Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:55

Thêm vào BST

Báo xấu

33
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận văn nghiên cứu xác định loại vật liệu làm thể nhận gen, mật độ tế bào vi khuẩn A. tumefaciens, nồng độ acetosyringone (AS), thời gian nhiễm khuẩn A. tumefaciens và nồng độ kanamycin phù hợp cho chuyển gen ở cây dừa cạn; nghiên cứu chuyển gen gus vào cây dừa cạn và tạo cây dừa cạn chuyển gen; đề xuất quy trình chuyển gen vào cây dừa cạn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐỖ HUY HOÀNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN Ở CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G. DON) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2016
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐỖ HUY HOÀNG NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN Ở CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G. DON) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm THÁI NGUYÊN - 2016
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm. Các số liệu và kết quả được trình bày trong luận văn là trung thực, chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Đỗ Huy Hoàng i
LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo để tôi hoàn thành luận văn thạc sĩ. Tôi xin cảm ơn KTV Trần Thị Hồng, phòng thí nghiệm Công nghệ Tế bào đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi tiến hành các thí nghiệm của luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu luận văn. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè luôn quan tâm, ủng hộ và tạo động lực cho tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó! Thái Nguyên, ngày … tháng …. năm 2016 Người thực hiện Đỗ Huy Hoàng ii
MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN...............................................................................................i LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................ii MỤC LỤC........................................................................................................iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.........................................................................iv DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... v DANH MỤC HÌNH..........................................................................................vi MỞ ĐẦU ..........................................................................................................1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................3 1.1. Giới thiệu về cây dừa cạn ....................................................................... 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây dừa cạn ................................................ 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây dừa cạn ................................................. 4 1.1.3. Thành phần hóa học và một số công dụng của cây dừa cạn .............. 5 1.1.4. Alkaloid chính trong cây dừa cạn ..................................................... 6 1.2. Công nghệ chuyển gen thực vật và ứng dụng.......................................... 6 1.2.1. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật .......................................... 6 1.2.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở cây dừa cạn bằng phương pháp chuyển gen ............................................. 10 1.3 Một số thành tựu trong nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen gus 12 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................19 2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 19 2.1.1. Vật liệu thực vật ............................................................................. 19 2.1.2. Chủng vi khuẩn .............................................................................. 19 2.1.3. Hóa chất và thiết bị ........................................................................ 19 2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ......................................................... 20 2.3. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 20 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro......................................................... 20 iii
2.3.2. Phương pháp chuyển gen ............................................................... 20 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...........................................................25 3.1. Ảnh hưởng của loại vật liệu làm thể nhận gen, mật độ A. tumefaciens, nồng độ acetosyringone, thời gian nhiễm khuẩn, nồng độ kanamycin đến hiệu quả chuyển gen ở cây dừa cạn ............................................................................. 25 3.1.1. Xác định mật độ tế bào A. tumefaciens phù hợp cho chuyển gen ở cây dừa cạn .............................................................................................. 25 3.1.2. Xác định nồng độ acetosyringone (AS) phù hợp cho chuyển gen ở cây dừa cạn .............................................................................................. 27 3.1.3. Xác định thời gian nhiễm khuẩn A. tumefaciens phù hợp cho chuyển gen ở cây dừa cạn ..................................................................................... 29 3.1.4. Xác định nồng độ kanamycin (Km) thích hợp để chọn lọc cây chuyển gen ........................................................................................................... 31 3.2. Kết quả chuyển gen gus vào cây dừa cạn và ra cây............................... 36 3.3. Đề xuất quy trình chuyển gen vào cây dừa cạn ..................................... 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................................42 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................43 iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tên đầy đủ AS Acetosyringone BAP 6 - Benzyl amoni purin Cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid gus β - Glucuronidase gene IBA Indol - 3 - butyric acid Km Kanamycin LB Môi trường nuôi cấy Luria - Bertani MS Môi trường cơ bản Murashige and Skoog nptII Neomycin phototranspherase II gene OD Optical density (Mật độ quang học) PCR Polumerase chain reaction (Phản ứng dây chuyền polimerase) T - DNA Transfer – DNA X - gluc 5-bromo-4 chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid iv
DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A. tumefaciens đến tỉ lệ biểu hiện gen gus tạm thời .................................................................... 25 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone đến tỉ lệ biểu hiện gen gus tạm thời .................................................................................. 27 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến tỉ lệ biểu hiện gen gus tạm thời .................................................................................. 30 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến chọn lọc mẫu không chuyển gen.................................................................................... 32 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến chọn lọc mẫu chuyển gen ...... 34 Bảng 3.6: Kết quả biến nạp gen gus vào dừa cạn ............................................ 37 v
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Ba giống Catharanthus roseus .........................................................4 Hình 1.2: Sơ đồ Ti plasmid ..............................................................................9 Hình 1.3: Quá trình chuyển T-DNA từ A.tumefaciens sang tế bào thực vật..... 10 Hình 2.1: Sơ đồ vector pCB-gusplus............................................................... 19 Hình 3.1: Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của mật độ tế bào vi khuẩn A. tumefaciens đến tỉ lệ biểu hiện gen gus tạm thời ............................... 26 Hình 3.2: Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone đến tỉ lệ biểu hiện gen gus tạm thời ................................................................ 28 Hình 3.3: Kết quả biểu hiện gen gus tạm thời ................................................. 29 Hình 3.4: Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến tỉ lệ biểu hiện gen gus tạm thời ................................................................ 31 Hình 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin đến hiệu quả chọn lọc mẫu không chuyển gen ............................................................................. 33 Hình 3.6: Đồ thị phản ánh ảnh hưởng của kanamycin đến tỉ lệ sống sót của mẫu chuyển gen.......................................................................... 35 Hình 3.7: Mẫu chuyển gen trên môi trường chọn lọc bổ sung nồng độ kanamycin 50 mg/l............................................................................ 36 Hình 3.8: Kết quả biểu hiện bền vững gen gus................................................ 38 Hình 3.9: Sơ đồ quy trình chuyển gen vào cây dừa cạn thông qua vi khuẩn A. tumefaciens................................................................................... 39 Hình 3.10: Hình ảnh chuyển gen gus vào cây dừa cạn .................................... 41 vi
MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Bệnh ung thư là một căn bệnh nguy hiểm, số người mắc căn bệnh này ngày một gia tăng và độ tuổi mắc phải ngày càng trẻ hóa, tạo gánh nặng lớn cho gia đình và xã hội. Trong khi đó, các loại thuốc chữa trị ung thư chưa nhiều và giá thành của chúng khá đắt. Vì vậy, việc nghiên cứu phương pháp làm tăng hàm lượng alkaloid ở cây thảo dược để hạ giá thành thuốc chữa bệnh được nhiều nhà khoa học trên thế giới và trong nước quan tâm. Cây dừa cạn là một trong những cây có khả năng sản xuất các indol alkaloid như vinblastine, vincristine có dược tính quan trọng trong chế tạo các loại thuốc chống ung thư, đặc biệt được sử dụng trong chống ung thư máu. Nhưng các chất này lại có hàm lượng rất nhỏ trong tế bào thực vật (khoảng 1 phần vạn trong lá dừa cạn khô đối với vinblastine còn đối với vincristine thì ít hơn 10 lần nữa) và không thể tổng hợp bằng con đường hóa học do có cấu trúc rất phức tạp. Trong cây dừa cạn, con đường dẫn tới sự tổng hợp vinblastine và vincristine qua một số sản phẩm trung gian, dưới sự xúc tác của một số enzym. Trong đó, deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (DAT) là một enzyme chìa khóa xúc tác cho phản ứng cuối cùng của quá trình tổng hợp vindoline [26]. Do vậy, nghiên cứu biện pháp nâng cao năng suất tổng hợp vinblastine và vincristine ở cây dừa cạn bằng công nghệ gen để phục vụ cho việc tạo thuốc chữa bệnh ung thư là rất cần thiết. Xuất phát từ thực tế trên, để góp phần tạo thành công cây dừa cạn chuyển gen với mục đích nâng cao năng suất tổng hợp hai loại ankaloid nói trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng được quy trình chuyển gen vào cây dừa cạn để phục vụ chuyển gen mục tiêu. 1
3. Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu xác định loại vật liệu làm thể nhận gen, mật độ tế bào vi khuẩn A. tumefaciens, nồng độ acetosyringone (AS), thời gian nhiễm khuẩn A. tumefaciens và nồng độ kanamycin phù hợp cho chuyển gen ở cây dừa cạn; - Nghiên cứu chuyển gen gus vào cây dừa cạn và tạo cây dừa cạn chuyển gen; - Đề xuất quy trình chuyển gen vào cây dừa cạn. 2
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây dừa cạn 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây dừa cạn Giống Catharanthus có nguồn gốc ở đảo Madagasca thuộc châu Phi với 8 loài (trừ loài C. pusillus (Murr) G. Don tìm thấy ở Ấn Độ). Vào giữa thế kỉ 18, dừa cạn được trồng nhiều ở Paris, sau đó được di nhập sang nhiều nước nhiệt đới Nam Á cũng như Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam và đảo Hải Nam - Trung Quốc. Được biết đến phổ biến nhất là loài Madagasca Periwinkle hay còn gọi là vinca nhờ vào khả năng chịu hạn và chịu nóng của nó. Ở Việt Nam, dừa cạn xuất hiện ở nhiều địa phương (nhất là ở các tỉnh đồng bằng và ven biển) do tính chất dễ trồng và phát triển nhanh của cây này. Dừa cạn có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tương đối tập trung ở các tỉnh miền Trung như Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Ðà Nẵng, Bình Ðịnh và Phú Yên. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa cạn có khi mọc gần như thuần loại trên các bãi cát dưới rừng phi lao, trảng cỏ, cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. Dừa cạn còn được trồng khắp nơi trong nước để làm cảnh và làm thuốc [17]. Cây dừa cạn có tên khoa học là: Catharanthus roseus (L.) G. Don, tên đồng nghĩa là Vinca rosea L. Hay còn được gọi là hải đằng, dương giác, bông dừa, tứ thời hoa, cây sừng dê, cây nhật tân, trường xuân hoa, thuộc Họ: Apocynaceae, Chi: Catharanthus, Loài: Catharanthus roseus. Catharanthus roseus (L.) G. Don là nguồn giàu alkaloid thuộc chủng loại alkaloid terpenoid indole được biết đến với 3 giống cây khác nhau: ‘roseus’ với hoa màu hồng tím; ‘ocellatus’ với hoa màu trắng, nhụy đỏ; ‘albus’ với hoa màu trắng. Trong đó giống hoa màu hồng tím có hàm lượng vincristine và vinblastine cao nhất [16], [30]. 3
C. roseus var. roseus C. roseus var. ocellatus C. roseus var. albus Hình 1.1: Ba giống Catharanthus roseus [30] 1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây dừa cạn Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40 - 60cm, phân nhiều cành, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên. Thân hình trụ có 4 khía dọc, có lông ngắn, thân non màu xanh lục nhạt sau chuyển sang màu hồng tím. Cây có bộ rễ phát triển và mọc thành bụi dày. Lá đơn nguyên, mọc đối chéo chữ thập, hình trứng, đầu hơi nhọn, dài 4 - 7cm, rộng 2 - 3cm, mặt trên sẫm, mặt dưới nhạt, có lông. Cuống lá ngắn, dài 3 - 5cm. Gân lá hình lông chim lồi mặt dưới, 12 - 14 cặp gân phụ hơi lồi mặt dưới, cong hướng lên trên. Hoa trắng hoặc đỏ tím, có mùi thơm. Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá gần ngọn. Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5. Cuống hoa dài 4 - 5mm. Lá đài 5, hơi dính nhau ở dưới, trên chia thành 5 thùy hình tam giác hẹp, có lông ở mặt ngoài, dài 3 - 4mm. Cánh hoa 5, dính. Ống tràng màu xanh, cao 2 - 4cm, hơi phình ở gần họng, mặt ngoài có 5 chấm lồi; 5 thùy có màu đỏ hây hồng tím, trắng, ... ở mặt trên, mặt dưới màu trắng, dài 1,5 - 1,7cm; miệng ống tràng có nhiều lông và có màu khác phiến (màu vàng hay đỏ nếu hoa trắng, màu đỏ sẫm hay vàng nếu hoa màu hồng tím). Tiền khai hoa vặn cùng chiều kim đồng hồ. Nhị rời đính ở phần phình của ống tràng, xen kẽ cánh hoa, chỉ nhị ngắn. Bao phấn hình mũi tên, hướng trong, khai dọc, đính đáy. Các bao phấn chụm trên đầu nhụy. Hạt phấn rời, hình chữ nhật, có rãnh dọc. Lá noãn rời ở bầu nhưng dính ở vòi và 4
đầu nhụy, mặt ngoài có nhiều lông, mỗi lá noãn mang nhiều noãn, đính noãn mép, bầu trên. Vòi nhụy dài bằng ống tràng, dạng sợi màu trắng. Đầu nhụy hình trụ, màu xanh, đỉnh có 2 thùy nhọn, phía dưới có màng mỏng màu vàng. 2 đĩa mật màu vàng, hình tam giác hẹp nằm xen kẽ 2 lá noãn [17]. Quả gồm 2 đại, dài 2 - 4cm, rộng 2 - 3cm, mọc thẳng đứng, hơi ngả sang hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù, trong quả chứa 12 - 20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có các hột nổi thành đường chạy dọc. Mùa hoa quả gần như quanh năm [17]. 1.1.3. Thành phần hóa học và một số công dụng của cây dừa cạn Dừa cạn trồng ở Việt Nam chứa khoảng 0,1 - 0,2% alkaloid toàn phần. Trong đó, loại hoa màu hồng tím có tỷ lệ hoạt chất cao nhất. Có nhiều loại alkaloid được tìm thấy trong dừa cạn, chủ yếu là vinblastine, vincristine, tetrahydroalstonine, pirinine, vindoline, catharanthine, vindolinine, ajmalicin… Trong đó, ajmalicin có hiệu quả tốt trong điều trị rối loạn thần kinh tim. Còn vinblastine và vincristine có liên kết đặc hiệu với tubulin, protein ống vi thể ở thoi phân bào, phong bế sự tạo thành các vi ống này và gây ngừng phân chia tế bào ở pha giữa. Vì thế, chúng được sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc điều trị ung thư [17]. Chiết xuất alkaloid trong dừa cạn được dùng dưới dạng muối sulfat để chữa bệnh ung thư. Vinblastine sulfat được coi là lựa chọn hàng đầu để điều trị ung thư biểu mô tinh hoàn, ngoài ra nó rất hiệu quả trong liệu pháp trị bệnh Hodgkin, ung thư nhau, ung thư biểu mô da đầu và ung thư biểu mô thận. Vinblastine sulfat cũng dùng để điều trị u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, ung thư cổ tử cung và ung thư dạng nấm da. Vincristine sulfat là một trong những thuốc chống ung thư được dùng rộng rãi nhất, đặc biệt có ích đối với các bệnh ung thư máu, thường được dùng để làm thuyên giảm bệnh bạch cầu lympho cấp. Đây là lựa chọn hàng đầu để điều trị bệnh Hodgkin, u bạch huyết không - Hodgkin, ung thư biểu mô phổi, u Wilm, bạch cầu tủy bào mạn (đợt 5
cấp tính), sarcom Ewing và sarcom cơ vân. Ngoài ra, ở dạng dùng phối hợp, vincristine sulfat còn được dùng cho ung thư biểu mô vú, ung thư cổ tử cung, u nguyên bào thần kinh và bệnh bạch cầu lympho mạn tính. Nhân dân ta đã có bài thuốc chữa bạch cầu cấp (bệnh máu trắng) bằng cách sắc uống thân và lá cây dừa cạn (khoảng 15 gam thân lá khô/ngày) [27]. Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, có nơi dùng thân và lá phơi khô, sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít, làm thuốc điều kinh, tẩy giun, chữa sốt, chữa bệnh ngoài da [17]. 1.1.4. Alkaloid chính trong cây dừa cạn Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ, và có tính base. Alkaloid có hoạt tính sinh lý rất cao đối với cơ thể con người và động vật, nhất là đối với hệ thần kinh. Với chỉ một lượng nhỏ alkaloid là chất độc gây chết người nhưng lại có khi nó là thần dược trị bệnh đặc hiệu [19]. Alkaloid toàn phần có ở lá dừa cạn với hàm lượng 0,37 - 1,15%, ở thân 0,40%, rễ chính 0,7 - 2,4%, rễ phụ 0,9 - 3,7%, hoa 0,14 - 0,84%, vỏ quả 1,14%, hạt 0,18%. Có khoảng 150 loại alkaloid đã được chiết từ Catharanthus roseus. Trong số đó đặc biệt chú ý là nhóm 20 alkaloid dimeric, là những nhóm có hoạt tính chống ung thư bao gồm vinblastine và vincristine. Vinblastine có ở lá với hàm lượng 0,013 - 0,063%, ở bộ phận trên mặt đất 0,0015%, ở rễ 0,23% (cây bị bệnh asteryllow-virus thì không có vinblastine). Vincristine với hàm lượng thấp hơn 0,0003 - 0,0015% [23]. 1.2. Công nghệ chuyển gen thực vật và ứng dụng 1.2.1. Các phương pháp chuyển gen ở thực vật Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, động vật, …) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện 6
các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen. Gen chuyển phải được di truyền cho thế hệ sau và ở mỗi thế hệ sản phẩm biểu hiện của gen phải thể hiện được chức năng sinh học [11]. Chuyển gen ở thực vật có ý nghĩa lớn về mặt khoa học, nó khẳng định tính khách quan tự nhiên của vật chất di truyền: khả năng mã hóa cho các tính trạng nhất định, khả năng phiên mã, dịch mã và khả năng di truyền. Thông qua chuyển gen các nhà sinh lý, hóa sinh và di truyền học có thể nghiên cứu các quá trình điều khiển, thể hiện và ảnh hưởng của các yếu tố di truyền và ngoại cảnh lên hoạt động của gen. Có nhiều phương pháp chuyển gen ở thực vật nhưng có thể phân loại thành hai nhóm phương pháp chính: phương pháp chuyển gen trực tiếp và phương pháp chuyển gen gián tiếp. Phương pháp chuyển gen trực tiếp thường được sử dụng là chuyển gen bằng súng bắn gen (gene gun). Với ưu điểm là thao tác dễ dàng, bắn một lần được nhiều tế bào và nguyên liệu để bắn đa dạng, trong những năm gần đây phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen đã được áp dụng thành công trên lúa, mía, đu đủ, bông. Nhưng phương pháp này đòi hỏi chi phí thiết bị đắt tiền và có nhiều bản sao trong gen biến nạp được chuyển vào tế bào cùng lúc gây khó khăn trong việc phân tích biểu hiện gen, dẫn đến sự biểu hiện của các gen không bền vững. Phương pháp chuyển gen gián tiếp được sử dụng phổ biến là chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium. Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium được nghiên cứu từ những năm 1960 - 1970. Việc phát hiện ra Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) có khả năng chuyển gen vào thực vật vào đầu năm 1980 đã biến loài này trở thành một công cụ quan trọng nhất trong chuyển gen thực vật với những ưu điểm nổi trội: (i) Gen chuyển ít bị đào thải; (ii) Số lượng bản sao ít, do đó tránh được hiện tượng ức chế và câm lặng lẫn nhau; (iii) 7
Tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật do phụ thuộc vào hệ thống protein Vir; (iv) Tránh được sự hình thành các cây chuyển gen khảm; (v) Kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện và không đòi hỏi thiết bị đắt tiền. Mặc dù vậy, phương pháp này mới chỉ được sử dụng thành công ở nhiều cây hai lá mầm, nhưng hiệu quả với cây một lá mầm còn thấp (do ở cây một lá mầm các tế bào khi bị thương có xu hướng hóa gỗ chứ không phân chia mạnh để tái tạo hoặc tiếp hợp chất phenol như cây hai lá mầm). Khi nhược điểm này được khắc phục thì phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium sẽ ngày càng được quan tâm và dẫn trở thành một phương pháp chuyển gen được các nhà nghiên cứu ưu tiên lựa chọn vì lúa, ngô, lúa mì, … là những cây lương thực thiết yếu [28]. * Vi khuẩn A. tumefaciens và hiện tượng khối u ở thực vật Agobacterium là vi khuẩn gram âm, gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương. Trong chi Agrobacterium thì A. tumefaciens được sử dụng nhiều nhất trong chuyển gen. Vi khuẩn A. tumefaciens không tự sản xuất được một số amino acid như octopin, nopaline. Để tồn tại nó chuyển gen của nó vào thực vật, thực vật sản xuất các chất cần thiết, vi khuẩn phân hủy các chất này để lấy năng lượng. Trong quá trình cộng sinh này, vi khuẩn cũng chuyển các gen kích thích sinh trưởng làm các tế bào nhiễm vi khuẩn phân chia vô tổ chức, gây phát sinh khối u ở thực vật. Ti plasmid - một loại plasmid đặc hiệu được vi khuẩn chuyển nạp vào tế bào thực vật - là tác nhân gây nên tình trạng khối u [29]. Ti plasmid là một phân tử DNA kép, gồm 150.000 – 200.000 cặp nucleotit. Tuy nhiên chỉ có một đoạn gồm 20.000 – 30.000 cặp nucleotit có khả năng thâm nhập vào genome của tế bào chủ, đó là đoạn T-DNA. T-DNA có chứa các đoạn gen gây ra sự sinh trưởng không kiểm soát của tế bào thực vật, đó là các gen mã hóa auxin và cytokynin. Trên Ti plasmid còn có vùng vir chứa các gen chịu trách nhiệm lây nhiễm, chuyển nạp và tiêu hóa opine [31]. 8
Hình 1.2: Sơ đồ Ti plasmid [31] * Quá trình chuyển nạp của vi khuẩn Thực vật khi bị thương sẽ tiết ra các chất có bản chất phenol là acetosyringone và hydroxyacetosyringone. Các chất này sẽ thu hút vi khuẩn tập trung vào vùng bị thương đồng thời chúng hoạt hóa các gen ở vùng vir là A, B, C, D, E, F, G và tạo ra các protein tương ứng. Các protein này này có hai chức năng chính: (i) Cắt đứt đoạn bờ phải và bờ trái để giải phóng đoạn T-DNA; (ii) Bao bọc và vận chuyển đoạn T-DNA vào tế bào thực vật để tiếp cận với genome cây chủ. Vết thương của cây được nhận diện thông qua tín hiệu hóa học acetosyringone. Tín hiệu này được nhận biết đầu tiên bởi vir A. Gen vir A sẽ tổng hợp nên một loại protein nằm trong màng tế bào để đáp ứng sự trao đổi chất của vết thương trên thực vật. Protein vir A tự phosphoryl hóa đồng thời làm cho protein vir G được phosphoryl hóa và kích hoạt sao mã các gen vir B, C, E, F, G, H [20]. Tiếp đó, các protein được mã hóa bởi vir D, vir E thực hiện chức năng giải phóng sợi T-DNA. Protein D2 cắt T-DNA ở vị trí 5’ của bờ phải và 3’ của bờ trái, protein E2 bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của enzyme nuclease trong cây. Protein C1, C2 đồng thực hiện chức năng tăng cường giải phóng T-DNA. Sự chuyển phức hợp T-DNA do operon vir B đảm nhiệm. Protein vir B có chức năng tạo kênh xuyên màng tế bào giúp sợi đơn T-DNA vào nhân tế bào. Đồng thời protein vir B4, vir B11 có hoạt tính ATPase cung cấp năng lượng cho vận chuyển T-DNA [18], [20]. 9
Hình 1.3: Quá trình chuyển T-DNA từ A. tumefaciens sang tế bào thực vật 1.2.2. Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine ở cây dừa cạn bằng phương pháp chuyển gen Nghiên cứu nuôi cấy rễ tơ, loại rễ hình thành do sự xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes vào mô thực vật tổn thương từ lâu đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như phân tích chức năng của gen, biểu hiện protein ngoại lai, sản xuất các hợp chất thứ cấp hay biến đổi thành phần các chất chuyển hóa ở thực vật. Nguyên nhân của sự phát triển rễ tơ đã được xác định liên quan đến vùng TL-DNA nằm trên plasmid Ri của các chủng Agrobacterium rhizogenes, trong đó giữ vai trò quan trọng là 4 locus gen rolA, rolB, rolC và rolD. Các nghiên cứu về hàm lượng alkaloid, vincristine và vinblastine ở cây dừa cạn cho thấy, các chất này có hàm lượng cao ở rễ. Vì vậy, nghiên cứu sự phát triển rễ tơ ở cây dừa cạn đã được một số nghiên cứu đề cập. Javier và cs (1998), thu được các dòng rễ Catharanthus roseus chuyển gen phát triển rễ tơ nhờ Agrobacterium rhizogenes chủng A4 trên môi trường muối B5 1/2, không bổ sung chất kích thích sinh trưởng. Hàm lượng indole alkaloid trong rễ nuôi cấy đã được xác định. Kết quả cho thấy, tất cả các dòng rễ dừa 10
cạn chuyển gen được phân tích đều có mặt của vindoline và catharanthine, hai tiền chất tổng hợp vinblastine và vincristine. Trong điều kiện nuôi cấy của thí nghiệm, rễ với hình thái mỏng cho lượng sản phẩm gen rolC cao nhất. Như vậy, các rễ nuôi cấy có tốc độ tăng trưởng thấp thì có khả năng sản xuất alkaloid cao. Ngược lại, những rễ mập là những rễ có khả năng tăng trưởng nhanh hơn thì lại cho hàm lượng alkaloid thấp hơn [21]. Cũng bằng nghiên cứu chuyển các gen mã hóa các enzyme chìa khóa của con đường tổng hợp TIAs vào rễ tơ C.roseus qua Agrobacterium rhizogenes, sau đó tiến hành phân tích các dòng rễ chuyển gen bằng RT-PCR và HPLC, Goklany và cs (2009), đã nhận thấy có sự tăng hàm lượng các chất tương ứng trong con đường tổng hợp TIAs [24]. Tuy nhiên, hạn chế của các nghiên cứu này là mới chỉ dừng lại ở việc tạo được các dòng rễ chuyển gen và phát hiện ra mối quan hệ giữa hình thái rễ với khả năng tổng hợp alkaloid nói chung và các tiền chất của vincristine, vinblastine. Wang và cs (2012) đã phát triển phương pháp chuyển gen ở cây dừa cạn bằng cách sử dụng Agrobacterium tumefaciens chủng EHA được biến nạp vector nhị thể pCAMBIA2301chứa gen β-glucuronidase (gus) và gen neomycin phosphotransferase II (nptII). Lây nhiễm Agrobacterium tumefaciens chủng EHA tái tổ hợp nói trên vào mô sẹo, chồi và rễ, sau đó chuyển các mẫu lên môi trường nuôi cấy bổ sung kanamycin, các tác giả đã thu được các dòng cây tái sinh. Biểu hiện của gen gus được xác định thông qua biểu hiện kiểu hình của mô nuôi cấy trên môi trường bổ sung X-gal. Sự có mặt của gen gus được xác định bằng phản ứng dây chuyền polymerase và phân tích southern blot. Để chứng minh hiệu quả của kĩ thuật chuyển gen thông qua gen chỉ thị gus vào Catharanthus roseus, gen DAT mã hóa deacetylvindoline-4-O- acetyltransferase đã được chuyển vào cây dừa cạn và thu được 16 cây T0 chuyển gen thành công, hiệu suất chuyển gen là 11%. Kết quả phân tích bằng 11