Phương pháp PCR

Chia sẻ: Dương An | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:12

Thêm vào BST

Báo xấu

831
lượt xem 248
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

I. Phương pháp PCR 1. Khái niệm PCR (Polymerase Chain Reaction) (Phản ứng Trùng Phân, Phản ứng chuỗi Polymerase, hay phản ứng PCR). Bản chất của PCR là sự tổng hợp nhân tạo nhằm tạo ra các đoạn ADN mới. 2. Các thành phần chính của PCR Các thành phần chính của PCR gồm: ADN khuôn, dNTP, Mồi (primer), enzym polymerase (Taq), MgCl2 và đệm PCR Phản ứng được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt, hay còn gọi là máy PCR....

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phương pháp PCR

Phương pháp PCR I. Phương pháp PCR 1. Khái niệm PCR (Polymerase Chain Reaction) (Phản ứng Trùng Phân, Phản ứng chuỗi Polymerase, hay phản ứng PCR). Bản chất của PCR là sự tổng hợp nhân tạo nhằm tạo ra các đoạn ADN mới. 2. Các thành phần chính của PCR Các thành phần chính của PCR gồm: ADN khuôn, dNTP, Mồi (primer), enzym polymerase (Taq), MgCl2 và đệm PCR Phản ứng được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt, hay còn gọi là máy PCR. 2.1. ADN khuôn ADN khuôn (DNA template) hay còn gọi là ADN mục tiêu được sử dụng làm cái khuôn để các mồi PCR gắn vào vị trí bổ sung với nó, sau đó với sự tham gia của các thành phần cần thiết, phản ứng tổng hợp sẽ diễn ra tạo lên một đoạn ADN mới giống hệt đoạn ADN nằm giữa hai vị trí gắn mồi. Từ chu kỳ thứ hai trở đi, ngoài ADN khuôn ban đầu, những đoạn ADN vừa được tổng hợp cũng được sử dụng làm khuôn cho những chu kỳ tổng hợp tiếp theo. Lượng ADN khuôn rất nhỏ khoảng từ 20ng đến 100ng. Do lượng ADN cần thiết nhỏ như vậy, nên khi chuẩn bị ADN khuôn phải hết sức chú ý tránh bị lẫn ADN từ các nguồn khác và cần phải có ADN khuôn với độ nguyên vẹn cao. 2.2. Mồi PCR Mồi là một đoạn oligonucleotít ngắn, có chiều dài khoảng từ 6 đến 70 nucleotít. Những mồi ngẫu nhiên (mồi RAPD) có chiều dài khoảng 10 nucleotít và đa số các mồi PCR có chiều dài khoảng 20 dến 30 nucleotít. - Thiết kế mồi Khi thiết kế mồi, người ta thường quan tâm sao cho không có sự bổ sung giữa các bazơ trong cùng một mồi và giữa các mồi. Vì phản ứng tổng hợp được bắt đầu từ đuôi 3’ của mồi; do vậy để nâng cao hiệu quả gắn mồi và tính đặc hiệu của phản ứng, người ta thường quan tâm đến việc thiết kế sao cho đuôi 3’ của chúng là các bazơ G hoặc C để tạo ra sự bắt cặp chắc hơn và đặc hiệu hơn so với cặp A và T. - Nhiệt độ gắn mồi 1
Trong PCR phải tìm được nhiệt độ thích hợp nhất cho mồi gắn vào ADN khuôn. Để xác định nhiệt độ gắn mồi tương đối ban đầu, người ta đã dựa trên những công thức toán khác nhau. *Đối với những mồi có chiều dài ≤ 20 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi được tính theo công thức sau: Tm ( oC) = {2 x (A + T) + 4 x (G + C)} VD: một mồi có trình tự nucleotide như sau: CAG CAA ATA TCT GTC CTT AC, nhiệt độ gắn mồi tương đối sẽ là: Tm = 2 x 12 + 4 x 8 = 56 oC. *Đối với những mồi có chiều dài từ 20 đến 35 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi được tính theo công thức: Tm ( oC) = 22 + 1,46 x {[2 x (C +G) + ( A + T)]} *Đối với những mồi có chiều dài từ 35 đến 70 bazơ thì nhiệt độ gắn mồi được tính theo công thức: Tm ( oC) = 81,5 + 16.6 log10C+ + 0,41 (% của G + C) – 600/L. C+ là nồng độ của cation hoá trị một (Na+), tính theo nồng độ của phân tử; L là chiều dài mồi. Trong thực tế nhiệt độ gắn mồi có thể dao động từ 30C đến 150C so với nhiệt độ tính toán được từ các công thức. Các công thức nêu trên chỉ để tham khảo; nhiệt độ gắn mồi tối ưu được rút ra qua thí nghiệm cụ thể. + Nồng độ mồi Nồng độ mồi có thể được sử dụng vào khoảng 100 đến 500 nM. Tuy nhiên nồng độ cụ thể phụ thuộc vào từng thí nghiệm và mục đích nghiên cứu. Nếu nồng độ mồi quá thấp sẽ không đủ cho phản ứng và nồng quá cao có thể dẫn tới sai lệch kết quả. + Thời gian gắn mồi Thời gian gắn mồi vào khuôn thường dao động trong khoảng 30 đến 60 giây. Nếu thời gian gắn mồi lâu sẽ gây ra sai lệch kết quả phản ứng do sự gắn mồi không đặc hiệu, hơn nữa sẽ kéo dài thời gian phản ứng làm suy giảm sự hoạt động của enzym Taq. 2.3. dNTP dNTP (A, T, G, C là những “viên gạch” để xây dựng lên sợi ADN mới trong phản ứng chuỗi. Nồng độ của dNTP thường sử dụng cho mỗi phản ứng là 200µ M. Nếu nồng độ dNTP quá cao nó sẽ liên kết với Mg2+, một ion rất cần cho sự hoạt động của enzym tổng hợp, vì vậy mà sẽ ảnh hửng tới phản ứng tổng hợp. dNTP rất nhậy cảm với sự thay đổi nhiệt độ, cứ sau 35 chu kỳ của PCR thì dNTP hầu như đã bị suy giảm; trong một môi trường axít nó sẽ chuyển 2
hoá nhanh thành dNDP và dNMP. Do vậy mà dNTP là chất không bền, đặc biệt sử dụng cho PCR. 2.4. Enzym tổng hợp ADN. Là một thành phần quan trọng của phản ứng PCR. Trong điều kiện thích hợp cùng với các thành phần cần thiết khác, enzym hoạt động tổng hợp nên ADN mới. Nồng độ sử dụng enzym phụ thuộc vào mỗi loại enzym và thuộc tính của nó; có thể sử dụng từ 1 đến 2 đơn vị enzym sẽ cho hiệu quả tốt nhất với PCR có thể tích 25µ l. Nếu quá nhiều enzym có thể sẽ làm tăng nồng độ glycerol trong dung dịch phản ứng, dẫn tới quá trình tổng hợp không đồng đều giữa các vị trí và tạo ra hình ảnh điện di không rõ nét. Ngược lại, nếu quá ít sẽ thiếu enzym và kết quả nhận được là sản phẩn tổng hợp không đầy đủ. 2.5. Dung dịch đệm PCR Dung dịch đệm chung nhất của PCR bao gồm các thành phần KCl, MgCl 2 và Tris. Muối KCl góp phần làm tăng hiệu quả của phản ứng, thông thường những mồi cho sản phẩm PCR với kích thước lớn hơn thì hoạt động tốt hơn trong môi trường có nồng độ muối thấp hơn và ngựơc lại những đôi mồi cho sản phẩm PCR ngắn hơn sẽ hoạt động tốt hơn trong môi trường có nồng độ muối cao hơn. MgCl2 là nhân tố cần thiết để enzym Taq hoạt động, nếu nồng độ MgCl2 thấp, sẽ ức chế sự hoạt động của enzym Taq, tuy nhiên nếu nồng độ quá cao sẽ cho kết quả PCR không đặc hiệu. Tris có vai trò giữ cho pH dung dịch ổn định, sự thay đổi nồng độ của Tris không ảnh hưởng nhiều đến kết quả phản ứng PCR. 2.6. Thể tích phản ứng: Thể tích không ảnh hưởng tới kết qủa của phản ứng, nếu chúng ta sử dụng ống PCR nhỏ có thành mỏng và sử dụng loại máy PCR không cần dầu để chống bay hơi dung dịch. Thể tích phản ứng có thể được điều chỉnh từ 5µ l đến 100µ l, tuy nhiên nếu với cùng lượng ADN khuôn, thể tích PCR nhỏ sẽ cho nồng độ sản phẩm lớn hơn so với thể tích PCR lớn. 2.7. Chu kỳ phản ứng: Các thí nghiệm cho thấy số chu kỳ cần áp dụng cho một phản ứng từ 25 đến 45 là vừa đủ. Nếu tiếp tục tăng số chu kỳ, thậm trí lên tới 60 chu kỳ thì sản phẩm PCR có tăng lên nhưng không đáng kể. 3
3. Nguyên lý phản ứng và chu kỳ nhiệt của PCR (xem file powerpoint) Khi chúng ta chuẩn bị một dung dịch phản ứng gồm các thành phần cơ bản như: ADN khuôn, dNTP, Mồi (primer), enzym polymerase (Taq), MgCl2 và đệm PCR.v.v. Dung dịch phản ứng trong ông PCR được đặt trong máy PCR và hoạt động theo sơ đồ nguyên lý sau: 5’ 3’ ADN khuôn 3’ 5’ 5’ 3’ ADN khuôn biến tính (94oC-95oC) 3’ 5’ 5’ 3’ Mồi gắn 3’ 5’ vào ADN 5’ 3’ 3’ 5’ khuôn 3’ 5’ 3’ 5’ Tổng hợp ADN (72oC) 5’ 3’ 5’ 3’ 4
II. Các kỹ thuật PCR Một số kỹ thuật đang được ứng dụng phổ biến trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật gồm: (1) Kỹ thuật RT-PCR; (2) Kỹ thuật RAPD; (3) Kỹ thuật AFLP; (4) Kỹ thuật STS; (5) Kỹ thuật CAPS; (6) Kỹ thuật SSR (xem file powerpoint) 1. Kỹ thuật RT-PCR RT-PCR (reverse transcription PCR) là kỹ thuật dùng để tổng hợp cADN từ mARN. Kỹ thuật này được tiến hành như sau: trước tiên, người ta tách ARN thông tin từ tế bào, sau đó tiến hành phản ứng PCR để phiên mã ngược từ ARN thành cADN, ở giai đoạn này các thành phần tham gia phản ứng vẫn tương tự như PCR thông thường, chỉ trừ enzym tổng hợp người ta phải sử dụng loại sao mã ngược (reverse transcriptase) để tổng hợp ra sợi cDNA, quá trình tổng hợp được thực hiện ở 370C. Sau khi có sợi cADN, sợi này sẽ được làm khuôn để nhân bội nhiều bản sao qua một qui trình PCR thông thường. Thường người ta tiến hành hai quá trình phiên mã ngược và nhân bội cùng nhau bằng cách bố trí một phản ứng với hai loại enzym và hai loại mồi PCR (một loại để sao mã ngược và một loại để nhân bội), còn các thành phần khác vẫn không đổi. 2. Kỹ thuật RAPD RAPD là viết tắt của cụm từ tiếng Anh: Randomly Amplified Polymorphic DNA (Đa hình ADN dược nhân bản ngẫu nhiên). Nó là kỹ thuật được xây dựng dựa trên nguyên lý PCR, với những mồi được thiết kế ngẫu nhiên có chiều dài khoảng 10 nucleotide. Trong phản ứng, các mồi RAPD gắn ngẫu nhiên vào ADN khuôn ở bất kỳ vị trí nào mà có trình tự bổ sung với nó. Phản ứng sau đó xảy ra với sự tham gia của enzym Taq, dNTP và các thành phần khác. Kỹ thuật này chỉ sử dụng một lượng nhỏ ADN khuôn (khoảng 25ng). Sản phẩm PCR được điện di trong gel agarose và phát hiện bằng cách nhuộm với dung dịch ethidium bromide, kích thước sản phẩm có chiều dài từ 200bp đến 2000 bp. Về cơ bản, chỉ thỉ RAPD là một chỉ một chỉ thị trội, nghĩa là chỉ thị này không phân biệt được giữa những cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử trong quần thể F2. RAPD là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không mất nhiều thời gian, ít tốn kém. Kỹ thuật này rất phù hợp cho phân tích đa dạng di truyền và lập bản đồ gen sử dụng quần thể RIL (Recombinant Inbred Line). Hạn chế lớn nhất của kỹ thuật RAPD đó là nó rất nhậy cảm với nhiều yếu tố như: các thành phần tham gia phản ứng và đặc biệt là nhiệt độ gắn mồi, vì yếu tố gắn mồi mà có thể có hai kết quả khác nhau với cùng một thí nghiệm sử dụng hai máy PCR 5
khác nhau. Để hạn chế nhược điểm này, cần phải tuân thủ nghiêm ngặt các điều kiện thí nghiệm và phải tiến hành đồng bộ giữa các lần thí nghiệm. Qui trình và ví dụ minh họa - Các thành phần PCR ADN 25 ng • dNTP 200 mM • Mồi PCR (PCR primer) 200 µ M • MgCl2 1.5 mM • Đệm PCR 1X* • Enzym Taq polymerase 1 đơn vị • 10µ l đến 20µ l Thể tích phản ứng • * Thông thường đệm PCR được chuẩn bị ở nồng độ 10 lần (10X), nồng độ của đệm trong phản ứng PCR được pha loãng xuống một lần (1X). - Chu kỳ nhiệt của phản ứng Nhiệt độ tiền biến tính 950C, thời gian 5 phút B1: Nhiệt độ biến tính 940C, thời gian 1 phút B2: Nhiệt độ gắn mồi 350C, thời gain 30 giây B3: Nhiệt độ tổng hợp 720C, thời gian 2 phút B4: 720C trong 7 phút B5: Các bước B2, B3, B4 được lặp lại 45 lần và sau đó bước B5 ở 720C trong 7 phút để tất cả các đoạn ADN có thể được tổng hợp hoàn thiện. - Điện di và phát hiện sản phẩm Sản phẩn RAPD được điện di trong gel agarose 2%, sau đó nhuộm cùng ethidium bromide và phát hiện các băng ADN dưới tia sáng của đèn cực tím. 3. Kỹ thuật SSR (Single Sequence Repeat hay Microsatelite) Khi nghiên cứu genom của một số sinh vật người ta đã phát hiện ra những đoạn ADN có chiều dài khác nhau phân bố một cách ngẫu nhiên mà trình tự của nó bao gồm các nhóm nucleotide giống nhau nhắc lại nhiều lần; các nhóm này thường có số lượng không vượt quá 5 nucleotide ví dụ như (TG)n hoặc (AAT)n. ở lúa các nhóm nucleotide đã phát hiện được gồm GA, GT, CAT, CTT. Những đoạn ADN lặp lại như vậy được gọi là Microsatelite hay còn có các tên khác như: SSLPs (single sequence length polymorphisms), SSRs (simple sequence repeats), STRs (short tADNom repeats). Các đoạn ADN nhắc lại này có rình tự 6
hai đầu rất đặc trưng cho mỗi đoạn; bởi vậy mà trình tự đặc trưng ở hai đầu của đoạn nhắc lại này đã được sử dụng để thiết kế mồi cho PCR. Do có sự khác nhau về chiều dài giữa các đoạn nhắc lại, bởi vậy mà kỹ thuât nhận dạng ADN Microsatelite rất phù hợp trong nghiên cứu đa hình; lập bản đồ và phân lập gen. Cũng giống như kỹ thuật RAPD, kỹ thuật SSR đơn giảm, thuận tiện, không tốn kém; mặt khác Microsatelites là chỉ thị đồng trội nên nó được sử dụng để phát hiện cá thể dị hợp tử và lập bản đồ gen sử dụng quần thể F2. Qui trình và vi dụ minh họa - Các thành phần và nồng độ cho một phản PCR • ADN 25 ng • dNTP • Mồi SSR 20nM • MgCl2 • Đệm PCR 1X 1 đơn vị • Enzym Taq 10µ l đến 20µ l • Thể tích phản ứng - Chu kỳ nhiệt của phản ứng B1: Nhiệt độ tiền biến tính 95oC, thời gian 5 phút B2: Nhiệt độ biến tính 94oC, thời gian 1 phút B3: Nhiệt độ gắn mồi 35oC, thời gain 1 phút B4: Nhiệt độ tổng hợp 72oC, thời gian 2 phút B5: 72oC trong 7 phút Các bước B2, B3, B4 được lặp lại 35 lần và bước B5 ở 720C trong 7 phút để tất cả các đoạn ADN có thể được tổng hợp hoàn thiện. - Điện di và phát hiện sản phẩm Sản phẩm PCR có thể được điện di trong gel agarose 3% và phát hiện bằng nhuộm ethidium bromide (hình 1A) hoặc điện di trong gel polyarylamide và phát hiện bằng cách nhuộn bạc. 4. Kỹ thuật AFLP - Nguyên lý AFLP Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphim) được phát triển dựa trên nguyên lý PCR để nhân bản những đoạn ADN đã được phân cắt bởi enzym giới hạn (restriction enzyme). Điểm cơ bản nhất của kỹ thuật này đó là sự thiết kế mồi PCR đặc trưng. Qui trình thiết kế mồi PCR được tiến hành như sau trước tiên, ADN tổng số được cắt bởi các enzym giới hạn; hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng hai enzym EcoRI (enzym nhận biết 6 nucleotit) và MseI (enzym nhận biết 4 nucleotit). Khi sử lý với enzym giới hạn, ADN sẽ bị cắt thành vô số mảnh có kích thước khác nhau mà mỗi mảnh ta đều biết được trình tự nucleotide của chúng ở hai đầu cắt. Dựa vào trình tự đã biết ở đầu cắt, ta thiết kế các đoạn gắn (adapter) và gắn chúng vào mỗi đầu. Dựa vào trình tự 7
adapter người ta thiết kế mồi PCR, mồi gồm hai phần: một phần có trình tự nucleotide bổ sung với adapter và phần còn lại là những nucleotide đựơc thêm vào tuỳ ý, thông thường từ 1 đến 3 nucleotide. Với mồi thiết kế như vậy thì chỉ có những đoạn ADN có trình tự ở hai đầu bổ sung với trình tự mồi mới được nhân bản. Do kết hợp được những đặc điểm của kỹ thuật RFLP và kỹ thuật RAPD nên kỹ thuật AFLP có nhiều ưu điểm như: đơn giản, ổn định, khả năng ứng dụng rộng và do có thể bổ sung các nucleotide khác nhau khi thiết kết mồi nên số lượng mồi có thể thiết kế được và tiềm năng ứng dụng rất lớn. Về cơ bản AFLP là chỉ thị trội và vị trí nhiễm sắc thể của chúng chưa xác định, do vậy nếu dùng chỉ thị này để lập bản đồ gen ở quần thể F 2 thì cần phải sử dụng kết hợp với các chỉ thị khác đã biết trước vị trí nhiễm sắc thể như: RFLP hoặc microsattelite. Qui trình và ví dụ minh hoạ của kỹ thuật AFLP S1. Xử lý enzym giới hạn ADN tổng số được cắt bởi các enzym giới hạn, thường là hai enzym EcoRI và MseI để tạo thành các đoạn nhỏ gọi là đoạn hay mảnh giới han. Ví dụ dưới đây được tiến hành trên một số cây trồng như lúa, ngô, lúa mỳ... Phản ứng cắt được pha trộn với các thành phần sau: - ADN (25ng/µ l) 10µ l - Enzym EcoRI (10u/µ l) 0,5µ l - Enzym MseI (10u/µ l) 0,5µ l 2,5µ l - Đệm cắt 10xM 2,5µ l - Đệm cắt Not1 9µ l - Nước cất khử trùng Dung dịch hỗn hợp của phản ứng bao gồm các thành phần nói trên được trộn đều và ủ ở 370C trong 3 giờ. S2. Gắn adapter Sau khi có được các mảnh ADN giới hạn, các mảnh này sẽ được gắn adapter vào hai đầu của của chúng. Có hai loại adapter đã được thiết kế, loại dựa vào đầu cắt của enzym EcoRI được gọi là EcoRI adapter và loại dựa vào đầu cắt của enzym MseI được gọi là MseI adapter. Phản ứng gắn adapter gồm các chất sau: 5µ l - Đoạn ADN giới hạn - EcoRI adapter (5pmol/µ l) 1µ l - MseI adapter (50pmol/µ l) 1µ l - Enzym gắn ADN T4 (350u/µ l) 0,08µ l 8
1µ l - Đệm gắn 10X 1.92µ l - Nước cất khử trùng Dung dịch phản ứng được ủ ở nhiệt độ phòng (240C - 370C) trong 3 giờ. Sản phẩm thu được sau khi gắn adapter được pha loãng xuống 10 lần. S3. Tiền PCR Bước này có mục đích nhân bội những mảnh ADN đã được gắn adapter để tạo thành nhiều mảnh làm khuôn cho các bước nhân bội chọn lọc tiếp theo. ở bước này sử dụng hai loại mồi PCR gồm: mồi tiền AFLP-EcoRI và mồi tiền AFLP-MseI, những mồi này có trình tự bổ sung chính xác với phần adapter (hoặc cộng thêm một vài nucleotide tùy ý). - Thành phần phản ứng 15.9µ l + Nước cất khử trùng 2,5µ l + Đệm PCR 10X 2µ l + dNTP (2,5mM) 2,5µ l + Dung dịch ADN (ADN khuôn) + Mồi tiền AFLP EcoRI (5ng/µ l) 1µ l + Mồi tiền AFLP MseI (30ng/µ l) 1µ l + Enzym Taq (5u/µ l) 0,1µ l - Chương trình PCR gồm 1 chu kỳ, với nhiệt độ thời gian là: B1: 940C 2 phút gồm 20 chu kỳ, với nhiệt độ thời gian là: B2: 940C 30 giây 0 56 C 1 phút 0 72 C 1 phút gồm 1 chu kỳ, với nhiệt độ thời gian là: B3: 720C 10 phút Sản phẩm cuối cùng của phản ứng được bảo quản ở 40C B4: Sản phẩm tiền nhân bội được pha loãng xuống 50 lần và được sử dụng làm ADN khuôn cho bước nhân chọn lọc. 9
4. Nhân bội chọn lọc Sau khi đã có ADN khuôn nhận từ giai đoạn tiền PCR, chúng ta tiến hành PCR chọn lọc sử dụng cặp mồi EcoRI và MseI bổ sung với adapter và có những nucleotide thêm vào đầu 3’ của chúng. Với mồi thiết kế như vậy thì chỉ có những đoạn ADN có trình tự bổ sung hoàn toàn với mồi mới được nhân bội, các đoạn khác mồi chỉ bổ sung với phần adapter mà không bổ sung với các nucleotide đặt thêm thì sẽ không được nhân bội. Sản phẩm PCR trong giai đoạn này gọi là sản phẩm nhân bội chọn lọc. - Thành phần phản ứng 2,4µ l + Nước cất khử trùng 1µ l + Đệm PCR 10X 2,5µ l + Dung dịch ADN (ADN khuôn) + Mồi chọn lọc EcoRI (7ng/µ l) 1µ l + Mồi chọn lọc MseI (7ng/µ l) 2,25µ l 0,8µ l + dNTP (2,5mM) + Taq (5u/µ l) 0,05µ l - Chu kỳ nhiệt B1: một chu kỳ gồm: 940C 30 giây 0 68 C 30 giây 0 72 C 1 phút B2: 17 chu kỳ 940C 30 giây 0 68 C* 30 giây 0 72 C 1 phút *Giai đoạn gắn mồi (680C) ở mỗi chu kỳ bị giảm xuống 0,70C. 23 chu kỳ gồm: B3: 940C 30 giây 0 56 C 30 giây 0 72 C 1 phút 720C B4: 10 phút 40C B5: 5. Điện di và phát hiện sản phẩm 10
Sản phẩm AFLP được điện di trong gel polyacrylamide sau đó nhuộm bạc, dung dịch ethidium bromide hoặc vistra green...để phát hiện các băng ADN (hình 1B, hình 2) 5. Kỹ thuật STS STS (Sequence Tagged Sites) có thể được xem như là một kỹ thuật thay thế RFLP và RAPD. Trong các kỹ thuật ADN thì RFLP rất phức tạp, tốn kém và khó thực hiện nhất; trong khi đó RAPD lại được xem như một kỹ thuật không ổn định, kết quả có thể không đồng nhất nếu thực hiện phản ứng trong cùng điều kiện nhưng ở hai máy PCR khác nhau. Để khắc phục những nhựơc điểm này, người ta đã xây dựng kỹ thuật STS. Nguyên lý của STS đó là: trước tiên người ta xác định trình tự các nucleotide ở hai đầu của các đoạn ADN sử dụng làm mẫu dò trong kỹ thuật RFLP và sản phẩn RAPD; sau đó dựa vào trình tự đã xác định, người ta đã thiết kế những mồi PCR có chiều dài khoảng 18 đến 20 nucleotide. Với những mồi như vậy, chúng có thể tổng hợp nên những đoạn ADN nằm trong vùng sản phẩm RFLP và RAPD. Vì dựa trên nguyên lý PCR nên dễ thực hiện, không tốn kém, hơn nữa lại sử dụng mồi đặc hiệu nên kết quả ổn định. Qui trình kỹ thuật STS cũng tương tự với SSR, tuy nhiên có một số điểm cần điều chỉnh cho phù hợp chẳng hạn như nhiệt độ gắm mồi. 6. Kỹ thuật CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) Do sự đa hình giữa các cá thể sinh vật được xác định dựa vào kết qủa so sánh kích thước các băng ADN của chúng, vì vậy mà sản phẩm PCR gồm các băng ADN của các mẫu sinh vật có thể không khác nhau về kích thước nhưng lại có thể khác nhau về trình tự sắp xếp các nucleotide. Từ lý giải nói trên, các nhà khoa học đã sử dụng các enzym giới hạn để cắt sản phẩm RAPD, STS., SSR.. nếu trình tự nucleotide của các sản phẩm đó chứa vị trí nhận biết của enzym nào đó thì nó sẽ bị cắt tại đó. Sự đa hình sẽ được phát hiện khi sản phẩm cắt được tiếp tục được điện di trong gel. Sau đây là qui trình và ví dụ của kỹ thuật CAPS khi cắt sản phẩm STS. Xử lý enzym giới hạn tiến hành như sau: 10µ l 1. Sản phẩm STS 1,5µ l 2. Đệm cắt 3. Enzym giới hạn 10 đơn vị tới thể tích là: 15µ l. 4. Cho thêm nước cất khử trùng Phản ứng cắt được thực hiện ở 370C từ 2 đến 12 giờ. Sản phẩm cắt được điện di trong gel agarose ở 120V khoảng 2 đến 3 giờ; các băng ADN sẽ 11
được phát hiện bằng nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide. Hình dưới là kết quả điện di của cùng một sản phẩm STS và được cắt với các ezim khác nhau; chỉ có 2 enzym PstI và KpnI cho phản ứng cắt sản phẩm STS; tuy nhiên chỉ có enzym KpnI là cho đa hình giữa hai mẫu. 12