Phát hiện đột biến gen EGFR trên bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ có đáp ứng với erlotinib

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN EGFR TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI<br /> KHÔNG TẾ BÀO NHỎ CÓ ĐÁP ỨNG VỚI ERLOTINIB<br /> Hoàng Anh Vũ*, Nguyễn Thiện Nhân**, Phan Thị Xinh***, Nguyễn Sơn Lam**, Trần Đình Thanh**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Giới thiệu: Đột biến gen EGFR gây nên ung thư phổi không tế bào nhỏ (UTPKTBN). Mặc dù erlotinib đã<br /> được chỉ định cho điều trị ung thư này tại Việt Nam, cơ sở phân tử cho chỉ định điều trị vẫn chưa được khảo sát.<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Bệnh nhân UTPKTBN có đáp ứng với erlotinib của Khoa C4<br /> Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch được khảo sát đột biến gen EGFR tại 4 exon (18 – 21). Sau khi khuếch đại<br /> thành công bằng PCR từ bệnh phẩm là mô vùi nến, đột biến của EGFR được xác định bằng kỹ thuật giải<br /> trình tự chuỗi DNA.<br /> Kết quả: 2 đột biến của exon 19 và 1 đột biến của exon 21 được phát hiện ở 3 bệnh nhân. Các đột biến này<br /> đã được báo cáo nhạy với erlotinib.<br /> Kết luận: Chẩn đoán đột biến EGFR bằng giải trình tự chuỗi DNA có thể giúp ích cho lựa chọn bệnh nhân<br /> UTPKTBN trong chỉ định điều trị thuốc nhắm trúng đích phân tử.<br /> Từ khóa: Đột biến gen EGFR, ung thư phổi không tế bào nhỏ, erlotinib<br /> <br /> ABSTRACT<br /> EGFR GENE MUTATION IN NON-SMALL CELL LUNG CANCERS RESPONSED WITH ERLOTINIB<br /> Hoang Anh Vu, Nguyen Thien Nhan, Phan Thi Xinh, Nguyen Son Lam, Tran Dinh Thanh<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 2 - 2011: 150 - 154<br /> Background: EGFR mutations lead to non-small cell lung cancer (NSCLC). Although erlotinib response<br /> was observed in Vietnamese patients, the molecular mechanism underlying sensitivity to erlotinib was not<br /> investigated.<br /> Material and method: Tumors from patients with NSCLC who had a response to erlotinib were searched<br /> for mutation in EGFR exons 18 – 21. PCR was used to amplify 4 exons from DNA of paraffin-embedded tissue<br /> samples, followed by direct DNA sequencing.<br /> Results: Two mutations in exon 19 and 1 mutation in exon 21 were detected in 3 patients. These mutations<br /> were known to be sensitive to erlotinib.<br /> Conclusion: Detection of EGFR mutation is now available for selecting NSCLC patients benefit from<br /> molecularly targeted therapy.<br /> Key words: EGFR mutations, non-small cell lung cancer, erlotinib.<br /> đoạn trễ, can thiệp phẫu thuật không còn khả<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> thi hoặc hiệu quả rất hạn chế do tế bào ung thư<br /> Ung thư phổi nguyên phát gây tử vong<br /> đã xâm lấn hay di căn xa. Về mặt chẩn đoán,<br /> hàng đầu trong số những loại ung thư thường<br /> ung thư phổi nguyên phát được chia thành<br /> gặp(1). Tiên lượng rất xấu của ung thư phổi là do<br /> nhóm ung thư phổi không tế bào nhỏ<br /> chẩn đoán thường chỉ thực hiện được trong giai<br /> **Khoa C4, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch<br /> Bộ môn Mô – Phôi, Đại học Y Dược TP.HCM<br /> Bộ môn Huyết học, Đại học Y Dược TP.HCM<br /> Tác giả liên lạc: TS. Hoàng Anh Vũ ĐT: 01222993537<br /> Email: hoangvuxinh@yahoo.com<br /> *<br /> <br /> ***<br /> <br /> 150<br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> (UTPKTBN) và ung thư phổi tế bào nhỏ.<br /> UTPKTBN chiếm khoảng 80%, do đột biến của<br /> gen EGFR gây ra(5). Erlotinib (biệt dược Tarceva<br /> của Roche) được chấp nhận là chỉ định thay thế<br /> (second-line therapy) cho UTPKTBN ở giai đoạn<br /> tiến xa đã thất bại với hóa trị liệu chuẩn. Trong<br /> trường hợp này thuốc giúp kéo dài thời gian<br /> sống thêm trung bình từ 4,7 tháng lên 6,7<br /> tháng(11). Hiện nay erlotinib đã được dùng trong<br /> điều trị ung thư phổi trên 80 quốc gia. Các kết<br /> quả nghiên cứu nhằm tìm ra những dấu ấn sinh<br /> học cho đáp ứng với thuốc ức chế đặc hiệu<br /> EGFR cho thấy tình trạng đột biến gen EGFR<br /> chính là yếu tố tiên đoán chính xác nhất, trong<br /> khi đó hóa mô miễn dịch để đánh giá biểu hiện<br /> protein lại không cho thông tin có ý nghĩa nào<br /> cho tiên đoán đáp ứng điều trị(6,8,16).<br /> Tại Việt Nam, đã có những báo cáo về đáp<br /> ứng lâm sàng của bệnh nhân UTPKTBN được<br /> điều trị bằng erlotinib(7,17). Chúng tôi thực hiện<br /> nghiên cứu này nhằm làm rõ hơn cơ chế phân<br /> tử của những đáp ứng điều trị quan sát được<br /> trên bệnh nhân Việt Nam.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> 4 bệnh nhân UTPKTBN thuộc khoa C4 –<br /> Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, có đáp ứng với<br /> erlotinib, được chọn để xác định tình trạng đột<br /> biến của gen EGFR. Tiêu chuẩn đáp ứng với<br /> erlotinib bao gồm: cải thiện các triệu chứng về<br /> hô hấp trên lâm sàng và kích thước u, nốt di căn<br /> phổi, tình trạng tái lập dịch màng phổi dựa trên<br /> X quang phổi thẳng, CT scan ngực. Các bệnh<br /> nhân này được điều trị trong khoảng thời gian<br /> từ tháng 10/2008 tới tháng 10/2010.<br /> <br /> Tách chiết genomic DNA<br /> Bệnh phẩm là mô vùi nến đã dùng để chẩn<br /> đoán giải phẫu bệnh. Trong 4 mẫu nghiên cứu, 3<br /> từ bệnh phẩm phẫu thuật, 1 từ sinh thiết.<br /> Trường hợp là bệnh phẩm phẫu thuật, vùng mô<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> ung thư được đánh dấu trên lam giải phẫu bệnh<br /> để thu vào tube ly tâm 1,5 mL nhằm tăng khả<br /> năng chẩn đoán được đột biến. Bệnh phẩm sinh<br /> thiết quá nhỏ không thể đánh dấu phân biệt<br /> vùng ung thư và mô lành nên được thu toàn bộ<br /> vào tube ly tâm. Xylene (Merk, Đức) được thêm<br /> vào tube ly tâm 2 lần để khử nến, sau đó được<br /> rửa lại bằng ethanol tuyệt đối và để khô trước<br /> khi ủ với proteinase K (Invitrogen, Mỹ) ở 480C<br /> trong 16 giờ. Tinh sạch sản phẩm DNA sau khi<br /> ủ proteinase K được thực hiện bằng phenol –<br /> chloroform (Invitrogen, Mỹ). Cuối cùng, kết tủa<br /> DNA bằng ethanol tuyệt đối trong muối<br /> NH4OAC và định nồng độ DNA bằng<br /> spectrophotometer.<br /> <br /> Khuếch đại các exon bằng PCR<br /> Các đoạn mồi (Bảng 1) được thiết kế bằng<br /> phần mềm Oligo 4.1 dựa trên trình tự chuẩn<br /> của EGFR mang accession number NG_007726<br /> trong GenBank. Trong mỗi tube PCR có tổng<br /> thể tích 50 µL, các thành phần gồm có PCR<br /> buffer, dNTP (250 µM cho mỗi loại), 2 loại<br /> mồi xuôi và ngược (0,5 µM cho mỗi loại), 1,25<br /> unit TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase<br /> (Takara, Nhật Bản) và 20 ng genomic DNA.<br /> Chu kỳ luân nhiệt được thực hiện trên máy<br /> GeneAmp® PCR system 9700 (Applied<br /> Biosystems, Mỹ) bao gồm giai đoạn biến tính<br /> ban đầu ở 980C trong 2 phút, theo sau bằng 40<br /> chu kỳ gồm biến tính ở 980C trong 10 giây,<br /> gắn mồi ở 600C trong 15 giây, tổng hợp chuỗi<br /> DNA ở 720C trong 1 phút và kết thúc bằng<br /> giai đoạn kéo dài sản phẩm ở 720C trong 5<br /> phút. Sản phẩm PCR được phát hiện bằng<br /> điện di trên thạch agarose 2% có nhuộm<br /> ethidium bromide và quan sát dưới màn soi<br /> gel Pringraph (Atto, Nhật Bản). Sản phẩm<br /> PCR được tinh sạch bằng QIAquick Gel<br /> Extraction kit (Qiagen, Mỹ) và được kiểm tra<br /> lại bằng điện di trên thạch agarose 2%.<br /> <br /> Bảng 1: Các đoạn mồi dùng trong nghiên cứu<br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh<br /> <br /> 151<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> Tên mồi<br /> EGFR.18F<br /> EGFR.18R<br /> EGFR.19F<br /> EGFR.19R<br /> EGFR.20F<br /> EGFR.20R<br /> EGFR.21F<br /> EGFR.21R<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> Trình tự (5’--- 3’)<br /> CATGGTGAGGGCTGAGGTGA<br /> CTTGCAAGGACTCTGGGCT<br /> GCATGTGGCACCATCTCACA<br /> GAGAAAAGGTGGGCCTGAGG<br /> ACCTGGAAGGGGTCCATGTG<br /> TGCTATCCCAGGAGCGCAGA<br /> TCACAGCAGGGTCTTCTCTGTTT<br /> ATGCTGGCTGACCTAAAGCC<br /> <br /> Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA<br /> Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được<br /> thực hiện phản ứng cycle sequencing với<br /> BigDye V3.1 từ Applied Biosystems, theo 2<br /> chiều xuôi và ngược cho mỗi exon. Sản phẩm<br /> sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan<br /> trong Hi-Di formamide, biến tính ở 950C trong<br /> 2 phút trước khi làm lạnh đột ngột. Trình tự<br /> DNA được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic<br /> Analyzer, với POP-7 polymer và capillary 50<br /> cm (Applied Biosystems, Mỹ). Kết quả được<br /> phân tích bằng phần mềm SeqScape, so sánh<br /> với trình tự tham chiếu của EGFR mang<br /> accession number NG_007726 để chẩn đoán<br /> tình trạng đột biến của các exon. Quy trình<br /> chẩn đoán đột biến gen được thực hiện tại Đại<br /> học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> Hầu hết đột biến EGFR trong UTPKTBN<br /> nằm trong các exon 18 – 21(9). Vì các đột biến rất<br /> đa dạng, bao gồm đột biến điểm, đột biến mất<br /> đoạn và đột biến thêm đoạn nên giải trình tự<br /> chuỗi DNA được coi là kỹ thuật phù hợp nhất<br /> để khảo sát đột biến. Các kỹ thuật khác chỉ khảo<br /> sát các đột biến thường được báo cáo sẽ bỏ sót<br /> những đột biến mới, nhất là trên những quần<br /> thể mới được nghiên cứu lần đầu như bệnh<br /> nhân Việt Nam.<br /> Để có thể giải trình tự chuỗi DNA, bước<br /> quyết định là phải khuếch đại được các exon<br /> muốn tìm đột biến từ mô vùi nến. Hình 1A cho<br /> thấy các exon đã được khuếch đại một cách đặc<br /> hiệu bằng các đoạn mồi do chúng tôi thiết kế.<br /> Trong điều kiện PCR của chúng tôi, nhiệt độ bắt<br /> cặp của cả 4 cặp mồi là 600C, giúp cho việc<br /> <br /> 152<br /> <br /> Exon được khuếch đại<br /> <br /> Sản phẩm PCR (bp)<br /> <br /> 18<br /> <br /> 252<br /> <br /> 19<br /> <br /> 217<br /> <br /> 20<br /> <br /> 341<br /> <br /> 21<br /> <br /> 212<br /> <br /> khuếch đại cùng lúc 4 exon bằng một chương<br /> trình luân nhiệt rất thuận lợi.<br /> Kết quả giải trình tự sau đó phát hiện 3 bệnh<br /> nhân có mang đột biến của EGFR (Hình 1B). Đột<br /> biến L858R, do thay thế thymidine bằng guanine<br /> tại codon 858 của exon 21, là một trong những<br /> đột biến thường gặp nhất trong UTPKTBN(4).<br /> Đột biến Del_L747-S752 do mất đi 18 nucleic<br /> acid của exon 19, là đột biến hiếm gặp (chiếm<br /> khoảng 0,79% trong tổng số các trường hợp đột<br /> biến được tổng kết trong EGFR mutation<br /> database). Riêng đột biến tại codon 702 chỉ mới<br /> được báo cáo 3 trường hợp trong UTPKTBN. Cả<br /> 3 đột biến này đều nằm trong vùng đột biến<br /> nhạy với erlotinib. Kết quả của chúng tôi chứng<br /> tỏ kỹ thuật giải trình tự DNA giúp phát hiện<br /> được cả đột biến thường được báo cáo cũng như<br /> những đột biến hiếm gặp. Đây được coi là tiêu<br /> chuẩn vàng cho chẩn đoán đột biến gen EGFR<br /> trong các nghiên cứu lâm sàng(14,15). Cần lưu ý<br /> rằng kỹ thuật này chỉ có khả năng phát hiện đột<br /> biến nếu số tế bào có mang đột biến (tế bào ung<br /> thư) chiếm từ 30% trong tổng số tế bào thu được<br /> trong tube ly tâm(6). Vì thế, việc đánh dấu vùng<br /> tế bào ung thư để phân biệt với mô bình thường<br /> xung quanh trên lam giải phẫu bệnh trước khi<br /> thu tế bào là bước vô cùng quan trọng, tránh<br /> khả năng bỏ sót đột biến. Chúng tôi không phát<br /> hiện đột biến trên 1 bệnh nhân có bệnh phẩm là<br /> mô sinh thiết, có thể do tỷ lệ tế bào ung thư quá<br /> ít vì không tách được mô lành ra khỏi mô ung<br /> thư. Trong trường hợp này, các kỹ thuật có độ<br /> nhạy cao hơn nên được triển khai thêm để bổ<br /> sung cho giải trình tự chuỗi DNA(3,6).<br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Hình 1: Đột biến EGFR. (A) khuếch đại đặc hiện 4 exon 18 – 21 bằng PCR. (B) các đột biến được phát hiện bằng<br /> giải trình tự chuỗi DNA.<br /> sát đột biến EGFR trên bệnh nhân UTPKTBN<br /> Ngoài erlotinb, gefitinib (biệt dược Iressa<br /> nhằm mô tả được tần suất cũng như phổ đột<br /> của Astrazeneca) cũng là thuốc ức chế đặc hiệu<br /> biến gen này trên bệnh nhân Việt Nam.<br /> EGFR. Nếu được chỉ định rộng rãi, thuốc này<br /> không cải thiện thời gian sống thêm trên bệnh<br /> KẾT LUẬN<br /> nhân người da trắng, vì vậy không được chỉ<br /> Kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA đã được<br /> định tại Mỹ và châu Âu(12). Tuy nhiên, trên bệnh<br /> ứng dụng thành công để phát hiện đột biến<br /> nhân châu Á, Iressa tỏ ra rất hiệu quả, đặc biệt<br /> EGFR trong UTPKTBN trên bệnh nhân Việt<br /> nếu bệnh nhân có mang đột biến của EGFR. Một<br /> Nam, giúp lựa chọn điều trị nhắm trúng đích<br /> nghiên cứu trên bệnh nhân Nhật Bản cho thấy tỷ<br /> phân tử bằng erlotinib và gefitinib.<br /> lệ sống thêm 1 năm là 79%(12). Nhóm tác giả của<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> Mỹ công bố kết quả rất khả quan về hiệu quả<br /> 1.<br /> Dubey S, Powell CA (2007). Update in lung cancer 2006. Am J<br /> của gefitinib khi được chỉ định ưu tiên cho bệnh<br /> Respir Crit Care Med;175(9):868-74.<br /> 2.<br /> Inoue A, Suzuki T, Fukuhara T, Maemondo M, Kimura Y,<br /> nhân UTPKTBN có mang đột biến của EGFR,<br /> Morikawa N, et al (2006). Prospective phase II study of gefitinib for<br /> với tỷ lệ sống thêm 1 năm là 73% và thời gian<br /> chemotherapy-naive patients with advanced non-small-cell lung<br /> (10)<br /> sống thêm trung vị là 17,5 tháng . Ngay cả<br /> cancer with epidermal growth factor receptor gene mutations. J Clin<br /> Oncol;24(21):3340-6.<br /> những trường hợp đã có di căn não, erlotinib và<br /> 3.<br /> Janne PA, Borras AM, Kuang Y, Rogers AM, Joshi VA, Liyanage<br /> gefitinib cũng tỏ ra có hiệu quả trên bệnh nhân<br /> H, et al (2006). A rapid and sensitive enzymatic method for<br /> có mang đột biến EGFR(2). Thành công trong<br /> epidermal growth factor receptor mutation screening. Clin Cancer<br /> Res;12:751-8.<br /> chẩn đoán đột biến EGFR bằng kỹ thuật giải<br /> 4.<br /> Johnson BE, Janne PA (2005). Epidermal growth factor receptor<br /> trình tự chuỗi DNA của chúng tôi có thể giúp<br /> mutations in patients with non-small cell lung cancer. Cancer<br /> ích cho điều trị bệnh nhân bằng erlotinib hay<br /> Res;65(17):7525-9.<br /> 5.<br /> Lynch TJ, Bell DW, Sordella R, Gurubhagavatula S, Okimoto<br /> gefitinib. Hiện nay kỹ thuật này cũng đang được<br /> RA, Brannigan BW, et al (2004). Activating mutations in the<br /> ứng dụng tại Đại học Y Dược TP.HCM để khảo<br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh<br /> <br /> 153<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> 6.<br /> <br /> 7.<br /> <br /> 8.<br /> <br /> 9.<br /> <br /> 10.<br /> <br /> 11.<br /> <br /> 154<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of nonsmall-cell lung cancer to gefitinib. N Engl J Med;350(21):2129-39.<br /> Marchetti A, Martella C, Felicioni L, Barassi F, Salvatore S,<br /> Chella A, et al (2005). EGFR mutations in non-small-cell lung<br /> cancer: analysis of a large series of cases and development of a<br /> rapid and sensitive method for diagnostic screening with<br /> potential implications on pharmacologic treatment. J Clin<br /> Oncol;23(4):857-65.<br /> Nguyễn Thiện Nhân, Trần Đình Thanh, Nguyễn Sơn Lam,<br /> Nguyễn Trần Phùng (2010). Báo cáo một trường hợp ung thư<br /> phế quản – phổi xâm lấn gây chít hẹp khí quản, đáp ứng hoàn<br /> toàn sau 10 ngày điều trị bằng erlotinib. Y học TP. Hồ Chí<br /> Minh;14(4):379 – 85.<br /> Parra HS, Cavina R, Latteri F, Zucali PA, Campagnoli E,<br /> Morenghi E, et al (2004). Analysis of epidermal growth factor<br /> receptor expression as a predictive factor for response to gefitinib<br /> ('Iressa', ZD1839) in non-small-cell lung cancer. Br J<br /> Cancer;91(2):208-12.<br /> Rosell R, Moran T, Queralt C, Porta R, Cardenal F, Camps C, et<br /> al (2009). Screening for epidermal growth factor receptor mutations<br /> in lung cancer. N Engl J Med;361(10):958-67.<br /> Sequist LV, Martins RG, Spigel D, Grunberg SM, Spira A, Janne<br /> PA, et al (2008). First-line gefitinib in patients with advanced nonsmall-cell lung cancer harboring somatic EGFR mutations. J Clin<br /> Oncol;26(15):2442-9.<br /> Shepherd FA, Rodrigues Pereira J, Ciuleanu T, Tan EH, Hirsh V,<br /> Thongprasert S, et al (2005). Erlotinib in previously treated nonsmall-cell lung cancer. N Engl J Med;353(2):123-32.<br /> <br /> 12.<br /> 13.<br /> <br /> 14.<br /> <br /> 15.<br /> <br /> 16.<br /> <br /> 17.<br /> <br /> Stinchcombe TE, Socinski MA (2008). Considerations for secondline therapy of non-small cell lung cancer. Oncologist;13:28-36.<br /> Tamura K, Okamoto I, Kashii T, Negoro S, Hirashima T, Kudoh<br /> S, et al (2008). Multicentre prospective phase II trial of gefitinib for<br /> advanced non-small cell lung cancer with epidermal growth factor<br /> receptor mutations: results of the West Japan Thoracic Oncology<br /> Group trial (WJTOG0403). Br J Cancer;98(5):907-14.<br /> Toyooka S, Takano T, Kosaka T, Hotta K, Matsuo K, Ichihara S,<br /> et al (2008). Epidermal growth factor receptor mutation, but not sex<br /> and smoking, is independently associated with favorable prognosis of<br /> gefitinib-treated patients with lung adenocarcinoma. Cancer<br /> Sci;99(2):303-8.<br /> Tsao MS, Sakurada A, Cutz JC, Zhu CQ, Kamel-Reid S, Squire J,<br /> et al (2005). Erlotinib in lung cancer - molecular and clinical<br /> predictors of outcome. N Engl J Med;353(2):133-44.<br /> Uramoto H, Sugio K, Oyama T, Ono K, Sugaya M, Yoshimatsu<br /> T, et al (2006). Epidermal growth factor receptor mutations are<br /> associated with gefitinib sensitivity in non-small cell lung cancer in<br /> Japanese. Lung Cancer;51(1):71-7.<br /> Vũ Văn Vũ, Đặng Thanh Hồng và cs (2010). Điều trị ung thư phổi<br /> không tế bào nhỏ tiến xa bằng erlotinib – những nhận định ban đầu<br /> nhân 10 trường hợp tại Bệnh biện Ung bướu TPHCM 2008 – 2010.<br /> Y học TP. Hồ Chí Minh;14(4):408 – 413.<br /> <br /> Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh<br /> <br />