Phương Trang. Tác giả xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới sự hướng dẫn của cô. Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tác giả đã nhận được sự quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình về nhiều mặt của Ban lãnh đạo Viện ST & TNSV,cán bộ phụ trách đào tạo của Viện, của TS. Đặng Tất Thế, trưởng phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn. Chân thành cảm ơn các anh chị, bạn bè đồng nghiệp, ThS. Nguyễn Giang Sơn, TS. Hồ Thị Loan, TS. Phạm Thế Cường, ThS. Lê Thị Mai Linh đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, quan tâm, chỉ bảo những bước đi ban đầu trong lĩnh vực nghiên cứu khoa học. Cuối cùng, tác giả cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới những người thân trong gia đình đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Luận văn được hoàn thành từ nguồn kinh phí hỗ trợ từ đề tài hợp tác song phương của Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam do TS. Nguyễn Thị Phương Trang làm chủ nhiệm, mã số VAST.HTQT.Nga.10/15-16. Tác giả xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2018
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài này là do chính tôi thực hiện, các số liệu thu thập và kết quả phân tích trong đề tài là trung thực, đề tài không trùng với bất kỳ đề tài nghiên cứu khoa học nào. Những thông tin tham khảo trong khóa luận đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng. Ngày tháng năm 2018 Học viên thực hiện ( Ký và ghi rõ họ tên) Nguyễn Thị Hồng Mai
MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................ii MỤC LỤC ........................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU ................................................... v DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................vi DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................vii MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3 1.1.Giới thiệu về chi Sâm (Panax L.) .................................................................. 3 1.2. Tổng quan về sâm ngọc linh......................................................................... 3 1.2.1. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 3 1.2.2. Phân bố tự nhiên của cây sâm ngọc linh ................................................ 5 1.2.3. Tầm quan trọng, giá trị, thành phần hoá học của sâm ngọc linh.............. 5 1.2.4. Công trình nghiên cứu của loài sâm ngọc linh ....................................... 7 1.2.5. Hiện trạng của loài sâm ngọc linh ở Việt Nam....................................... 9 1.3. Phương pháp luận và cách tiếp cận........................................................... 10 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................................................... 16 2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 16 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .............................................................. 16 2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 16 2.3.1. Tách chiết DNA tổng số ....................................................................... 16 2.3.2. Lựa chọn mồi SSR.................................................................................... 17 2.3.3. Phân tích số liệu SSR ........................................................................... 18 2.3.4. Thiết kế mồi đọc trình tự .................................................................... 19 2.3.5. PCR khuếch đại gen ........................................................................... 20 2.3.6. Điện di trên gel agarose...................................................................... 21 2.3.7. Kiểm tra khả năng bắt cặp bằng BLAST .......................................... 21
2.3.8. Đọc trình tự gen .................................................................................. 21 2.3.9. Xây dựng cây phát sinh chủng loại ................................................... 21 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 23 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ............................................................. 23 3.2. Lựa chọn mồi SSR .................................................................................... 23 3.3. Kết quả phân tích SSR – đặc điểm di truyền quần thể sâm ngọc linh .... 25 3.4. Kết quả khuếch đại gen từ các cặp mồi đặc hiệu ................................ 30 3.5. Kết quả phân tích trình tự gen – đặc điểm phân tử của các vùng gen rbcL, rpoB, ITS và 18S của loài sâm ngọc linh. .............................................. 32 3.6. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của sâm ngọc linh với một số loài trong chi Panax trên cơ sở phân tích trình tự hai vùng gen rbcL, ITS - sơ đồ mối quan hệ di truyền của chúng. ........................................................... 47 3.7. Kết quả so sánh khả năng phân loại sâm ngọc linh đối với các loài chi Panax khác của ba vùng gen nghiên cứu. ....................................................... 50 3.8. Kết quả đăng ký mã số các vùng gen nghiên cứu trên ngân hàng gen .. 55 KẾT LUẬN......................................................................................................... 56 KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 57 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN CỦA TÁC GIẢ .................................................................................................... 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 59 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 65
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU AFLP Đa hình độ dài các đoạn DNA nhân chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism) bp base pair BLAST Basic Local Alignment Search Tool CBOL Consortium for the Barcode of Life DNA Deoxyribo Nucleic Acid ME Phương pháp Minimum Evolution Method MP Phương pháp Maximum Parasimony Method NJ Phương pháp Neighbor Joining PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) RAPD Đa hình các đoạn DNA khuyếch đại ngẫu nhiên (Random Amplified Polymorphic DNA) RFLP Đa hình độ dài các đoạn DNA giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism) SSR Trình tự lặp đơn giản (Simple Sequence Repeats) UPGMA Unweighted Pair Group Method Analysis VQG Vườn Quốc Gia
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Trình tự 11 cặp mồi SSR dùng cho phân tích đa dạng di truyền ...... 17 Bảng 2.2. Bảng trình tự 5 cặp mồi dùng trong khuếch đại và đọc trình tự gen. 20 Bảng 2.3: Danh sách các loài/thứ trên Genbank sử dụng trong nghiên cứu. .... 22 Bảng 3.1: Thông số đa dạng di truyền loài sâm ngọc linh dựa trên phân tích 4 chỉ thị SSR.............................................................................................. 26 Bảng 3.2. Kết quả so sánh các Nu sai khác trên vùng gen rbcL (gồm rbcLa và rbcLc) giữa sâm ngọc linh và các loài khác thuộc chi Panax. ....................... 37 Bảng 3.3. Khoảng cách di truyền gen rbcL giữa loài sâm ngọc linh (phía trên bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 loài /thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax. ........................................................... 44 Bảng 3.4. Khoảng cách di truyền gen rpoB giữa loài sâm ngọc linh ( phía trên bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 loài /thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax ............................................................ 44 Bảng 3.5. Khoảng cách di truyền vùng gen ITS giữa loài sâm ngọc linh ......... 45 (phía trên bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 loài /thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax ........................................... 45 Bảng 3.6. Khoảng cách di truyền mồi 18S giữa loài sâm ngọc linh (phía trên bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 loài /thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax. ........................................................... 46
DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh cây sâm ngọc linh 4 Hình 1.2: Hình ảnh hạt sâm ngọc linh khi chín 4 Hình 2.1. Bản đồ địa điểm thu mẫu sâm ngọc linh 15 Hình 3.1: Kiểm tra DNA tổng số bằng điện di trên gel agarose 1% 22 Hình 3.2. Một số hình ảnh alen ghi nhận khi phân tích SSR của 4 23 mồi PG - 29, PG - 668, PG -1419 và PG - 1481 Hình 3.3: Kiểm tra sản phẩm PCR gen ITS; rpoB; 18S bằng điện di 30 trên gel agarose 1% Hình 3.4: Kiểm tra sản phẩm PCR gen rbcLa; rbcLc bằng điện di 30 trên gel agarose 1%. Hình 3.5. Ví dụ về hình ảnh các peak trong giải trình tự 31 Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rbcLa với các loài 35 Panax trên ngân hàng gen. Hình 3.7. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rbcLc với các loài 36 Panax trên ngân hàng gen. Hình 3.8. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rpoB với các loài 39 Panax trên ngân hàng gen Hình 3.9. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen ITS với các loài 41 Panax trên ngân hàng gen Hình 3.10: Sơ đồ hình cây (NJ) mối quan hệ di truyền của sâm ngọc 48 linh với 9 loài khác trong chi Panax dựa trên phân tích trình tự vùng gen ITS và rbcL Hình 3.11. Thứ tự ghép nối các đoạn gen nghiên cứu 50 Hình 3.12. Kết quả so sánh phân loại chín loài chi Panax dựa trên so 53 sánh từng vùng gen (rpoB, rbcL, ITS) và sự kết hợp của chúng. Hình 3.13. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của chín loài thuộc chi 54 Panax phân tích dựa trên sự kết hợp trình tự gen rbcL và ITS.
MỞ ĐẦU Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) đã được xác định là một cây thuốc quý về giá trị sử dụng cũng như giá trị nguồn gen, được xếp vào một trong bốn cây sâm quý nhất trên thế giới do có chứa nhiều thành phần saponin, hàm lượng acid amin, các chất khoáng vi lượng hơn hẳn những loài sâm khác. Tuy nhiên, việc khai thác quá mức và phá hủy vùng phân bố tự nhiên đã dẫn đến sự tuyệt chủng ngoài tự nhiên của sâm ngọc linh. Hiện loài này chỉ còn tồn tại ở một số vườn trồng tại các khu bảo tồn của tỉnh Quảng Nam và Kon Tum. Sâm ngọc linh đã được đưa vào sách đỏ Việt Nam, danh lục của IUCN và Nghị định 32/2006/NĐ-CP của Chính phủ. Ngành Y tế đã hướng chọn sâm ngọc linh làm cây thuốc xây dựng sản phẩm quốc gia về dược liệu. Ngày 18/7/2012, chính phủ đã có Quyết định số 936/QĐ-TT phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển kinh tế - xã hội vùng Tây Nguyên đến năm 2020, trong đó phát triển cây sâm ngọc linh trở thành cây đặc sản quốc gia. Những nghiên cứu về di truyền quần thể giúp các nhà khoa học và các nhà chiến lược có cái nhìn tổng thể về thực trạng di truyền của các quần thể sâm ngọc linh, từ đó có những chiến lược hợp lý trong việc bảo tồn và phát triển bền vững loài sâm quý hiếm này của Việt Nam. Các nghiên cứu ở cấp độ phân tử còn giúp xác định được những sai khác về mặt di truyền của loài sâm ngọc linh so với các loài Panax khác, làm cơ sở cho việc phân loại và giám định các mẫu sâm ngọc linh. Xuất phát từ tình hình thực tế này, luận văn tập trung nghiên cứu đặc điểm di truyền của hai quần thể sâm ngọc linh thu tại Quảng Nam và Kon Tum, đồng thời kiểm tra sự sai khác di truyền của bốn vùng gen gồm hai vùng gen nhân: 18S, ITS và hai vùng gen lục lạp: rbcL và rpoB của mẫu sâm ngọc linh, so sánh với một số loài Panax khác. Mục tiêu cụ thể: - Xác định đặc điểm di truyền quần thể của hai quần thể sâm ngọc linh thu tại tỉnh Quảng Nam và Kon Tum. - Đánh giá mối quan hệ di truyền của sâm ngọc linh với một số loài Panax 1
khác trên cơ sở giải mã trình tự vùng gen rbcL, rpoB, 18S và ITS, đặc điểm phân tử của các vùng gen này, đồng thời so sánh khả năng phân loại của bốn vùng gen nói trên trong việc phân biệt loài sâm ngọc linh với một số loài Panax khác. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Luận văn cung cấp cơ sở khoa học cho các nhà quản lý cập nhật thông tin về hiện trạng di truyền của quần thể sâm ngọc linh tại Quảng Nam và Kon Tum. Kết quả của luận văn là cơ sở khoa học giúp cho công tác bảo tồn và chọn giống có những chiến lược hợp lý trong công tác bảo tồn và phát triển bền vững loài sâm quý hiếm này của Việt Nam. Kết quả của luận văn góp phần chọn lọc được vùng gen hữu hiệu (chỉ thị phân tử) cho công tác nghiên cứu khoa học và phân loại loài sâm ngọc linh của Việt Nam. Nội dung nghiên cứu - Lựa chọn mồi SSR phù hợp với loài sâm ngọc linh của Việt Nam. - Đánh giá đặc điểm di truyền của hai quần thể sâm ngọc linh thu tại tỉnh Quảng Nam và Kon Tum bằng kỹ thuật SSR. - Kiểm tra đặc điểm phân tử của bốn vùng gen rpoB, ITS, rbcL và 18S, so sánh khả năng phân loại của bốn vùng gen này trong việc phân biệt loài sâm ngọc linh của Việt Nam; đăng ký số hiệu genbank. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về chi Sâm (Panax L.) Chi sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae). Toàn bộ chi sâm (Panax L.) trên thế giới đã biết chắc chắn có 11 loài và 1 dưới loài (thứ -var.) [21]. Sự phân bố của chi Panax L. trên thế giới cho thấy chúng chỉ xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của Bắc Mỹ bao gồm bắc Hoa Kỳ và Tây Nam Canada (có 2 loài Panax quinquefolius và Panax trifoliatus). Vùng Đông Bắc Á có 2 loài Panax ginseng và Panax japonica. Trung tâm phân bố của chi Panax L. có thể từ vùng Tây Nam của Trung Quốc lan tỏa xuống phía Bắc của Việt Nam. Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân Nam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt Nam). Ở đây đang có tới 7 loài và thứ (dưới loài) mọc hoàn toàn tự nhiên. Hai loài nhập trồng là Panax notoginseng nhập từ Bắc Mỹ và Panax pseudoginseng (không tìm thấy trong hoang dại nhưng giả thiết có nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi nào đó). Đây có thể coi là trung tâm phân bố của chi sâm (Panax L.) của thế giới. Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài (Panax notoginseng; Panax quinquefolius và Panax trifoliatus). Giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi Panax L. là loài sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) ở miền Trung của Việt Nam, tại 14°15’ vĩ độ Bắc. Chính vì vậy sâm ngọc linh được coi là loài đặc hữu hẹp của miền Trung Việt Nam [12]. 1.2. Tổng quan về sâm ngọc linh 1.2.1. Đặc điểm hình thái Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)[36] là cây thân thảo, sống nhiều năm. Thân rễ có đường kính 3.5cm, không có rễ phụ dày dự trữ, đôi khi ở một số cây phần cuối thân rễ có củ gần hình cầu, đường kính đến 5cm. Thân cao từ 40 cm – 60 cm, rỗng, lá mọc vòng, thường có 4 (ít khi 3, 5, 6). Lá kép chân vịt có 5 (ít khi 6, 7) lá chét, lá dài 7 – 12 cm (ít khi 15 cm). Lá 3
chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8 – 14 cm, rộng 3 – 5 cm, đầu lá thường nhọn, mũi nhọn kéo 1.5 - 2cm, góc lá hình nêm, mép lá có răng cưa nhỏ đều [12], [14], [25] (Hình 1.1). Hình 1.1: Hình ảnh cây sâm ngọc linh (Ảnh chụp tại vườn Sâm Tac ngo, Nam Trà My, Quảng Nam - 2016) Sinh thái: Sâm ngọc linh mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với nhiệt độ ban ngày từ 20 - 25°C, ban đêm 15 - 18°C, sâm ngọc linh có thể sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm [25]. Công dụng: Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra cũng có thể dùng lá và rễ con [25]. Sinh học: Vào đầu tháng giêng hàng năm, cây sâm xuất hiện chồi mới sau mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành, từ tháng 4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả, tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài đến tháng 9. Khi quả chín, vỏ quả chuyển từ màu xanh sang vàng lục rồi đỏ cam với chấm đen lớn chiếm 1/4 đến 1/5 xuất hiện ở đỉnh quả (Hình 1.2). Hình 1.2: Hình ảnh hạt sâm ngọc linh khi chín (Ảnh chụp tại vườn Sâm Tac - ngo, Nam Trà My, Quảng Nam - 2016) 4
Vào khoảng cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng để lại một vết sẹo ở đầu củ sâm và bắt đầu giai đoạn ngủ đông đến tháng 12. Ngay trong quá trình tàn lụi, từ đầu mầm thân rễ nằm sát hoặc dưới mặt đất hình thành một chồi thân mới. Các chồi này tồn tại dưới dạng chồi ngủ trong suốt 3-4 tháng mùa đông và sẽ mọc lên vào mùa xuân năm sau để tiếp tục một chu trình sinh trưởng phát triển mới. Căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mà người ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi. Phải ít nhất từ 3 năm tuổi tức trên củ có một sẹo mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5 năm tuổi [2], [12]. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm. 1.2.2. Phân bố tự nhiên của cây sâm ngọc linh Cho đến nay, sâm ngọc linh mới chỉ phát hiện thấy ở cao nguyên trung phần, trong đó điểm phân bố tập trung vốn có và quan trọng nhất là núi Ngọc Linh. Cụ thể là ở các xã Tê Xăng, Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông; xã Mường Hoong, Ngọc Linh, huyện Đăk Glei (tỉnh Kon Tum) và xã Trà Cang, Trà Linh, Trà Nam, huyện Nam Trà My (tỉnh Quảng Nam) [12]. Cây sâm do Phạm Hoàng Hộ phát hiện ở núi Lang Biang (tỉnh Lâm Đồng) năm 1970 cũng là sâm ngọc linh. Như vậy, nếu tính về “tính nguyên thuỷ” của nó thì sâm ngọc linh đã có mặt ở 3 vùng núi khác nhau, tạm thời cho rằng thuộc 2 điểm phân bố (dãy Ngọc Linh và Lang Biang). Cả 2 khối núi này đều có độ cao trên 1.500 m. Điểm phát hiện có sâm ngọc linh mọc tự nhiên đều vào khoảng 1.800 - 2.200 m [5], [25], [21]. 1.2.3. Tầm quan trọng, giá trị, thành phần hoá học của sâm ngọc linh 1.2.3.1. Tầm quan trọng và giá trị của sâm ngọc linh Tất cả những loài thuộc chi Panax đều có giá trị làm thuốc, một số loài của chi này đã trở thành những cây thuốc nổi tiếng, không chỉ trong phạm vi của nền y học cổ truyền phương Đông mà trên toàn thế giới như nhân sâm (Panax ginseng); giả nhân sâm (Panax pseudoginseng); tam thất (Panax notoginseng) và sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) [6], [3], [9], [21]. Ở Việt Nam, ngay từ những năm kháng chiến chống 5
Pháp (1952 - 1953) nhiều cán bộ cách mạng hoạt động nằm vùng ở Quảng Nam đã được đồng bào chỉ cho cây thuốc này được coi như một thứ thần dược để phòng thân những khi đau yếu, dùng để chữa cho người đau ốm nặng, người bị rắn cắn và các bệnh thông thường như đau bụng, cầm máu vết thương,… [2], [3], [6], [11], [21]. Theo quan điểm hóa phân loại và dược lý học, những công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã chia các loài thuộc chi Panax thành 2 nhóm chính: Nhóm 1: gồm các loài hiện đã được phát triển trồng trọt gồm: nhân sâm (Panax ginseng), sâm mỹ (Panax quinquefolius), tam thất (Panax notoginseng),… có bộ phận dưới mặt đất là một rễ củ dạng cà rốt phát triển và chứa các Saponin có khung thuộc nhóm dammaran. Nhóm 2: gồm các loài mọc hoang như Panax japonicas, Panax zingiberensis, Panax stipuleanatus,… với bộ phận thân rễ dưới đất phát triển theo hướng nằm ngang, chứa Saponin có khung cấu tạo thuộc nhóm olean [3]. Từ năm 1985 đến năm 2000, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả, đặc biệt với các nhà khoa học Ba Lan, Nhật Bản đã cho thấy sâm ngọc linh có 52 hợp chất saponin, trong đó có 24 saponin đã được xác định là có cấu trúc hoàn toàn mới, lần đầu tiên được công bố. Khi so sánh với nhóm sâm trồng (nhóm 1) có giá trị trên thế giới như nhân sâm (Panax ginseng), sâm mỹ (Panax quinquefolius), tam thất (Panax notoginseng),… thì thành phần saponin của sâm ngọc linh rất giống với 3 loài nói trên, nhưng hàm lượng lại cao hơn nhiều [3], [11]. 1.2.3.2. Thành phần hóa học của sâm ngọc linh Từ năm 1974 – 1990, Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự đã nghiên cứu nhân sâm Việt Nam, so sánh với nhân sâm Triều Tiên (Panax ginseng), nhân sâm Nhật Bản (Panax japonicus) và nhân sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolium). Kết quả là bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKIM) đã phát hiện trong Panax vietnamensis 15 vết saponin có giá trị Rf (Rf: Hệ số di chuyển) và mầu sắc tương ứng với 12 hợp chất saponin của Panax ginseng [13]. Chi tiết hơn nữa, trong Panax vietnamensis có hàm lượng cao nhất saponin kiểu damarane 6
(7.58%), trong đó saponin thuộc diol và triol có tỷ lệ 32% và một lượng nhỏ saponin của axit oleanolic[13]. Điều này trái với quy luật chung là thông thường các cây nhân sâm cho thân rễ phát triển thì thường chứa lượng saponin của axit oleanolic và saponin nhóm damarane [8], [11]. Cũng là lần đầu tiên trên thế giới, người ta chiết được một lượng lớn majonozit R2 và ocotillol saponin trong cùng một loại Panax (chỉ riêng hai chất này đã chiếm 4.34%) gấp 43 lần hàm lượng majonozit và ocotillol saponin cao nhất có trong các loài chi Panax [16]. Ocotillol saponin đã trở thành một hợp chất cần chú ý có thể đưa thành tiêu chuẩn để phân loại hóa học vì nó có thể ảnh hưởng đến một số tác dụng mang tính đặc thù của Panax vietnamensis. Sự có mặt của damarane saponin kiểu ocotillol cũng còn làm cho sâm ngọc linh khác với nhân sâm Triều Tiên vì cho tới nay người ta chưa tìm thấy ocotillol trong nhân sâm Triều Tiên. Năm 1994, Nguyễn Minh Đức còn chứng minh nhân sâm của Việt Nam có hàm lượng saponin damarane cao nhất (12 - 15%) so với nhân sâm khác chỉ chứa 10% và số lượng saponin nhiều nhất (49%) so với 26% trong nhân sâm triều tiên [9]. Ngoài những saponin nói trên, trong nhân sâm của Việt Nam còn chứa các polyacetylen, axit béo, axit amin, gluxit, tinh dầu và một số yếu tố vi lượng [11]. Như vậy, sâm ngọc linh không những đặc biệt về mặt phân bố (là loài duy nhất có phấn bố tại 14°15’ vĩ độ Bắc, giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi Panax L.) mà còn độc đáo về cấu tạo hoá học bởi tuy là loài sâm thuộc nhóm 2 với bộ phận thân rễ thuộc dạng khí sinh, phát triển theo hướng nằm ngang nhưng thành phần hoá học lại chứa các saponin chủ yếu thuộc nhóm dammaran (giống các loài sâm của nhóm 1), đặc biệt hơn lại có chứa một số saponin đặc trưng mà các loài sâm khác trên thế giới không có. 1.2.4. Công trình nghiên cứu của loài sâm ngọc linh Ở Việt Nam, cho đến nay, các công trình khoa học nghiên cứu về sâm ngọc linh khá đa dạng, ngoài những nghiên cúu cơ bản tập trung vào điều tra, phân loại, xác định vùng phân bố thì cũng đã có nhiều nghiên cứu về 7
thành phần hoá học, thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan, giải mã hệ gen lục lạp…có thể liệt kê một số các công trình đáng chú ý như sau: - Trần Lê Quân và cs (2002): tách chiết, majonoside R2, Triterpen Saponin từ cây sâm việt nam (Panax vietnamensis) và thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan. Nghiên cứu cho thấy cao chiết MeOH của củ sâm việt nam có hoạt tính bảo vệ gan in vitro trên mô hình gây độc cho tế bào gan bằng D- galactosamine (D-GaLN)/yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-anpha) . Nguyễn Thị Thu Hương và cs (1999): nghiên cứu về tác dụng dược lý của sâm việt nam, trong đó tập trung vào tác dụng kích thích miễn dịch chống căng thẳng, trầm cảm [48], [5], [11], [18]. - Nguyễn Thới Nhâm và cs (1993) Nghiên cứu về dược liệu học và hoá học cây sâm Việt Nam [16]. - Loạt công trình của PGS.TS. Dương Tấn Nhựt (2010, 2011, 2014, 2015) về nhân giống vô tính Sâm ngọc linh [13], [14]. - Cụm công trình của Viện Dược Liệu trong khuôn khổ chương trình bảo tồn nguồn gen đã khoanh vùng được khu vực phân bố, đặc điểm sinh thái, hình thái, lập bản đồ quy hoạch vùng trồng sâm (các tác giả, Lê Minh Thảo [8], [18],…) - Phan Kế Long và cs (2014) đã sử dụng vùng gen ITS để đánh giá sự sai khác di truyền giữa loài sâm ngọc linh và mẫu sâm thu được tại Phong Thổ Lai Châu, cũng dựa trên trình tự gen matK và ITS, mẫu sâm thu tại Lai Châu đã được xác định tên khoa học là Panax vietnamensis var. fuscidiscus, là một thứ của loài Panax vietnamensis [9, 40]. - Nguyễn Thị Phương Trang và cs (2011) đã sử dụng vùng gen ITS để đánh gía mối quan hệ di truyền của loài sâm việt nam, sâm lai châu với các loài khác trong chi Panax [22]. Hay nhóm nghiên cứu của Đặng Tất Thế, Nguyễn Thị Phương Trang (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật) thực hiện một số hợp tác nghiên cứu với nhóm nghiên cứu của Viện sỹ Yuri Zhuralev và TS. Galina D. Reunova (Viện Sinh học thỗ nhưỡng Viễn Đông, 8
Viện Hàn Lân khoa học Liên Bang Nga) về phân bố và di truyền của loài sâm việt nam và sâm nga bằng kỹ thuật AFLP và SSR [34, 35]. - Trong đề tài nghiên cứu về đa dạng di truyền chi sâm, nhóm nghiên cứu của Trần Văn Tiến, Lê Ngọc Triệu, và cs (2016) đã thực hiện “Đánh giá di truyền quần thể loài tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai) bằng chỉ thị ISSR. Nhóm nghiên cứu của GS. Nông văn Hải (2017) (Viện nghiên cứu hệ gen-Viện Hàn Lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam) nghiên cứu về giải mã hệ gen lục lạp sâm ngọc linh. Nhóm nghiên cứu của TS. Lê Hùng Lĩnh (2017)-(Viện Di truyền Nông nghiệp) thực hiện nghiên cứu nuôi cấy mô và xác định gen lục lạp đặc hiệu của một số loài trong chi Panax. 1.2.5. Hiện trạng của loài sâm ngọc linh ở Việt Nam Ở Việt Nam cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có chắc chắn 5 loài, trong đó có 2 loài nhập trồng là tam thất (Panax notogineng) và nhân sâm (Panax ginseng) [5]. Ba loài mọc tự nhiên và đang là đối tượng bảo tồn là sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng) và đặc biệt sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) là loài đặc hữu hẹp của miền Trung Việt Nam, có phân bố tự nhiên ở các huyện Tu Mơ Rông, huyện Đăk Glei (tỉnh Kom Tum), huyện Nam Trà My, huyện Phước Sơn (tỉnh Quảng Nam), trên vùng núi Ngọc Linh độ cao trên 1500 m. Tuy nhiên, hiện tại loài này đã trở nên cực hiếm ngoài tự nhiên do tình trạng khai thác cạn kiệt trong nhiều năm cộng với việc đốt nương làm rẫy nên diện tích rừng tự nhiên bị thu hẹp. Hiện, sâm ngọc linh đã được đưa vào danh lục đỏ của IUCN (2003) và danh sách các loài hạn chế khai thác và sử dụng vì mục đích thương mại (Nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 31/03/2006 về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp quý hiếm), theo Sách đỏ Việt Nam (2007), sâm ngọc linh được xếp vào hạng EN Ala, c, d, BI + 2b, c, e [1]. Sâm ngọc linh chủ yếu tập trung tại 2 điểm bảo tồn là Chốt Sâm (xã Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum) và Trạm Dược Liệu Trà Linh (xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam) với tổng diện tích trồng 9
khoảng 10 hecta [6]. Tuy nhiên, với quyết định số 936/QĐ-TT ngày 18/7/2012 của thủ tướng chính phủ thì kế hoạch đến năm 2020, diện tích trồng sâm ngọc linh sẽ được tăng lên đến khoảng 200ha. 1.3. Phương pháp luận và cách tiếp cận Trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hoá, phân loại và đa dạng di truyền quần thể sinh vật. Phương pháp chủ yếu dựa trên kỹ thuật phân tích DNA, đặc biệt đối với lĩnh vực phân loại học và di truyền phân tử. Việc sử dụng các chỉ thị DNA để định danh loài đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu và đã có nhiều đóng góp, phát hiện đáng kể [10], [17], [22], [24], [27], [30], [40], [41], [42], [53]. Xác định loài bằng chỉ thị DNA có độ chính xác cao và đặc biệt hữu dụng với các loài gần gũi mà những quan sát hình thái, sinh trưởng, phát triển chưa đủ cơ sở để phân biệt. Vì thế chỉ trong vài thập kỷ, cơ sở dữ liệu gen (Genbank, 2007) của thế giới đã lưu giữ trên 70 triệu trình tự DNA với gần 90 tỷ nucleotide. Đây là nguồn dữ liệu có giá trị trong sinh học bảo tồn (Conservation biology) vì bốn lý do chính là: (1) số liệu về trình tự các nucleotide rất có giá trị trong việc xác định các đơn vị bảo tồn giúp cho đánh giá sắp xếp phân loại, nhất là bậc loài và dưới loài; (2) số liệu trình tự nucleotide đảm bảo độ chính xác cao nên tạo cơ sở khoa học tốt nhất cho bảo tồn đa dạng di truyền, nghiên cứu di truyền quần thể (population genetics), vì nó bộc lộ rõ các biến đổi di truyền ở trong và giữa các quần thể, giữa các cá thể, giữa các cha mẹ và con cái...; (3) kết quả phân tích DNA cho phép xác định chính xác loài, quần thể cho đến tận cá thể từ các mẫu vật không còn nguyên vẹn mà vẫn xác định thấy hiện tượng tạp lai giữa các loài, các quần thể địa lý…; và (4) kết quả nghiên cứu DNA không bị ảnh hưởng vào bất cứ yếu tố khách quan do môi trường hay con người gây ra [10]. Vì các giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử đang là công cụ hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa dạng di truyền, quan hệ chủng loại và mức độ tiến hoá của nhiều loài động thực 10
vật và vi sinh vật [37]. Các kết quả nghiên cứu ở mức độ DNA đã và đang góp phần đánh giá tính đa dạng sinh học, định hướng khoa học cho việc bảo tồn và khai thác một cách hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Sâm ngọc linh là loài dược liệu quý có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch và ngăn ngừa ung thư… Đến nay quần thể sâm ngọc linh tự nhiên bị khai thác mạnh mẽ, dẫn tới có nguy cơ cạn kiệt do nhu cầu sử dụng loại dược liệu này ngày càng cao. Công tác bảo tồn và phát triển bền vững loại dược liệu này ở Việt Nam trở nên cần thiết và cấp bách. Vì vậy, nghiên cứu đánh giá tính đa dạng di truyền, làm cơ sở cho công tác bảo tồn nguồn gen cho loài sâm ngọc linh cần được tập trung thực hiện. Bên cạnh đó, việc phát triển bộ mã vạch phân tử cũng cần được nghiên cứu để giúp góp phần phân loại/giám định chính xác sâm ngọc linh và các loài sâm khác thuộc chi nhân Sâm. 1.3.1 Phương pháp phân loại học phân tử 1.3.1.1. Ưu điểm của việc ứng dụng nghiên cứu phân tử trong phân loại học Một trong những phương pháp đáng tin cậy nhất hiện nay trong việc xác định mối quan hệ giữa các loài là phân tích trình tự DNA, bởi vật liệu di truyền là duy nhất cho mỗi cá thể bất chấp hình dạng ngoài của chúng và ít bị ảnh hưởng bởi tuổi, điều kiện sinh lý, yếu tố môi trường, thu hoạch, bảo quản và chế biến. DNA chiết từ bất cứ bộ phận nào đều mang cùng thông tin di truyền. DNA chiết thì ổn định và có thể giữ ở -20°C trong thời gian dài (khoảng 3-5 năm), do đó loại bỏ sự giới hạn về thời gian trong phân tích, đặc biệt chỉ cần sử dụng một lượng ít mẫu cũng có hiệu quả [8], [12], [26]. 1.3.1.2. Sử dụng hệ gen lục lạp trong nghiên cứu phân loại ở thực vật Lục lạp là bào quan nằm trong tế bào chất của thực vật và tảo (algae), chúng có chứa DNA riêng. DNA lục lạp có từ 102 – 104 bản sao trong mỗi tế bào. Lục lạp có chứa chất diệp lục (chlorophyl) và là nơi thực hiện quá trình quang hợp của cây. Hệ gen lục lạp thường được sử dụng cho phân loại ở thực vật do đặc tính di truyền theo dòng mẹ, không bị tái tổ hợp di truyền cho thế hệ sau và tốc độ đột biến cũng khá cao. Hệ gen lục lạp được các nhà phân loại 11