Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 nhằm tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá

Chia sẻ: Hoang Tung Linh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:51

Thêm vào BST

Báo xấu

261
lượt xem 90
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quỳnh Liên, Phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viên Công Nghệ Sinh Học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 nhằm tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá

Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 nhằm tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quỳnh Liên, Phòng Công Ngh ệ Tế Bào Thực Vật, Viên Công Nghệ Sinh Học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Chu Hoàng Hà, ThS. Ph ạm Thị Vân cùng tập thể cán bộ, học viên, sinh viên Phòng Công Ngh ệ Tế Bào Thực Vật, Viện Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện làm việc, giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm làm việc quý báu trong suôt quá trình hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo khoa Công Ngh ệ Sinh Học, Viện Đại Học Mở Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè nhứng người đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận. Hà Nội, tháng 05 năm 2011 Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hiền 1
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Deoxyribonucleic Acid ARN Ribonucleic Acid Bp Base pair dNTPs Deoxy Nucleoside Triphosphate LB Luria and Bertani PCR Polymerase Chain Reaction Taq Thermus aquaticus IAA Indolaxetic Acid α- naphthalenneacetic Acid NAA PVY Ptato virus TMV Tobacco Mosaic virus CMV Cucumber Mosaic virus Môi trƣờng cơ bản theo Murashige và Skoog MS BAP 6- benzenladenine Gen mã hóa enzyme β -glucuronidase Gus Môi trƣờng ra rễ RM RNAi RNA interfence X-gluc 5-bromo-4- chloro-3 - indolyl glucuronide EDTA Ethylene Diamine tetra - acetate Acid 2
M Ở Đ ẦU Thuốc lá là một trong những cây trồng vừa có giá trị về kinh tế vừa là cây mô hình quan trọng trong nghiên cứu công nghệ sinh học cây trồng. Vì vậy, thuốc lá là một trong những đối tƣợng đƣợc sử dụng nhiều nhất trong các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng đặc biệt là làm đối tƣợng chuyển gen. Khảm lá bệnh rất phổ biến trên cây thuốc lá, bệnh khảm lá gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất và chất lƣợng thuốc lá, nhất lá đối với thuốc lá sợi vàng. Bệnh khảm thuốc lá do hai loại virus TMV (Tobacco mosaic virus) và CMV (Cucumber mosaic virus) gây ra. Trong đó, TMV loại virus có phổ ký chủ rất rộng có tới 230 loài thuộc 32 họ và là một trong virus gây hại trên thực vật đƣợc mô tả sớm nhất ở nƣớc ta. Những phƣơng pháp thông dụng để khắc phục bệnh khảm lá nhƣ sử dụng giống kháng bệnh, giống sạch bệnh và các biện pháp canh tác( trồng luận canh cây thuốc lá với cây lúa, vệ sinh đồng ruộng...). Tuy nhiên, những biện pháp này không những chỉ có tác dụng làm giảm bớt sự lây lan và phát triển của bệnh, chủ yếu chỉ manh tính chất phòng trừ chứ không thể chống lại bệnh này mà còn đòi hỏi nhiều thời gian, công sức và ảnh hƣởng xấu tới môi trƣờng. Hiện nay, nhờ những tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền mà ngƣời ta đã tạo ra các giống cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus gây ra bằng cách đƣa gen mã hóa protein vỏ (coat protein gene) của virus vào genome của thực vật. Xuất phát từ cơ sở thực tiễn trên, giống thuốc lá C9-1 đã đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu “ Nghiên cứu qui trình chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 nhằm tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá” với các nội dung và mụ c đích nghiên cứu: (1) Chuẩn hóa phƣơng pháp chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 thông qua cấu trúc mang chỉ thị gus; (2) Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc TMV-RNAi; (3) Bƣớc đầu phân tích cây chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR 3
Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ 1.1. 1.1.1. Phân loại Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotinana.sp thuộc ngành hạt kín Angiosper, lớp 2 lá mầm Dicotylndones, phân lớp Asteridae, bộ hoa mõm sói Scrophulariales, họ cà Solanaceae, chi Nicotiana. Trong chi Nicotiana c ó 50- 70 loài, đa số là dạng cỏ, một số dạng thân đứng, hầu hết là các dạng dại phụ. Căn cƣ vao hì nh thai, màu sắc của hoa ngƣời ta phân chia thành 4 loại chính: ́̀ ́ - Loài Nicotiana tabacum L.: có hoa màu hồng hay đỏ tƣơi . Đây la loai ̣̀ phô biên nhât chiêm 90% diên tí ch thuôc la trên thê giơi. ̉ ́ ́ ́ ̣ ́́ ́ ́ - Loài Nicotiana rustica L.: có hoa màu vàng, chiêm 10% diên tí ch thuôc ́ ̣ ́ lá trên thế giới. - Loài Nicotiana petunioide L.: có hoa màu trắng , phơt hông hay tí m . ́ ̀ Thƣơng chỉ co trong vƣơn thƣc vât phuc vu nguô n dƣ trƣ gen cho lai ̀ ́ ̀ ̣ ̣ ̣ ̣ ̀ ̣̃ tạo, ít đƣợc dùng trong sản xuất. - Loài Nicotiana polidiede L. : có hoa màu trắng . Loài này cũng ít đƣợc dùng trong sản xuất, chủ yếu chỉ có trong vƣờn thực vật học của một số quôc gia. ́ 4
Hình 1.1: Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) Trên thế giới cây thuốc lá đƣợc trồng chủ yếu ở Châu Á với diện tích canh tác khoảng 2.500.000ha, Châu Mĩ là 1.600.000ha và Châu Phi khoảng 326.000ha với nhiều loại thuốc lá khác nhau trong đó giống thuốc lá sợi vàng phổ biến nhất.Vùng trồng thuốc lá cho chất lƣợng cao tập trung chủ yếu ở một số bang của nƣớc Mĩ, Cu Ba, Ấn Độ.Tại Việt Namcây thuốc lá đƣợc canh tác từ Bắc chí Nam, chủ yếu ở các tỉnh sau: Cao Bằng và Lạng Sơn (khu vực phía Bắc), Đà Nẵng, Gia Lai và Dak Lak (khu vực miền Trung), Ninh Thuận (khu vực Tây nguyên) và Tây Ninh (khu vực phía Nam). 1.1.2. Giá trị của cây thuốc lá Thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) là loại cây công nghiệp ngắn ngày có tầm quan trọng bậc nhất về kinh tế trên thị trƣờng thế giới không chỉ đối với trên 33 triệu nông dân của trên 120 quốc gia, mà còn cho cả toàn bộ nền công nghiệp - từ các nhà máy chế biến, cuốn điếu, sản xuất phụ gia, phụ liệu đến cả hệ thống phân phối tiêu thụ, thậm chí cả một phần ngành sản xuất các vật tƣ 5
nông nghiệp phục vụ cho cây thuốc lá nhƣ phân bón, thu ốc bảo vệ thực vật [10], [15].Trồng thuốc lá có hiệu quả cao hơn nhiều so với các loại cây trồng khác (1000- 1200 USD/ tấn lá khô) [8]. Các hãng sản xuất thuốc lá của các nƣớc tƣ bản đều nhận đƣợc nguồn lợi nhu ận khổng lồ từ cây thuốc lá. Ở nƣớc ta, cây thuốc lá cũng mang lại giá trị kinh tế cao, sử dụng hiệu quả đất đai, góp phần tạo công ăn việc làm, tận dụng đƣợc nguồn lao động của địa phƣơng, tăng thu nh ập cho ngƣời lao động. Lợi nhuận cao từ sản xuất thuốc lá đã sự quan tâm của nhiều cấp chính quyền trong cả nƣớc, tại một số tỉnh miền núi phía Bắc nhƣ Cao Bằng, Lạng Sơn, ... cây thuốc lá đã nằm trong cơ cấu cây trồng truyền thống, thực sự mang lại hiệu quả kinh tế cao. Tại An Giang nhờ vào cây thuốc lá nên giải quyết đƣợc khoảng 200 lao động với thu nhập trung bình 30.000- 40.000 đồng/ ngày [49]. Năm 2010, Tổng công ty thuốc lá Việt Nam đạt kim ngạch xuất khẩu trên 175 triệu USD, tăng 17% so với năm 2009. Xuất siêu gần 54 triệu USD, nộp ngân sách vƣợt mốc 5.000 tỉ đồng, tăng 6% so với năm 2009 [47]. Đời sống, việc làm và thu nhập của ngƣời lao động đƣợc bảo đảm ổn định. Đối với ngành công nghệ sinh học cây thuốc lá đƣợc sử dụng nhƣ thực vật mô hình cho những nghiên cứu cơ bản cũng nhƣ ứng dụng nhờ khả năng dễ dàng tiến hành nuôi cấy in vitro và chuyển gen [26]. 1.1.3 . Thực trạng phát triển vùng thuốc lá nguyên liệu tại Việt Nam Là loại cây công nghiệp ngắn ngày có giá trị kinh tế cao hiện thuốc lá đƣợc trồng ở nhiều địa phƣơng trong cả nƣớc. Diện tích trồng thuốc lá năm 2008 khoảng 25.000 ha. Theo đ ịnh hƣớng của chính phủ, dự kiến diện tích trồng thuốc lá năm 2010 là 39.200 ha và phát tri ển ổn định tới năm 2020 là 40.300 ha [50]. Theo đánh giá của các chuyên gia, nguyên liệu thuốc lá vàng sấy củ a 6
nƣớc ta có chất lƣợng tƣơng đối tốt, có thể thay thế đƣợc nguyên liệu Trung Quốc. Công ty TNHH Một Thành viên Viện KTKT thuốc lá là đơn vị đi đầu trong nghiên cứu chọn tạo giống thuốc lá đã phát triển sản xuất đại trà các giống thuốc lá K326, C9-1, K176 đồng thời sản xuất thử nghiệm thành công một số giống lai nhƣ VTL1H, VTL5H tại vùng núi phía Bắc (theo báo cáo Văn phòng chƣơng trình KC06) hay kh ảo nghiệm một số giống nhƣ RGH04, PVH09, PVH51 trên khu vực đất cát ở Gia Lai. Những nghiên cứu của Công ty TNHH Một Thành viên Viện KTKT thuốc lá cho thấy sự quan tâm của Tổng công ty thuốc lá Việt Nam trong công tác phát triển giống mới nhằm thúc đẩy sự phát triển vùng thuốc lá nguyên liệu tại nƣớc ta. Đặc thù của sản xuất thuốc lá điếu là phải có sự phối trộn nhiều loại nguyên liệu thuốc lá từ các vùng khác nhau để tạo nên tính phong phú của sản phẩm. Hàng năm, ngành thuốc lá vẫn phải nhập khẩu một lƣợng đáng kể nguyên liệu từ các nƣớc trên thế giới và nguyên liệu trong nƣớc cũng đƣợc xuất khẩu với số lƣợng đến chục ngàn tấn. Sản xuất thuốc lá vẫn là một lĩnh vực kinh tế cần thiết khi ngành thuốc lá Việt Nam đóng góp cho ngân sách Nhà nƣớc trên bảy ngàn tỷ đồng mỗi năm. Hút thuốc lá có ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe ngƣời tiêu dùng nên nhà nƣớc có chủ trƣơng hạn chế sản xuất thuốc lá điếu cho tiêu thụ nội địa. Hiện nay thuốc lá nguyên liệu sản xuất trong nƣớc chƣa đáp ứng đủ nhu cầu cho các nhà máy thuốc điếu, mặt khác nhu cầu nguyên liệu cho xuất khẩu khá lớn nên Chính phủ khuyến khích phát triển sản xuất nguyên liệu trong nƣớc. Chiến lƣợc phát triển Ngành thuốc lá Việt nam đến năm 2020 đã đƣợc Chính phủ phê duyệt, trong đó nhấn mạnh chủ chƣơng phát triển thuốc lá nguyên liệu để hạn chế nhập khẩu, tăng cƣờng xuất khẩu, tạo công ăn việc làm và nâng cao hiệu quả kinh tế cho nhà nông [50]. Vùng trồng thuốc lá của Việt Nam tập trung chủ yếu tại các tỉnh miền núi, nên việc phát triển trồng thuốc lá tại đây sẽ hiện thực hoá chủ trƣơng của Đảng và Nhà nƣớc “Xóa đói, giảm nghèo” cho đồng bào các dân tộc miền núi. Chín tỉnh trồng thuốc lá tập trung tại Việt Nam (gồm Cao Bằng, Lạng Sơn, Thái 7
Nguyên, Bắc Giang, Gia Lai, Đắc Lắc, Ninh Thuận Bình Thuận và Tây Ninh) do tổng công ty hỗ trợ phát triển đã chiếm hơn 90% diện tích vùng trồng thuốc lá nguyên liệu tại Việt Nam. Trong những năm qua, Tổng công ty cũng đã không ngừng mở rộng thị trƣờng xuất khẩu thuốc lá nguyên liệu và thuốc điếu với giá trị kim ngạch xuất khẩu năm 2008 đạt trên 80 triệu USD. 1.2. MỘT SỐ BỆNH THƢỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ 1.2.1. Bệnh virus trên cây thuốc lá Trong sản xuất nông nghiệp thiệt hại do bệnh virus gây ra là rất lớn. Đối với cây hàng năm, sự thiệt hại thể hiện qua việc giảm năng suất hoặc gây mất mùa toàn bộ trong vụ. Đối với cây lâu năm, cây thân gỗ bệnh virus không những làm gi ảm chất lƣợng và năng suất ngay đối với cây bị nhiễm bệnh mà, mà còn có nguy cơ lây lan cho các cây kh ỏe mạnh những năm sau [1]. Hiện nay, có khoảng hơn 2000 loại virus thực vật đã đƣợc phát hiện và nghiên cứu, trong số đó khoảng môt nƣa là nh ững loài gây hại chính cho cây trồng. Mức ̣ ̉ độ thiệt hại do các bệnh virus gây ra cho cây trồng là rất nghiêm trọng, có thể lên tơi 95 - 100%. Sự thiệt hại không những chỉ dừng ở mức độ suy giảm về ́ năng suất mà còn ảnh hƣởng cả đến chất lƣợng sản phẩm thu hoạch [2]. Riêng đối với cây thuốc lá thiệt hại về kinh tế do virus gây ra ở thuốc lá khá lớn lên tới hàng chục tỷ đồng [40]. Bệnh virus không những làm giảm năng suất, chất lƣợng cây thuốc lá, mà còn là nguy cơ truyền bệnh cho c ây kh ỏ e n h ữ ng năm sau. M ặ t khác, virus không thể tiêu diệt, phòng trừ nhƣ những bệnh vi khuẩn, nấm, mà chúng tiềm tàng tích lũy dần dần trong cây và làm thoái hoá giống [3]. Một số loại bệnh virus trên cây thuốc lá 8
Bảng 1.1: Bệnh virus trên thuốc lá [52] Tên bệnh Tên virus gây bệnh Khảm linh lăng Alfalfa mosaic virus( virus khảm linh lăng) Quăn ngọn cúc tần Beet curty top virus ( virus gây b ệnh quăn ngọn cúc tần) Ngọn cây bụi Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus (virus gây biến nạp gân thuốc lá) và tobacco bushy top virus (virus ngọn cây bụi thuốc lá) Khảm cà chua Cucumber mosaic virus (virus gây b ệnh khảm dƣa chuột) Vàng hoại tử rau Vàng hoại tử rau diếp(trong Nicotiana glutinosa) diếp Còi cọc cây lạc Peanut stunt virus Bệnh hoa Tái tổ hợp Tobacco vein distorting virus ( virus gây bệnh biến dạng hình hồng gân lá thuốc lá) và tobacco mottle virus( virus gây đốm thuốc lá) Kỵ axit thuốc lá Tobacco etch virus (virus gây b ệnh kỵ axit thuốc lá) Xoăn thuốc lá Tobacco leaf curl virus (Virus gây xoăn thu ốc lá) Khảm thuốc lá Tobacco mosaic virus( virus gây bệnh khảm thuốc lá) và Satellite tobacco mosaic virus (virus gây bệnh khảm thuốc lá vệ tinh) Hoại tử thuốc lá Tobacco necrosis virus (virus gây hoại tử thuốc lá) Bung hạt thuốc lá Tobacco rattele virus (virus gây bung hạt thuốc lá) Đốm vòng thuốc Tobacco ring spot virus (virus gây bệnh đốm vòng thuốc lá) lá Sọc thuốc lá Tobacco streak virus (virus gây b ệnh sọc thuốc lá) Còi cọc thuốc lá Tobacco stunt virus (virus gây b ệnh còi cọc thuốc lá) Vằn gân thuốc lá Tobacco vein mottling virus (virus gây b ệnh vằn gân thuốc lá) Héo đốm cà chua Tomato spotted wilt virus (virus gây b ệnh héo đốm cà chua) Viền gân lá Potato virus ( virus Y khoai tây) U vết thƣơng Wound tumor virus (virus gây b ệnh khối u vết thƣơng) 9
1.2.2. Bệnh khảm lá do virus Bệnh khảm lá do virus gây ra là bệnh rất phổ biến trên cây thuốc lá, gây hại nghiêm trọng đến năng suất và chất lƣợng của lá thuốc, nhất là đối với thuốc lá sợi vàng. Bệnh còn có tên là bệnh “hoa lá vàng”. Bệnh nặng và phân bố rộng ở nhiều nơi và vào bất kỳ mùa vụ nào trong năm [3]. Bệnh xuất hiện càng sớm thì càng ảnh hƣởng đến năng suất , tỉ lệ phục hồi hoàn toàn khá thấp (2,3 - 5,2%). Tuy nhiên, phẩm chất của lá thuốc thƣờng bị tác hại nghiêm trọng hơn so với tác hại về năng suất: lá thuốc bị bệnh, sau khi sấy, lá sẽ bị nâu đen, dòn, dễ bị nát vụn ra, không có mùi vị thơm ngon và hút nặng. Biểu hiện của bệnh khảm lá đầu tiên là các lá non ngả màu vàng nhạt, lá nhỏ lại biến thành dạng khảm. Trên bề mặt của lá có biểu hiện của các vết khả m loang lổ, màu sắc chỗ đậm, chỗ nhạt. Ngoài ra còn có các biểu hiện khác nhƣ: phiến lá nhăn nheo, lồi lõm do các gân lá bị kìm hãm sinh trƣởng trong khi thịt lá vẫn phát triển, kích thƣớc lá bị thu nhỏ lại. Ngoài đồng, đôi khi cây bệnh ở dạng tiềm ẩn (không biểu lộ triệu chứng ra ngoài) ở các mức độ khác nhau [3]: Ẩn bệnh toàn phần: cây hoàn toàn không biểu lộ triệu chứng;  Ẩn bệnh cục bộ: chỉ có vài triệu chứng ở lá ngọn nhƣng không  tiêu biểu lắm; Ẩn bệnh tạm thời: chỉ biểu lộ triệu chứng ở giai đoạn sau của  bệnh; Ẩn bệnh vĩnh viễn: không biểu lộ triệu chứng trong suốt giai  đoạn cây phát triển. 10
Do TMV cần thời gian ủ bệnh tƣơng đối dài nên hiện tƣợng ẩn bệnh có thể giải thích do do cây bị nhiểm bệnh vào giai đoạn trƣởng thành nên TMV không kịp gây ra triệu chứng. Tuy nhiên năng suất và phẩm chất thuốc vẫn bị ảnh hƣởng nghiêm trọng. Chỉ có thể phát hiện đƣợc cây ẩn bệnh bằng phƣơng pháp phản ứng huyết thanh. Ngoài ra, trong điều kiện nóng (>30 oC), cây cũng dễ bị mất triệu chứng. Hình 1.2: Bệnh khảm lá trên cây thuốc lá TMV và CMV là hai loại virus gây bệnh khảm phổ biến và nghiêm tr ọng nhất cho cây thuốc lá hiện nay. CMV thuộc loại Cucumovirus, họ Bromovirus. Đây là virus th ực vật có phổ cây bệnh rộng nhất với khoảng trên 1000 loài cây khác nhau [29].Virus có dạng hình tròn kích thƣớc 28- 30mm, CMV lây lan qua vật chủ trung gian chủ yếu là qua rệp. Genome của CMV bao gồm 3 sợi RNA đơn dƣơng (RNA1, RNA2 và RNA3) chứa 5 khung đọc mở (ORF). 11
Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc genome CMV Các chủng CMV đã đƣợc phân chia thành hai nhóm I và II d ựa vào huyết thanh học [42] [22], lai acid nucleic [50], trình tự gen [27]. Phân nhóm I và II có mối quan hệ khá xa nhau và genmon của chúng chỉ có 75% nucleotid tƣơng đồng. Trong đó phân nhóm I lại đƣợc chia thành IA và IB, độ tƣơng đồng của chúng lên tới 92%-95% [29] [31]. Các chủng CMV phân nhóm IA và II xuất hiện hầu nhƣ khắp thế giới trong khi các chủng CMV phân nhóm IB chủ yếu có mặt ở Châu Á [21] [9]. Trong ba RNA của CMV, RNA3 xảy ra sự tái tổ hợp thƣờng xuyên hơn RNA1 và RNA2 [31]. Vì vậy có rất nhiều nghiên cứu dựa trên RNA3 để đánh giá bảng đa dạng di truyền và xây dựng cây phát sinhc ủa chủng CMV TMV thuộc loại Tobamovirus, phổ ký chủ virus TMV có tới 230 loài thuộ c 32 họ và là một trong virus gây hại trên thực vật đƣợc mô tả sớm nhất ở nƣớc ta. Đây là một trong những virus gây bệnh thực vật đƣợc mô tả sớm nhất bởi 12
Mayer (1886), Iwanowshi (1882), Allard (1914), Stanley (1935). Ở Việt Nam, có thể có hai dòng TMV chủ yếu: dòng mạnh và dòng yếu. Dòng mạnh sẽ làm cây biến dạng nhiều, thƣờng lá có dạng sợi chỉ. Dòng yếu làm cây biến dạng ít hơn, thƣờng chỉ gây khảm lá. Bệnh có thể mất triệu chứng ở thấp hơn 11˚ C hoặc cao hơn 37˚C [4]. Virus TMV là virus đơn dƣơng (ssRNa) có hình cuộn xoắn, dạng que hoàn chỉnh của TMV có 2130 đơn vị capsid ( capsomeres), cứ 16 capsomeres tạo thành một vòng xoắn. Mỗi capsomeres có 158 amino acid và có trọng lƣợng 1800 Daltons. Virion có chiều dài 300 mm và đƣờng kính là 18mm [34]. TMV là virus RNA đơn dƣơng (ssRNA) có hình cuộn xoắn [9 ]. Hình 1.4: Hình ảnh hiển vi virus TMV 13
6,395 nt RdRp CP Helicase MP Hình 1.5: Sơ đồ cấu trúc genome của TMV RdRp: replicase; CP: protein vỏ; helicase: enzyme liên quan tới quá trình duỗi xoắn; MP: protein vận chuyển. Chiều mũi tên thể hiện chiều dịch mã Virus TMV xâm nhiễm vào cây thông qua con đƣờng cơ giới do tiếp xúc virus thâm nhập vào các tế bào thông qua vết thƣơng và qua khí khổng lá, thân hoặc rễ mà không qua côn trùng. TMV có độ bền vững cao đối với nhiệt độ. Đa số TMV bị mất hoạt tính ở 90 -100oC trong 10 phút, nhƣng vẫn còn một số rất ít TMV tồn tại và chúng còn khả năng gây bện h tùy theo chủng [4]. 1.3. BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC Bện virus là bệnh khó phòng chống, chúng không thể tiêu diệt xử lý bằng các chất hóa học nhƣ những bệnh nấm, vi khuẩn hay sâu bọ. Hiện nay đã có rất nhiều phƣơng pháp đƣợc đƣa ra nhằm chống lại bệnh virus nhƣ: 1.3.1. Sử dụng giống kháng bệnh: Sử dụng các loại gi ống đã đƣợc nghiên cứu có thể kháng lại những virus gây bệnh. Phƣơng pháp này đem lại hiệu quả cao, không gây ô nhiễm môi trƣờng và tạo đƣợc cây sạch bệnh. Tuy nhiên hạn chế của biện pháp này đó là số lƣợng biên phap g ặp nhiều hạn chế về số lƣợng giống kháng bệnh cũng ̣ ́ 14
nhƣ nguồn vật liệu di truyền kháng virus phục vụ cho cho công tác lai tạo giống. 1.3.2. Sử dụng giống sạch bệnh Giống sạch bệnh thu từ cây thuốc lá khỏe chọn giống chống bệnh bằng cách lai với các giống thuốc lá dại.Sử dụng nguồn vật liệu giống sạch bệnh đƣợc xem là biện pháp quan trọng nhất để hạn chế bệnh virus ở nhiều loại cây trồng. Nhƣợc điểm của biện pháp này là cac loai cây trông co thê bị nhiêm ́ ̣ ̀ ́ ̉ ̃ virus trong qua trì nh canh tac trên đông ruông. ́ ́ ̀ ̣ 1.3.3. Các biện pháp canh tác  Luân canh: nên luân canh với lúa (thuốc lá - luá - lúa - thuốc lá) vì trong điều kiện ngập nƣớc, phần lớn TMV sẽ bị tiêu diệt. Tránh độc canh hoặc luân canh với cây trồng cạn.  Vệ sinh đồng ruộng: làm sạch cỏ dại, thiêu hủy xác cây bệnh trƣớc và sau khi thu hoạch, phát hiện bệnh sớm và thiêu hủy cây bệnh, , cẩn thận khi tiếp xúc với cây bệnh. Không nên để vụ thuốc tái sinh ở những ruộng bị nhiễm bệnh[51]. - Phòng trị bệnh cho cây con ở vƣờn ƣơ m: đây là biện pháp có hiệu quả kinh tế cao. Chọn đất sạch mầm bệnh để làm vƣờn ƣơ m, cách xa ruộng sản xuất đại trà. Chỉ chọn cây con không bệnh đem đi trồng. - Sử dụng các biện pháp kiểm soát côn trùng trung gian truyền bệnh: các loại rệp, bọ trĩ. 1.3.4. Sử dụng biện pháp công nghệ sinh học 15
Thành công trong việc ứng dụng công nghệ sinh học trong tạo giống cây trồng kháng bệnh virus đƣợc đánh dấu bởi công bố của Beachy và cộng sự năm 1986 khi những cây thuốc lá chuyển gen mã hóa protein vỏ của TMV (cấu trúc dạng sense) đã biểu hiện tính kháng với virus này [14]. Sau đó Beachy và cộng sự đã phát triển những thí nghiệm của mình thành phƣơng pháp CP tạo cây trồng kháng virus. Phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng tạo những dòng cây chuyển gen kháng nhiều loại virus gây bệnh trên thực vật hai lá mầm và sau đó là thực vật một lá mầm [21]. Tuy vậy, các cây chuyển gen này chỉ kháng đƣợc duy nhất một chủng virus mang gen mã hóa protein vỏ mà nó chuyển vào. Điều này gây trở ngại trong việc phát triển các giống cây trồng kháng virus dựa trên phƣơng pháp CP do đ ộ đa dạng của virus thƣờng khá cao [32] Cho tới những năm cuối thế kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc (ihpRNA) hay k ỹ thuật RNAi đƣợc xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu nhất trong việc chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật. Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế hoạt động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus ở thực vật. Các bƣớc chính trong kỹ thuật này bao gồm: (1) thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi, (2) biến nạp vector chuyển mang cấu trúc RNAi vào cây thông qua vi khu ẩn Agrobacterium tumefaciens làm bất hoạt các mRNA của virus gây bệnh, (3) sàng lọc các cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi và kiểm tra tính kháng virus của các cây chuyển gen [38]. Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc t ạo cây tr ồng chuyển gen mã hoá protein của virus (gen mã hóa protein vỏ CP, enzyme phiên mã RdRp,…) có kh ả năng kháng lại chính virus đó đã đƣợc chứng minh bằng thực tế trong những nghiên cứu tạo cây trồng kháng các loại virus khác nhau nhƣ: Potato virus Y PVY [43][33]cucumber mosaic virus CMV, Plum pox potyvirus PPV [18], Tobacco mosaic virus TMV và Potato virus Y PVY[35], Tomato yellow leaf curl virus TYLCV [46]Rice tungro bacilliform virus RTBV, African cassava mosaic virus ACMV [41] … Trong những nghiên cứu này, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen của virus lặp lại đảo chiều thƣờng đƣợc sử dụng để chuyển vào cây và sẽ đƣợc biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen từ đó kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây. 16
Ngƣời ta đã nhận thấy rằng khi vùng đệm của hpRNA đƣợc lặp lại với một trình tự intron (ihpRNA) thì kết quả ihpRNA tạo ra sự bất hoạt gen là cao nhất[33][44]. Năm 2007, Bonfim và cộng sự đã tạo ra đƣợc một dòng cây đậu chuyển gen kháng virus BGMV (Bean golden mosaic virus) với tính kháng lên đến 93%. Cũng năm này, Shinichiro Kamachi và cộng sự [ 26] đã công bố kết quả tạo ra đƣợc một số dòng thuốc lá chuyển gen CP trong cấu trúc ihpRNA có khả năng kháng cao với virus cucumber green mottle mosaic virus CGMMV đến thế hệ T2 (12/14 số cây kiểm tra) và những siRNA đã đƣợc phát hiện trong những dòng cây chuyển gen này. Nói chung, h ầu hết các cây chuyển gen làm chậm sự tích lũy virus và làm ch ậm hoặc giảm nhẹ các triệu chứng bệnh[19] Cho đến nay đã có các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus đƣợc công nhận và trồng thƣơng mại nhƣ: Đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng (papaya ringspot virus, PRSV) đã đƣợc công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc, Philippine; Bí đao chuyển gen kháng ba loại vi rút Cucumber mosaic virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã đƣợc công nhận và trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus, đƣợc công nhận và trồng ở Trung Quốc … Ngoài ra rất nhiều các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm để đƣợc công nhận là giống cây trồng thƣơng mại nhƣ: Sắn chuyển gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen kháng Maize steak virus (Mastrevirus); Khoai tây chuyển gen kháng đồng thời 3 loại virus Potato virus X (Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus); Lúa chuyển gen kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); Khoai lang chuyển gen kháng Sweet potato feathery mottle virus (Potyvirus... Các cấu trúc gen có nguồn gốc từ virus gây bệnh đƣợc sử dụng chuyển vào cây trồng để tạo tính kháng có thể là các loại khác nhau nhƣ: các cấu trúc của virus theo chiều xuôi (sense) hay chiều ngƣợc (antisense), các cấu trúc dạng kẹp tóc (inverted repeats/hairpin) và các miRNA nhân t ạo có đích là các trình tự gen của virus gây bệnh, hay kỹ thuật RNAi “RNA interference”, đang đƣợc quan tâm nhiều và ứng dụng rộng rãi. 17
1.3.4.1. Giới thiệu chung về công nghệ RNAi trong tạo cây trồng kháng virus 1.3.4.2. Cơ chế hoạt động của RNAi RNAi là cơ chế ức chế sự biểu hiện vật chất di truyền ở giai đoạn RNA. Ở thực vật có ba con đƣờng ức chế RNA trong đó con đƣờng đầu tiên là sự ức chế gen sau phiên mã PTGS (post-transcriptional gen silencing ) qua trung gian là các RNA nh ỏ có vai trò ức chế siRNA (short interfering RNA) đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong những nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus. Quá trình này xảy ra ở tế bào chất và là con đƣờng quan trọng trong tế bào thực vật nhiễm virus nơi mà sợi RNA kép hoặc cấu trúc thứ cấp của RNA virus sợi đơn có thể sao chép gián tiếp. Trong trƣờng hợp virus DNA, dsRNA có thể đƣợc tạo ra nhờ quá trình phiên mã bổ sung liên tiếp [13]. Cơ chế cũng xảy ra tƣơng tự nhƣ ở động vật. Khi có sự xâm nhập của dsRNA, Dicer bản chất là RNaseIII đặc hiệu cho dsRNA cắt những chuỗi kép RNA này ra những đoạn ngắn hơn, khoảng 21-25 nucleotide, gọi là siRNA . Sau đó, các siRNA kép hình thành đƣợc tách ra làm hai chuỗi đơn, và chỉ một chuỗi đơn RNA với đầu 5' có l ực bắt cặp base (base-pairing) nhỏ nhất tiếp tục liên kết với Argonaute trong phức h ệ RISC. Tiếp đó, phức hệ RISC đã gắn đoạn siRNA nhận biết các mRNA của tế bào có trình tự tƣơng đồng với trình tự của đoạn chuỗi đơn siRNA này. Sau khi nhận dạng mRNA qua việc bắt cặp các base tƣơng đồng vớ i trình tự của chuỗi đơn siRNA, mRNA bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi kép siRNA-mRNA thành những đoạn nhỏ khoảng 12 nucleotid từ đầu 3’. Sau khi bị cắt đứt, mRNA nhanh chóng bị tiêu hu ỷ bởi các RNA nuclease [16] (Hình 1.6). 18
Hình 1.6: Cơ chế hoạt động RNAi. 1.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS Ở VIỆ T NAM. Ở Việt Nam gần đây đã có một số nghiên cứu theo hƣớng ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen chống lại các bệnh do virus gây ra. Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học do GS. Lê Trần Bình và PTS. Chu Hoàng Hà đ ứng đầu là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus. Một trong những kết quả của đê tai câp Viên ̀̀ ́ ̣ KH&CN Viêt Nam đƣơc ti ến hanh trong 2 năm 2007-2008: “Nghiên cưu ưng ̣ ̣ ̀ ́́ dụng kỹ thuật RNAi trong tao giống cây trồng chuyên gen khang bênh virus” ̣ ̉ ́ ̣ là đã tạo đƣợc các cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dƣa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 loại virus trên. Năm 2009, ứng dụng RNAi, Phạm Thị Vân và cộng sự [7] (Phòng Công 19