Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng vi nấm biển Penicillium oxalicum CLC-MF05

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:85

Thêm vào BST

Báo xấu

40
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn Thạc sĩ Sinh học "Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng vi nấm biển Penicillium oxalicum CLC-MF05" trình bày các nội dung chính sau: Xác định được thành phần và cấu trúc hoá học của một số hợp chất có mặt trong chủng vi nấm biển Penicillium oxalicum CLC-MF05, đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất đó.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm của một số hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng vi nấm biển Penicillium oxalicum CLC-MF05

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN THUỶ TIÊN Nguyễn Thuỷ Tiên SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP PHÂN LẬP TỪ CHỦNG VI NẤM BIỂN Penicillium oxalicum CLC-MF05 LUẬN VĂN THẠC SĨ Sinh học thực nghiệm 2021 Hà Nội - 2021
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ Nguyễn Thuỷ Tiên NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG VIÊM CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP PHÂN LẬP TỪ CHỦNG VI NẤM BIỂN Penicillium oxalicum CLC-MF05 Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS. Trần Hồng Quang Hà Nội - 2021
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Trần Hồng Quang. Các số liệu, kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách quan nhất. Đồng thời, các kết quả này chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Nguyễn Thuỷ Tiên
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Trần Hồng Quang, Viện Hoá sinh Biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người đã định hướng khoa học, trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài. Đồng thời tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các anh chị, bạn bè trong phòng Dược liệu Biển, Viện Hoá sinh Biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã ủng hộ, giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt được đề tài. Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả các thầy cô, cán bộ, thành viên Học viện Khoa học và Công nghệ đã giảng dạy, cung cấp các kiến thức mới để tôi hoàn thành các học phần và các chuyên đề trong chương trình đào tạo. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, những người thân yêu đã luôn ở bên, động viên và giúp đỡ tôi cả về mặt vật chất lẫn tinh thần trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Mặc dù đã cố gắng rất nhiều, song do thời gian và kiến thức còn hạn hẹp nên luận văn của tôi không thể tránh được những thiếu sót tôi rất mong sẽ nhận được sự đóng góp ý kiến từ phía thầy giáo, cô giáo cùng toàn thể các bạn để bài báo cáo của tôi được hoàn thiện hơn. Luận văn được giúp đỡ về mặt kinh phí và thực hiện trong khuôn khổ Nhiệm vụ Hợp tác quốc tế cấp Viện Hàn lâm KHCNVN: “Nghiên cứu hoạt tính kháng viêm in vitro của các chủng vi nấm biển phân lập từ hải miên thu thập ở quần đảo Cù Lao Chàm – Việt Nam”. Mã số: QTKR01.03/20-21. Hà Nội, ngày 20 tháng 9 năm 2021 Học viên Nguyễn Thuỷ Tiên
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................ iii LỜI CẢM ƠN .............................................................................................. iv MỤC LỤC .................................................................................................... v MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 3 1.1. Giới thiệu về viêm và một số yếu tố quan trọng trong phản ứng viêm 3 1.1.1. Sơ lược về viêm ................................................................. 3 1.1.2. Một số yếu tố quan trọng trong quá trình viêm ................... 4 1.2. Vi nấm và ứng dụng của vi nấm ......................................................... 5 1.3. Vi nấm biển và các hợp chất thứ cấp từ vi nấm biển .......................... 9 1.3.1. Sơ lược về vi nấm biển ......................................................... 9 1.3.2. Lịch sử nghiên cứu các hợp chất từ vi nấm biển ................. 13 1.3.3. Tiềm năng của các hợp chất từ vi nấm biển ........................ 14 1.4. Penicillium oxalicum .......................................................................... 23 1.4.1. Tổng quan về Penicillium oxalicum .................................... 23 1.4.2. Các hợp chất thứ cấp từ Penicillium oxalicum .................... 25 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 30 2.1. Chủng vi khuẩn .................................................................................. 30 2.2. Hoá chất và thiết bị nghiên cứu .......................................................... 30 2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 30 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy vi nấm ............................................ 30 2.3.2. Phương pháp lên men, tạo dịch chiết và phân lập các hợp chất ........................................................................................................ 31 2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất ...................... 32 2.3.4. Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm .............................. 32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................... 35
3.1. Kết quả nhân sinh khối và tạo cao chiết tổng chủng vi nấm Penicillium oxalicum CLC-MF05 ................................................................................ 35 3.2. Kết quả phân lập các hợp chất ............................................................ 36 3.3. Kết quả xác định cấu trúc hoá học các hợp chất.................................. 38 3.3.1. Kết quả xác định cấu trúc hóa học hợp chất 1 ..................... 38 3.3.2. Kết quả xác định cấu trúc hóa học hợp chất 2 ..................... 43 3.3.3. Kết quả xác định cấu trúc hóa học hợp chất 3 ..................... 46 3.4. Kết quả hoạt tính kháng viêm của hợp chất ........................................ 49 3.4.1. Ảnh hưởng của hợp chất 1-3 đến khả năng sống sót của tế bào BV2 ................................................................................................. 49 3.4.2. Ảnh hưởng của hợp chất 1-3 đến việc sản xuất NO và PGE2 do LPS gây ra trong tế bào BV2 ............................................................. 51 3.4.3. Ảnh hưởng của hợp chất 1-3 đến biểu hiện protein iNOS và COX-2 ................................................................................................... 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................... 58
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic BGC-823 Gastric adenocarcinoma cell Tế bào ung thư dạ dày line CC Column chromatography Sắc ký cột CD Circular dichroism Phổ lưỡng sắc tròn Spectroscopy 13 C-NMR 13 C-Nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt resonance spectroscopy nhân cacbon 13 COSY Correlation spectroscopy Phổ tương tác hai chiều đồng hạt nhân DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarization Transfer EtOAc Ethyl acetate Ethyl acetate GC-MS Gas chromatography – mass Sắc ký khí – khối phổ spectrometry HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác đa liên kết Correlation dị hạt nhân HMQC Heteronuclear Multiple- Phổ kết hợp đa lượng tử dị Quantum Coherence hạt nhân 1 H-NMR Proton nuclear magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt resonance nhân proton HPLC High performance liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao chromatography HR-ESI- High-resolution electrospray Phổ khối lượng phân giải TOF-MS ionisation time-of-flight mass cao phun mù điện tử thời spectrometry gian bay IC50 Inhibitory concentration Nồng độ ức chế 50% K562 Human leukemic cell line Tế bào ung thư bạch cầu MCF-7 Human breast carcinoma cell Tế bào ung thư vú ở người line MIC Minimum inhibitory Nồng độ ức chế tối thiểu concentration
NOESY Nuclear overhauser effect Phổ NOESY spectroscopy PDA Potato Dextrose Agar Môi trường thạch khoai tây TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TMV Tobacco mosaic virus Virut khảm thuốc lá
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số chất hợp thứ cấp từ nấm được sản xuất thương mại ............ 8 Bảng 1.2: Các hợp chất kháng viêm phân lập từ vi nấm biển trong giai đoạn 2000-2018 .................................................................................................... 17 Bảng 3.1: Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất 1 .................................. 43 Bảng 3.2: Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất 2 .................................. 45 Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H và 13C NMR của hợp chất 3 .................................. 49 Bảng 3.4: Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO và PGE2 của hợp chất 1-3 ........................................................................................................ 53
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Một số hợp chất thứ cấp từ nấm sử dụng trong y học ...................... 7 Hình 1.2: Các hợp chất mới từ vi nấm biển được phân chia theo nguồn gốc. 12 Hình 1.3: Các hợp chất mới từ vi nấm viển được phân chia theo cấu trúc .... 12 Hình 1.4: Các hợp chất mới từ vi nấm biển được phân chia theo hoạt tính ... 13 Hình 1.5: Cấu trúc hoá học của Cephalosporin C, Glitoxin và Indanonaftol A ..................................................................................................................... 14 Hình 1.6: Cấu trúc hoá học của Aspergillitine, Aspergione A, Aspergione F, Sorbicillactone A.......................................................................................... 15 Hình 1.7: Cấu trúc hoá học của Pestalone, Ascochital, Trichoderins A, A1 và B .................................................................................................................. 16 Hình 1.8: Một số loài nấm thuộc chi Penicillium .......................................... 24 Hình 1.9: Cấu trúc hoá học của hợp chất 1-11 đã được công bố từ P. oxalicum ..................................................................................................................... 27 Hình 1.10: Cấu trúc hoá học của hợp chất 12-32 đã được công bố từ P. oxalicum ....................................................................................................... 29 Hình 3.1: Sơ đồ tạo cao chiết tổng P.oxalicum CLC-MF05 .......................... 35 Hình 3.2: Siêu âm và tạo dịch chiết tổng ...................................................... 36 Hình 3.3: Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao chiết tổng Penicillium oxalicum CLC-MF05 ................................................................................................... 37 Hình 3.4: Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC () và COSY (—) chính của hợp chất 1 .............................................................................................. 38 Hình 3.5: Phổ HR-ESI-TOF-MS của hợp chất 1........................................... 39 Hình 3.6: Phổ 1H NMR (400 MHz, CDCl3) của hợp chất 1 .......................... 39 Hình 3.7: Phổ 13C NMR (100 MHz, CDCl3) của hợp chất 1 ......................... 40 Hình 3.8: Phổ HMQC (400 MHz, CDCl3) của hợp chất 1 ............................ 41 Hình 3.9: Phổ HMBC (400 MHz, CDCl3) của hợp chất 1............................. 41 Hình 3.10: Phổ COSY (400 MHz, CDCl3) của hợp chất 1 ............................ 42 Hình 3.11: Cấu trúc hóa học của hợp chất 2 ................................................. 43 Hình 3.12: Phổ HR-ESI-TOF-MS của hợp chất 2......................................... 44 Hình 3.13: Phổ 1H NMR (400 MHz, CD3OD) của hợp chất 2 ...................... 44 Hình 3.14: Phổ 13C NMR (100 MHz, CD3OD) của hợp chất 2 ..................... 45 Hình 3.15: Cấu trúc hóa học của hợp chất 3 ................................................. 46
Hình 3.16: Phổ HR-ESI-TOF-MS của hợp chất 3......................................... 47 Hình 3.17: Phổ 1H NMR (400 MHz, CD3OD) của hợp chất 3 ...................... 47 Hình 3.18: Phổ 13C NMR (100 MHz, CD3OD) của hợp chất 3 ..................... 48 Hình 3.19: Cấu trúc hoá học của hợp chất 1-3 từ P. oxalicum CLC-MF05 ... 49 Hình 3.20: Ảnh hưởng của hợp chất 1-3 đến khả năng sống sót của tế bào BV2 .............................................................................................................. 50 Hình 3.21: Ảnh hưởng của hợp chất 1-3 đến sự sản xuất quá mức NO ở tế bào BV2 được kích thích bởi LPS ....................................................................... 52 Hình 3.22: Ảnh hưởng của hợp chất 1-3 đến sự sản xuất quá mức PGE2 ở tế bào BV2 được kích thích bởi LPS ................................................................ 53 Hình 3.23: Ảnh hưởng của 1-3 đối với sự biểu hiện quá mức của iNOS và COX-2 do LPS gây ra ở tế bào BV2 ............................................................. 55
1 MỞ ĐẦU Các hợp chất trao đổi thứ cấp tự nhiên luôn được xem đóng một vai trò quan trọng trong nghiên cứu phát triển các loại thuố c mới hoặc là mô hình, khuôn mẫu cho các nghiên cứu tổng hợp hữu cơ, tổng hợp hóa dược. Với diện tích hơn 70% bề mă ̣t trái đấ t, môi trường biển là nguồn cung cấp các sinh vật và vi sinh vâ ̣t biển đa dạng quý giá với nhiều hoạt động sinh học phong phú. So với các sinh vật trên cạn, các sinh vật biển thường sản sinh ra các hợp chất trao đổi thứ cấp có cấu trúc độc đáo và hoạt tính sinh học mạnh mẽ, giúp chúng thích nghi với những môi trường cực kỳ khó khăn. Nhờ sự đa da ̣ng của hê ̣ sinh thái biể n cùng với sự khắ c nghiê ̣t của môi trường số ng nên các hơ ̣p chấ t từ vi sinh vâ ̣t biể n cũng vô cùng đa da ̣ng về cấ u trúc cũng như hoa ̣t tiń h sinh ho ̣c. Vi nấm biển là mô ̣t trong những nguồn sản xuấ t quan tro ̣ng các chất chuyển hóa thứ cấp hữu ích trong nghiên cứu phát triể n thuốc. Vi nấ m biể n rấ t đa da ̣ng, chúng xuấ t hiê ̣n hầ u hế t ở trong các hê ̣ sinh thái biể n bao gồm nước biể n, bo ̣t biể n, trầ m tích biể n, tảo, san hô, rong biể n và các sinh vâ ̣t biể n khác. Nhờ khả năng chố ng chiụ với điề u kiê ̣n số ng như đô ̣ mă ̣n cao, áp suấ t cao, dinh dưỡng thấ p đồ ng thời ca ̣nh tranh với các sinh vâ ̣t khác, nên vi nấm biển có thể tổ ng hơ ̣p các hơ ̣p chấ t thứ cấ p có hoa ̣t tính sinh ho ̣c mạnh hơn, ưu viê ̣t hơn loài trên ca ̣n. Các hoa ̣t tính sinh ho ̣c của các chấ t chuyể n hóa thứ cấ p của vi nấ m rất đa dạng, bao gồ m kháng viêm, kháng khuẩ n, kháng virut, chố ng oxy hóa và gây độc tế bào ung thư ... Những hợp chất được tạo ra chủ yếu từ các loài vi nấm thuộc chi Penicillium, Aspergillus và một số loài vi nấm thuộc các chi ít phổ biến hơn như Acremonium, Emericella, Epicoccum, Exophiala, Paraphaeospaeria, Phomosis và Halarosellinia. Trong lịch sử nghiên cứu phát triển thuốc trên thế giới, vi nấm là một trong những nguồn cung cấp thuốc tự nhiên quan trọng, bằng chứng là có nhiều loại thuốc đang được sử dụng như paclitaxel, camptothecin, vincristin, axit torreyanic và cytarabine đã được phân lập từ vi nấm. Viê ̣t Nam là quố c gia nằ m ở khu vực nhiệt đới với bờ biển dài 3260km và diê ̣n tić h mă ̣t nước hơn 1 triê ̣u km² do đó sở hữu mô ̣t nguồ n tài nguyên sinh vâ ̣t biể n vô cùng phong phú và quý giá. Tuy nhiên theo các báo cáo cho
2 thấ y số lươṇ g công trin ̀ h nghiên cứu còn ha ̣n chế so với tiề m năng nguồ n khai thác nấ m biể n ở Viê ̣t Nam. Với mu ̣c đić h nghiên cứu xác đinḥ các hoa ̣t chấ t thứ cấ p có hoa ̣t tính kháng viêm để tìm ra nguồ n dươ ̣c liê ̣u mới góp phầ n phu ̣c vu ̣ sức khỏe cô ̣ng đồ ng tôi lựa cho ̣n đề tài “Nghiên cứu hoa ̣t tính kháng viêm của mô ̣t số hơ ̣p chấ t thứ cấ p phân lâ ̣p từ chủng vi nấ m biể n Penicillium oxalicum CLC-MF05”. Mục tiêu của luận văn: Xác định được thành phần và cấu trúc hoá học của một số hợp chất có mặt trong chủng vi nấm biển Penicillium oxalicum CLC-MF05, đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất đó. Nội dung luận văn bao gồm: 1. Lên men sinh khối lượng lớn, tạo cao chiết tổng của chủng nấm Penicillium oxalicum CLC-MF05 2. Phân lập các hợp chất từ cao chiết tổng của chủng Penicillium oxalicum CLC-MF05. 3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được. 4. Đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được.
3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về viêm và một số yếu tố quan trọng trong phản ứng viêm 1.1.1. Sơ lược về viêm Viêm là một đáp ứng miễn dịch bảo vệ cơ thể trước sự tấn công của tác nhân bên ngoài (vi sinh vật, tác nhân hóa, lý, cơ) hoặc của tác nhân bên trong (hoại tử do thiếu máu cục bộ, bệnh tự miễn). Đây là một đáp ứng miễn dich ̣ tự nhiên. Quá trình viêm thường kèm theo các triệu chứng sưng, nóng, đỏ và đau, do các mạch máu giãn nở, đưa nhiề u máu và các tế bào bạch cầu đến nơi tổ n thương. Các bạch cầu cũng theo mạch máu xâm nhập vào mô, sản sinh ra các tác nhân nhằm tiêu diệt hoặc trung hòa các tác nhân gây tổ n thương. Viêm không kiểm soát được có thể như một yếu tố dẫn đến các bệnh mãn tính. Hiện nay, thuốc dùng để quản lý các cơn đau và viêm là các thuốc thuộc dòng nacotics, không thuộc dòng nacotics, và corticosteroids. Tất cả những loại thuốc này đều có tác dụng phụ. Trong quá trình viêm, các tế bào đơn nhân và đại thực bào miễn dịch được kích thích sẽ kích hoạt quá trình chuyển hóa một số yếu tố phiên mã quan trọng. Con đường tín hiệu viêm được biết đến nhiều là con đường tín hiệu NF-κB được gọi là con đường kinh điển [1]. NF-κB nằm trong tế bào chất bao gồm hai tiểu đơn vị (p50 và p65) như một liên kết heterodimer không hoạt động với IκB-α, là một protein ức chế. Trong điều kiện được kích thích, quá trình phosphoryl hóa và phân giải protein của IκB-α cho phép chuyển vị NF-κB vào nhân để điều chỉnh phiên mã gen đích bằng cách liên kết với vị trí κB trong cấu trúc của DNA [2]. Sự chuyển hóa NF-κB sẽ làm tăng hoạt động của các phản ứng hạ lưu như các cytokine tiền viêm (như IL- 1β IL-6 và TNF-α), các enzyme tiền viêm quan trọng (như iNOS và COX- 2) và sản phẩm thu được tương ứng của chúng là NO và PGE2 [3]. Ngoài kích hoạt NF-κB, một con đường quan trọng khác, con đường tín hiệu MAPK như kinase điều chỉnh tín hiệu ngoại bào (ERK), p38 MAPK và cJun NH2- terminal kinases (JNK), cũng có thể được kích hoạt bởi quá trình viêm và điều chỉnh sự phiên mã của các gen liên quan đến viêm khác nhau sau đó biểu hiện quá mức phản ứng viêm hạ nguồn [4]. Lượng chất trung gian gây viêm
4 và các yếu tố liên quan đến tổn thương tế bào và gây viêm như mẩn đỏ, đau, sốt và sưng [5]. Do đó, việc ức chế sự sản xuất quá mức của những chất này là một mục tiêu quan trọng trong điều trị bệnh viêm. Các nhà nghiên cứu thường đánh giá hoạt động chống viêm bằng cách ức chế sự biểu hiện của các cytokine tiền viêm, enzyme chống viêm của COX-2, iNOS và các protein liên quan đến viêm khác nhau trong các đường dẫn tín hiệu NF-κB và MAPK trong bạch cầu đơn nhân và đại thực bào miễn dịch (tế bào BV2, tế bào RAW264.7) được kích thích bởi LPS in vitro [6]. 1.1.2. Một số yếu tố quan trọng trong quá trình viêm Nitric oxide (NO) là một trung gian tiền viêm, một phân tử tín hiệu đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh bệnh của viêm. NO liên quan đến đáp ứng miễn dịch bởi các đại thực bào kích hoạt cytokine. Sự sản sinh NO được điều khiển bởi nitric oxide synthase (NOS), trong đó bao gồm nitric oxide synthases cảm ứng (iNOS), nitric oxide synthases nội bào (eNOS) và nitric oxide synthases thần kinh (nNOS). NO được sinh ra từ quá trình chuyển hóa L-Arginine thành L-citruline, xúc tác bởi iNOS. NO ở nồng độ cao gây ra chứng viêm quá mức trong các tình huống bất thường. NO còn tác động vào quá trình sinh bệnh viêm khớp, viêm ruột và viêm phổ i. Do đó, ức chế sản sinh NO là yếu tố quan trọng trong việc điều trị các bệnh viêm [7]. PGE2 là một trung gian viêm quan trọng khác và được sản xuất từ các chất chuyển hóa arachidonic acid bởi sự xúc tác của cyclooxygenase-2 (COX2) [8]. Cyclooxygenases (COX) nhường 2 phân tử oxy cho arachidonic acid để tạo thành prostaglandin G2 (PGG2) bởi peroxidation, sau đó lần lượt chuyển hóa thành prostaglandin H2 (PGH2) dẫn đến sự hình thành của PGE2, thông qua kích hoạt phối hợp của PGE synthanse (PGES). Trong các đại thực bào, sự có mặt của LPS sẽ kích hoạt các dẫn truyền tín hiệu cho quá trình phiên mã các gen COX-2, iNOS, từ đó gây nên các đáp ứng viêm đặc trưng. Do vậy, sự thay đổi nồng độ NO và PGE2 thông qua sự ức chế hoạt động của iNOS và COX-2 là một phương tiện quan trọng để đánh giá hiệu quả của các hoạt chất kháng viêm. Microglia là các tế bào thần kinh đệm có chức năng như các tế bào hiệu ứng chính trong việc bảo vệ miễn dịch và phản ứng viêm trong hệ thần kinh
5 trung ương (CNS) [9, 10]. Các tế bào này được kích hoạt để đáp ứng với căng thẳng môi trường và tạo ra các phân tử hoạt tính sinh học khác nhau, bao gồm nitric oxide, prostaglandin E2, các loại oxy phản ứng và các cytokine gây viêm, chẳng hạn như interleukin (IL) -1β, IL -6, và yếu tố hoại tử khối u (TNF) -α, có chức năng khôi phục cân bằng nội môi của thần kinh trung ương bằng cách dọn sạch các tế bào và mảnh vỡ bị hư hỏng [11, 12]. Giống như các microglia khác, BV-2 cũng là một tế bào thần kinh đệm có thể được kích hoạt để giải phóng các cytokine gây viêm do stress oxy hóa hoặc các yếu tố gây viêm. Kích thích như vậy có thể gây ra rối loạn thoái hóa thần kinh như bệnh Alzheimer và bệnh Parkinson, do đó BV-2 được sử dụng rộng rãi như một hệ thống mô hình thay thế cho mô hình microglia nguyên phát và bệnh thoái hóa thần kinh in vitro. Lipopolysaccharide (LPS) là thành phần chính của nội độc tố, bắt đầu một số tác động tế bào chính đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh của các phản ứng viêm và được sử dụng để gây ra sự hoạt hóa tế bào vi mô trong quá trình nhiễm vi khuẩn Gram âm. Do đó, sự kích thích LPS của microglia là một mô hình hữu ích để nghiên cứu các cơ chế làm nền tảng cho tổn thương tế bào thần kinh thông qua các yếu tố gây viêm và độc tố thần kinh khác nhau do microglia hoạt hóa tiết ra, chẳng hạn như oxit nitric (NO), prostaglandin E2 (PGE2), các loại oxy phản ứng. (ROS), interleukin (IL) -1β, IL-6, và hoại tử khối u hệ số (TNF)-α [13]. 1.2. Vi nấm và ứng dụng của vi nấm Trước đây, các nhà khoa học luôn chú trọng đến xạ khuẩn vì khả năng sản xuất kháng sinh của chúng. Trên thực tế, nhiều chất chuyển hóa của nấm trên thị trường dược phẩm cho thấy tiềm năng của vi sinh vật là nguồn cung cấp thuốc chì có giá trị, ví dụ như kháng sinh polyketide griseofulvin (Likuden M®), axit terpenoid fusidic kháng khuẩn (Fucidine®), penicillin bán tổng hợp hoặc tổng hợp và cephalosporin, macrolid, statin cũng như các ancaloit ergot như ergotamine (Ergo-Kranit®) [14]. Vi nấm là những sinh vật đặc biệt tạo ra một loạt các chất chuyển hóa thứ cấp và các hoạt động hóa học của chúng có lịch sử lâu đời [15]. Việc Fleming phát hiện ra penicillin được phân lập từ vi nấm Penicillium notatum
6 vào mùa thu năm 1928, và được ông báo cáo vào năm 1929, đã cách mạng hóa dược phẩm sau một thời gian dài. Và sau đó, sự bùng nổ của Chiến tranh thế giới thứ II càng làm tăng tính cấp thiết mà nghiên cứu đã được tiến hành để thành công. Sản lượng của penicillin đã được tăng lên vào năm 1940 và đủ nguyên liệu đã được sử dụng cho thử nghiệm đầu tiên trên người vào tháng 2 năm 1941, dẫn đến một bước đột phá trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn. Sau khám phá thú vị về penicillin, các công ty dược phẩm và các phòng thí nghiệm hàn lâm đã chú ý hơn đến vi nấm như một nguồn cung cấp các hợp chất chì. Vì vậy, vi nấm đã trở thành một nguồn phát hiện thuốc quan trọng để điều trị các bệnh khác nhau [16]. Kể từ đó, nhiều chất chuyển hóa mới với cấu trúc khung carbon khá đa dạng đã được phân lập từ vi nấm. Động lực chính là việc tìm kiếm các chất chuyển hóa của vi nấm có hoạt tính sinh học để sử dụng trong dược phẩm, không chỉ làm thuốc kháng sinh mà còn cho các lĩnh vực điều trị khác, và điều này đã dẫn đến một số hợp chất đã đạt được tầm quan trọng về mặt thương mại đó là lovastatin được phân lập từ Aspergillus terreus được sử dụng như một chất làm giảm cholesterol [13], cyclosporin A được phân lập từ Cylindrocarpon lucidum và Tolypocladium được sử dụng rộng rãi như một chất ức chế miễn dịch [17], aphidicolin được phân lập từ Cephalosporium aphidicola được sử dụng như một chất ức chế mạnh DNA polymerase alpha đã được kiểm tra như một chất ức chế khối u tiềm năng và tác nhân chống vi rút, pleuromutilin từ Pleurotus mutilus là cốt lõi của kháng sinh thiamulin [18], ngoài các chất kháng khuẩn nổi tiếng là axit fusidic, griseofulvin, và axit mycophenolic được sử dụng làm chất ức chế miễn dịch [19]. Mặc dù vậy, vi nấm vẫn sẽ chịu trách nhiệm cho bước đột phá lớn tiếp theo trong y học [20].
7 Penicillin G Lovastatin Cyclosporine A A Cyclosporine Aphidicolin Pleuromutilin Fusidic axit Griseofulvin Mycophenolic axit Hình 1.1: Một số hợp chất thứ cấp từ nấm sử dụng trong y học
8 Ngoài những ứng dụng trong y học, vi nấm còn được sử dụng trong nhiều nhiều lĩnh vực như công nghiệp chế biến thực phẩm dùng để sản xuất tương, chao, xì dầu…, các loại axit hữu cơ như citric acid, oxalic acid, các enzyme thực phẩm như protease, pectinase, amylase. Trong nông nghiệp, vi nấm được ứng dụng trong sản xuất các chất kích thích tăng trưởng kéo dài ngọn, lá, rễ cho cây trồng như gibberellin, auxin, các chế phẩm phân bón hữu cơ, phân vi sinh giúp tăng độ màu mỡ, cải tạo đất hoặc là thiên địch chống lại côn trùng. Bảng 1.1: Một số chất hợp thứ cấp từ nấm được sản xuất thương mại Chất chuyển hoá Nguồn gốc nấm Ứng dụng TLTK Penicillins P. chrysogenum Kháng khuẩn [21] Cephalosporins Acremonium Kháng khuẩn [22] chrysogenum Griseofulvin P. griseofulvum Kháng nấm [23] Fusidin Fusidium Kháng khuẩn [24] coccineum Cyclosporins Tolypocladium spp. Thuốc ức chế miễn [25] dịch Zearalenone Gibberella zeae Chất thúc đẩy tăng [26] trưởng gia súc Strobilurins Strobilurus Kháng nấm [27] tenacellus, các chi Basidiomycete, Ascomycete, Bolinea lutea Gibberellins Gibberella Hóc môn thực vật [28] fujikuroi Lovastatin Monascus ruber, Chống mỡ máu [29] Aspergillus terreus
9 1.3. Vi nấm biển và các hợp chất thứ cấp từ vi nấm biển Hiện nay phần lớn nguồn nguyên liệu làm thuốc, đặc biệt thuốc y học cổ truyền được lấy từ các sinh vật hoang dã hoặc nuôi trồng trên đất liền, chỉ một phần nhỏ được khai thác từ các sinh vật sống biển. Nguồn nguyên liệu từ sinh vật hoang dã trên mặt đất ngày càng cạn kiệt, còn nguồn từ sinh vật biển vô cùng phong phú và đa dạng, nhưng còn ít được khai thác và sử dụng. Trong khi đó biển và đại dương chiếm 71% bề mặt trái đất, là nơi chứa đựng nhiều sinh vật biển khác nhau. Do các điều kiện vật lý và hóa học đặc biệt trong môi trường biển, hầu hết mọi lớp sinh vật biển đều hiển thị nhiều loại phân tử với các đặc điểm cấu trúc độc đáo [30]. Trong những năm gần đây, một số lượng đáng kể các chất chuyển hóa mới có tiềm năng dược lý đã được phát hiện từ các sinh vật biển, chẳng hạn như polyketide, alkaloid, peptide, protein, lipid, shikimate, glycoside, isoprenoids và hybrid, có hoạt tính sinh học bao gồm chống ung thư, kháng u, chống tăng sinh, chất kháng khuẩn, chất độc tế bào, chất bảo vệ hình ảnh, cũng như các đặc tính kháng sinh và chống hà [31]. Trong số đó, các vi sinh vật biển, chẳng hạn như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm và vi khuẩn lam đã được chú ý nhiều hơn với tư cách là những nhà sản xuất hợp chất tiềm năng. So với các động vật không xương sống ở biển, chúng là nguồn tái tạo và có thể tái sản xuất, vì chúng có thể được nuôi cấy và thậm chí có thể được coi là nhà máy sản xuất vi sinh vật tuyệt vời cho các sản phẩm tự nhiên [32]. Mặc dù đã có nhiều loại thuốc quan trọng đang sử dụng được phân lập từ vi nấm biển, nhưng số lượng các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ vi nấm biển vẫn tăng rất chậm. Chỉ từ cuối những năm 1980, các nhà nghiên cứu mới tập trung vào các loại nấm có nguồn gốc từ biển. Trên thực tế, vi nấm biển rất quan trọng cho các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học mới có thể được sử dụng làm thuốc. 1.3.1. Sơ lược về vi nấm biển Vi nấm là một trong những sinh vật đa dạng và quan trọng trên thế giới. Đã có khoảng 70.000 loài nấm được mô tả và trong đó gần 1.500 loài có nguồn gốc từ biển [33,34].