intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Luận văn thạc sỹ y khoa: Xác định đột biến gen KatG liên quan đên tính kháng thuốc I Soniazid của một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam

Chia sẻ: Carol123 Carol123 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:59

139
lượt xem
17
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3 dân số thế giới). Theo số liệu công bố của TCYTTG (2004), ước tính trong năm 2003 có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và 2 triệu người chết do lao. Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các nước có thu nhập vừa và thấp,...

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Luận văn thạc sỹ y khoa: Xác định đột biến gen KatG liên quan đên tính kháng thuốc I Soniazid của một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam

  1. Luận văn XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘT BIẾN GEN KatG LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG THUỐC I SONIAZID CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LAO TẠI VIỆT NAM
  2. MƠ ĐÂU ̉ ̀ 1. Lý do chọn đề tài Nhiêm vi khuân lao (Mycobacterium tuberculosis) là một trong những ̃ ̉ nhiêm trung phô biên nhât ơ loai ngươi ̃ ̀ ̉ ́ ́̉ ̀ ̀ . Hiên nay ty lê nhiêm vi khuân lao ̣ ̣̉ ̃ ̉ đươc xac đị nh la chiêm 1/3 dân sô thê giơi . Có khoảng 9 triêu ngươi măc lao ̣ ́ ̀ ́ ́́́ ̣ ̀ ́ mơi va hơn 3 triêu ngươi chêt do lao môi năm . Tuy vây ty lê phat hiên chỉ đat ́ ̀ ̣ ̀ ́ ̃ ̣ ̣̉ ́ ̣ ̣ 37% sô bênh nhân ươc tí nh . Vì vậy còn rất nhiều bệnh nhân lao không được ̣́ ́ chưa trị va đang tiêp tuc lam lây lan bênh cho c ộng đồng . ̃ ̀ ̣́̀ ̣ Hiên nay, bênh lao đang trơ nên nghiêm trong hơn vơi đăc trưng la khang ̣ ̣ ̉ ̣ ̣́ ̀ ́ đa thuôc. Trong cac trương hơp bênh lao khang đa thuôc, khó khăn không chỉ là ́ ́ ̀ ̣ ̣ ́ ́ điêu trị thât bai cao , dân đên lan truyên nhanh chong vi khuân lao ̀ ̣́ ̃ ́ ̀ ́ ̉ kháng đa thuôc ma con chưa tì m ra đươc nhưng thuôc thay thê hiêu qua va hơp ly , trong ́ ̀̀ ̣ ̃ ́ ̣́ ̣̉̀ ́ khi cac thuôc chông lao thưc sư co hiêu qua chỉ tâp trung co thuôc. ́ ́ ́ ̣ ̣̣́ ̉ ̣ ́ ́ 5 Nhưng bênh nhân bị nhiêm cac chung vi khuân lao khang đa thuôc râ ̃ ̣ ̃ ́ ̉ ̉ ́ ́ ́ t khó điều trị . Do đo viêc phat hiên sơm cac chung vi khuân lao khang đa thuôc ̣́ ́ ̣ ́ ́ ̉ ̉ ́ ́ sẽ góp phần đáng kể trong điều trị bệnh lao . Đê ch ẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc ̉ , hiên nay cac cơ sơ trong ̣ ́ ̉ nươc vân phai dưa vao nuôi câ y vi khuân va lam khang sinh đô ́ ̃ ̣̉ ̀ ́ ̉ ̀̀ ́ ̀ . Thơi gian ̀ chuân đoan lao khang thuôc cân í t nhât ̉ ́ ́ ́ ̀ ́ 4 – 6 tuân . Vơi thơi gian dai như ̀ ́ ̀ ̀ vây se kho khăn cho công tac điêu trị ̣ ̃ ́ ́ ̀ , khó đáp ứng yêu cầu giám sát và thanh toan bênh lao . ́ ̣ Khăc phuc như ng nhươc điêm đo , viêc ưng dung sinh hoc phân tư đang ́ ̣ ̃ ̣ ̉ ́ ̣́ ̣ ̣ ̉ tạo ra những đột phá trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc . Thơi gian ̀ chân đoan co thê rut ngăn xuông con vai ngay ̉ ́ ́ ̉́ ́ ́ ̀ ̀ ̀ , vơi đô nhây va đô đăc hiêu ́ ̣ ̣ ̣̣̀ ̣ cao, tạo điều kiệ n cho viêc kiêm soat bênh lao dê dang hơn . ̣ ̉ ̣́ ̃̀ 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
  3. Các nghiên cứu về sinh học phân tử trong chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc đã chỉ ra rằng mỗi loại kháng thuốc là do các gen tương ứng chịu trách nhiệm . Ví dụ, nêu chỉ ra đươc đô t biên ơ gen KatG cũng có nghĩa là chủng lao ́ ̣ ̣ ́̉ đo khang isoniazid . ́ ́ Xuât phat tư nhưng ly do trên , chúng tôi tiến hành đề tài : "Xác định ́ ́̀ ̃ ́ các đột biến trên gen katG liên quan đên tí nh khang thuôc i soniazid cua ́ ́ ́ ̉ môt sô chung vi khuân lao tai Viêt Nam". ̣́ ̉ ̉ ̣ ̣ 2. Mục tiêu nghiên cứu 1. Nhân ban đoan gen katG tư cac chung vi khuân lao nghiê n cứu. ̉ ̣ ̀́ ̉ ̉ 2. Phát hiện đột biến trên gen katG liên quan đên tính kháng isoniazid ở ́ các chủng vi khuân lao nghiê n cưu. ̉ ́ 3. Nôi dung nghiên cƣu ̣ ́ - Nhân ban đoan gen katG tư cac chung vi khuân lao nghiên cưu . ̉ ̣ ̀́ ̉ ̉ ́ - Tạo vector tái tổ hợp và biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli. - Tách dòng gen katG. - Giải trình tự gen katG. - Phát hiên , phân tích đôt biên trên gen katG liên quan đên tí nh khang ̣ ̣ ́ ́ ́ thuôc isoniazid ơ cac chung vi khuân lao nghiên cưu . ́ ̉́ ̉ ̉ ́ 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
  4. CHƢƠNG 1 TÔNG QUAN TÀI LIỆU ̉ 1.1. Tình hình bệnh lao 1.1.1. Tình hình bệnh lao trên thế giới Bệnh lao gắn liền với sự phát tr iển xã hội loài người từ hàng ngàn năm nay, trên thế giới chưa bao giờ và không có một quốc gia nào, một khu vực nào, một dân tộc nào không có người mắc bệnh lao và chết do lao [1]. Do sự phát minh các thuốc hóa học chống lao khiến việc chữa lao đơn giản hơn và hiệu quả hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng chủ quan của y giới, đã làm lãng quên căn bệnh nguy hiểm này. Ngày nay, bệnh lao đang xuất hiện trở lại và cùng với đại dịch HIV/AIDS trở thành một trong những căn nguyên gây mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước đang phát triển. Năm 1993, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) đã tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm hoạ của nó trong tương lai là bệnh lao kháng thuốc [22]. Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3 dân số thế giới). Theo số liệu công bố của TCYTTG (2004), ước tính trong năm 2003 có thêm khoảng 9 triệu người mắc lao mới và 2 triệu người chết do lao. Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết do lao ở các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ ở độ tuổi lao động. Trong đó, có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao [1,22]. Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 82%, nhưng tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính. Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
  5. ước tính của TCYTTG, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu người) [22]. Hơn 33% số bệnh nhâ n lao toàn cầu tại khu vực Đông nam Châu Á. Dưới đây là ước tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực [22]. Bảng 1.1: Ƣớc tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực Tử vong do lao Số BN (nghìn) Tỷ lệ/100 000 (bao gồm cả nhiễm HIV) Khu vực AFB Các AFB Các thể SL (nghìn) TL/100000 thể (+) (+) 2354 Châu Phi 1000 350 149 556 83 (26%) 370 Châu Mỹ 165 43 19 53 6 (4%) 622 Trung Đông 279 124 55 143 28 (7%) 472 Châu Âu 211 54 24 73 8 (5%) 2890 Đông nam Châu Á 1294 182 81 625 39 (33%) 2090 Tây Thái Bình Dương 939 122 55 373 22 (24%) 8797 Toàn cầu 3887 141 63 1823 29 (100%) Mức độ nặng nề của bệnh lao đã ảnh hưởng tới thu nhập quốc dân và chỉ số phát triển con người của các quốc gia. Các nghiên cứu về kinh tế y tế cho thấy, mỗi bệnh nhân lao sẽ mất trung bình 3 -4 tháng lao động, làm giảm 20-30% thu nhập bình quân của gia đình. Những gia đình có người chết sớm vì bệnh lao có thể sẽ mất tới 15 năm thu nhập. Bệnh lao đã tác động mạnh 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
  6. tới 70% đối tượng lao động chính của xã hội, làm lực lượng sản xuất bị giảm sút, năng suất lao động giảm và mùa màng, chợ búa sẽ khô ng tham gia được. Diễn đàn các đối tác chống lao lần thứ nhất diễn ra năm 2001 tại trụ sở của ngân hàng thế giới ở Washington D.C với sự có mặt của đại diện cấp Bộ trưởng từ các quốc gia có tình hình bệnh lao nặng nề đã nhận định, bệnh lao là nguyên nhân chủ yếu làm nghèo đói dai dẳng và là trở ngại đối với sự phát triển kinh tế xã hội [22]. Bệnh lao là bệnh của người nghèo, lây lan nhanh trong cộng đồng có điều kiện sống chật chội, thiếu vệ sinh, thông khí và dinh dưỡng kém. Trên 95% số bệnh nhân lao, 98% số chết do lao trên toàn cầu thuộc các n ước có thu nhập vừa và thấp, 75 % số người mắc bệnh lao ở các lứa tuổi 14 -55, là tuổi làm ra nhiều của cải nhất trong cuộc đời [1, 22]. Bệnh lao là kết quả của nghèo đói và nghèo đói lại là nguyên nhân làm cho bệnh lao phát triển. 1.1.2. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam Ở nước ta, bệnh lao còn phổ biến và ở mức độ trung bình cao. Việt Nam đứng thứ 13 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu (TCYTTG, 2004). Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và Philipinnes về số lượ ng bệnh nhân lao lưu hành cũng như bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm [1]. Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách thức mới là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế Việt Nam đã quyết định đưa Chương trình chống lao thành một trong những Chương trình y tế quốc gia trọng điểm. Cùng với sự đầu tư phát triển các Chương trình y tế quốc gia nói chung, Bộ Y tế và Chính phủ đã ưu tiên đầu tư đồng bộ lượng rất lớn cán bộ, kinh phí và trang thiết bị cho Chương trình 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
  7. chống lao. Ban chỉ đạo Chương trình chống lao và chính quyền địa phương các cấp đã tham gia tích cực triển khai công tác này, cùng với sự hợp tác và giúp đỡ có hiệu quả về tài chính và kỹ thuật của các tổ chức quốc tế [4]. Năm 1996, Chương trình chống lao quốc gia (CTCLQG) với sự hỗ trợ về kỹ thuật và tài chính của Chính phủ Hà Lan, hiệp hội chống lao hoàng gia Hà Lan, uỷ ban hợp tác y tế Hà Lan - Việt Nam, CTCLQG đã hình thành và xây dựng kế hoạch phòng chống lao giai đoạn 1996 -2000. Đến năm 1999, chiến lược DOTS (điều trị bằng hoá trị liệu ngắn ngày có kiểm soát trực tiếp) đã được bao phủ 100% số huyện trên cả nước [4]. Trong giai đoạn 1997-2002, CTCLQG đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với mục tiêu của TCYTTG là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi AFB (+) với tỷ lệ khỏi là 92% [3]. Năm 2002, khu vực Tây Thái Bình Dương phát hiện 806.460 bệnh nhân lao các thể, 372.220 bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới. Trong đó, số bệnh nhân do CTCLQG Việt Nam phát hiện chiếm 12% bệnh nhân các thể và 15% số bệnh nhân lao phổi AFB (+) mới [1]. Với những kết quả đạt được trong chỉ tiêu phát hiện và điều trị bệnh nhân, năm 1996, Việt Nam là nước đầu tiên ở Châu Á đã đạt được mục tiêu của TCYTTG. Việt Nam đã được TCYTTG và ngân hàng thế giới đánh giá cao thành tích đạt được trong mọi hoạt động chống lao. Từ năm 1997, TCYTTG và hiệp hội bài lao và bệnh phổi quốc tế cùng phối hợp với CTCLQG Việt Nam tổ chức 8 khoá học về quản lý Chương trình chống lao cho các học viên quốc tế tại Việt Nam. Mô hình hoạt động chống lao ở Việt Nam được xem là mô hình để học viên các nước học tập [4]. Vì là một trong số ít nước sớm nhất đạt được các mục tiêu phòng chống lao do TCYTTG đề ra, những kết quả đạt được có tính bền vững, nên tháng 10 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
  8. năm 2003 vừa qua CTCLQG Việt Na m đã nhận được giải thưởng của hội chống lao hoàng gia Hà Lan (KNCV) nhân lễ kỷ niệ m 100 năm ngày thành lập tổ chưc này. ́ Nhân ngày thế giới chống lao, 24/3/2004, tại diễn đàn các đối tác chống lao lần thứ 2 do TCYTTG tổ chức tại New Dehli, CTCLQG Việt Nam là một trong 6 nước trên thế giới (bao gồm: Việt Nam, Peru, Madives, Cuba, Tunisia và Morocco) và là nước duy nhất trong 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao được nhận giải thưởng của TCYTTG về thành tích đã đạt được mục tiêu của TCYTTG và kết quả có tính bền vững trên 4 năm [4]. Hiện nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% (ở các tỉnh phía nam là 2%, ở các tỉnh phía bắc là 1%). Ước tính với dân số 70-80 triệu, hàng năm ở nước ta có môt s ố lượng ̣ lơn người bị măc lao mơi . Số lư ợng người mắc lao mơi được th ể h iên qua ́ ́ ́ ́ ̣ bảng 1.2. Bảng 1.2: Bảng ƣớc tính số bệnh nhân mắc lao mới qua mỗi năm ở Việt Nam Số mới mắc lao (mọi thể): 130.000 Số lao phổi BK dương tính mới: 60.000 Tổng số trường hợp lao: 260.000 Tổng số lao phổi BK dương tính: 120.000 Nước ta thuộc loại trung bình về dịch tễ lao so với các nước vùng Tây Thái Bình Dương, vùng dịch tễ lao vào loại trung bình trên thế giới. Trên thực tế có thể chỉ số nguy cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn 1,5% như vậy các con số nêu trên có thể còn lớn hơ n. Điều đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tác chống lao không những trong những năm tới mà có thể còn trong thời gian khá dài, ngay cả khi đã bước sang thiên niên kỷ mới. 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
  9. 1.1.3. Tình hình lao kháng thuốc Theo báo cáo dựa trên thăm dò lớn về lao kháng thuốc toàn cầu của TCYTTG công bố ngày 26/2/2008, tỷ lệ nhiễm lao kháng nhiều thuốc hiện nay ở mức cao chưa từng có. Mỗi năm có khoảng nửa triệu ca lao kháng đa thuốc, theo ước tính của TCYTTG, chiếm khoảng 5% trong số 9 triệu ca nhiễm lao hàng năm. Cũng trong báo cáo này, lần đầu tiên lao kháng thuốc cực mạnh được đề cập, đây là một dạng gần như không chữa lành được [5]. Theo TCYTTG, hiện nay bệnh lao kháng thuốc là một vấn đề toàn cầu, đặc biệt nghiêm trọng là tình hình kháng đa thuốc. Bệnh lao khán g thuốc xuất hiện khi có vi khuẩn lao kháng với một hoặc nhiều loại thuốc chống lao, nguyên nhân là do bệnh nhân không hợp tác, không tuân thủ đúng nguyên tắc điều trị được quy định của chương trì nh chông lao , một nguyên nhân khác ́ hay gặp là do thầy thuốc kê đơn không đúng do không phối hợp đầy đủ các thuốc chống lao, liều lượng thuốc không đủ, hướng dẫn bệnh nhân không đúng cách, điều trị không đủ thời gian... Kết quả điều trị với bệnh nhân kháng thuốc thường không cao, nhất là đối với bệnh nhân kháng đa thuốc. Chi phí điều trị bệnh nhân lao kháng đa thuốc tăng lên 100 lần so với bệnh nhân lao không kháng thuốc và thậm chí không điều trị được ở một số trường hợp. Tỷ lệ kháng đa thuốc trong bệnh nhân lao mới ở khu vực Tây Thái Bình Dương dao động trong khoảng 1% đến 10,8% (theo một số nghiên cứu trong khu vực) [4]. Dư an nghiên cưu khang t huôc lao trên cơ sơ toan c ầu đươc thưc hiên ̣́ ́ ́ ́ ̉ ̀ ̣ ̣ ̣ tư năm 1995 vơi muc tiêu la xac đị nh đươc tông sô bênh nhân lao khang ̀ ́ ̣ ̀́ ̣ ̉ ̣́ ́ thuôc trên thê giơi băng nhưng phương phap thông nhât thư đô nhay vơi thuôc ́ ́́ ̀ ̃ ́ ́ ́ ̣̉ ̣ ́ ́ lao của vi khuẩn . Năm 1998, TCYTTG đa công bô kêt qua khao sat tì nh hì nh ̃ ́́ ̉ ̉ ́ vi khuân lao khang thuôc ơ 35 nươc va khu vưc trên thê giơi [6]. ̉ ́ ́̉ ́ ̀ ̣ ́́ Theo công bô nay , tỷ lệ kháng thuốc tiê n phat trung bì nh vơi riêng tư ng ́̀ ́ ́ ̀ loại thuốc có khác nhau , cụ thể là : kháng isoniazid 3,2%, rifampicin 0,2%, 8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
  10. ethambutol 0,3%, steptomycin 2,5% % , trong đo khang steptomycin ơ vung ́ ́ ̉̀ Ivanovo (Nga ) là nơi kháng đơn thuốc cao nhất . Tỷ lệ kh áng thuốc tiên phát trung bì nh la 9,9 % trong đo khang 1 thuôc chiêm 6,6 %, kháng 2 thuôc chiêm ̀ ́ ́ ́ ́ ́ ́ 2,5 %, kháng 3 thuôc chiêm 0,6 %, kháng bốn thuôc chiêm 0,2 %, kháng đa ́ ́ ́ ́ thuôc trung bì nh la 1,4 %. Tỷ lệ kháng thuốc tiên phát cao n hât 40,6 % ở cộng ́ ̀ ́ hòa Dominica , thâp nhât la 2% ở cộng hòa Séc [6]. ́ ́̀ Tình hình kháng thuốc mắc phải với từng loại thuốc cũng khác nhau : kháng isoniazid trung bì nh 6,3 %, rifampicin 0,7 %, ethambutol 0,4 %, steptomycin 2,6 %. Kháng thuôc măc phai vơi steptomycin ơ Cuba co ty lê ́ ́ ̉́ ̉ ̣́̉ cao nhât 57 %. Tỷ lệ kháng thuốc mắc phải trung bình trên toàn thế giới là ́ 36 %, trong đó kháng 1 loại thuốc 12,2 %, 2 loại thuốc 9,7 %, 3 loại thuốc 5,4 %, 4 loại thuốc 4,4 %. Lao khang đa thuôc măc phai co ty lê trung bì nh la ́ ́ ́ ̉ ̣́̉ ̀ 13 %. Kháng đa thuốc mắc phải cao nhất ở Latvia , có tỷ lệ 54 % [6]. Vi khuân lao khang đa thuôc la môt thach thưc lơn ̉ ́ ̣́̀ ́ ́ ́ , đe doa công cuôc ̣ ̣ phòng chống lao trên toàn cầu , vì các thuôc chông lao co hiêu qua hiên nay ́ ́ ̣́ ̣̉ đang bị vi khuân lao khang lai nhât la khang đa thuôc ̉ ́ ̣ ́̀ ́ ́ . Trong khi cac thuôc ́ ́ chông lao hang đâu chỉ co năm thuôc thì cac thuôc chông lao loai hai lai ́ ̀ ̀ ́ ́ ́ ́ ́ ̣ ̣ thương co đôc tí nh cao va gia thanh đăt [5]. ̀ ̣́ ̀́̀ ́ Viêc nghiên cưu lao khang thuôc ơ Viêt Nam đươc tiên hanh kha sơm . ̣ ́ ́ ́̉ ̣ ̣ ́ ̀ ́́ Năm 1958 Phạm Ngọc Thạc h va công sư đa công bô t ỷ lê khang thuôc măc ̣̀ ̣̃ ́ ̣ ́ ́ ́ phải v ới isoniazid là 53 %, vơi paraminosalicylic acid là 26 %, vơi ́ ́ steptomycin la 59 % [6]. ̀ Báo cáo của CTCLQG năm 1998 cho thây tì nh hì nh khang thuôc cua vi ́ ́ ́ ̉ khuân lao ơ Viêt Nam la môt vân đê đang lo ngai ̉ ̉ ̣ ̣̀́ ̀́ ̣ . Tỷ lệ kháng thuốc tiên phát là 32,5 % đưng thư tư trong khao sat cua TCYTTG sau Latvia ́ ́ ̉ ́̉ (34%), Thái Lan (36,6%), và Cộng hòa Dominica (40,6%). Qua cac nghiên cưu đa ́ ́ ̃ cho thây Viêt Nam la môt trong nhưng quôc gia co ty lê bênh lao khang thuôc ́ ̣ ̣̀ ̃ ́ ̣̣́̉ ́ ́ cao trên thê giơi [6]. ́́ 9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
  11. Nhiêm vi khuân lao khang thuôc la nguyên nhân dân đên thâ t bai trong ̃ ̉ ́ ́̀ ̃ ́ ́ ̣ điêu trị . Nhưng bênh nhân lao mơi co thê chưa khoi 95 – 100%. Nhưng bênh ̀ ̃ ̣ ́́ ̉ ̃ ̉ ̣ nhân lao khang thuôc măc phai , tỷ lệ chữa khỏi chỉ 20 – 30% [22]. Kêt qua ́ ́ ́ ̉ ́ ̉ còn thâp hơn nưa ơ nhưng trương hơp khang đa thuôc măc phai thậm chí không ́ ̃̉ ̃ ̀ ̣ ́ ́ ́ ̉, chưa đươc. Nguy hiêm hơn la cac bênh nhân nay co thê tiêp tuc truyên bênh cho ̃ ̣ ̉ ̀́ ̣ ̀ ̣́̉́ ̀ ̣ ngươi khac . Vì vậy việc phát hiện và ngăn chặn sự lan tràn của các chủng lao ̀ ́ kháng đa thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong chiế lươc điêu trị lao hiên nay ṇ ̀ ̣ . 1.2. Vi khuân lao ̉ 1.2.1. Đặc điểm phân loai ̣ Vi khuân lao thuôc giơi Bacteria ̉ ̣ ́ , ngành Actinobacteria , bô ̣ Actinomycetales , phân bô, họ Mycobacteriaceae , giông Mycobac terium [18]. ̣ ́ Tên khoa hoc cua vi khuân lao là: Mycobacterium tuberculosis. ̣ ̉ ̉ Các chủng vi khuẩn lao được chia làm 2 nhóm : M ycobacterium tuberculosis gôm bôn ̀ ́ loài có khả năng gây bệnh ở người , và nhóm Mycobacteria other than tuberculosis gôm nhiêu loai không gây bênh ơ ̀ ̀ ̀ ̣ ̉ ngươi [6,7]. ̀ 1.2.2. Đặc điểm hình thể Vi khuẩn lao có hình trực khuẩn , kích thước 2 – 4 μm, rông 0,3 – 1,5 ̣ μm. Trưc khuân thanh manh , đưng riêng le hoăc xêp thanh hì nh chư N , Y, V ̣ ̉ ̉ ́ ̉ ̣ ́ ̀ ̃ hoăc thanh day phân nhanh như canh cây . ̣ ̀ ̃ ́ ̀ Vi khuẩn lao không di đông , không sinh bao tử, khó băt màu các thuôc ̣ ̀ ́ ́ nhuôm thông thường do co lớp sáp ở thành tế bào [7]. ̣ ́ 1.2.3. Khả năng gây bệnh Các bệnh lý nhiễm trùng là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên thế giới. Không chỉ có những bệnh nhiễm trùng mới phát sinh mà những bệnh nhiễm trùng cũ gây chết người đã biết từ lâu cũng tái xuất hiện. Hơn nữa tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh đề kháng kháng sinh ngày càng tăng cao là nguy cơ lớn cho sức khỏe cộng đồng. Những bằng chứng gần đây cho thấy các tác nhân gây bệnh mặc dù rất khác nhau đều sử dụng những phương thức chung để 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
  12. phát động quá trình nhiễm trùng và gây bệnh. Những cơ chế này tạo nên độc lực của vi khuẩn. Tìm hiểu các cơ chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập và gây bệnh có ý nghĩa quan trọng trong cuộc chiến chống lại các tác nhân bé nhỏ này [7]. Độc lực của vi khuẩn lao có liên quan đến “Cord factor” (trehalose – 6,6’ – dimycolate ) là chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu , gây nên nhưng u hat man tí nh . Miên dị ch trong bê nh lao ngay nay đươc xac đị nh la ̃ ̣ ̃ ̃ ̣ ̀ ̣ ́ ̀ đap ưng miên dị ch qua trung gian tê bao ́́ ̃ ́̀ . Đap ưng miên dị ch lam châm sư ́́ ̃ ̀ ̣ ̣ nhân lên cua vi khuân lao , gây han chê sư lan tran cua vi khuân lao , dân tơi ̉ ̉ ̣ ̣́ ̀ ̉ ̉ ̃́ phá hủy tế bào vi khuẩn . Đap ưng miên d ịch trong bệnh lao phát sinh một ́́ ̃ phản ứng quá muộn . Môt sô trương hơp vi khuân lao co kha năng ưc chê hoăc ̣́ ̀ ̣ ̉ ́ ̉ ́ ́ ̣ tiêu diê t trơ lai bach câu ngươi va tôn tai dươi dang ngu trong cac u hat nên cơ ̣ ̣̉ ̣ ̀ ̣̀̀̀ ́ ̣ ̉ ́ ̣ thê không tiêu diêt đươc . Đặc bi ệt trong cac trương hơp lao khang thuôc cơ ̉ ̣ ̣ ́ ̀ ̣ ́ ́ thê không tiêu diêt đươc vi khuân va cac thuôc cung không tac đông đươc . Đo ̉ ̣ ̣ ̉ ̀́ ́ ̃ ́ ̣ ̣ ́ là một vấn đề nan giả i trong điêu trị bênh lao [8]. ̀ ̣ Vi khuân lao co thê vao cơ thê qua nhiêu đương , thươ ng la qua đương ̉ ́̉̀ ̉ ̀ ̀ ̀ ̀ ̀ hô hâp , bên canh đo la cac đương tiêu hoa , da, kêt mac măt ... Sau khi gây tôn ́ ̣ ́̀́ ̀ ́ ́ ̣ ́ ̉ thương tiên phat , vi khuân lao co thê theo đương bach huyêt hoăc đương mau ́ ̉ ́̉ ̀ ̣ ́ ̣ ̀ ́ tơi cơ quan khac gây tôn thương thư phat . ́ ́ ̉ ́ ́ Nhiêu cơ quan : phôi, thân, màng não , xương , hạch, da... đều có thể bị ̀ ̉ ̣ vi khuân lao xâm nhâp , nhưng thương bị hơn ca la phôi va vị trí găp nhiêu ̉ ̣ ̀ ̉̀ ̉̀ ̣ ̀ nhât la đỉ nh phôi , nơi co phân ap oxy 120 mmHg [6]. ́̀ ̉ ́ ́ 1.2.4. Hê gen cua vi khuân lao ̣ ̉ ̉ Hê gen cua v i khuân lao đa đươc đoc trì nh tư , có chiều dài 4.411.522 ̣ ̉ ̉ ̃ ̣ ̣ ̣ căp base trong đo co 3.924 trình tự được dự đoán là có mã hóa protein , tỷ lệ G ̣ ́́ + C chiêm đên 65,6%. Genome cua vi khuân lao co chưa tơi 90,8 % trình tự ́ ́ ̉ ̉ ́ ́ ́ mã hóa protei n va chỉ co 6 gen gia [28]. ̀ ́ ̉ 11 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
  13. 1.3. Gen KatG và tính kháng thuốc isoniazid ở vi khuẩn lao Gen katG là một đoạn DNA có kích thước 2223 bp, năm trên nhiêm săc ̀ ̃ ́ thê cua vi khuân lao va chị u trach nhiêm mã hóa cho enzyme catalase ̉̉ ̉ ̀ ́ ̣ - peroxidase. Ngươi ta nhân thây co khoang 95% các chủng vi khuẩn lao kháng ̀ ̣ ́ ́ ̉ isoniazid có đột biến trên gen này [28]. Gen katG mã hóa cho enzyme catalase-peroxidase. Enzyme này hoạt hóa isoniazid bằng cách kết hợp axyl isonicotinic với NADH để tạo thành phức hệ axyl isonicotinic -NADH. Phức hệ này liên kết chặt chẽ với enzyme ketoenoylreductase (mã hóa bởi gen InhA), theo đó làm ngăn cản cơ chất enoyl-AcpM. Quá trình này làm ức chế sự tổng hợp axit mycolic cần cho thành tế bào vi khuẩn lao. Cơ chế phân tử c ủa tính kháng isoniazid chủ yếu có liên quan tới đột biến thêm đoạn/mất đoạn hoặc các đột biến nhầm nghĩa/vô nghĩa, trong đó chủ yếu diễn ra tại codon 315 và 463 (S315T) của gen katG mã hóa catalase-peroxidase. Nếu có sự biến dạng hay đột biến ở base thứ 2 tại codon 315 của gen katG (AGC biến thành ACC hay ACA) sẽ dẫn đến làm giảm hoặc mất hoàn toàn hoạt tính của enzyme catalase -peroxidase do đó M. tuberculosis sẽ trở thành kháng thuốc isoniazid [51]. Do đó phát hiện sự thay đổi di truyền này trong gen katG có thể cung cấp một phương pháp sàng lọc nhanh và chính xác cho việc phát hiện các chủng M. tuberculosis kháng isoniazid. 1.4. Chân đoan vi khuân lao khang Isoniazid ̉ ́ ̉ ́ Vi khuân lao khang isoniazid đươc xác định theo phương pháp ̉ ́ ̣ chân ̉ đoan kiêu gen. Các phương pháp chẩn đoán kiểu gen đều dựa trên cơ sở xác ́ ̉ đị nh đôt biên ơ cac gen co liên quan khang thuôc tương ưng . ̣ ́̉́ ́ ́ ́ ́ Đê xac đị nh đôt biên trên gen ̉́ ̣ ́ katG hiên co nhiêu phương phap , song ̣ ́ ̀ ́ giải trình gen vẫn là phương phá p cơ ban , chính xác , rõ ràng nhất . Tuy nhiên ̉ đây la phương phap không phai nơi nao cung lam đươc vì đoi hoi may moc ̀ ́ ̉ ̀ ̃ ̀ ̣ ̀̉ ́ ́ thiêt bị đăt tiên va nhân lưc co trì nh đô đê vân hanh khai thac [28]. ́ ́ ̀ ̀ ̣ ́ ̣̣̉ ̀ ́ 12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
  14. Giải trình tự (DNA squencing ) là p hương phap xac đị nh vị trí săp xêp ́ ́ ́ ́ các nucleotide trong phân tư DNA . Nguyên ly cua phương phap nay la : Tông ̉ ́̉ ́ ̀̀ ̉ hơp cac mach đơn DNA mơi co đô dai ngăn hơn mach khu ôn, nhơ ky thuât ̣ ́ ̣ ́́ ̣̀ ́ ̣ ̀̃ ̣ đanh dâu va ngăt đoan trong qua trì nh tông h ́ ́ ̀ ́ ̣ ́ ̉ ợp mạch DNA , thu đươc cac ̣ ́ mạch đơn hơn kem nhau môt base ́ ̣ tư đo co đươc sơ đô trât tư mach DNA ̀́́ ̣ ̣̣̀ ̣ khuôn mâu . So sanh trât tư cua mâu thí nghiêm vơi trât tư DNA ch uẩn ta biết ̃ ́ ̣̣̉ ̃ ̣ ́ ̣̣ đươc vị trí các sai lệch (đôt biên ) [33]. ̣ ̣ ́ Ứng dụ ng cac ky thuât sinh hoc phân tư đa xac đị nh cac chung vi ́ ̃ ̣ ̣ ̉̃́ ́ ̉ khuân lao khang isoniazid la do co đôt biên ơ gen ̉ ́ ̀ ̣́ ́̉ katG. Codon xảy ra đôt ̣ biên la codo n 315 [34]. ́̀ Sư đôt biên xay ra la do thay thê nucleotid e ơ codon 315 (AGC  ACC ̣̣ ́ ̉ ̀ ́ ̉ hoăc AGC  ACA) [34]. ̣ Đê giai trì nh tư gen katG, hiên nay ngươi ta co thê thưc hiên trưc tiêp ̉̉ ̣ ̣ ̀ ́ ̣̉ ̣ ̣ ́ tư san phâm PCR . Khi san phâm PCR la đơn nhât va co đô dài thích hợp cho ̀̉ ̉ ̉ ̉ ̀ ̣́̀́ viêc phân tí ch kêt qua thì co thê thưc hiên giai trì nh ̣ ́ ̉ ́ ̣̉ ̣ ̉ tư trưc tiêp . Cũng có thể ̣̣ ́ giải trình tự thông qua tach dong , găn đoan gen katG cân nghiên cưu vao ́ ̀ ́ ̣ ̀ ́ ̀ vector. Đoan gen cung vơi vector tai tô hơp đươc nhân lên trong tê bao E.coli. ̣ ̀ ́ ̣́̉ ̣ ́̀ Khi giai trì nh tư gen , cả đoạn gen katG và 1 phần vector đê u đươc xac đị nh ̉ ̣ ̀ ̣ ́ trình tự . Giải trình tự thông qua tách dòng đươc ưng dung khi san phâm PCR ̣́ ̣ ̉ ̉ không đươc tôt , đăc biêt là trong các trương hơp gây đôt biên nhân tao kiêm ̣ ́ ̣ ̣ ̀ ̣ ̣ ́ ̣ ̉ chưng khang thuôc va trong nghiên cưu biêu h iên gen [6]. ́ ́ ́ ̀ ́ ̉ ̣ 13 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
  15. CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG, VÂT LIÊU VA PHƢƠNG PHAP NGHIÊN CƢU ̣ ̣ ̀ ́ ́ 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn lao M. tuberculosis được cung cấp bởi Học viện Quân y. Bảng 2.1: Đặc điểm kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn lao Mã DNA Mã Chủng Kháng thuốc ĐA1 TB06-22 HSRE ĐA2 TB06-23 HSRE ĐA3 TB06-26 HSRE ĐA4 TB06-27 HSR ĐA5 TB06-28 HSRE ĐA6 TB06-31 HSRE ĐA7 TB06-33 HSRE ĐA8 TB06-35 HSR ĐA9 TB06-36 HSRE ĐA10 TB06-37 HSRE ĐA11 TB06-38 HSRE ĐA12 TB06-39 HSR ĐA13 TB06-41 HSRE ĐA14 TB06-51 HSRE 14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
  16. 2.2. Vât liêu thiêt bị va dung cu nghiê n cƣu ̣ ̣ ́ ̣̀ ̣ ́ 2.2.1. Các sinh phẩm hóa chất chính Bảng 2.2: Các sinh phẩm hóa chất chính Tên hoa chât ́ ́ Hãng sản xuất 1. H/c dung trong PCR ̀ Applied BioSciences (Mỹ) Tris base Fermentas (Mỹ) Lysozyme Sigma (Mỹ) Proteinase K Sigma (Mỹ) Agarose Thang chuân DNA ̉ Fermentas (Mỹ) Fermentas (Mỹ) EDTA Fermentas (Mỹ) Taq-DNA-polymerase 2. H/c sinh phâm dung trong tach dong ̉ ̀ ́ ̀ Fermentas (Mỹ) Pepton Fermentas (Mỹ) Yeast Extract Fermentas (Mỹ) Nacl Fermentas (Mỹ) Agar Fermentas (Mỹ) Ampicilin Fermentas (Mỹ) X-gal Fermentas (Mỹ) IPTG Fermentas (Mỹ) Accuprep plasmid Mini Extraction Kit Fermentas (Mỹ) EcoRI Fermentas (Mỹ) pBT 3. H/c phuc vu giai trì nh tƣ gen e ̣ ̣ ̉ ̣ Applied BioSciences (Mỹ) Big Dye Terminator V3.1 Applied BioSciences (Mỹ) HiDi Formamid Ethanol tuyê đôi ̣́ Fermentas (Mỹ) 15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
  17. 2.2.2. Các máy và thiết bị chính Bảng 2.3: Các máy và thiết bị chính Tên may, thiêt bị ́ ́ Hãng sản xuất Tủ ấ m ôn nhiêt ̉ ̣ Sanyo (Nhât Ban ) ̣ ̉ Máy PCR (GenAmp PCR System 9700) Applied BioSciences (Mỹ) Máy PCR (Thermo cycle) Bio -rad (Pháp ) Máy ly tâm (Biofuge Primo R) Heraeus (Mỹ) Máy đo pH (Digital pH Meter Delta 320) Thommas Scientific (Mỹ) Máy chụp ảnh Gel -Doc Dolphin (Mỹ) Tủ lạnh -200C, -800C Nuaire (Mỹ) Lò vi sóng Sanyo (Nhât B ản) ̣ Tủ an toàn sinh học cấp II Nuaire Nuaire (Mỹ) Bê ôn nhiêt ̉̉ ̣ Memmert (Đức ) Máy lăc Gyromax 737R ́ Amerex Instrument (Đức ) Máy quang phổ tử ngoại khả biến Nano Drop Analitika (Đức ) Máy phân tích trình tự DNA ABI 3100- Applied BioSciences (Mỹ) Avant 2.2.3. Các mồi dùng trong nghiên cứu Các mồi đăc hiêu cho phat hiên trưc khuân lao va lao khang thuôc đươc ̣ ̣ ́ ̣ ̣ ̉ ̀ ́ ́ ̣ sư dung cho phan ưng PCR n hân cac đoan gen đí ch co trì nh tư tương ưng la : ̣̉ ̉́ ́ ̣ ́ ̣ ́ ̀ - Căp môi dùng cho nhân trì nh tư gen katG: ̣ ̀ ̣ KatG F: 5'-GAG CCC GAT GAG GTC TAT TG-3' KatG R: 5'-ACA AGC TGA TCC ACC GAG AC-3' - Căp môi dùng cho giải trình tự gen katG: ̣ ̀ M13 F: 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3' M13 R: 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' Các trình tự này được gửi tổng hợp ở công ty Invitrogen , Hông Kông . ̀ 16 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
  18. 2.3. Phƣơng phap nghiên cƣu ́ ́ 2.3.1. Thiêt kê nghiên cƣu ́́ ́ Tiên hanh nghiên cưu theo phương phap : ́ ̀ ́ ́ - Dịch tễ học mô tả , điêu tra căt ngang , có đối chứng . ̀ ́ - Thưc nghiêm labo co đôi chưng . ̣ ̣ ́́ ́ Sơ đô nghiên cƣu ̀ ́ DNA (Tách từ vi khuẩn lao đa đƣơc xac đị nh tí nh ̃ ̣ ́ kháng thuốc ) Nhân ban đoan gen katG ̉ ̣ sƣ dung môi đăc hiêu ̣̉ ̀ ̣ ̣ Sản phẩm gen KatG Tách dòng gen KatG Sản phẩm vector có đoạn gen KatG Xác định đột biến liên Giải trình tự gen KatG quan đên tí nh khang INH ́ ́ 17 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
  19. 2.3.2. Các kỹ thuật cụ thể 2.3.2.1. Kỹ thuật nhân ban đoan gen katG sư dung môi đăc hiêu ̉ ̣ ̣̉ ̀ ̣ ̣ Sơ đô qui trì nh nhân bản đoạn gen KatG ̀ Đo nông đô DNA cua mâu ̀ ̣ ̉ ̃ nghiên cƣu ́ Tính toán giá trị các thành phân phản ứng PCR ̀ Tạo hỗn hợp phản ứng Nhân gen theo chu trì nh nhiêt đa đƣơc tôi ƣu hoa ̣̃ ̣ ́ ́ Điên di kiêm tra vach đăc ̣ ̉ ̣ ̣ hiêu ̣ Sƣ dung san phâm PCR lam ̣̉ ̉ ̉ ̀ DNA chen vao plasmid ̀ ̀ Cụ thể: 1. Sau khi đo nông đô DNA khuô n, tính và tạo các nồng độ DNA của ̀ ̣ các mẫu như nha u đê khi đưa vao hôn hơp san phâm cùng môt thê tí ch DNA ̉ ̀ ̃ ̣ ̉ ̉ ̣ ̉ khuôn, và đạt khoảng 100 ng/thê tí ch 25µl phản ứng . ̉ 2. Tính các giá trị của các thành phần khác . 18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
  20. Bảng 2.4: Tính toán các thành phần cho phản ứng PCR Thành phần phản ứng PCR Thê tí ch (µl) ̉ Nông đô ̀ ̣ Nươc ́ 10,25 MgCl2 (25 mM) 2,5 2 mM PCR bufer (10X) 2,5 1X dNTP mix (5mM) 2,5 0,2 mM Môi KatG F ̀ 1 0,5 µM Môi KatG R ̀ 1 0,5 µM Taq Polymerase 0,25 1 unit DNA khuôn 5 Tông ̉ 25 Các thành phần này ở phản ứng của các mẫu bệnh phẩm đều giống nhau. Có đối chứng âm khi tiến hành phản ứng . 3. Chu trì nh nhiêt như sau : ̣ 35 chu ky ̀ 950C 950C 720C 720C 5 phút 1 phút 1 phút 4 phút 560C 45 giây 40C 60 phút 4. Điên di san phâm PCR trên a garose 1,5%, nhuôm Ethidium bromide ̣ ̉ ̉ ̣ và đọc kết quả trên máy Gel - Doc. 19 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
3=>0