intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Nghiên cứu tính đa dạng của allele HLA-DQA1 bằng kỹ thuật polymerase chain reaction sequence specific primers (PCR-SSP) ở dân tộc Kinh miền Trung Việt Nam

Chia sẻ: Kinh Kha | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:9

54
lượt xem
0
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen) nằm trên nhiễm sắc thể thứ 6, đây là một hệ kháng nguyên rất phức tạp và đa dạng. Hệ HLA không những là tiêu chí di truyền của mỗi người, mà đồng thời còn liên hệ chặt chẽ tới chức năng điều hòa miễn dịch và các bệnh tật khác. Mời các bạn cùng tham khảo nghiên cứu.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu tính đa dạng của allele HLA-DQA1 bằng kỹ thuật polymerase chain reaction sequence specific primers (PCR-SSP) ở dân tộc Kinh miền Trung Việt Nam

TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 18, 2003<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG CỦA ALLELE HLA­DQA1 <br /> <br /> BẰNG KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION SEQUENCE <br /> <br /> SPECIFIC PRIMERS (PCR­SSP) Ở DÂN TỘC KINH <br /> <br /> MIỀN TRUNG VIỆT NAM<br /> <br /> Trần Đình Bình<br />  Trường Đại học Y khoa, Đại học Huế<br /> Wang Linlin, Lin Weixiong<br />   Trường Đại học Y khoa Quảng Tây, Trung Quốc<br /> <br /> Hệ kháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen) nằm trên  <br /> nhiễm sắc thể thứ 6, đây là một hệ kháng nguyên rất phức tạp và đa dạng. Hệ HLA <br /> không những là tiêu chí di truyền của mỗi người, mà đồng thời còn liên hệ chặt chẽ <br /> tới chức năng điều hòa miễn dịch và các bệnh tật khác [1­3]. Những người không <br /> cùng một loại hình phân bố các allele của HLA thì tính nhạy cảm hay sức đề  kháng  <br /> với một số bệnh không giống nhau [1­3]. Nhiều tác giả nước ngoài đã nghiên cứu sự <br /> khác biệt về  phân bố  allele HLA­DQA1 trong quần thể  người đã phát hiện một số <br /> người mang những allele này sẽ  có khả  năng nhạy cảm hay đề  kháng với một số <br /> bệnh tật nhất định. Trong thực tế, mỗi dân tộc có mỗi bối cảnh di truyền, yếu tố di <br /> truyền khác nhau, cùng một dân tộc nhưng khác nhau về vị trí địa lý... thì sụ phân bố <br /> các alleles của hệ HLA cũng khác nhau[4 ­11]. Ở Trung Quốc đã có nhiều nghiên cứu <br /> về  hệ  HLA, nhất là sự  phân bố  của allele HLA­DQA1 trên nhiều dân tộc như  Hán, <br /> Choang, Bố Y, Duy Ngô Nhĩ, Mãn..., Thái Lan cũng đã có báo cáo về vấn đề này [11],  <br /> nhưng cho đến nay chưa có báo cáo nào về  phân bố  allele HLA­DQA1  ở Việt Nam.  <br /> Chúng   tôi   áp   dụng   kỹ   thuật   khuếch   đại   chuỗi   gen   Polymerase   Chain   Reaction <br /> Sequence Specific Primers (PCR­SSP) [12] để nghiên cứu tính đa dạng của sự phân bố <br /> 81<br /> allele HLA­DQA1 ở dân tộc Kinh, miền Trung Việt Nam để góp phần nghiên cứu sự <br /> khác biệt về di truyền giữa các dân tộc khác nhau.<br /> <br /> I. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> 1. Đối tượng nghiên cứu: là 214 thanh thiếu niên khỏe mạnh, tuổi từ  7­36, dân <br /> tộc Kinh, cư trú tại các tỉnh Thừa Thiên Huế, Quảng Trị và Quảng Bình, tỉ lệ nam nữ <br /> 1:1. Tuổi bình quân là 14 tuổi.<br /> 2. Tách DNA: Trên mỗi đối tượng lấy 2ml máu tĩnh mạch, thêm 0,5ml Natri <br /> citrate 3,8% chống đông và dùng phương pháp chiết tách DNA kinh điển có cải tiến  <br /> là Phenol/ Chloroform. Các bước như sau [13]:<br /> Với 2ml máu chống đông, thêm 5ml dung dịch Gelatine 3%, trộn đều,  ủ   ở <br /> 37 C/ 10 phút, tách lấy phần dịch phía trên, ly tâm 3500 rpm/5 phút, bỏ phần dịch phía <br /> o<br /> <br /> trên, thêm 2 ml dung dịch TES 2mM, trộn đều, thêm 0,5 ml dung dịch 10% SDS, trộn <br /> đều, thêm 2ml dung dịch Phenol bão hòa trong TES. Trộn đều, ly tâm 3500rpm?5 <br /> phút, tách lấy phần dịch ở trên, (có thể tiến hành bước này thêm một lần nữa), thêm <br /> 2ml   dung   dịch   Chloroform/Isoamylic   (v/v:24/1),   trộn   đều,   ly   tâm   3500rpm/5   phút. <br /> Tách lấy phần nước trong  ở  trên, thêm 5ml dung dịch cồn Ethylic 95%, nhẹ  nhàng  <br /> quay  ống nghiệm để  các sợi DNA xoắn lại, dùng  ống hút nhỏ  nhẹ  nhàng hút lấy  <br /> DNA và bảo quản  ở  một  ống khác trong dung dịch cồn 75%. Khi sử  dụng có thể <br /> dùng dung dịch TE hoặc nước cất để hòa tan DNA.<br /> 3. Kỹ thuật PCR để phân tích allele HLA­DQA1.<br /> 3.1. Specific Primers: Căn cứ  vào bảng các nucleotides của các alleles của hệ <br /> HLA II năm 2002[14] và dựa vào các Primers đặc hiệu của O.Olerup [12], chúng tôi <br /> lấy các Primers đặc hiệu từ Trung tâm nghiên cứu Vi sinh vật học và Công nghệ Sinh <br /> học của Viện Khoa học Trung Quốc (tham khảo bảng 1), bao gồm 9 chuỗi 5’ và 7  <br /> chuỗi 3’ hợp thành 12 đôi Primers đặc hiệu để  khuếch đại và phân tích exon thứ  2 <br /> của HLA­DQA1 allele.<br /> 3.2. Primers đối chiếu: Mỗi lần tiến hành PCR đều dùng một đôi Primers đối <br /> chiếu là Ctrl 1 (5’ TAT CAT GCC TCT TTG CAC CAT TC  3’, 23 mer, Tm 660C) ? Ctrl <br /> 2 (5’ AAT GCA CTG AAC TCC CAC ATT CC  3’, 23 mer, Tm 700C) để kiểm soát và <br /> đối chiếu phản ứng khuếch đại PCR.<br />    3.3. Kỹ thuật PCR­SSP: Dựa vào phương pháp của O.Olerup để  tiến hành, cụ <br /> thể  là: Mỗi  ống tiến hành PCR chứa 10µl gồm có : 75ng tiêu bản DNA , dung dịch <br /> đệm 5 x PCR (50mmol KCl;1.5mmol MgCl2;10mmol Tris­HCl (pH 8.3); 0.001%(w/v)  <br /> Gelatin)1% BSA;200àl dNTPs chính là các dATP, dGTP, dCTP và dTTP; 0.25àM các <br /> đôi Primers đặc hiệu, 0.05àM đôi Primers đối chiếu và 0.50 IU Taq DNA polymerase. <br /> Tiến hành 30 tuần hoàn, mỗi tuần hoàn như  sau: Biến tính 94 oC/30 giây      Giảm  <br /> nhiệt 62oC/30giây                                             N ối dài 72oC/90 giây. Sản phẩm thu <br /> được sau PCR được tiến hành điện di ở trong thạch Agarose 1,5% với điện áp 100 V  <br /> 82<br /> trong 15 phút. Xem và phân tích kết quả   ở  đèn cực tím hoặc  ở  máy vi tính để  chụp <br /> ảnh và bảo lưu kết quả.<br /> 4. Xử  lý số  liệu thống kê: Dùng cách tính tần suất % theo Hardy­Weinberg [15]  <br /> để thống kê và xử lý các kết quả đạt được.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 83<br /> Bảng 1:  Vị  trí, kích thước và tên gọi của các Primers đặc hiệu để  khuếch đại allele  <br /> DQA1<br /> <br /> TT Tên   gọi   các  Đôi Primers  Sản phẩm  Các allele thu hoạch<br /> allele đặc hiệu PCR sau PCR<br /> 1 DQA1*0101/4 A*5’01+A*3’01 149 bp DQA1*0101, DQA1*0104<br /> 2 DQA1*0101/2/4 A*5’02+A*3’01 172 bp DQA1*0101, DQA1*0102 ?<br /> DQA1*0104<br /> 3 DQA1*0102/3 A*5’03+A*3’01 149 bp DQA1*0102, DQA1*0103<br /> 4 DQA1*0103 A*5’04+A*3’01 172 bp DQA1*0103<br /> 5 DQA1*0201 A*5’04+A*3’02 170 bp DQA1*0201<br /> 6 DQA1*0301 A*5’05+A*3’03 183 bp DQA1*0301<br /> 7 DQA1*0302 A*5’06+A*3’03 183 bp DQA1*0302<br /> 8 DQA1*0401 A*5’07+A*3’04 190 bp DQA1*0401<br /> 9 DQA1*0501 A*5’02+A*3’05 186 bp DQA1*0501<br /> 10 DQA1*0601 A*5’04+A*3’06 117 bp DQA1*0601<br /> 11 DQA1* “A” A*5’08+A*3’07 196 bp all   DQA1   alleles   except <br /> DQA1*0104<br /> 12 DQA1*0104 A*5’09+A*3’07 170 bp DQA1*0104<br /> II. KẾT QUẢ<br /> <br /> Kết quả  phân tích HLA­DQA1 từ  214 mẫu máu (xem bảng 2). Đã kiểm tra <br /> được 10 loại allele DQA1, tần suất tìm thấy cao nhất là allele DQA1*0104 (25,8%),  <br /> tiếp đó là các allele DQA1*0101 và DQA1*0102 với tần suất tìm thấy lần lượt là  <br /> 19,4% và 15,7%, các allele DQA1 còn lại đều được tìm thấy dưới 10%. Nhiều alleles  <br /> là đồng hợp tử nên tổng số các alleles tìm được là 328 trên số  người điều tra là 214  <br /> (lẽ  ra phải là 428 alleles). Để  kiểm tra alleles là đồng hợp tử  thì cần phải tiếp tục  <br /> kiểm tra chuỗi DNA. Đề  tài này chưa tiến hành xác định các alleles là đồng hợp tử <br /> bàng kỹ thuật đọc chuỗi. Hình  ảnh dưới đây là kết quả  điện di sản phẩm PCR sau  <br /> khuếch đại được phân tích và lưu ảnh ở máy tính Bio­Rad Gel Doc 2000.<br /> Bảng 2: Tần suất các allele HLA­DQA1 của người Kinh Việt Nam<br /> TT Tên gọi các allele Lượt tìm thấy Tần suất kháng  Tần suất allele<br /> (328) nguyên (%)  tìm được(%)<br /> 1 DQA1*0101/4 75 0.35 0.194<br /> 2 DQA1*0101/2/4 62 0.29 0.157<br /> 3 DQA1*0102/3 8 0.04 0.020<br /> 4 DQA1*0103 96 0.45 0.258<br /> 5 DQA1*0201 24 0.11 0.056<br /> 6 DQA1*0301 24 0.11 0.056<br /> 7 DQA1*0302 6 0.03 0.015<br /> 84<br /> 8 DQA1*0401 22 0.10 0.051<br /> 9 DQA1*0501 7 0.03 0.015<br /> 10 DQA1*0601 4 0.02 0.010<br />                  <br />      1   2   3    4   5   6    7   8    9   10   11  12<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1: Hình ảnh kết quả allele dị hợp tử HLA­DQA1*0102/0103<br />  sau khi điện di trong Agarose sản phẩm của PCR­SSP.<br /> 1­12 là 12 cột điện di cho đôi Primers đặc hiệu khuếch đại HLA­DQA1.<br />      1   2   3   4    5   6  7  8   9  10  11  12<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2: Hình ảnh kết quả allele dị hợp tử HLA­DQA1*0101/0104<br /> sau khi điện di trong Agarose sản phẩm của PCR­SSP.<br /> 1­12 là 12 cột điện di cho đôi Primers đặc hiệu khuếch đại HLA­DQA1.<br /> Bảng 3: So sánh tần suất các allele HLA­DQA1 của người Kinh miền Trung Việt Nam<br /> với các dân tộc khác của Trung Quốc và người Thái Lan hiện đại<br /> Tên allele Người  Ngườ Ngườ Ngườ Người  Ngườ Ngườ Ngưồ Ngườ Ngườ Người  Ngườ<br /> Kinh  i Hán  i Hán  i Hán  Choang  i Tải i Bố  i Duy  iMãn i Di Choang  i Thái <br /> Việt  miền  miền  Vân  Quảng  n=146 Y Ngô  n=50 n=85 Ba mã Lan<br /> Nam Bắc Nam Nam Tây n=67 Nhĩ n=142 n=140<br /> n=214 n=34 n=27 n=54 n=140 n=18<br /> 2 0 4<br /> <br /> DQA1*0101 19.4 11.7 9.6 0 5.0 27.0 20.8 13.6 13.8 15.3 15.2 15.7<br /> 85<br /> DQA1*0102 15.7 14.3 23.0 15.9 17.8 32.0 33.1 12.0 14.9 15.3 27.8 15.7<br /> DQA1*0103 2.0 12.0 5.9 7.6 5.4 0 4.6 15.2 8.5 6.7 2.1 5.0<br /> DQA1*0104 25.8 0 0 17.8 22.1 0 0 0 0 0 19.5 0<br /> DQA1*0201 5.6 11.7 4.8 0 0.0 1.0 0.7 19.0 8.6 5.4 0 14.3<br /> DQA1*0301 5.6 27.8 28.5 22.8 35.0 22.0 14.5 14.7 25.5 23.3 12.8 26.0<br /> DQA1*0302 1.5 0 0 0 0.0 0 0 0 0 0 0 0<br /> DQA1*0401 5.1 0.9 0.7 0 1.1 0 0 3.3 1.1 0 2.8 0.0<br /> DQA1*0501 1.5 18.1 15.2 11.5 14.3 9.0 18.0 20.7 13.8 15.9 19.5 12.8<br /> DQA1*0601 1.0 3.5 12.2 24.9 0.0 8.0 6.2 1.6 12.8 18.1 0 16.4<br /> <br /> III. BÀN LUẬN<br /> Cho đến nay, hệ  kháng nguyên bạch cầu người (HLA) được coi là hệ  kháng <br /> nguyên di truyền phức tạp và đa dạng nhất. Chúng không chỉ  có sự  phân bố  khác <br /> nhau giữa các cá thể khác nhau, mà còn có sự khác biệt giữa các dân tộc do khác nhau  <br /> về  bối cảnh di truyền, yếu tố  di truyền và ngay cả  cùng một dân tộc nhưng khác  <br /> nhau về vị trí địa lý. Nghiên cứu tính đa dạng của hệ Kháng nguyên bạch cầu người  <br /> có vị  trí rất quan trọng vì nó là một tiêu chí di truyền học vô cùng chắc chắn,  ứng  <br /> dụng nhiều trong việc xác định con cái, bố  mẹ, trong khoa học hình sự  để  tìm tội <br /> pham, trong nghiên cứu nhân chủng học, dân tộc học để tìm hiểu nguồn gốc của một <br /> dân tộc...[1]. Ngoài ra, nhiều kết quả nghiên cứu gần đây còn khẳng định mối liên hệ <br /> mật thiết giữa HLA  và một số  bệnh tật như:  Đái tháo  đường không phụ  thuộc  <br /> Insulin, Viêm cứng cột sống, Viêm đa khớp dạng thấp, Viêm khớp thiếu niên... Vì <br /> thế nghiên cứu HLA còn có ý nghĩa quan trọng trong phân loại, chẩn đoán và hỗ  trợ <br /> chẩn đoán, tiên lượng bệnh, dự phòng và điều trị một số bệnh tật. Theo đà phát triển  <br /> mạnh mẽ của Sinh học phân tử, việc nghiên cứu hệ HLA ngày càng đơn giản, thuận  <br /> tiện và chính xác. Tại Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu về HLA vẫn còn khu trú tại các  <br /> Viện nghiên cứu, Phòng Khoa học hình sự... còn chưa được sử  dụng nhiều trong  <br /> bệnh viện và các phòng thí nghiệm y học. Đây có lẽ là nghiên cứu đầu tiên tại Việt  <br /> Nam về HLA, dẫu rằng có tài liệu đề cập đến hệ HLA của người Việt Nam nhưng  <br /> không ghi rõ nơi nghiên cứu [15]. <br /> Theo kết quả nghiên cứu trên đây, người dân tộc Kinh Miền Trung Việt Nam có  <br /> tần suất tìm thấy allele HLA­DQA1*0104 là cao nhất 25,8%, tiếp đó là các allele  <br /> DQA1*0101 và DQA1*0102 với tần suất tìm thấy lần lượt là 19,4% và 15,7%, các <br /> allele khác được tìm thấy với tần suất rất thấp. So sánh với các dân tộc khác ở Trung  <br /> Quốc thấy rằng tần suất tìm thấy các allele phân bố  khá giống với dân tộc Choang <br /> (đã tìm thấy allele HLA­DQA1*0104 với tần suất 22,1% và allele HLA­DQA1*0401  <br /> là 1,1% ). Dân tộc Kinh miền Trung Việt Nam có các allele HLA­DQA1*0301 và  <br /> <br /> <br /> <br /> 86<br /> HLA­DQA1*0501 được tìm thấy rất thấp, đều thấp hơn cả 10 dân tộc ở Trung Quốc  <br /> (xem bảng 3). Như vậy, tần suất allele HLA­DQA1*0401 cao, HLA­DQA1*0301 và <br /> HLA­DQA1*0501 thấp có lẽ là đặc trưng phân bố allele HLA­DQA1 của người Kinh <br /> miền   Trung  Việt  Nam.   So  sánh  với   nghiên   cứu  trên  người  Thái  Lan   thấy  HLA­<br /> DQA1*0101,   HLA­DQA1*0102   có   tần   suất   tương   tự   nhưng   tần   suất   HLA­<br /> DQA1*0501 (12,8%) cũng cao hơn nhiều so với người Kinh miền Trung Việt Nam  <br /> (p
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2