Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - ThS. Ninh Thị Thảo (Bài 4)

Chia sẻ: Minh Vũ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:48

Thêm vào BST

Báo xấu

136
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài giảng "Công nghệ sinh học đại cương - Chương 2: Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại (Bài 4)" cung cấp cho người học các kiến thức về phương pháp PCR và các ứng dụng bao gồm: Sự phát minh ra kỹ thuật PCR, nguyên tắc kỹ thuật PCR, các giai đoạn trong phản ứng PCR, chu kỳ phản ứng PCR,... Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài giảng Công nghệ sinh học đại cương: Chương 2 - ThS. Ninh Thị Thảo (Bài 4)

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG (SH3014) 1 BM CNSH TV – Khoa CNSH
CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT) 1. Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn 2. Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen 3. Các phương pháp lai phân tử 4. Phương pháp PCR, ứng dụng 5. Kỹ thuật xác định trình tự DNA 6. Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 2 BM CNSH TV – Khoa CNSH
PCR Polymerase Chain Reaction 3
Sự phát minh ra kỹ thuật PCR • Kỹ thuật PCR hay còn được gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase được Kary Mullis phát minh vào năm 1983. • Hai năm sau (1985), phát minh này được chính thức công bố trên tạp chí khoa học quốc tế. • Với công trình này, Kary Mullis được tặng giải thưởng Nobel hóa học năm 1993. “Sự phát minh của kỹ thuật này xứng đáng được coi là một bước ngoặt hay một kỹ thuật mang tính cách mạng thúc đẩy sự phát triển của Công nghệ sinh học hiện đại” (J. Watson) 4
Khái niệm Kỹ thuật PCR là một phương pháp cho phép nhân nhanh số lượng lớn một đoạn DNA Phương pháp này có độ nhạy rất cao và ngày nay đã trở thành một công cụ nghiên cứu đầu tay trong phần lớn các phòng thí nghiệm có liên quan đến gen và DNA thuộc các lĩnh vực khoa học sinh học, nông nghiệp, môi trường, y tế, dược phẩm, pháp y … 5
Nguyên tắc của kỹ thuật PCR • Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzyme DNA polymerase để nhân bản một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotide (primer) tương hợp với hai đầu 3’ ở hai mạch đơn của đoạn DNA. Kỹ thuật này được phát minh nhờ sự phát hiện ra Taq polymerase, là một DNA polymerase từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng 6
Sự tái bản DNA trong cơ thể sống 7
Thành phần của PCR • DNA khuôn: mang trình tự cần nhân lên • 2 mồi tổng hợp oligonucleotide (mồi xuôi và mồi ngược) • dNTPs: dATP, dTTP, dGTP, dCTP • Polymerase chịu nhiệt • Mg2+: cofactor của enzyme • Dung dịch đệm: ổn định pH và lực ion của dung dịch phản ứng cho phù hợp với hoạt động của enzyme 8
Các giai đoạn trong phản ứng PCR Có 3 giai đoạn chính trong một phản ứng PCR và chúng được lặp lại từ 20-40 lần. Việc này được tự động hóa nhờ Thermo cycler, là thiết bị có khả năng tăng và giảm nhiệt độ của ống phản ứng trong thời gian ngắn. 1. Biến tính (denaturation): hai sợi của chuỗi xoắn kép được duỗi xoắn và tách nhau rnhờ nhiệt cao (94-95oC). 2. Gắn mồi (primer annealing): Nhiệt độ phản ứng được giảm xuống (55-50oC) để các mồi gắn vào các sợi DNA tương ứng theo nguyên tắc bổ sung của các base. 3. Kéo dài (extension): Phản ứng trùng hợp phân tử DNA được thực hiện nhờ enzyme DNA polymerase (65- 75oC) để kéo dài mạch tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung với sợi khuôn từ đầu 3’ – 5. 9
Chu kỳ phản ứng PCR Chu kỳ nhiệt: Hçn hîp Bước 1: 94o C, 30 giây ph¶n øng B¾t ®Çu chu kú míi Nh¾c ®i nh¾c l¹i n chu Bước 2: 94o C, 15 giây PCR (2) kú Bước 3: 55o C, 30 giây NhiÖt ®é G§ Bước 4: 72o C, 1.5 phút (oC) 1 Bước 5: lặp lại từ bước 2-4 G§ trong 35 lần G§ 3 Bước 6: 72o C, 10 min 2 Bước 7: 4o C f- bảo quản Bước 8: Kết thúc Thêi gian (phót) Chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 bước được lặp đi lặp lại nhiều lần. Nhờ vậy, trong vài giờ ta có thể thu được hàng triệu bản copy của một đoạn DNA nào đó, đủ cho các mục đích thí nghiệm khác nhau 10
Thực hiện phản ứng ống phản ứng PCR THERMOCYCLER
Biến t ính Gắn mồi K éo dài
Số bảnDNA copy DNA copies và số vs Cycle chu kỳ nhiệt number (2n - 2n)x 2500000 n = số chu kỳ 2000000 x = số bản sao của DNA khuôn DNA copies 1500000 DNAcopy Số bản 1000000 500000 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Số chu Cycle kỳ number
1 0 2 0 3 2 Khuôn DNA được biến đổi 4 4 thành 2 sợi đơn 5 8 (94oC, 5 phút 6 16 7 32 8 64 9 128 Gắn mồi vào 10 256 chuỗi DNA 11 512 (30-65oC) 12 1024 30 giây 13 2048 14 4096 15 8192 16 16.384 17 32.768 Chu trình PCR 18 65.536 19 131.072 Tổng hợp 20 265.144 Tách thành sợi chuỗi mới 21 524.288 đơn DNA (65-75oC, 2-5 22 1.048.576 (94oC, 30 giây) phút) 23 2.097.152 24 4.194.304 25 8.388.608 26 16.777.216 27 33.544.432
PCR animation 16
Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR  Ảnh hưởng của thành phần phản ứng  Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng  Ảnh hưởng của thiết bị và dụng cụ thực hiện PCR
Ảnh hưởng của thành phần phản ứng • DNA khuôn • Mồi • Enzyme • dNTPs • Mg2+
Ảnh hưởng của thành phần phản ứng Ảnh hưởng của DNA khuôn  Độ tinh sạch của DNA khuôn Không cần tinh sạch lắm Cần tránh các chất gây ức chế phản ứng  Hàm lượng sử dụng: 0.1 – 1 mg cho 100 mL phản ứng Hàm lượng ít: không đủ cho phản ứng khuếch đại Hàm lượng cao: sản phẩm không đặc hiệu  Độ dài của trình tự mục tiêu: quá dài có thể dẫn đến sai sót, hoặc không thực hiện được phản ứng  Hàm lượng GC của DNA khuôn: liên quan đến sự hình thành cấu trúc thứ cấp
https://www.soils.org/publications/cs/articles/46/3/1064