Nghiên cứu tính đa dạng của allele HLA-DQA1 bằng kỹ thuật polymerase chain reaction sequence specific primers (PCR-SSP) ở dân tộc Kinh miền Trung Việt Nam

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 18, 2003<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG CỦA ALLELE HLA­DQA1 <br /> <br /> BẰNG KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION SEQUENCE <br /> <br /> SPECIFIC PRIMERS (PCR­SSP) Ở DÂN TỘC KINH <br /> <br /> MIỀN TRUNG VIỆT NAM<br /> <br /> Trần Đình Bình<br />  Trường Đại học Y khoa, Đại học Huế<br /> Wang Linlin, Lin Weixiong<br />   Trường Đại học Y khoa Quảng Tây, Trung Quốc<br /> <br /> Hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen) nằm trên  <br /> nhiễm sắc thể thứ 6, đây là một hệ kháng nguyên rất phức tạp và đa dạng. Hệ HLA <br /> không những là tiêu chí di truyền của mỗi người, mà đồng thời còn liên hệ chặt chẽ <br /> tới chức năng điều hòa miễn dịch và các bệnh tật khác [1­3]. Những người không <br /> cùng một loại hình phân bố các allele của HLA thì tính nhạy cảm hay sức đề  kháng  <br /> với một số bệnh không giống nhau [1­3]. Nhiều tác giả nước ngoài đã nghiên cứu sự <br /> khác biệt về  phân bố  allele HLA­DQA1 trong quần thể  người đã phát hiện một số <br /> người mang những allele này sẽ  có khả  năng nhạy cảm hay đề  kháng với một số <br /> bệnh tật nhất định. Trong thực tế, mỗi dân tộc có mỗi bối cảnh di truyền, yếu tố di <br /> truyền khác nhau, cùng một dân tộc nhưng khác nhau về vị trí địa lý... thì sụ phân bố <br /> các alleles của hệ HLA cũng khác nhau[4 ­11]. Ở Trung Quốc đã có nhiều nghiên cứu <br /> về  hệ  HLA, nhất là sự  phân bố  của allele HLA­DQA1 trên nhiều dân tộc như  Hán, <br /> Choang, Bố Y, Duy Ngô Nhĩ, Mãn..., Thái Lan cũng đã có báo cáo về vấn đề này [11],  <br /> nhưng cho đến nay chưa có báo cáo nào về  phân bố  allele HLA­DQA1  ở Việt Nam.  <br /> Chúng   tôi   áp   dụng   kỹ   thuật   khuếch   đại   chuỗi   gen   Polymerase   Chain   Reaction <br /> Sequence Specific Primers (PCR­SSP) [12] để nghiên cứu tính đa dạng của sự phân bố <br /> 81<br /> allele HLA­DQA1 ở dân tộc Kinh, miền Trung Việt Nam để góp phần nghiên cứu sự <br /> khác biệt về di truyền giữa các dân tộc khác nhau.<br /> <br /> I. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> 1. Đối tượng nghiên cứu: là 214 thanh thiếu niên khỏe mạnh, tuổi từ  7­36, dân <br /> tộc Kinh, cư trú tại các tỉnh Thừa Thiên Huế, Quảng Trị và Quảng Bình, tỉ lệ nam nữ <br /> 1:1. Tuổi bình quân là 14 tuổi.<br /> 2. Tách DNA: Trên mỗi đối tượng lấy 2ml máu tĩnh mạch, thêm 0,5ml Natri <br /> citrate 3,8% chống đông và dùng phương pháp chiết tách DNA kinh điển có cải tiến  <br /> là Phenol/ Chloroform. Các bước như sau [13]:<br /> Với 2ml máu chống đông, thêm 5ml dung dịch Gelatine 3%, trộn đều,  ủ   ở <br /> 37 C/ 10 phút, tách lấy phần dịch phía trên, ly tâm 3500 rpm/5 phút, bỏ phần dịch phía <br /> o<br /> <br /> trên, thêm 2 ml dung dịch TES 2mM, trộn đều, thêm 0,5 ml dung dịch 10% SDS, trộn <br /> đều, thêm 2ml dung dịch Phenol bão hòa trong TES. Trộn đều, ly tâm 3500rpm?5 <br /> phút, tách lấy phần dịch ở trên, (có thể tiến hành bước này thêm một lần nữa), thêm <br /> 2ml   dung   dịch   Chloroform/Isoamylic   (v/v:24/1),   trộn   đều,   ly   tâm   3500rpm/5   phút. <br /> Tách lấy phần nước trong  ở  trên, thêm 5ml dung dịch cồn Ethylic 95%, nhẹ  nhàng  <br /> quay  ống nghiệm để  các sợi DNA xoắn lại, dùng  ống hút nhỏ  nhẹ  nhàng hút lấy  <br /> DNA và bảo quản  ở  một  ống khác trong dung dịch cồn 75%. Khi sử  dụng có thể <br /> dùng dung dịch TE hoặc nước cất để hòa tan DNA.<br /> 3. Kỹ thuật PCR để phân tích allele HLA­DQA1.<br /> 3.1. Specific Primers: Căn cứ  vào bảng các nucleotides của các alleles của hệ <br /> HLA II năm 2002[14] và dựa vào các Primers đặc hiệu của O.Olerup [12], chúng tôi <br /> lấy các Primers đặc hiệu từ Trung tâm nghiên cứu Vi sinh vật học và Công nghệ Sinh <br /> học của Viện Khoa học Trung Quốc (tham khảo bảng 1), bao gồm 9 chuỗi 5’ và 7  <br /> chuỗi 3’ hợp thành 12 đôi Primers đặc hiệu để  khuếch đại và phân tích exon thứ  2 <br /> của HLA­DQA1 allele.<br /> 3.2. Primers đối chiếu: Mỗi lần tiến hành PCR đều dùng một đôi Primers đối <br /> chiếu là Ctrl 1 (5’ TAT CAT GCC TCT TTG CAC CAT TC  3’, 23 mer, Tm 660C) ? Ctrl <br /> 2 (5’ AAT GCA CTG AAC TCC CAC ATT CC  3’, 23 mer, Tm 700C) để kiểm soát và <br /> đối chiếu phản ứng khuếch đại PCR.<br />    3.3. Kỹ thuật PCR­SSP: Dựa vào phương pháp của O.Olerup để  tiến hành, cụ <br /> thể  là: Mỗi  ống tiến hành PCR chứa 10µl gồm có : 75ng tiêu bản DNA , dung dịch <br /> đệm 5 x PCR (50mmol KCl;1.5mmol MgCl2;10mmol Tris­HCl (pH 8.3); 0.001%(w/v)  <br /> Gelatin)1% BSA;200àl dNTPs chính là các dATP, dGTP, dCTP và dTTP; 0.25àM các <br /> đôi Primers đặc hiệu, 0.05àM đôi Primers đối chiếu và 0.50 IU Taq DNA polymerase. <br /> Tiến hành 30 tuần hoàn, mỗi tuần hoàn như  sau: Biến tính 94 oC/30 giây      Giảm  <br /> nhiệt 62oC/30giây                                             N ối dài 72oC/90 giây. Sản phẩm thu <br /> được sau PCR được tiến hành điện di ở trong thạch Agarose 1,5% với điện áp 100 V  <br /> 82<br /> trong 15 phút. Xem và phân tích kết quả   ở  đèn cực tím hoặc  ở  máy vi tính để  chụp <br /> ảnh và bảo lưu kết quả.<br /> 4. Xử  lý số  liệu thống kê: Dùng cách tính tần suất % theo Hardy­Weinberg [15]  <br /> để thống kê và xử lý các kết quả đạt được.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 83<br />  Bảng 1:  Vị  trí, kích thước và tên gọi của các Primers đặc hiệu để  khuếch đại allele  <br /> DQA1<br /> <br /> TT Tên   gọi   các  Đôi Primers  Sản phẩm  Các allele thu hoạch<br /> allele đặc hiệu PCR sau PCR<br /> 1 DQA1*0101/4 A*5’01+A*3’01 149 bp DQA1*0101, DQA1*0104<br /> 2 DQA1*0101/2/4 A*5’02+A*3’01 172 bp DQA1*0101, DQA1*0102 ?<br /> DQA1*0104<br /> 3 DQA1*0102/3 A*5’03+A*3’01 149 bp DQA1*0102, DQA1*0103<br /> 4 DQA1*0103 A*5’04+A*3’01 172 bp DQA1*0103<br /> 5 DQA1*0201 A*5’04+A*3’02 170 bp DQA1*0201<br /> 6 DQA1*0301 A*5’05+A*3’03 183 bp DQA1*0301<br /> 7 DQA1*0302 A*5’06+A*3’03 183 bp DQA1*0302<br /> 8 DQA1*0401 A*5’07+A*3’04 190 bp DQA1*0401<br /> 9 DQA1*0501 A*5’02+A*3’05 186 bp DQA1*0501<br /> 10 DQA1*0601 A*5’04+A*3’06 117 bp DQA1*0601<br /> 11 DQA1* “A” A*5’08+A*3’07 196 bp all   DQA1   alleles   except <br /> DQA1*0104<br /> 12 DQA1*0104 A*5’09+A*3’07 170 bp DQA1*0104<br /> II. KẾT QUẢ<br /> <br /> Kết quả  phân tích HLA­DQA1 từ  214 mẫu máu (xem bảng 2). Đã kiểm tra <br /> được 10 loại allele DQA1, tần suất tìm thấy cao nhất là allele DQA1*0104 (25,8%),  <br /> tiếp đó là các allele DQA1*0101 và DQA1*0102 với tần suất tìm thấy lần lượt là  <br /> 19,4% và 15,7%, các allele DQA1 còn lại đều được tìm thấy dưới 10%. Nhiều alleles  <br /> là đồng hợp tử nên tổng số các alleles tìm được là 328 trên số  người điều tra là 214  <br /> (lẽ  ra phải là 428 alleles). Để  kiểm tra alleles là đồng hợp tử  thì cần phải tiếp tục  <br /> kiểm tra chuỗi DNA. Đề  tài này chưa tiến hành xác định các alleles là đồng hợp tử <br /> bàng kỹ thuật đọc chuỗi. Hình  ảnh dưới đây là kết quả  điện di sản phẩm PCR sau  <br /> khuếch đại được phân tích và lưu ảnh ở máy tính Bio­Rad Gel Doc 2000.<br /> Bảng 2: Tần suất các allele HLA­DQA1 của người Kinh Việt Nam<br /> TT Tên gọi các allele Lượt tìm thấy Tần suất kháng  Tần suất allele<br /> (328) nguyên (%)  tìm được(%)<br /> 1 DQA1*0101/4 75 0.35 0.194<br /> 2 DQA1*0101/2/4 62 0.29 0.157<br /> 3 DQA1*0102/3 8 0.04 0.020<br /> 4 DQA1*0103 96 0.45 0.258<br /> 5 DQA1*0201 24 0.11 0.056<br /> 6 DQA1*0301 24 0.11 0.056<br /> 7 DQA1*0302 6 0.03 0.015<br /> 84<br />  8 DQA1*0401 22 0.10 0.051<br /> 9 DQA1*0501 7 0.03 0.015<br /> 10 DQA1*0601 4 0.02 0.010<br />                  <br />      1   2   3    4   5   6    7   8    9   10   11  12<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1: Hình ảnh kết quả allele dị hợp tử HLA­DQA1*0102/0103<br />  sau khi điện di trong Agarose sản phẩm của PCR­SSP.<br /> 1­12 là 12 cột điện di cho đôi Primers đặc hiệu khuếch đại HLA­DQA1.<br />      1   2   3   4    5   6  7  8   9  10  11  12<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2: Hình ảnh kết quả allele dị hợp tử HLA­DQA1*0101/0104<br /> sau khi điện di trong Agarose sản phẩm của PCR­SSP.<br /> 1­12 là 12 cột điện di cho đôi Primers đặc hiệu khuếch đại HLA­DQA1.<br /> Bảng 3: So sánh tần suất các allele HLA­DQA1 của người Kinh miền Trung Việt Nam<br /> với các dân tộc khác của Trung Quốc và người Thái Lan hiện đại<br /> Tên allele Người  Ngườ Ngườ Ngườ Người  Ngườ Ngườ Ngưồ Ngườ Ngườ Người  Ngườ<br /> Kinh  i Hán  i Hán  i Hán  Choang  i Tải i Bố  i Duy  iMãn i Di Choang  i Thái <br /> Việt  miền  miền  Vân  Quảng  n=146 Y Ngô  n=50 n=85 Ba mã Lan<br /> Nam Bắc Nam Nam Tây n=67 Nhĩ n=142 n=140<br /> n=214 n=34 n=27 n=54 n=140 n=18<br /> 2 0 4<br /> <br /> DQA1*0101 19.4 11.7 9.6 0 5.0 27.0 20.8 13.6 13.8 15.3 15.2 15.7<br /> 85<br /> DQA1*0102 15.7 14.3 23.0 15.9 17.8 32.0 33.1 12.0 14.9 15.3 27.8 15.7<br /> DQA1*0103 2.0 12.0 5.9 7.6 5.4 0 4.6 15.2 8.5 6.7 2.1 5.0<br /> DQA1*0104 25.8 0 0 17.8 22.1 0 0 0 0 0 19.5 0<br /> DQA1*0201 5.6 11.7 4.8 0 0.0 1.0 0.7 19.0 8.6 5.4 0 14.3<br /> DQA1*0301 5.6 27.8 28.5 22.8 35.0 22.0 14.5 14.7 25.5 23.3 12.8 26.0<br /> DQA1*0302 1.5 0 0 0 0.0 0 0 0 0 0 0 0<br /> DQA1*0401 5.1 0.9 0.7 0 1.1 0 0 3.3 1.1 0 2.8 0.0<br /> DQA1*0501 1.5 18.1 15.2 11.5 14.3 9.0 18.0 20.7 13.8 15.9 19.5 12.8<br /> DQA1*0601 1.0 3.5 12.2 24.9 0.0 8.0 6.2 1.6 12.8 18.1 0 16.4<br /> <br /> III. BÀN LUẬN<br /> Cho đến nay, hệ  kháng nguyên bạch cầu người (HLA) được coi là hệ  kháng <br /> nguyên di truyền phức tạp và đa dạng nhất. Chúng không chỉ  có sự  phân bố  khác <br /> nhau giữa các cá thể khác nhau, mà còn có sự khác biệt giữa các dân tộc do khác nhau  <br /> về  bối cảnh di truyền, yếu tố  di truyền và ngay cả  cùng một dân tộc nhưng khác  <br /> nhau về vị trí địa lý. Nghiên cứu tính đa dạng của hệ Kháng nguyên bạch cầu người  <br /> có vị  trí rất quan trọng vì nó là một tiêu chí di truyền học vô cùng chắc chắn,  ứng  <br /> dụng nhiều trong việc xác định con cái, bố  mẹ, trong khoa học hình sự  để  tìm tội <br /> pham, trong nghiên cứu nhân chủng học, dân tộc học để tìm hiểu nguồn gốc của một <br /> dân tộc...[1]. Ngoài ra, nhiều kết quả nghiên cứu gần đây còn khẳng định mối liên hệ <br /> mật thiết giữa HLA  và một số  bệnh tật như:  Đái tháo  đường không phụ  thuộc  <br /> Insulin, Viêm cứng cột sống, Viêm đa khớp dạng thấp, Viêm khớp thiếu niên... Vì <br /> thế nghiên cứu HLA còn có ý nghĩa quan trọng trong phân loại, chẩn đoán và hỗ  trợ <br /> chẩn đoán, tiên lượng bệnh, dự phòng và điều trị một số bệnh tật. Theo đà phát triển  <br /> mạnh mẽ của Sinh học phân tử, việc nghiên cứu hệ HLA ngày càng đơn giản, thuận  <br /> tiện và chính xác. Tại Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu về HLA vẫn còn khu trú tại các  <br /> Viện nghiên cứu, Phòng Khoa học hình sự... còn chưa được sử  dụng nhiều trong  <br /> bệnh viện và các phòng thí nghiệm y học. Đây có lẽ là nghiên cứu đầu tiên tại Việt  <br /> Nam về HLA, dẫu rằng có tài liệu đề cập đến hệ HLA của người Việt Nam nhưng  <br /> không ghi rõ nơi nghiên cứu [15]. <br /> Theo kết quả nghiên cứu trên đây, người dân tộc Kinh Miền Trung Việt Nam có  <br /> tần suất tìm thấy allele HLA­DQA1*0104 là cao nhất 25,8%, tiếp đó là các allele  <br /> DQA1*0101 và DQA1*0102 với tần suất tìm thấy lần lượt là 19,4% và 15,7%, các <br /> allele khác được tìm thấy với tần suất rất thấp. So sánh với các dân tộc khác ở Trung  <br /> Quốc thấy rằng tần suất tìm thấy các allele phân bố  khá giống với dân tộc Choang <br /> (đã tìm thấy allele HLA­DQA1*0104 với tần suất 22,1% và allele HLA­DQA1*0401  <br /> là 1,1% ). Dân tộc Kinh miền Trung Việt Nam có các allele HLA­DQA1*0301 và  <br /> <br /> <br /> <br /> 86<br /> HLA­DQA1*0501 được tìm thấy rất thấp, đều thấp hơn cả 10 dân tộc ở Trung Quốc  <br /> (xem bảng 3). Như vậy, tần suất allele HLA­DQA1*0401 cao, HLA­DQA1*0301 và <br /> HLA­DQA1*0501 thấp có lẽ là đặc trưng phân bố allele HLA­DQA1 của người Kinh <br /> miền   Trung  Việt  Nam.   So  sánh  với   nghiên   cứu  trên  người  Thái  Lan   thấy  HLA­<br /> DQA1*0101,   HLA­DQA1*0102   có   tần   suất   tương   tự   nhưng   tần   suất   HLA­<br /> DQA1*0501 (12,8%) cũng cao hơn nhiều so với người Kinh miền Trung Việt Nam  <br /> (p