Nghiên cứu đặc điểm vi học và thành phần hóa học của xuyên tâm tâm liên (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees)

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VI HỌC VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA XUYÊN TÂM TÂM<br /> LIÊN (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees)<br /> <br /> Nguyễn Ngọc Chương∗, Nguyễn Ngọc Vinh∗∗,Võ Thị Bạch Huệ∗∗∗<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Nghiên cứu thực vật học, phân lập các diterpenlacton từ dược liệu Xuyên tâm liên góp phần xây dựng<br /> chuyên luận dược liệu xuyên tâm liên cho Dược ñiển Việt Nam, chuẩn hoá dược liệu và các chế phẩm.<br /> Đối tương và phương pháp nghiên cứu: Dược liệu Xuyên tâm liên do Trung tâm nghiên cứu dược liệu miền<br /> trung cung cấp. Mô tả ñặc ñiểm hình thái thực vật, ñặc ñiểm vi học qua kính hiển vi, xác ñịnh các nhóm họat chất hóa<br /> học bằng các phản ứng hóa học ñặc trưng. Chiết xuất và phân lập các diterpenlacton dựa vào ñộ phân cực khác nhau<br /> của dung môi. Đánh giá ñộ tinh khiết các chất chiết xuất bằng phản ứng hóa học, sắc ký lớp mỏng, phổ UV, phổ IR,<br /> HPLC và khối phổ.<br /> Kết quả: Đã xác ñịnh ñặc ñiểm hình thái thực vật, ñặc ñiểm vi học và hóa học của Xuyên tâm liên. Phân lập ñược<br /> Andrograrpholid, dehydroandrographolid và chúng ñã ñược ñánh giá mức ñộ tinh khiết.<br /> Kết luận: Kết quả nghiên cứu có thể góp phần xây dựng chuyên luận dược liệu Xuyên tâm liên cho Dược ñiển<br /> Việt Nam. Các chất phân lập ñược rất cần thiết ñể chuẩn hóa dược liệu này và các chế phẩm có chứa Xuyên tâm liên.<br /> Từ khóa: Andrographolid, dehydroandrographolid, Diterpenlacton, Xuyên tâm liên, thực vật học, chiết xuất,<br /> phân lập.<br /> ABSTRACT<br /> <br /> STUDIES ON MICROSCOPIC CHARACTERISTICS AND CHEMICAL COMPONENTS OF<br /> Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees<br /> Nguyen Ngoc Chuong, Nguyen Ngoc Vinh, Vo Thi Bach Hue<br /> Objective: The phytology research on Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees and isolation diterpenlactons<br /> from this traditional medicinal plant to contribute a special issue of medicinal plant for Vietnamese Pharmacopoeia<br /> and to standardize this plant and preparations.<br /> Materials and methods: The plants were provided by The Medicinal plant research Center of Midle of Viet Nam.<br /> Botanical characteristics were described by observation. Microscopic characteristics determined by microscopy<br /> method. Identify the chemical components by mean of chemical reaction. Extraction and isolation diterpenlactons<br /> base on polarization of the solvents. The purity of isolated substances were evaluated on the basic of chemical<br /> reaction, thin layer chromatography, UV spectral, IR spectral, HPLC and MS.<br /> Results: Botany characteristics, Microscopic characteristics, chemical components were determined.<br /> Androgarpholid and dehydroandrographolid were isolated and evaluated the purity.<br /> Conclusion: The results can contribute a special issue of Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees for<br /> Vietnamese Pharmacopoeia. The isolated substances are necessary for standardizing of this plant and preparations.<br /> Key words: Andrographolid, dehydroandrographolid, Diterpenlacton, Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees,<br /> phytology, extraction, isolation<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Cây Xuyên tâm liên có tên khoa học là Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees, ñã có một thời gian ñược sử<br /> dụng phổ biến, rất nhiều người quan tâm và ñược xem là một vị thuốc không thể thiếu ñược với tủ thuốc gia ñình,<br /> trạm y tế và các bệnh viện ở nước ta, là thần dược cho các bệnh kèm theo sốt, các bệnh của gan và mắt. [7],[10],[11]<br /> Nhiều năm qua ở Việt Nam, Xuyên tâm liên dần dần ñã bị lãng quên, trong khi ñó các nhà khoa học và nhiều hãng<br /> dược phẩm nước ngoài ñã chứng minh giá trị của dược liệu này bằng nhiều kết quả nghiên cứu và ñã có nhiều ứng<br /> dụng thực tế trên lâm sàng, cho thấy nó có các tác dụng kháng viêm, thải ñộc, nâng cao sức ñề kháng, kháng vi khuẩn<br /> và virus [3],[4],[6],[8]. Hiện nay, nước ta ñang có nhiều nơi phát triển vùng trông Xuyên tâm liên, tạo ñiều kiện khôi<br /> phục lại sản xuất và sử dụng dược liệu quý này. Mặt khác Dược ñiển Việt nam cũng chưa có chuyên luận về dược liệu<br /> này. Vì vậy việc xác ñịnh ñặc ñiểm vi học và thành phần hóa học của xuyên tâm liên là cần thiết giúp cho việc tiêu<br /> chuẩn hóa nguồn nguyên liệu và các chế phẩm có chứa Xuyên tâm liên.<br /> ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> ∗<br /> <br /> Khoa Y học Cổ Truyền- Đại học Y Dược Tp. HCM<br /> Viện kiểm nghiệm thuốc Tp. HCM<br /> ∗∗∗<br /> Khoa Dược –Đại học Y Dược Tp. HCM<br /> Địa chỉ liên hệ: ThS. Nguyễn Ngọc Chương<br /> ĐT: 0913640750<br /> ∗∗<br /> <br /> Email: ngngchuong@yahoo.fr<br /> <br /> 157<br /> <br /> Cây Xuyên tâm liên do Trung tâm nghiên cứu và sản xuất dược liệu miền trung cung cấp. Chuẩn làm việc<br /> andrographolid và dehydroandrographolid do Viện công nghệ hóa học cung cấp, ñã xác ñịnh cấu trúc.<br /> Dung môi, hóa chất, thuốc thử<br /> Chloroform, methanol (Trung Quốc, Merck), acetonitril (Merck), H3PO4, nước cất 2 lần.<br /> acid 3,5-dinitrobenzoic, kali hydroxid, acid sulfuric, vanillin, acid acetic băng, than hoạt tính.<br /> Thuốc thử Vanillin sulfuric, Thuốc thử Kedde<br /> Máy móc – dụng cụ<br /> Bản mỏng silicagel F 254, bể nước ñun cách thủy, bể siêu âm Ultrasonic Branson 3510, cân phân tích Metler<br /> Toledo AB-204, máy cô quay Buchi, kính hiển vi quang học Olympus, tủ sấy Shellab 1330 FX, cân phân tích Mettler<br /> Toledo AB265-S, các loại dụng cụ thủy tinh chính xác, lò nung Heraeus D6450, máy ño ñiểm chảy Stuart smp3, máy<br /> ño phổ hồng ngoại FTIR NICOLET MAGNA 760, máy HPLC LC-20AD (SHIMADZU), ñầu dò PDA SPD-M20AD,<br /> máy sắc ký lỏng cao áp ghép khối phổ AGILENT 1100 LC-MSD.<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Khảo sát về thực vật học: ñặc ñiểm hình thái, vi phẫu, soi bột, hóa thực vật<br /> Bằng cảm quan mô tả ñặc ñiểm thực vật học dựa trên quan sát cây tươi. Cắt ngang vi phẫu thân, lá nhuộm vi phẫu<br /> bằng phương pháp nhuộm kép (dùng ñỏ carmin và lục iod) quan sát bằng kính hiển vi và mô tả. Nhận xét cảm quan<br /> bột dược liệu và quan sát dưới kính hiển vi các ñặc ñiểm của lông che chở, mạch dẫn, sợi, tế bào mô cứng, hạt tinh<br /> bột, tinh thể... của dược liệu. Xác ñịnh mẫu thực vật bằng các khảo sát hóa học dựa trên nguyên tắc chiết 50 g dược<br /> liệu bằng ethanol thu ñược 50 ml dịch chiết, thực hiện phản ứng hóa học với các thuốc thử chuyên biệt nhằm xác ñịnh<br /> các nhóm hoạt chất diterpenlacton, flavonoid<br /> Chiết xuất diterpen lacton toàn phần từ xuyên tâm liên<br /> Nguyên liệu là phần trên mặt ñất của cây Xuyên tâm liên ñược xay nhỏ, ngấm kiệt với dung môi ethanol. Loại tạp<br /> bằng than hoạt tính. Cô dịch chiết ñể thu ñược cao lỏng dược liệu chứa diterpen lacton toàn phần.<br /> Phân lập andrographolid, dehydroandrographolid<br /> Tiến hành tách andrographolid từ cao lỏng bằng phương pháp kết tinh trong ethanol và tái kết tinh nhiều lần trong<br /> MeOH.<br /> Dehydroandrographolid có tỉ lệ thấp hơn, ñược tách qua sắc ký cột bằng cách thay ñổi ñộ phân cực của dung môi<br /> ly giải. Sau ñó chúng cũng ñược tái kết tinh nhiều lần qua methanol.<br /> Tiến hành khảo sát hệ dung môi chạy sắc ký trên sắc ký bản mỏng ñối với chất chuẩn và chất cần khảo sát. Trước<br /> tiên là chọn hệ bắt ñầu chạy cột là hệ ñẩy ñược các tạp chất phía trên chất cần tách ñến vị trí có Rf > 0,2 và chất cần<br /> tách không di chuyển. Tiếp theo là hệ ñẩy ñược chất cần tách ñến vị trí có Rf > 0,2 và các tạp chất phía dưới chất cần<br /> tách không di chuyển.<br /> Khảo sát chất ñã chiết tách dùng làm chất chuẩn<br /> Khảo sát chất ñã chiết tách so với chất chuẩn andrographolid và Dehydroandrographolid chuẩn theo các chỉ tiêu<br /> sau: cảm quan, phản ứng hóa học, ñiểm nóng chảy, sắc ký lớp mỏng, phổ tử ngoại UV, phổ hồng ngoại IR, HPLC,<br /> phổ MS.<br /> KẾT QUẢ<br /> Khảo sát thực vật học về ñặc ñiểm hình thái, vi phẫu, soi bột của Xuyên tâm liên<br /> Thân: cỏ ñứng, cao 0,5-1 m, phân nhánh nhiều. Thân vuông, nhẵn; ở thân già mấu lá thường phình to. Lá: ñơn,<br /> nguyên, mọc ñối chéo chữ thập. Phiến lá thuôn dài hình mũi mác có ñáy hẹp hoặc hình xoan thon hẹp do men dần<br /> xuống cuống, ñỉnh nhọn, dài 4-8 cm, rộng 1,5-2,5 cm, nhẵn. Gân lá hình lông chim, nổi rõ ở mặt dưới, có 4-5 cặp gân<br /> phụ. Cuống lá rất ngắn, khoảng 1-2 mm không có lá kèm. Cụm hoa: là chùm kép ở nách lá hoặc ở ngọn cành. Nhánh<br /> mang hoa còn non cong lên ở ñỉnh. Hoa: nhỏ, dài khoảng 1,2-1,3 cm, màu trắng, ñiểm những ñốm hồng tím, không<br /> ñều, lưỡng tính, mẫu 5, cuống hoa dài khoảng 4-6 mm. Lá bắc: dài khoảng 2 mm, dạng dải hẹp, lá bắc con dạng sợi<br /> màu xanh nhỏ hơn lá bắc. Lá ñài: 5, rời, ñều, dài khoảng 3 mm, dạng tam giác hẹp màu xanh, có lông thưa trắng.<br /> Cánh hoa: hợp thành ống hình trụ dài 6 mm, có lông, phần trên loe ra và chia thành 2 môi 2/3 rõ, môi trên có thùy cạn,<br /> màu trắng không có sọc tím; môi dưới xẻ 3 thùy rộng có sọc hồng tím, ñầu nhọn; tiền khai lợp. Nhị: 2, ñính ở họng<br /> tràng; chỉ nhị rời, dạng sợi màu trắng, 2 bao phấn dính nhau ở ñáy, bao phấn hình hạt ñậu, màu tím, nứt dọc, hướng<br /> trong, hạt phấn rời, màu vàng nhạt, hình bầu dục có các rãnh dọc. Nhụy: vòi nhụy dạng sợi màu tím, không lông, 2<br /> ñầu nhụy hình sợi. Bầu dẹp dài khoảng 1,5 cm, 2 lá noãn vị trí trước sau tạo bầu trên, 2 ô, mỗi ô có trên 4 noãn, ñính<br /> noãn trung trụ, ñĩa mật to bao quanh ñáy bầu. Quả: nang dẹp, 2 buồng, hình bầu dục hai ñầu nhọn, dài 15-16 mm,<br /> rộng 3-3,5 mm, có ít lông mịn.<br /> Nhận xét: kết quả mô tả thực vật phù hợp với tài liệu ñã công bố.<br /> <br /> 158<br /> <br /> Vi phẫu Thân: Mặt cắt ngang vi phẫu có hình vuông, 4 góc lồi. Tế bào biểu bì khá ñều, một số tế bào phình to mang<br /> bào thạch xù xì, không cuống. Lông che chở ña bào từ 3-5 tế bào và lông tiết ñầu ña bào, chân ngắn. Mô dày góc<br /> nhiều ở 4 góc, ít hơn ở cạnh vi phẫu, những ñoạn không có mô dày thường gặp các lỗ khí hơn. Mô mềm vỏ ñạo, 3-8<br /> lớp tế bào hình tròn, vách mỏng. Nội bì ñai Caspary, trụ bì gồm từ 2-3 lớp tế bào nhỏ hơn nội bì, hóa mô cứng rải rác.<br /> Hệ thống dẫn tạo thành vòng liên tục, libe ở ngoài, gỗ ở trong. Libe 1 bị ép dẹp vào sát trụ bì. Gỗ 1 tập trung nhiều ở 4<br /> góc và 2 cạnh, 2 cạnh còn lại ít thấy gỗ 1. Mô mềm tủy khuyết, tế bào lớn, vách cellulose hoặc hóa gỗ ít. Mô mềm tủy<br /> và vỏ rải rác có tinh thể calci oxalat hình khối.<br /> Vi phẫu Gân giữa lá: Biểu bì trên lồi thành 2-3 thùy rõ, biểu bì dưới lồi thành 2 thùy nhọn hướng về hai phía, ñáy<br /> phẳng. Tế bào biểu bì kích thước lớn, hình chữ nhật hoặc ña giác, mang lông che chở ña bào và lông tiết ña bào chân<br /> ngắn, cutin mỏng. Dưới biểu bì có từ 2-8 lớp mô dày góc. Mô mềm gồm các tế bào gần tròn, kích thước không ñều,<br /> vách mỏng. Cung libe gỗ gần như liên tục, gỗ ở trên và libe ở dưới.<br /> Vi phẫu Thịt lá: Biểu bì tương tự như gân giữa, mô mềm giậu chỉ có 1 lớp tế bào ngắn, dưới mỗi tế bào biểu bì có 23 tế bào mô giậu. Mô mềm có chứa các khuyết to.<br /> Đặc ñiểm bột dược liệu: Bột thân lá màu lục xám, không mùi, vị rất ñắng. Thành phần gồm: mảnh biểu bì mang lỗ<br /> khí, bào thạch không cuống có bề mặt sần sùi hoặc u lồi; mảnh mô mềm; các mảnh mạch xoắn, mạch mạng, mạch<br /> vạch.<br /> Khảo sát hóa học nhóm hoạt chất<br /> Bảng 1. Kết quả khảo sát hóa học nhóm hoạt chất<br /> Hợp chất<br /> Thuốc thử Kết quả phản<br /> ứng hóa học<br /> Diterpenlacton<br /> <br /> TT Kedde<br /> <br /> +++<br /> <br /> Flavonoid<br /> Mg/HCl ññ<br /> +++<br /> Quy trình chiết chiết xuất và phân lập<br /> Từ 6 kg Xuyên tâm liên phơi khô, loại bỏ rễ thu ñược 1,6 kg dược liệu, sau ñó xay nhỏ thành bột. Làm ẩm bột rồi<br /> cho vào bình ngấm kiệt dung tích 5 lít, ngâm 24 giờ với 3 lít Ethanol. Tiến hành rút dịch chiết với tốc ñộ 10 ml/phút,<br /> bổ sung dung môi ñến khi thu ñược 5 lít dịch chiết ethanol màu xanh ñậm (tỉ lệ 1 dược liệu: 3 dung môi). Loại tạp<br /> chất bằng 250 g than hoạt, lọc qua phễu Buchner ñể loại than. Cô thu hồi 5 lít dịch chiết trên máy cô quay, thu ñược<br /> khoảng 500 ml dung dịch. Để kết tinh lạnh, lọc qua phễu Buchner thu ñược khoảng 200 g hỗn hợp các chất và dịch<br /> lọc 1. Hòa tan hỗn hợp các chất này trong Methanol nóng vừa ñủ, loại tạp bằng than hoạt, kết tinh lạnh lọc qua phễu<br /> Buchner thu ñược khỏang 450 mg chất A1 và dịch lọc 2. Gom dịch lọc 1 và 2 cô còn 50 g [1],[2],[3], [9]<br /> <br /> Mảnh biểu bì<br /> <br /> Lông tiết<br /> <br /> Bào thạch<br /> <br /> 159<br /> <br /> Mảnh mạch xoắn<br /> <br /> Mảnh mạch mạng<br /> <br /> Mảnh mô mềm<br /> <br /> Hình 1. Đặc ñiểm bột dược liệu xuyên tâm liên<br /> Biểu bì<br /> <br /> Biểu bì trên<br /> Mô dày<br /> Mô mềm giậu<br /> Mô mềm vỏ<br /> Gỗ<br /> Libe<br /> <br /> Mô mềm khuyết<br /> Lỗ khí<br /> Biểu bì dưới<br /> <br /> Biểu bì<br /> Mô dày<br /> Mô mềm vỏ<br /> Libe 1<br /> Toàn vi<br /> phẫu thân<br /> <br /> Libe 2<br /> Gỗ 1<br /> Gỗ 2<br /> <br /> Lông che<br /> chở ña bào<br /> Nội bì ñai<br /> Caspary<br /> <br /> Sợi trụ bì<br /> <br /> Hình 2. Vi phẫu lá và thân Xuyên tâm liên<br /> <br /> 160<br /> <br /> (1)<br /> (2)<br /> Sơ ñồ 1. Quy trình chiết xuất và phân lập andrographolid (1) và dehydroandrographolid (2)<br /> Chất A1 tiếp tục rửa kết tinh và tái kết tinh trong MeOH ñể thu ñược tinh thể hình phiến màu trắng, ñạt ñộ tinh<br /> khiết cao.<br /> Để phân lập dehydroandrographolid, chọn quy trình sử dụng sắc ký cột cổ ñiển. Nghiền mịn 50 g cao D1, áp dụng<br /> phương pháp nhồi nhồi cột khô. Lượng silicagel gấp khoảng 50 lần lượng mẫu.<br /> Khảo sát dung môi cho sắc ký cột: Do dehydroandrographolid là chất kém phân cực nên khi triển khai trên bản<br /> mỏng silica gel F 254 với các hệ dung môi có ñộ phân cực tăng dần thì vết dehydroandrographolid có khuynh hướng<br /> di chuyển xa hơn các chất khác. Vì vậy ñể phân lập dehydroandrographolid cần phải sử dụng hỗn hợp dung môi có ñộ<br /> phân cực tăng dần từ CHCl3 ñến CHCl3 – MeOH (99:2)<br /> <br /> CHCl3:MeOH<br /> (99:1)<br /> <br /> KHẢO SÁT ĐỘ TINH<br /> CHIẾT TÁCH<br /> <br /> Hình 3. SKLM dịch chiết thu ñược từ SK cột<br /> <br /> KHIẾT CỦA CHẤT ĐÃ<br /> <br /> 161<br /> <br />