Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu chuyển gen EcHB1 làm tăng chiều dài sợi gỗ vào bạch đàn lai UP (Eucalyptus urophylla x E. pellita) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:106

Thêm vào BST

Báo xấu

28
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài được tiến hành với mục tiêu xây dựng được quy trình chuyển gen cho chiều dài sợi gỗ EcHB1 vào Bạch đàn lai UP từ đó chọn tạo được các giống bạch đàn biến đổi gen có năng suất, chất lượng cao để phục vụ chương trình trồng rừng gỗ lớn.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu chuyển gen EcHB1 làm tăng chiều dài sợi gỗ vào bạch đàn lai UP (Eucalyptus urophylla x E. pellita) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Thị Việt Hà NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN EcHB1 LÀM TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ VÀO BẠCH ĐÀN LAI UP (Eucalyptus urophylla x E. pellita) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Hà Nội - 2021
BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Nguyễn Thị Việt Hà NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN EcHB1 LÀM TĂNG CHIỀU DÀI SỢI GỖ VÀO BẠCH ĐÀN LAI UP (Eucalyptus urophylla x E. pellita) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: Hƣớng dẫn 1: TS. Trần Hồ Quang Hƣớng dẫn 2: TS. Lê Sơn Hà Nội - 2021
Lời cam đoan Tôi xin cam đoan những nội dung trong luận văn là kết quả nghiên cứu của bản thân dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Trần Hồ Quang và TS. Lê Sơn. Mọi kết quả nghiên cứu cũng nhƣ ý tƣởng của các tác giả khác (nếu có) đều đƣợc trích dẫn cụ thể. Đề tài luận văn này cho đến nay chƣa đƣợc bảo vệ tại bất kỳ một hội đồng bảo vệ luận văn thạc sĩ nào cũng nhƣ chƣa đƣợc công bố trên bất kỳ phƣơng tiện nào. Tôi xin chịu trách nhiệm về những lời cam đoan trên. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Ngƣời cam đoan Nguyễn Thị Việt Hà
Lời cảm ơn Tôi xin cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, phòng Đào tạo, các thầy giáo, cô giáo tại Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giảng dạy, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trƣờng. Tôi cũng xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, cùng toàn thể các cán bộ Bộ môn Sinh học phân tử - Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy hƣớng dẫn, TS. Trần Hồ Quang (Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và TS. Lê Sơn (Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam) đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Luận văn đƣợc sử dụng một phần số liệu và kết quả từ đề tài cấp Nhà nƣớc “Nghiên cứu tạo giống bạch đàn lai biến đổi gen cho chiều dài sợi gỗ (giai đoạn 2)” do ThS. Trần Đức Vƣợng làm chủ nhiệm, thuộc Chƣơng trình trọng điểm phát triển và ứng dụng Công nghệ sinh học trong Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đến 2020 mà Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp là đơn vị thực hiện. Xin chân thành cám ơn. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình và bạn bè đã giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Học viên Nguyễn Thị Việt Hà
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt STT Từ viết tắt Viết đầy đủ 1. AS Acetosyringone 2. BAP 6-Benzyl Amino Purine 3. CNSH Công nghệ sinh học 4. ĐC Đối chứng 5. ĐHST Điều hòa sinh trƣởng 6. ADN Acid Deoxyribonucleic 7. IBA Indole-3-Butyric Acid Institute of Forest Tree Improvement and 8. IFTIB Biotechnology 9. Km Kanamycin 10. LB Môi trƣờng nuôi cấy Luria and Betani 11. MS Môi trƣờng nuôi cấy Murashige & Skoog 12. NAA 1-Naphthyl Acetic Acid 13. OD Mật độ quang học (Optical Density) Phản ứng trùng hợp chuỗi (Polymerase Chain 14. PCR Reaction)
Danh mục các bảng Bảng 1.1. Các loài bạch đàn đƣợc nghiên cứu chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ................................................................................................. 27 Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu .......................................... 40 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR ............................................................. 40 Bảng 2.3. Chu trình phản ứng PCR................................................................. 40 Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin .......... 42 Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ Kanamycin đến khả năng ra rễ .. 44 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của tuổi vật liệu đến mẫu tạo mô sẹo .......................... 45 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo................................................................................................ 47 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng mật độ vi khuẩn đến tỷ lệ chồi tái sinh ........................ 49 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ tạo mô sẹo ................ 50 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo........................................................................................................ 52 Bảng 3.8. Khả năng sống sót của chồi chuyển gen sau các lần chọn lọc ....... 56 Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra khả năng ra rễ của chồi chuyển gen sau các lần chọn lọc ........................................................................................................... 59 Bảng 3.10. So sánh hình thái thân giữa cây chuyển gen với cây đối chứng... 60 Bảng 3.11. So sánh hình thái lá giữa cây chuyển gen và cây đối chứng ........ 61 Bảng 3.12. Đánh giá sinh trƣởng về chiều cao của cây con ngoài vƣờn ƣơm sau 1, 2 và 3 tháng.................................................................................................. 63 Bảng 3.13. Tổng hợp kết quả đo kích thƣớc lá ở giai đoạn 2 tháng tuổi ........ 64 Bảng 3.14. Tổng hợp kết quả đo kích thƣớc lá ở giai đoạn 3 tháng tuổi ........ 65
Danh mục các hình vẽ, đồ thị Hình 1.1. Tỷ lệ cây trồng biến đổi gen/tổng diện tích cây cùng loại của 5 nƣớc trồng cây biến đổi gen lớn nhất trên thế giới .................................................... 7 Hình 1.2. Tổng giá trị (USD) thu đƣợc từ cây trồng biến đổi gen toàn cầu ..... 9 Hình 1.3. Bạch đàn lai UP trồng khảo nghiệm tại Yên Bình – Yên Bái ........ 21 Hình 1.4. Cây con Bạch đàn lai UP bằng phƣơng pháp nhân giống in vitro .. 23 Hình 2.1. Vật liệu Bạch đàn lai UP sử dụng trong chuyển gen ...................... 31 Hình 2.2. Cấu trúc vector pGWB2/35S/EcHB1 ............................................. 32 Hình 2.3. Sơ đồ quy trình tái sinh thông qua phôi soma cho Bạch đàn lai UP ......................................................................................................................... 34 Hình 2.4. Vị trí các lá đƣợc chọn để đánh giá hình thái ................................. 38 Hình 3.1. Ảnh hƣởng ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Km đến chồi chƣa chuyển gen....................................................................................................... 43 Hình 3.2. Bạch đàn lai UP 15 ngày tuổi tạo mô sẹo trên môi trƣờng chọn lọc .. 45 Hình 3.3. Mẫu bật chồi sau chuyển gen khi tiền nuôi cấy 48 giờ ................... 48 Hình 3.4. Mẫu nhiễm khuẩn với thời gian lần lƣợt sau 10 phút, 15 phút, 20 phút .................................................................................................................. 51 Hình 3.5. Sơ đồ quy trình chuyển gen EcHB1 vào Bạch đàn lai UP .............. 54 Hình 3.6. Mẫu chuyển gen tái sinh trên môi trƣờng chọn lọc ........................ 55 Hình 3.7. Bình nhân chồi dòng Bạch đàn lai UP chuyển gen EcHB1 ............ 55 Hình 3.8. Chồi chuyển gen EcHB1 trên môi trƣờng chọn lọc ........................ 58 Hình 3.9. Hình thái thân và lá của dòng bạch đàn chuyển gen và đối chứng . 62 Hình 3.10. Cây bạch đàn chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn 2 tháng tuổi ......................................................................................................................... 63 Hình 3.11. Hình thái và kích thƣớc lá cây chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn 2 tháng tuổi ............................................................................................. 64
Hình 3.12. Hình thái và kích thƣớc lá cây chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn 3 tháng tuổi ............................................................................................. 66 Hình 3.13. Bạch đàn chuyển gen ra rễ trên môi trƣờng chọn lọc và cây con tại vƣờn ƣơm ........................................................................................................ 67 Hình 3.14. Cây con chuyển gen EcHB1 trồng tại vƣờn ƣơm ......................... 67 Hình 3.15. Kết quả chạy điện di kiểm tra ADN một số dòng Bạch đàn lai UP ......................................................................................................................... 68 Hình 3.16. Kết quả PCR 40 dòng bạch đàn chuyển gen EcHB1 .................... 69 Hình 3.17. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen EcHB1 bằng PCR ................ 70
1 MỤC LỤC MỤC LỤC ........................................................................................................ 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 4 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 6 1.1. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ...................................... 6 1.1.1. Hiện trạng và vai trò cây trồng biến đổi gen ........................................... 6 1.1.1.1. Hiện trạng cây trồng biến đổi gen ....................................................... 6 1.1.1.2. Vai trò của cây trồng biến đổi gen ....................................................... 8 1.1.1.3. Tình hình cây trồng biến đổi gen ở nước ta ......................................... 9 1.1.2. Các phƣơng pháp chuyển gen ......................................................... 11 1.1.2.1. Chuyển gen trực tiếp ........................................................................... 11 1.1.2.2. Chuyển gen gián tiếp .......................................................................... 12 1.1.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen cây lâm nghiệp ............................... 13 1.1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................... 13 1.1.3.2. Các nghiên cứu trong nước ................................................................ 15 1.2. TỔNG QUAN VỀ CÂY BẠCH ĐÀN LAI UP....................................... 17 1.2.1. Tổng quan về bạch đàn và Bạch đàn lai UP ......................................... 17 1.2.1.1. Tổng quan về bạch đàn ...................................................................... 17 1.2.1.2. Nghiên cứu và phát triển giống Bạch đàn lai UP ở Việt Nam .......... 20 1.2.3. Các hƣớng cải thiện giống bạch đàn bằng ứng dụng Công nghệ sinh học ......................................................................................................................... 22 1.2.3.1. Nhân giống vô tính in vitro cây bạch đàn .......................................... 22 1.2.3.2. Tái sinh in vitro thông qua sự hình thành callus và phôi soma ......... 24 1.2.3.3. Nghiên cứu phát triển và sử dụng các chỉ thị phân tử trong chọn tạo và lai giống ...................................................................................................... 25
2 1.2.3.4. Chuyển gen cho loài bạch đàn ........................................................... 26 1.2.4. Gen EcHB1 và ứng dụng trong cải thiện chiều dài sợi gỗ .................... 28 1.2.4.1. Vai trò của nhân tố phiên mã trong sinh trưởng của thực vật ........... 28 1.2.4.2. Nhân tố phiên mã gen EcHB1 ............................................................ 30 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................................................................... 31 2.1. VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT ................................. 31 2.1.1. Vật liệu thực vật .................................................................................... 31 2.1.2. Vật liệu di truyền và chủng vi khuẩn .................................................... 31 2.1.3. Trang thiết bị và hóa chất ...................................................................... 32 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................ 33 2.2.1. Nghiên cứu tái sinh in vitro ở các dòng Bạch đàn UP .......................... 33 2.2.2. Xác định ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin ........................... 35 2.2.3. Xác định tuổi vật liệu đến tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ................................... 35 2.2.4. Xác định thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo .................. 36 2.2.5. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A. tumefaciens .................................. 36 2.2.6. Xác định thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo.................................................................................................................... 36 2.2.7. Xác định thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo ............................................................................................................. 37 2.2.8. Tái sinh cây từ mẫu đã biến nạp gen, nhân các dòng biến nạp gen, ra rễ và trồng chăm sóc bên ngoài vƣờn ƣơm ......................................................... 37 2.2.9. Phƣơng pháp đánh giá hình thái cây chuyển gen.................................. 37 2.2.10. Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số................................................. 38 2.2.11. Xác định sự có có mặt của gen trong cây chuyển gen bằng PCR ...... 39 2.2.12. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu .................................. 41
3 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 42 3.1. QUY TRÌNH CHUYỀN GEN VÀO CÂY BẠCH ĐÀN LAI UP THÔNG QUA A. TUMEFACIENS ................................................................................ 42 3.1.1. Ảnh hƣởng của ngƣỡng nồng độ chất chọn lọc Kanamycin ................. 42 3.1.3. Ảnh hƣởng của thời gian tiền nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo........................................................................................................ 46 3.1.4. Xác định mật độ tế bào vi khuẩn A. tumefaciens .................................. 48 3.1.5. Ảnh hƣởng của thời gian nhiễm khuẩn đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo........................................................................................................ 49 3.1.6. Ảnh hƣởng của thời gian đồng nuôi cấy đến tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo........................................................................................................ 51 3.1.8. Đánh giá khả năng sống sót của chồi chuyển gen ................................ 56 3.1.9. Đánh giá khả năng ra rễ và kiểm tra chồi chuyển gen .......................... 58 3.2. PHÂN TÍCH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÌNH THÁI CỦA CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI CHUYỂN GEN ................................................................. 60 3.2.1. So sánh hình thái cây Bạch đàn lai UP chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn in vitro ............................................................................................. 60 3.2.2. So sánh hình thái cây chuyển gen và cây đối chứng giai đoạn vƣờn ƣơm ......................................................................................................................... 62 3.3. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG MANG GEN CỦA CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN TẠO ĐƢỢC BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR .................................................. 66 3.3.1. Tách chiết DNA tổng số ........................................................................ 66 3.3.2. Xác định sự có có mặt của gen EcHB1 trong cây bằng PCR ............... 68 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 71 4.1. Kết luận .................................................................................................... 71 4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 72
4 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, công nghệ gen đƣợc ghi nhận là giải pháp quan trọng và hữu hiệu trong chọn tạo giống mới đặc biệt là kỹ thuật chuyển gen. Thông qua việc sử dụng các kỹ thuật trong chuyển gen cho phép tạo ra những giống cây trồng mới đột phá về năng suất, chất lƣợng cũng nhƣ khả năng chống chịu sâu bệnh hại. Không những thế cây trồng tạo ra từ quy trình chuyển gen có nhiều đặc tính ƣu việt mà ở cây trồng hoang dại ban đầu không có. Chuyển gen ở bạch đàn đã đƣợc thực hiện từ những năm 1990 cho nhiều loài bạch đàn nhƣ: Eucalyptus gunnii, E. globulus, E. camaldulensis, E. nitens,... [1]. Chuyển gen cho cây bạch đàn chủ yếu tập trung vào các tính trạng về tăng sinh khối, thay đổi tính chất gỗ (thay đổi hàm lƣợng lignin, cellulose), chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi (hạn hán, lạnh, nhiễm mặn) và chống sâu bệnh hại. Việc chuyển gen trên cây bạch đàn đã đƣợc thực hiện ở trong và ngoài nƣớc. Tetsu Kawazu và cộng sự (2003) đã đƣợc cấp bằng sáng chế về quy trình chuyển gen gus vào loài bạch đàn E. camaldulensis, E. globulus, E. grandis, E. grandis x E.urophylla và E. urophylla bằng các mẫu cấy sinh dƣỡng lấy từ cây bạch đàn trƣởng thành; Cheng và cộng sự (2006) cũng đã đƣợc cấp bằng sáng chế về quy trình chuyển gen và chọn lọc cây chuyển gen cho loài bạch đàn E. urophylla. Các kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng các loài bạch đàn, dòng bạch đàn khác nhau thì có quy trình chuyển gen khác nhau cũng nhƣ cho hiệu suất chuyển gen khác nhau [2]. Do vậy để chuyển gen hiệu quả vào từng loài bạch đàn và từng dòng bạch đàn cụ thể cần có một quy trình thích hợp. Tetsuya Sonoda và cộng sự (2009) phối hợp nghiên cứu với công ty giấy Oji đã thành công trong việc phân lập gen EcHB1 mã hóa nhân tố phiên mã loại II (HD-Zip class II transcription factor) liên quan đến việc hình thành và phát triển sợi gỗ đƣợc phân lập từ các nhóm gen nhân tố phiên mã trên bạch đàn E. camaldulensis. Sử dụng kỹ thuật microarray cho thấy ở bạch đàn E. camaldulensis biến nạp gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1), biểu hiện của
5 các gen chính liên quan đến quá trình sinh tổng hợp lignin nhƣ CCoAOMT, CAD, CCR và C4H đều giảm [3]. Tại Việt Nam, bạch đàn chuyển gen tăng chiều dài sợi gỗ (EcHB1) đã đƣợc Trần Hồ Quang và cộng sự thực hiện trong khuôn khổ đề tài ”Nghiên cứu tạo giống bạch đàn lai biến đổi gen cho chiều dài sợi gỗ” giai đoạn 2011- 2015, kết quả đã xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen EcHB1 vào Bạch đàn lai UU (E. urophylla x E. urophylla) làm tăng chiều dài sợi gỗ và chọn đƣợc dòng bạch đàn lai UU89 có sinh trƣởng nhanh (vƣợt trội về chiều cao hơn 25%, đƣờng kính hơn 10% so với giống đại trà). Hiện nay, một số dòng Bạch đàn lai UP là giống lai giữa Bạch đàn urophylla và Bạch đàn pellita (E. urophylla x E. pellita) đƣợc đánh giá có ƣu thế lai, sinh trƣởng tốt hơn so với các loài bố mẹ trên nhiều dạng lập địa và đã đƣợc công nhận là giống quốc gia và giống tiến bộ kỹ thuật để phát triển rộng rãi trong sản xuất, đây là nguồn vật liệu tiềm năng cho chuyển gen làm tăng chiều dài sợi gỗ. Xuất phát từ những cơ sở trên đề tài ”Nghiên cứu chuyển gen EcHB1 làm tăng chiều dài sợi gỗ vào bạch đàn lai UP (Eucalyptus urophylla x E. pellita) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens” đã đƣợc tiến hành với mục tiêu xây dựng đƣợc quy trình chuyển gen cho chiều dài sợi gỗ EcHB1 vào Bạch đàn lai UP từ đó chọn tạo đƣợc các giống bạch đàn biến đổi gen có năng suất, chất lƣợng cao để phục vụ chƣơng trình trồng rừng gỗ lớn.
6 1. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 1.1.1. Hiện trạng và vai trò cây trồng biến đổi gen 1.1.1.1. Hiện trạng cây trồng biến đổi gen Cây trồng biến đổi gen (Genetically Modified Crops – GM Crops) đƣợc thƣơng mại hóa từ năm 1996. Tổ chức Quốc tế về Tiếp thu các Ứng dụng Công nghệ sinh học trong Nông nghiệp (ISAAA) phát hành báo cáo thƣờng niên cập nhật tình hình ứng dụng cây trồng Công nghệ sinh học (CNSH) hay cây trồng biến đổi gen trên toàn cầu năm 2017; cho thấy diện tích canh tác cây trồng biến đổi gen đã tăng gấp 110 lần sau 21 năm thƣơng mại hoá - phát triển từ 1,7 triệu ha năm 1996 lên tới 185,1 triệu ha vào năm 2016. Báo cáo cũng tiếp tục cho thấy các lợi ích lâu dài của cây trồng biến đổi gen đối với nông dân, đồng thời nhấn mạnh tiềm năng phát triển và lợi ích của một số giống cây mới đƣợc chấp thuận thƣơng mại hoá trong thời gian gần đây đối với ngƣời tiêu dùng. Tính đến năm 2017 đã có 67 quốc gia sử dụng cây trồng biến đổi gen (bao gồm 26 quốc gia trồng cây biến đổi gen), cấp phép chính thức nhập khẩu và sử dụng cây trồng biến đổi gen với mục đích làm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và chế biến. Cụ thể, tại châu Âu, bốn quốc gia là Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha, Séc và Slovakia đã trồng hơn 136.000 ha bắp biến đổi gen trong năm 2016, tăng 17% so với năm 2015. Ở châu Phi, Nam Phi và Sudan cũng liên tiếp mở rộng diện tích bắp, đậu nành biến đổi gen và đạt 2,66 triệu ha trong năm 2016, trong khi năm 2015 mới chỉ có 2,29 triệu ha. Còn châu Mỹ, Brazil có diện tích canh tác bắp, đậu nành, bông và hạt cải dầu GM Crops tăng 11%, là nƣớc lớn thứ 2 sau Mỹ về diện tích trồng biến đổi gen. Tại châu Á, Bangladesh là nƣớc thứ 28 trồng cây Cà tím Bt vào tháng 10 năm 2013. Năm 2018, ở Châu Phi mới có 3 quốc gia ứng dụng cây trồng biến đổi gen là Nam Phi, Sudan, Vƣơng quốc Eswatini. Trong năm 2019, châu lục này đã có thêm 3 quốc gia là Malawi, Nigeria và Ethiopia, quyết định khai thác lợi ích của các cây trồng biến đổi gen. Ngoài ra, Kenya đã công bố việc
7 thƣơng mại hoá bông biến đổi gen vào cuối năm 2019, và chính thức bắt đầu canh tác vào năm 2020. Với việc bổ sung thêm ba quốc gia ở châu Phi, số quốc gia trồng cây trồng biến đổi gen trong năm 2019 tăng lên thành 29 quốc gia. Trong đó, 5 quốc gia dẫn đầu với diện tích cây trồng biến đổi gen lớn nhất là Hoa Kỳ, Brazil, Argentina, Canada và Ấn Độ (Hình 1.1). Với tỷ lệ ứng dụng cao các cây trồng biến đổi gen chính tại các quốc gia này, có khoảng 1,95 tỷ ngƣời, tƣơng đƣơng với 26% dân số thế giới, đƣợc hƣởng lợi từ CNSH vào năm 2019 [4]. Hình 1.1. Tỷ lệ cây trồng biến đổi gen/tổng diện tích cây cùng loại của 5 nƣớc trồng cây biến đổi gen lớn nhất trên thế giới (Nguồn: ISAAA) Tính đến năm 2019, tổng cộng có 190,4 triệu ha cây trồng biến đổi gen đƣợc canh tác tại 29 quốc gia, góp phần quan trọng vào giải quyết các vấn đề về an ninh lƣơng thực, tính bền vững, giảm thiểu biến đổi khí hậu cũng nhƣ nâng cao đời sống của hơn 17 triệu nông dân ứng dụng CNSH cùng gia đình của họ trên toàn cầu. Tốc độ tăng trƣởng diện tích vùng trồng cây biến đổi gen đạt đến hai con số đã đƣợc ghi nhận tại các quốc gia đang phát triển, đặc biệt là ở Việt Nam, Philippines và Colombia [4].
8 1.1.1.2. Vai trò của cây trồng biến đổi gen Cây trồng biến đổi gen có những đóng góp về mặt kinh tế, xã hội và môi trƣờng nhƣ sau: - Cây trồng biến đổi gen giúp nông dân các nƣớc đang phát triển cải thiện thu nhập, góp phần vào xóa đói giảm nghèo. Trong giai đoạn 1996 – 2016 diện tích canh tác cây trồng biến đổi gen đã tăng gấp 110 lần sau 21 năm thƣơng mại hóa, phát triển từ 1,7 triệu ha năm 1996 lên tới 185,1 triệu ha vào năm 2016 đã góp phần làm tăng giá trị sản xuất lên đến 186,1 tỷ đô la cho khoảng 17 triệu nông dân trên toàn cầu [4]. - Cung cấp nguồn lƣơng thực thiết yếu cho tƣơng lai với việc tạo ra các cây trồng biến đổi gen mang những tính trạng quý nhƣ kháng virus, kháng sâu bệnh, chịu mặn, năng suất cao hơn... Ngoài ra còn tăng cƣờng chất lƣợng thực phẩm đƣợc ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới nhƣ các giống lúa giàu carotenoid (tiền vitamin A), khoai tây biến đổi gen với hơn ⅓ lƣợng protein là các chất dinh dƣỡng thiết yếu và có giá trị cao. - Hoạt động nông nghiệp truyền thống của con ngƣời có tác động rất lớn với môi trƣờng. Cây trồng biến đổi gen với các tính trạng kháng sâu, kháng virus và chống chịu chất diệt cỏ góp phần làm giảm việc sử dụng các hóa chất trong trồng trọt. Giúp tiết kiệm 671 triệu kg thuốc trừ sâu (giai đoạn 1996 - 2016), và 48,5 triệu kg riêng trong năm 2016; làm giảm EIQ (Environmental Impact Quotient) đến 18,4% trong giai đoạn 1996-2016, và riêng năm 2016 đạt 18,3%. - Cây trồng biến đổi gen có thể giúp giải quyết những lo ngại lớn nhất về môi trƣờng, Giảm thiểu tác hại của biến đổi khí hậu và giảm lƣợng khí gây hiệu ứng nhà kính, giảm thiểu tác động của thay đổi thời tiết. Theo đánh giá trong năm 2016, cây trồng biến đổi gen đã làm giảm khoảng là 27,1 tỷ kg tƣơng đƣơng với khí thải của 16,7 triệu chiếc xe hơi chạy trên đƣờng 1 năm. - Cây trồng biến đổi gen góp phần giúp xóa đói giảm nghèo và tăng thu nhập cho ngƣời nông dân. Giá trị thu nhập từ cây trồng biến đổi gen tăng lên từ 91 triệu USD (năm 1996 - năm bắt đầu trồng cây trồng biến đổi gen) lên
9 đến 15,690 triệu USD năm 2014 (Hình 1.2). Tỷ lệ đóng góp của một số loài cây trồng chính vào tổng giá trị cây trồng biến đổi gen trong năm 2014 gồm 8,6 tỷ USD từ ngô biến đổi gen, 5,2 tỷ USD từ đậu tƣơng biến đổi gen, 1,2 tỷ USD từ ngô biến đổi gen, 0,4 tỷ USD từ cây Canola biến đổi gen, 2 tỷ USD từ cây củ cải đƣờng biến đổi gen và phần còn lại từ các loài cây trồng biến đổi gen khác. Đến 2018, giá trị từ cây biến đổi gen trên thế giới đạt 18,15 tỷ USD. Tổng giá trị cây trồng biến đổi gen đạt tới 27,9 tỷ USD vào năm 2020 và đƣợc dự đoán có thể đạt tới 45 tỷ USD vào năm 2027 [4]. Hình 1.2. Tổng giá trị (USD) thu đƣợc từ cây trồng biến đổi gen toàn cầu 1.1.1.3. Tình hình cây trồng biến đổi gen ở nước ta Ở nƣớc ta, việc đầu tƣ và khuyến khích các nghiên cứu tạo giống cây trồng biến đổi gen chính thức đƣợc thực hiện từ năm 2006, sau khi chƣơng trình trọng điểm phát triển và ứng dụng Công nghệ Sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đến năm 2020 đƣợc chính phủ phê duyệt (theo Quyết định số 11/2006/QĐ-TTg của Thủ tƣớng Chính phủ). Các đề tài nghiên cứu về chuyển gen thực vật chủ yếu đƣợc tiến hành ở các cơ sở nghiên cứu khoa học lớn có đội ngũ cán bộ có trình độ chuyên môn cao và có trang thiết bị hiện đại. Việt Nam đã phê chuẩn cây trồng công nghệ sinh học và thƣơng mại hóa vào tháng 9 năm 2014 cho 4 loại ngô lai là MON 89034 (kháng sâu),
10 NK603 (chống chịu chất diệt cỏ), Bt11 và MIR162 (kháng côn trùng). Năm 2017, có trên 45.000 ha trồng ngô biến đổi gen ở các tỉnh thành khắp cả nƣớc, tăng 13 lần so với năm 2015. Ƣớc tính có khoảng 37.500 hộ nông dân tham gia trồng loại cây này. Đến thời điểm hiện tại, Việt Nam có 22 giống cây trồng biến đổi gen đƣợc thƣơng mại hóa gồm 14 giống ngô và 8 giống đậu nành [4]. Đối với cây nông nghiệp, trong giai đoạn 2006 - 2011 các nhà khoa học của Việt Nam đã tạo đƣợc một số dòng bông, ngô, đậu tƣơng biến đổi gen mang gen kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ, một số dòng cà chua chuyển gen kháng bệnh vi rút xoắn vàng lá, thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá và xoắn đọt. Các dòng cây chuyển gen nay đang đƣợc đánh giá trong phạm vi nhà lƣới về khả năng biểu hiện của gen chuyển và hình thành các dòng cây biến đổi gen tiến tới khảo nghiệm và ứng dụng vào sản xuất. Tuy nhiên, để đƣa các giống cây trồng biến đổi gen này vào sản xuất diện rộng đang gặp rất nhiều khó khăn [5], [6], [7], [8], [9]. Đối với cây lâm nghiệp, việc nghiên cứu và phát triển giống biến đổi gen có nhiều thuận lợi hơn so với cây nông nghiệp do các sản phẩm từ cây lâm nghiệp nghiệp biến đổi gen không sử dụng trực tiếp làm thức ăn cho ngƣời và động vật nên ít bị cản trở hay kiểm soát bởi các quy định về quản lý an toàn sinh vật biến đổi gen. Vì vậy, nhiều nƣớc trên thế giới đã khuyến khích các nhà khoa học nghiên cứu tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen. Đến nay, Bộ Nông nghiệp & PTNT đã phê duyệt 04 nhiệm vụ nghiên cứu khoa học cấp nhà nƣớc về tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen, trên 3 đối tƣợng cây lâm nghiệp là: Xoan ta, thông và bạch đàn. Trong đó, Viện CNSH Lâm nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp đã triển khai 02 nhiệm vụ cấp nhà nƣớc về tạo giống cây Xoan ta và Bạch đàn urô biến đổi gen. Đề tài “Nghiên cứu tạo giống Xoan ta biến đổi gen” với mục tiêu tạo giống cây trồng mới có năng suất cao, chất lƣợng tốt. Kết quả đã xây dựng thành công quy trình biến nạp gen vào đối tƣợng Xoan ta đạt hiệu quả cao, tạo đƣợc 5 dòng Xoan ta chuyển gen sinh trƣởng nhanh và 3 dòng Xoan ta chuyển gen tăng chất lƣợng gỗ. Đề tài “Nghiên cứu tạo giống Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) sinh
11 trƣởng nhanh bằng công nghệ chuyển gen” triển khai trong 5 năm (2012 - 2016). Nhóm nghiên cứu đã xây dựng đƣợc hệ thống tái sinh bạch đàn urô thông qua phôi soma với hiệu suất cao phục vụ biến nạp gen và tạo ra một số dòng bạch đàn chuyển gen trong phạm vi phòng thí nghiệm. Sự thành công của đề tài cho thấy các nhà khoa học của Việt Nam hoàn toàn có khả năng tiếp cận và làm chủ loại công nghệ mới này. Kết quả của các đề tài cũng đã khẳng định một hƣớng nghiên cứu mới trong lĩnh vực chọn tạo giống cây trồng lâm nghiệp mới và công nghệ này có thể áp dụng đƣợc ở Việt Nam. Trong tƣơng lai, các nhà khoa học hy vọng hƣớng nghiên cứu tạo giống cây trồng đặc biệt là đối tƣợng cây lâm nghiệp bằng công nghệ chuyển gen sẽ tiếp tục đƣợc quan tâm phát triển. Tuy nhiên, nghiên cứu tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen cần có nhiều thời gian. Trƣớc tiên, cần xác định những loài cây chủ lực để tập trung nghiên cứu phát triển, sau đó xây dựng chƣơng trình nghiên cứu tổng thể dài hạn cho từng loài cây cụ thể với mức đầu tƣ kinh phí và thời gian nghiên cứu phù hợp (10 - 15 năm), giao nhiệm vụ cho cơ sở nghiên cứu và nhóm nhà khoa học đủ mạnh tập trung nghiên cứu để tạo ra đƣợc sản phẩm cuối (giống mới) đáp ứng mục tiêu của con ngƣời. 1.1.2. Các phƣơng pháp chuyển gen Hiện nay có nhiều phƣơng pháp đƣợc sử dụng để chuyển gen ở thực vật. Căn cứ vào cách thức đƣa gen vào tế bào thực vật mà ngƣời ta chia thành hai phƣơng pháp là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp. 1.1.2.1. Chuyển gen trực tiếp Chuyển gen trực tiếp là việc sử dụng các biện pháp cơ học, vật lý hoặc hóa học để chuyển trực tiếp các gen vào tế bào thực vật. Một số phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp bao gồm: - Phương pháp bắn gen: Là phƣơng pháp sử dụng các hạt kim loại nặng (vàng, vonfram) có kích thƣớc cực nhỏ, đƣợc bọc bên ngoài bằng ADN rồi bắn trực tiếp vào tế bào thực vật. Bằng phƣơng pháp này có thể biến nạp tất cả các loại tế bào. Tuy
12 nhiên, cho đến nay tần số biến nạp bằng phƣơng pháp bắn gen còn thấp và thƣờng xuyên nhận đƣợc cây biến nạp khảm [10]. - Phương pháp xung điện: Là phƣơng pháp dùng hiện tƣợng phóng điện để tạo lỗ trên màng tế bào, làm cho việc đƣa ADN vào tế bào dễ hơn, nhất là khi ADN đã tiếp giáp với màng tế bào. Phƣơng pháp này có thể dễ dàng thực hiện trên đối tƣợng cây một lá mầm [11]. - Phương pháp vi tiêm: Là phƣơng pháp sử dụng vi kim và kính hiển vi đƣa ADN vào những tế bào nhất định. Phƣơng pháp này đã tạo ra những dòng biến nạp từ proplast và cây biến nạp khảm từ các tế bào tiền phôi có nguồn gốc từ hạt phấn [10]. Hạn chế của phƣơng pháp này là cần dùng các thiết bị có độ chính xác cao và kỹ năng phức tạp từ ngƣời sử dụng [12]. - Phương pháp chuyển gen qua ống phấn: Đây là phƣơng pháp chuyển gen thông qua nuôi cấy in vitro, dựa trên nguyên tắc là ADN ngoại lai chuyển vào cây theo đƣờng ống phấn rồi chui vào bầu nhụy cái. - Phương pháp siêu âm: Dùng chuyển gen vào tế bào trần protoplast. - Phương pháp hóa học: Chuyển gen vào tế bào protoplast nhờ các chất hóa học nhƣ polyethylen-glycol. 1.1.2.2. Chuyển gen gián tiếp - Phương pháp chuyển gen nhờ virus: Virus là đối tƣợng đƣợc sử dụng chuyển gen vào thực vật vì có một số ƣu điểm: virus có khả năng xâm nhiễm và chuyển genome của mình sang tế bào thực vật. Nhƣng sự lây nhiễm virus thƣờng làm yếu tế bào thực vật, vì vậy đây là phƣơng pháp ít đƣợc sử dụng đến.