Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Hoàn thiện quy trình tinh chế huyết thanh kháng dại (SAR) bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:104

Thêm vào BST

Báo xấu

12
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học "Hoàn thiện quy trình tinh chế huyết thanh kháng dại (SAR) bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion" được thực hiện nhằm hoàn thiện quy trình tinh chế huyết thanh kháng dại để nâng cao chất lượng sản phẩm huyết thanh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Hoàn thiện quy trình tinh chế huyết thanh kháng dại (SAR) bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --------------------------- Nguyễn Phƣơng Vũ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TINH CHẾ HUYẾT THANH KHÁNG DẠI (SAR) BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2021
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --------------------------- Nguyễn Phƣơng Vũ HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TINH CHẾ HUYẾT THANH KHÁNG DẠI (SAR) BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC 1. TS. Dƣơng Hữu Thái 2. TS. Huỳnh Hoàng Nhƣ Khánh Hà Nội - 2021
L I CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận văn Th c s “Hoàn thiện quy trình tinh chế huyết thanh kháng dại (SAR) bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion”là công trình nghiên cứu của riêng cá nhân tôi và nh m nghiên cứu, không sao chép của ai. Do tôi và nh m nghiên cứu tự nghiên cứu, đọc, dịch tài liệu, tổng hợp và thực hiện. Nội dung lý thuyết trong luận văn tôi c sử dụng một số tài liệu tham khảo nhƣ đã trình bày trong phần tài liệu tham khảo. Các số liệu, chƣơng trình phần mềm và những kết quả trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trƣớc Học viện Khoa học và Công nghệ nếu phát hiện bất cứ sự sai ph m hay sao chép trong đề tài này! Hà Nội, ngày 22 tháng 11 năm 2021 Học viên Nguyễn Phƣơng Vũ
L I CẢM ƠN Đề tài đƣợc thực hiện t i Viện Vắc xin và Sinh ph m Y tế IV C , nơi làm việc, học tập và nghiên cứu của tôi. Viện đƣợc phân chia thành các phòng chức năng chuyên biệt nhƣ nghiên cứu, sản xuất, đ ng g i,… Trong thời gian thực hiện đề tài, tôi đã đƣợc trực tiếp tham gia học hỏi, thực hành nhiều giai đo n khác nhau của quy trình sản xuất huyết thanh kháng d i S R . Tôi cũng nhận đƣợc nhiều sự hỗ trợ từ cán bộ hƣớng dẫn và các anh chị em trong phòng Huyết thanh và phòng Ki m định. Tôi xin chân thành cảm ơn Viện trƣởng TS. Dƣơng Hữu Thái đã hƣớng dẫn và t o điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và làm luận văn t i Viện IV C. Tôi xin cảm ơn lãnh đ o, ban giám hiệu Học viện Khoa học và Công nghệ, phòng Đào t o và cùng toàn th các thầy cô khoa Công nghệ Sinh học đã t o điều kiện cho tôi hoàn thành tốt công việc nghiên cứu khoa học của mình. Cảm ơn phụ trách phòng Huyết thanh ThS. Dƣơng Tuấn Hiệp và cô TS. Huỳnh Hoàng Nhƣ Khánh, đã quan tâm, hỗ trợ kiến thức, tinh thần, giúp đỡ trong thiết kế và bố trí thí nghiệm cho tôi, cũng nhƣ phụ giúp tôi vào những ngày miệt mài viết luận văn. Đƣợc sự giúp đỡ nhiệt tình của mọi ngƣời, tôi đã hoàn thành luận văn đúng thời h n của Học viện. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình đã luôn hỗ trợ về vật chất và tinh thần trong suốt thời gian 2 năm học th c s qua. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng 11 năm 2021 Học viên Nguyễn Phƣơng Vũ
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT IVAC : Institute of Vaccines and Medical Biologicals WHO : World Health Organization SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis IgG : Immunoglobulin SE-HPLC : Size Exclusion High-Performance Liquid Chromatography SAR : Serum antirabique (huyết thanh kháng d i) CV : Column Volumn RNP : Ribonucleoprotein RIG : Rabies Immune Globulin PEP : Pre-exposure prophylaxis RNA : Ribonucleic acid
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1.Sự khác biệt của các d ng sắc ký trao đổi ion ................................. 22 ảng 2.1. Kết quả tiêu chu n chất lƣợng của lô 13.18 R............................. 32 ảng 2.2. Danh sách h a chất chính dùng trong tinh chế ............................... 33 ảng 2.3. Danh sách thiết bị và dụng cụ ......................................................... 33 ảng 3.1.Kết quả thử nghiệm dung dịch đệm 20mM Acetate + 50mM NaCl..... 49 ảng 3.2. Kết quả thử nghiệm dung dịch đệm 20mM Phosphate + 50mM NaCl... 51 ảng 3.3. Kết quả khả năng bám mẫu vào cột với n ng độ protein 4 mg ml của 3 lô thử nghiệm ......................................................................................... 55 ảng 3.4. Kết quả khả năng bám mẫu vào cột với n ng độ protein 6 mg ml của 3 lô thử nghiệm ......................................................................................... 56 ảng 3.5. Kết quả khả năng bám mẫu vào cột với n ng độ protein 8 mg ml của 3 lô thử nghiệm ......................................................................................... 56 ảng 3.6. Kết quả hàm lƣợng protein sau sắc ký của 3 mẫu .......................... 60 ảng 3.7. Kết quả tăng trọng trung bình của chuột trong thử nghiệm an toàn chung ............................................................................................................... 62 ảng 3.8. Kết quả ki m tra chất gây sốt của huyết thanh SAR tinh s ch bằng sắc ký ............................................................................................................... 62 ảng 3.9. Tiêu chu n chất lƣợng cơ sở đối với sản ph m huyết thanh kháng d i sau tinh s ch bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion................................. 64 ảng 3.1 . Các thông số quy trình tinh s ch huyết thanh kháng d i bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion ..................................................................... 65 Bảng 3.11. Chất lƣợng của huyết thanh kháng d i sử dụng quy trình cũ ............. 67 Bảng 3.12. Chất lƣợng của huyết thanh kháng d i sử dụng quy trình tinh s ch mới đƣợc thiết lập ........................................................................................... 68
DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Vi rút d i ........................................................................................... 5 Hình 1.2. Hình thái, cấu trúc vi rút d i ............................................................. 6 Hình 1.3.Cấu trúc của F ab 2 ......................................................................... 12 Hình 1.4.Nguyên tắc của sắc ký lọc gel ........................................................ 13 Hình 1.5. H t gel liên kết Protein A, sử dụng trong tinh chế kháng th ......... 15 Hình 1.6. Vị trí trên Fc của IgG với protein A................................................ 16 Hình 1.7. Nguyên tắc sắc ký kỵ nƣớc ............................................................. 18 Hình 1.8. Cơ chế sắc ký trao đổi ion ............................................................... 19 Hình 1.9. Các giai đo n trong quá trình trao đổi ion ...................................... 23 Hình 1.1 .Nguyên tắc sắc ký trao đổi Cation ................................................. 24 Hình 1.11. Cơ chế thay đổi điện tích bề mặt của protein theo pI ................... 25 Hình 1.12. Nguyên tắc sắc ký trao đổi Anion ................................................. 26 Hình 3.1. Phổ đ ch y máy sắc ký của dung dịch đệm 20mM Acetate + 5 mM NaCl lô 1 S R_SK ........................................................................ 48 Hình 3.2. Phổ đ ch y máy sắc ký của dung dịch đệm 20mM Phosphate + 5 mM NaCl lô P1 S R_SK ......................................................................... 50 Hình 3.3. Kết quả ki m tra độ s ch kháng th lô 13.18 R M Đ bằng phƣơng pháp SE-HPLC .................................................................................. 52 Hình 3.4. Kết quả ki m tra độ s ch kháng th của huyết thanh kháng d i chứa dung dịch đệm cetate lô 1 S R_SK bằng phƣơng pháp SE-HPLC ............ 53 Hình 3.5. Kết quả ki m tra độ s ch kháng th của huyết thanh kháng d i chứa dung dịch đệm phosphate lô P1 S R_SK bằng phƣơng pháp SE-HPLC ................... 53 Hình 3.6. Kết quả điện di SDS-PAGE dịch protein sau tinh s ch của 2 lo i dung dịch đệm sau các lần thử nghiệm so với mẫu ban đầu và mẫu thô ...................... 54
Hình 3.7. Kết quả điện di SDS-PAGE dịch protein sau tinh s ch của 3 khả năng bám mẫu trên cùng 1 dung dịch đệm cetate ........................................ 57 Hình 3.8. Kết quả định tính kháng th F ab 2 của ngựa ................................ 58 Hình 3.9. Kết quả độ tinh s ch của lô 8 . 1 S R_SK ................................ 59 Hình 3.1 . Kết quả độ tinh s ch của lô 8 . 2 S R_SK .............................. 59 Hình 3.11. Kết quả độ tinh s ch của lô A80.03/SAR_SK .............................. 60 Hình 3.12. Kết quả điện di SDS-PAGE của các lô huyết thanh SAR đƣợc tinh chế thử nghiệm theo quy trình tinh chế mới thiết lập so với mẫu Ấn Độ và mẫu Pháp. ........................................................................................................ 69 Hình 3.13. Đ thị về độ tinh s ch huyết thanh kháng d i của 5 lô tinh s ch thử nghiệm, Ấn Độ, Sanofi-Pháp .......................................................................... 70 Hình 3.14. Đ thị hàm lƣợng endotoxin 5 lô sử dụng quy trình chƣa tinh s ch và 5 lô sử dụng quy trình tinh s ch mới thiết lập ............................................ 71 Hình 3.15. Đ thị hàm lƣợng protein 5 lô sử dụng quy trình chƣa tinh s ch và 5 lô sử dụng quy trình tinh s ch mới thiết lập................................................. 71 Hình 3.16. Hình ảnh cảm quan của lô 7.19 R mẫu trƣớc tinh s ch và lô 02.21/AR_SK_TC (mẫu sau tinh s ch)........................................................... 72
1 MỤC LỤC LỜI C M ĐO N LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH MỤC LỤC ........................................................................................................ 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 4 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 5 1.1. T NG QU N VỀ NH DẠI .................................................................. 5 1.1.1. Sơ lƣợc về bệnh d i ........................................................................... 5 1.1.2. Tác nhân gây bệnh ............................................................................ 5 1.1.3. Tình hình bệnh d i hiện nay ............................................................. 7 1.1.4. Các biện pháp phòng ngừa ............................................................... 8 1.1.5. Sản xuất huyết thanh kháng d i S R .......................................... 11 1.2. C NG NGH SẮC K ........................................................................... 13 1.2.1. Khái niệm ....................................................................................... 13 1.2.2. Các kỹ thuật sắc ký tinh s ch protein ............................................. 14 1.3. TINH SẠCH PROTEIN BẰNG KỸ THUẬT SẮC K ......................... 27 1.3.1. Giới thiệu........................................................................................ 27 1.3.2. Nguyên lý chung ............................................................................ 27 1.3.3. Các bƣớc thực hiện......................................................................... 27 1.4. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮC K TINH CHẾ HUYẾT TH NH KHÁNG DẠI .................................................................................................. 29 1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới ......................................................... 29 1.4.2. Các nghiên cứu trong nƣớc ........................................................... 30
2 CHƢƠNG 2 NGUY N VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU. 32 2.1. NGUY N VẬT LI U.............................................................................. 32 2.1.1. Nguyên liệu ................................................................................... 32 2.1.2. Gel sắc ký và sinh ph m................................................................ 32 2.1.3. H a chất......................................................................................... 33 2.1.4. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................ 33 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU............................................................ 34 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ...................................................................... 34 2.2.2. Tinh s ch huyết thanh kháng d i .................................................. 37 2.2.3. Các phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng huyết thanh kháng d i ..... 40 2.2.4. PHƢƠNG PHÁP XỬ L SỐ LI U ............................................. 47 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 48 3.1. THIẾT LẬP QUY TRÌNH Ở GI I ĐOẠN TINH SẠCH ẰNG SẮC K TR O Đ I ION ....................................................................................... 48 3.1.1. Kết quả thử nghiệm dung dịch đệm .............................................. 48 3.1.2. Kết quả thử nghiệm khả năng bám mẫu ....................................... 55 3.1.3. Đánh giá chất lƣợng huyết thanh S R sau khi tinh s ch bằng sắc ký trao đổi ion và xây dựng tiêu chu n chất lƣợng cơ sở ....................... 58 3.1.4. Xây dựng thông số quy trình bằng sắc ký trao đổi ion................. 65 3.2. TINH CHẾ THỬ NGHI M VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢ NG HUYẾT TH NH KHÁNG DẠI ẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC K TR O Đ I ION Đ THIẾT LẬP .............................................................................................. 66 CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH ............................................... 75 4.1. KẾT LUẬN .............................................................................................. 75 4.2. KIẾN NGH ............................................................................................. 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 76 PHỤ LỤC
3 MỞ ĐẦU ệnh d i là một trong những bệnh truyền nhiễm đáng sợ nhất lịch sử nhân lo i. Khi đã lên cơn d i, k cả là động vật hay con ngƣời đều sẽ tử vong nhanh ch ng trong đau đớn và hoảng lo n. ệnh d i lây truyền cho ngƣời qua vết thƣơng hoặc vết trầy xƣớc do động vật bị d i cắn hoặc liếm, thông thƣờng nhất là do ch nuôi. ệnh d i cho đến nay vẫn còn là nỗi lo cho nhân dân trong cả nƣớc và toàn thế giới vì chƣa c thuốc đặc hiệu chữa trị khi lên cơn. Do đ , tiêm vắc xin kèm huyết thanh kháng d i là cách dự phòng duy nhất c hiệu quả cho ngƣời bị súc vật nghi d i cắn. Việc dùng phối hợp huyết thanh và vắc xin d i đã làm giảm tỷ lệ tử vong rất lớn trong điều trị bệnh nhân bị ch d i cắn, đặc biệt là các trƣờng hợp vết cắn ở những nơi gần trung khu thần kinh, bộ phận sinh dục. Hiện nay c 2 lo i huyết thanh kháng d i tinh chế là Huyết thnah kháng d i c ngu n gốc từ động vật thƣờng là từ ngựa ERIG và huyết thanh kháng d i ngu n gốc từ ngƣời HRIG . Viện Vắc xin và Sinh ph m Y tế IV C nghiên cứu sản xuất thành công huyết thanh kháng d i tinh chế dựa trên công nghệ sử dụng máu động vật máu ngựa miễn dịch với kháng nguyên d i c hiệu giá cao, tinh chế bằng phƣơng pháp Pope cải tiến từ năm. Sản ph m huyết thanh kháng d i S R) sau khi đƣợc thƣơng m i h a đã g p phần giảm dần số ca tử vong vì bệnh d i theo từng năm cho đến ngày nay. Từ năm 1996 cho đến nay IVAC vẫn sử dụng dây chuyền sản xuất huyết thanh theo phƣơng pháp Pope cải tiến đ tinh chế kháng th globulin kháng d i với sản lƣợng đ t qui mô lên đến 200.000 liều mỗi năm và c th nâng qui mô nếu thị trƣờng yêu cầu. Mặc dù vậy công nghệ sản xuất này vẫn còn t n t i một số vấn đề nhƣ hàm lƣợng protein tổng số còn cao làm cho độ tinh s ch của huyết thanh chƣa cao nhƣ mong muốn. Với mục đích khắc phục những vấn đề còn t n t i, nh m nghiên cứu ứng dụng phƣơng pháp sắc ký đ tinh s ch thử nghiệm huyết thanh kháng d i tinh chế. Đề tài:“Hoàn thiện quy trình tinh chế huyết thanh kháng dại (SAR) bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion” đƣợc thực hiện nhằm hoàn thiện quy trình tinh chế huyết thanh kháng d i đ nâng cao chất lƣợng sản ph m huyết thanh. Kết quả này sẽ là
4 bƣớc đầu cho việc mở rộng sản xuất ở quy mô cao hơn. Các mục tiêu và nội dung chính của đề tài đƣợc đề ra dƣới đây. Mục tiêu nghiên cứu: “Hoàn thiện quy trình tinh chế huyết thanh kháng d i (SAR) bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion”. Nội dung nghiên cứu: - Thiết lập quy trình ở giai đo n tinh s ch bằng sắc ký trao đổi ionvới sản ph m huyết thanh kháng d i tinh chế. - Tinh chế thử nghiệm và đánh giá chất lƣợng huyết thanh kháng d i bằng phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion đã thiết lập.
5 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. T NG QU N VỀ NH DẠI 1.1.1. Sơ lƣợc về ệnh dại Bệnh d i là bệnh lây truyền từ động vật, do vi rút lyssa thuộc họ Rhabdoviridae gây nên, khi các triệu chứng lâm sàng xuất hiện, ngƣời bệnh sẽ tử vong. Ở các nƣớc phát tri n, bệnh d i lây truyền từ động vật hoang dã, đến vật nuôi và đến con ngƣời. Ở các nƣớc nhƣ châu Phi, châu Á và châu Mỹ Latinh, ch là vật chủ chính truyền bệnh gây nên hầu hết các trƣờng hợp tử vong do bệnh d i. Bệnh d i gây tỷ lệ tử vong cao hơn hầu hết các bệnh truyền nhiễm khác trên toàn thế giới [1]. Ở các nƣớc phát tri n, bệnh d i lây truyền từ động vật hoang dã, đến vật nuôi và đến con ngƣời. Ở các nƣớc nhƣ châu Phi, châu Á và châu Mỹ Latinh, ch là vật chủ chính truyền bệnh gây nên hầu hết các trƣờng hợp tử vong vì bệnh d i là do bị lây truyền từ ch d i. 1.1.2. Tác nh n g y ệnh Hình 1 1 Vi rút d i [2] Vi rút d i thuộc bộ Mononegavirales, vi rút c bộ gen RN không phân đo n, sợi âm. Trong nh m này, vi rút c hình d ng “viên đ n” riêng biệt
6 đƣợc phân lo i trong họ Rhabdoviridae, bao g m ít nhất ba chi vi rút động vật, Lyssavirus, Ephemerovirus và Vesiculovirus. Chi Lyssavirus bao g m vi rút d i, vi rútLagos, virus Mokola, virus Duvenhage, vi rút dơi châu Âu 1 & 2 và vi rút dơi Úc. Rabies lyssavirus, trƣớc đây là Rabies virus (RABV), là một lo i vi rút hƣớng thần kinh gây bệnh d i ở ngƣời và động vật. Sự lây truyền bệnh d i c th xảy ra qua nƣớc bọt của động vật và ít phổ biến hơn khi tiếp xúc với nƣớc bọt của ngƣời. Lyssavirus gây bệnh d i, giống nhƣ nhiều lo i Rhabdovirus, c ph m vi ký chủ cực kỳ rộng. Trong tự nhiên, vi rút d i đã đƣợc phát hiện lây nhiễm cho nhiều loài động vật c vú. Trong phòng thí nghiệm, ngƣời ta thấy rằng vi rút d i c th lây nhiễm cho các loài chim hoặc nuôi cấy tế bào c ngu n gốc từ động vật c vú, chim, bò sát và côn trùng [1]. Lyssavirus gây bệnh d i c hình d ng trụ, dài khoảng 180 nm, rộng 75 nm và c bộ gen RNA sợi đơn âm. Tất cả các sự kiện phiên mã và sao chép diễn ra trong tế bào chất của tế bào thần kinh vật chủ, nơi vi rút xâm nhập và đƣợc ví nhƣ một “nhà máy sản xuất vi rút” chuyên biệt, ti u th Negri đƣợc đặt theo tên của Adelchi Negri). Ti u th Negri c đƣờng kính từ 2–1 µm và là đi n hình cho một trƣờng hợp nhiễm bệnh d i và do đ đã đƣợc sử dụng làm bằng chứng mô học xác định cho sự lây nhiễm [3]. Hình 1 2 Hình thái, cấu trúc vi rút d i [4] Bộ gen của vi rút d i mã h a 5 lo i protein: nucleoprotein (N), phosphoprotein P , matrix protein M , glycoprotein G và polymerase L . Tất cả các Rhabdovirus đều c hai thành phần cấu trúc chính: lõi Ribonucleoprotein d ng xoắn RNP và một lớp vỏ bao quanh. Trong RNP, RNA bộ gen đƣợc bao
7 bọc chặt chẽ bởi nucleoprotein. Hai protein khác của vi rút, phospoprotein và protein lớn (L-protein hoặc polymerase c liên quan đến RNP. Glycoprotein t o thành khoảng 400 gai Trimeric sắp xếp chặt chẽ trên bề mặt của vi rút. Protein M đƣợc liên kết với cả vỏ và RNP và c th là protein trung tâm của quá trình lắp ráp hình thành nên h t virion. 1 1 3 Tình hình ệnh dại hiện nay ệnh d i là một trong những bệnh lâu đời và nguy hi m nhất. Khi đã c dấu hiệu lâm sàng, tỷ lệ tử vong là 1 %. Mặc dù đã c vắc xin phòng bệnh hiệu quả nhƣng ƣớc tính, hằng năm c khoảng 59. ngƣời ở hơn 15 quốc gia, chủ yếu từ những nh m dân cƣ nghèo hoặc dễ bị tổn thƣơng, tử vong do bệnh d i. Khoảng 4 % n n nhân là trẻ em dƣới 15 tuổi. T i Việt Nam, bệnh d i lƣu hành và phát tri n ở hầu hết các tỉnh thành phố, mỗi năm c khoảng 70-11 ngƣời tử vong vì bệnh d i trong vòng 1 năm qua. Trung bình mỗi năm c khoảng 4 nghìn ngƣời bị ch , mèo cắn phải điều trị dự phòng bằng vắc xin d i, với kinh phí mua vắc xin ƣớc tính hơn 3 tỷ đ ng [5]. Trong những năm 199 -1995, tỷ lệ tử vong là ,43 1 . dân, trung bình mỗi năm c từ 350-500 ca tử vong. Năm 1996, Thủ tƣớng Chính phủ ban hành Chỉ thị 92/TTg về tăng cƣờng phòng chống bệnh d i. Trong giai đo n từ 1996-2007 nhờ các biện pháp phòng chống bệnh d i đã đƣợc tăng cƣờng và kết hợp nên số ca tử vong đã giảm 75% so với năm 1995. Từ năm 2 4 đến nay, bệnh d i l i c chiều hƣớng tăng lên, hằng năm vẫn c khoảng trên dƣới 100 ca tử vong liên quan đến d i [5]. Theo thống kê, từ đầu năm 2 21 đến nay, cả nƣớc ghi nhận 15 trƣờng hợp ngƣời tử vong do bệnh d i t i 1 tỉnh, thành phố và trên 14 . ngƣời phải đi điều trị dự phòng bệnh d i. Trên động vật, qua công tác giám sát chủ động, đã phát hiện 33 trƣờng hợp ch , mèo c kết quả xét nghiệm dƣơng tính với vi rút d i t i 6 tỉnh g m: Sơn La, Điện iên, L ng Sơn, Phú Thọ, Đắk Lắk, Đắk Nông [6].
8 1.1.4. Các iện pháp phòng ngừa Bệnh d i ở động vật đƣợc ngăn ngừa bằng cách tiêm vắc xin cho các loài nh y cảm, đặc biệt là ch và mèo. Các chƣơng trình tiêm phòng hàng lo t cho ch ở Hoa Kỳ và Châu Âu là nguyên nhân chủ yếu làm giảm đáng k bệnh d i ở ch và ở ngƣời trong những năm 194 và 195 . T i các quốc gia này, số trƣờng hợp đƣợc báo cáo ở động vật hoang dã hiện nhiều hơn khoảng 10 lần so với ở động vật nuôi; do đ động vật hoang dã là nguy cơ lớn nhất đối với con ngƣời. Việc phòng ngừa cho động vật hoang dã bằng cách sử dụng m i c chứa vắc xin mang l i hy vọng ki m soát dịch bệnh ở các quần th động vật hoang dã nh y cảm [7]. Bệnh d i ở ngƣời đƣợc ngăn ngừa tốt nhất bằng cách tránh tiếp xúc với ngu n lây bệnh. Điều trị dự phòng bệnh d i c 2 hình thức: dự phòng trƣớc phơi nhiễm (Pre-exposure prophylaxis: PrEP và dự phòng sau phơi nhiễm (Post-exposure prophylaxis: PEP). Dự phòng trƣớc phơi nhiễm (Pre-exposure prophylaxis: PrEP là chủ động tiêm vắc xin phòng d i cho áp dụng cho các nh m quần th c nguy cơ cao. Những ngƣời c nguy cơ cao c th tiêm chủng ngừa trƣớc phơi nhiễm (PrEP), chẳng h n nhƣ bác s thú y, ngƣời xử lý động vật, một số nhân viên phòng thí nghiệm và những ngƣời đến vùng dịch từ 1 tháng trở lên. Một số đối tƣợng nhƣ ngƣời nghiện chích ma túy, ngƣời mà việc theo đuổi nghề nghiệp hoặc giải trí khiến họ tiếp xúc thƣờng xuyên với động vật c khả năng mắc bệnh d i cũng nên đƣợc xem xét đ điều trị dự phòng trƣớc phơi nhiễm. Dự phòng sau phơi nhiễm (Post-exposure prophylaxis: PEP) bao g m việc kết hợp làm s ch vết thƣơng t i chỗ, tiêm vắc xin và huyết thanh kháng d i Rabies Immuno Globulin: RIG cho các đối tƣợng c chỉ định ngh a là vết cắn từ mức độ III trở lên . Cách xử lý sơ cứu t i chỗ và dự phòng sau phơi nhiễm khi bị ch , mèo cắn đ ngăn chặn sự xâm nhập của vi rút vào hệ thần kinh trung ƣơng nhƣ sau. Trƣớc tiên, phải vệ sinh vết thƣơng nơi bị cắn là cần tách rời quần áo ra khỏi vết cắn, trong trƣờng hợp vết cắn ở chân thì nên dùng kéo cắt bỏ phần
9 vải t i vị trí cắn. Điều này giúp h n chế nƣớc bọt của động vật bám nhiều hơn vào vết thƣơng. Tiếp tục rửa vết thƣơng dƣới vòi nƣớc chảy m nh trong vòng 15 phút, nƣớc ấm càng tốt. Sau đ , rửa s ch vết thƣơng với c n 70%, c n i-ốt hoặc Povidone-Iodine, tuyệt đối không cố gắng nặn máu. Không nên chà sát vết thƣơng, tránh làm vết thƣơng trầm trọng hơn. Sau khi vệ sinh vết thƣơng, ngƣời bệnh nên dùng g c y tế hoặc vải s ch đ băng b vết thƣơng đ cầm máu đ ng thời tránh trƣờng hợp vi khu n xâm nhập. Tuy nhiên, không nên băng b quá chặt khiến máu kh lƣu thông. Tiến hành đƣa ngƣời bệnh cần đến ngay các cơ sở y tế gần nhất đ tiêm vắc xin phòng d i ngay sau bị ch hoặc mèo cắn và sử dụng huyết thanh kháng d i phòng bệnh d i (RIG), nếu đƣợc chỉ định. Rủi ro phơi nhiễm và các dấu hiệu đ áp dụng PEP tùy thuộc vào mức độ nghiêm trọng của việc tiếp xúc với động vật nghi mắc bệnh d i, khuyến cáo sử dụng một liệu trình PEP theo ba phân độ phơi nhiễm và chỉ định điều trị dự phòng sau phơi nhiễm đầy đủ với từng phân độ. Đối với phân độ phơi nhiễm lo i I, là khi ch m tay cho động vật ăn, liếm vào phần da nguyên vẹn thì không cần không điều trị gì nếu c thông tin đáng tin cậy về tiền sử ca bệnh. Đối với phân độ phơi nhiễm lo i II là khi bị động vật cắn vào vùng da hở nhƣng không gây chảy máu thì tiêm ngay vắc xin phòng d i, c th dừng điều trị khi sau 1 ngày mà vật nuôi vẫn khỏe m nh. Đối với phân độ phơi nhiễm lo i III là một hoặc nhiều vết cắn xuyên da hoặc vết xƣớc, liếm lên vết thƣơng hở trên da, màng nhầy dính với nƣớc bọt thì phải tiêm ngay vắc xin và kết hợp tiêm huyết thanh kháng d i càng sớm càng tốt, chậm nhất là 7 ngày sau liều tiêm vắc xin phòng d i đầu tiên. Tất cả các trƣờng hợp phơi nhiễm lo i II và III đƣợc đánh giá là c nguy cơ phát tri n bệnh d i đều cần liệu trình điều trị dự phòng PEP bao g m một liệu trình vắc xin phòng d i đơn độc hoặc liệu trình dùng vắc xin phối hợp với huyết thanh kháng d i tùy theo chỉ định.Vì tính chất nguy hi m của bệnh d i, huyết thanh kháng d i đƣợc chỉ định dựa theo phân độ vết cắn nhƣ trên nhƣng vẫn rất cần đƣợc cân nhắc chỉ định bổ sung khi cần thiết nếu đánh giá các yếu tố nguy cơ mắc d i cao hơn. Nguy cơ này sẽ tăng lên nếu:
10 Nguy cơ này sẽ tăng lên nếu:  Động vật c vú cắn là một ổ chứa bệnh d i đã biết hoặc các loài vectơ  Sự phơi nhiễm xảy ra ở một khu vực địa lý vẫn còn bệnh d i  Con vật trông ốm yếu hoặc c bi u hiện bất thƣờng  Vết thƣơng hoặc màng nhầy bị ô nhiễm bởi nƣớc bọt của động vật  Vết cắn là vô cớ  Con vật chƣa đƣợc tiêm phòng. Tình tr ng tiêm phòng của động vật nghi ngờ không nên là yếu tố quyết định khi xem xét c bắt đầu PEP hay không khi tình tr ng tiêm phòng của động vật c nghi vấn. Điều này c th xảy ra nếu các chƣơng trình tiêm phòng cho ch không đƣợc quản lý đầy đủ hoặc đƣợc thực hiện vì thiếu ngu n lực hoặc mức độ ƣu tiên thấp. Hiệu giá kháng th thụ động xuất hiện và t n t i ở mức thỏa đáng trong 24 giờ sau khi tiêm sau đ giảm dần. Thời gian tác dụng bảo vệ ngắn. Chế độ dự phòng sau khi bị cắn, bao g m xử lý t i chỗ vết thƣơng, gây miễn dịch thụ động và chủ động, đã c hiệu quả 1 %. Khi c chỉ định, chỉ tiêm huyết thanh kháng d i 1 lần, thƣờng vào ngày đầu khi bị cắn. Nếu không tiêm đƣợc ngày đầu, c th tiêm bất cứ ngày nào, cho đến hết ngày thứ 7 của chế độ dự phòng sau khi bị cắn. Quá ngày thứ 7, không đƣợc chỉ định huyết thanh kháng d i, vì đã bắt đầu c t o kháng th kháng d i chủ động nếu đƣợc tiêm phòng vắc xin d i. Vì huyết thanh kháng d i c th ức chế một phần t o kháng th chủ động kháng d i, nên không đƣợc vƣợt quá liều khuyến cáo cho tới khi ngƣời bệnh c th chủ động t o kháng th nhờ tiêm phòng vắc xin d i. WHO tiếp tục đ y m nh công tác phòng chống bệnh d i ở ngƣời thông qua việc lo i bỏ bệnh d i ở ch , các chiến lƣợc phòng chống ch cắn và sử dụng rộng rãi hơn đƣờng tiêm trong da đối với PEP, làm giảm khối lƣợng và do đ giá thành của vắc xin nuôi cấy tế bào từ 6 % đến 8 % [7].
11 1.1.5. Sản xuất huyết thanh kháng dại (SAR) Huyết thanh kháng d i là một dung dịch không màu hoặc màu vàng nh t, c ngu n gốc từ huyết thanh huyết tƣơng ngƣời hoặc ngựa chứa kháng th kháng virus d i đƣợc chỉ định tiêm đ điều trị dự phòng bệnh d i khi bệnh nhân c vết thƣơng mức độ III Theo hƣớng dẫn giám sát và phòng chống bệnh d i trên ngƣời của ộ Y tế ban hành kèm theo Quyết định số 1622 QĐ- YT ngày 8 5 2 14 và trƣớc đ chƣa đƣợc tiêm vắc xin phòng d i dự phòng trƣớc phơi nhiễm nhằm mục đích t o miễn dịch thụ động kháng vi rút d i. Kháng th c trong huyết thanh c tác dụng trung hòa và làm chậm sự lan tỏa vi rút d i, làm cho các tính chất gây bệnh và gây nhiễm sẽ bị ức chế, nhờ đ bảo vệ đƣợc ngƣời bệnh cho tới khi các kháng th kháng d i đƣợc sản sinh sau khi tiêm vắc xin phòng d i. Mục đích chính của việc tinh chế và cô đặc huyết thanh kháng d i n i riêng và huyết thanh điều trị n i chung là lo i bỏ albumin và những protein không cần thiết vì đây là nguyên nhân gây phản ứng dị ứng hay bệnh huyết thanh, đ ng thời cô đặc các globulin miễn dịch đặc hiệu. Kháng th trung hòa vi rút d i ở phần Pseudoglobulin và một phần ở Euglobulin. Vì vậy, phƣơng pháp tinh chế và cô đặc huyết thanh kháng d i đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp của Pope. Năm 1936, Parfentjev đã dùng pepsin trong môi trƣờng acid. Trong môi trƣờng acid thì lbumin và Euglobulin bị phá hủy, chỉ còn l i Pseudoglobulin chứa kháng th đặc hiệu. Các protein không đặc hiệu đƣợc hấp phụ bởi tricalci phosphate. Đến năm 1939, Pope, Hansen, Modern và Ruff xác nhận kết quả kết quả của Parfentjev và xác định điều kiện về nhiệt độ, pH cần thiết trong quá trình thủy phân các protein. Đ c một kháng huyết thanh tinh khiết thì ngƣời ta c th dùng phƣơng pháp kết hợp kháng nguyên và kháng th , sau đ dùng amonium sulfate đ tách kháng th . Theo Pope điều kiện nhiệt độ rất cần thiết cho kết dính chọn lọc. Dƣới tác dụng của pepsin kháng th bị cắt thành hai mảnh c tính chất khác nhau: một mảnh không c tính kháng th bị biến đổi dễ dàng dƣới tác dụng của nhiệt ở nhiệt độ 56 – 580C trong môi trƣờng amonium sunfate 15%. Một mảnh khác gọi là
12 “Phân tử chịu nhiệt Pope” c tính kháng th , bị hòa tan trong dung dịch khi n ng độ amonium sunfate tăng lên 3 – 34%. Từ năm 1994, Viện Vắc xin và Sinh ph m Y tế IV C dựa theo phƣơng pháp Pope đ tiến hành cải tiến quy trình sản xuất sử dụng huyết tƣơng ngựa đ tinh chế kháng th globulin ngựa và thực hiện đề tài cấp nhà nƣớc về đề tài nghiên cứu sản xuất huyết thanh kháng d i (serum antirabique- SAR). Năm 1996, IV C đã áp dụng phƣơng pháp Pope cải tiến sản xuất thành công và đƣa sản ph m huyết thanh S R ra thƣơng m i h a. Phƣơng pháp đƣợc thực hiện cụ th qua những phân đo n sau đây: Phân đo n thứ nhất, lấy huyết tƣơng từ máu ngựa tinh chế. Huyết tƣơng đƣợc pha loãng theo tỷ lệ pha loãng 1 5. Đem thủy phân huyết tƣơng bằng pepsin ở nhiệt độ và pH xác định, thủy phân huyết tƣơng trong thời gian 2 giờ. Phân đo n thứ hai, tiến hành lo i bỏ albumin và những protein không cần thiết bằng tủa amoni sunfate ((NH4)2SO4) 14% trong thời gian 1 giờ, ở nhiệt độ và pH đƣợc xác định. Khi cắt kháng th bằng pepsin, vị trí đƣợc cắt là ở chuỗi nặng, phía sau cầu disulfua liên chuỗi t o ra một mảnh c chứa cả hai vị trí kết hợp kháng nguyên. Hình 1 3 Cấu trúc của F ab 2[8] Đo n này đƣợc gọi là F ab 2 vì n c h a trị hai. Vùng Fc của phân tử kháng th đƣợc phân cắt bởi pepsin t o thành các peptid nhỏ. Mảnh F ab 2