ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG VIỆC PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA E.COLI GÂY TIÊU CHẢY Ở NGƯỜI

Chia sẻ: Nguyễn Huy Hoàng | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:17

Thêm vào BST

Báo xấu

328
lượt xem 97
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu nhằm phát hiện các gen độc lực của 5 nhóm E.coli gây bệnh tiêu chảy ở người, làm tiền đề cho việc tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán các nhóm E.coli gây tiêu chảy.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG VIỆC PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA E.COLI GÂY TIÊU CHẢY Ở NGƯỜI

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC BỘ MÔN KHOA HỌC SỰ SỐNG ----------------- PHẠM THỊ NHÀN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG VIỆC PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA E.COLI GÂY TIÊU CHẢY Ở NGƯỜI ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC SINH VIÊN Người hướng dẫn khoa học: ThS. Nguyễn Phú Hùng THÁI NGUYÊN - 2010
NỘI DUNG BÁO CÁO 1. Mở đầu 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 3. Kết quả và thảo luận 4. Kết luận và kiến nghị
1. MỞ ĐẦU Tiêu chảy là một vấn đề sức khỏe toàn cầu. Một trong những nguyên nhân phổ biến gây tiêu chảy ở trẻ em là do vi khuẩn E.coli. Việc xác định nhanh các nhóm E.coli bằng các kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao sẽ có ý nghĩa rất quan trọng trong việc lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp cho bệnh nhân. Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định E.coli gây tiêu chảy. Trong đó, PCR là phương pháp được sử dụng hữu hiệu  Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài nhất. “Ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện các gen độc lực của E.coli gây tiêu chảy ở người”.
 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Sử dụng kỹ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu nhằm phát hiện các gen độc lực của 5 nhóm E.coli gây bệnh tiêu chảy ở người, làm tiền đề cho việc tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán các nhóm E.coli gây tiêu chảy.
2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU - Các chủng E.coli chuẩn Quốc tế do Phòng Vi khuẩn đường ruột - Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, gồm có: EPEC, EHEC1, EHEC2, EIEC, ETEC, EAEC và EC (chủng đối chứng không có gen độc lực). 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nuôi cấy Các qua đêm Tách Khuếch Điện di chủng trên DNA đại gen kiểm tra E.coli môi trường trực tiếp bằng sản chuẩn MPA đặc, từ phản ứng phẩm Quốc thu khuẩn lạc PCR trên gel tế khuẩn lạc agarose Hình 2.1. Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu
Bảng 2.1. Các trình tự mồi được sử dụng trong các phản ứng PCR Cặp Kích thước Gen m ồi Trình tự primer (5’ → 3’) sản phẩm độc lực (primer) PCR (bp) VT2 - F ACCGTTTTTCAGATTTTGCACATA vt2 298 VT2 - R TACACAGGAGCAGTTTCAGACAGT VT1 - F GAAGAGTCCGTGGGATTACG vt1 130 VT1 - R AGCGATGCAGCTATTAATAA LT - F TCTCTATGTGCATACGGAGC elt 322 LT - R CCATACTGATTGCCGCAAT eae - F CACACGAATAAACTGACTAAAATG eae 376 eae - R AAAAACGCTGACCCGCACCTAAAT IpaH - F GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCC IpaH 620 IpaH - R GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC EA - F CTGGCGAAAGACTGTATCAT EAST1 630 EA - R CAATGTATAGAAATCCGCTGTT
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước khử ion 12,5 2 PCR Buffer (10X) 2,5 3 dNTPs (25mM) 2 4 MgCl2 (25mM) 2,5 5 Mồi xuôi (10pM/mồi) 1 6 Mồi ngược (10pM/mồi) 1 7 DNA khuôn 3 8 Taq DNA polymerase (5 unit/µl) 0,5 Tổng thể tích 25
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ TÁCH DNA TRỰC TIẾP TỪ KHUẨN LẠC DNA được tách chiết trực tiếp từ khuẩn lạc E.coli bằng phương pháp của Cebula và cộng sự (1995) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm. Ưu điểm: - Tổng thời gian tách DNA là 25 phút - Không phải tiêu tốn nhiều hóa chất - Lượng DNA thu được là rất nhỏ, nên nó được sử dụng trực tiếp (3 µl/1 phản ứng) mà không cần tiến hành pha loãng Nhược điểm: DNA thu được không đủ để phát hiện bằng phương pháp điện di thông thường
3.2. KHUẾCH ĐẠI CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA CÁC NHÓM E.COLI 3.2.1. Gen độc lực eae M 1 2 3 4 5 6 7 872 bp 603 bp 376 bp 270 bp Hình 3.1. Kết quả khuếch đại gen eae M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EPEC; 2. ETEC; 3. EHEC1; 4. EAEC; 5. EHEC2; 6. EIEC; 7. EC
3.2.2. Gen độc lực vt1 M 1 2 3 4 5 6 7 130 bp Hình 3.2. Kết quả khuếch đại gen vt1 M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EHEC1; 2. EC; 3. EAEC; 4. EPEC; 5. EHEC2; 6. EIEC; 7. ETEC
3.2.3. Gen độc lực vt2 M 1 2 3 4 5 6 7 298 bp Hình 3.3. Kết quả khuếch đại gen vt2 M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EHEC1; 2. EHEC2; 3. EPEC; 4. ETEC; 5. EIEC; 6. EAEC; 7. EC
3.2.4. Gen độc lực elt M 1 2 3 4 5 6 7 322 bp Hình 3.4. Kết quả khuếch đại gen elt M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EPEC; 2. EHEC1; 3. EHEC2; 4. ETEC; 5. EAEA; 6. EIEC; 7. EC
3.2.5. Gen độc lực IpaH M 1 2 3 4 5 6 7 620 bp Hình 3.5. Kết quả khuếch đại gen IpaH M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EPEC; 2. EIEC; 3. EHEC1; 4. EHEC2; 5. ETEC; 6. EAEC; 7. EC
3.2.6. Gen độc lực EAST1 M 1 2 3 4 5 6 7 630 bp Hình 3.6. Kết quả khuếch đại gen EAST1 M. Marker ФX 174 cắt bằng Hae III; 1. EPEC; 2. EHEC1; 3. EHEC2;4. EIEC; 5. ETEC, 6. EAEC; 7. EC
Tóm tắt kết quả khuếch đại các gen độc lực của 5 nhóm E.coli Bảng 3.1. Kết quả khuếch đại các gen độc lực của 5 nhóm E.coli EPEC EHEC1 EHEC2 EAEC EIEC ETEC EC eae + + + - - - - vt1 - + - - - - - vt2 - - + - - - - IpaH - - - - + - - EAST1 - - - + - - - elt - - - - - + - Ghi chú: EHEC1 và EHEC2 là hai phân nhóm của nhóm EHEC + : Dương tính - : Âm tính
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. KẾT LUẬN Đã tách chiết được DNA tổng số của các nhóm vi khuẩn E.coli bằng phương pháp tách DNA trực tiếp từ khuẩn lạc, tiết kiệm đ ược nhi ều th ời gian và hoá chất nghiên cứu. Khuếch đại thành công các gen độc lực đặc trưng của 5 nhóm E.coli là: eae, vt1, vt2, IpaH, elt, EAST1. Kết quả nghiên cứu này là tiền đề cho nghiên cứu tiếp theo c ủa chúng tôi để tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán tác nhân gây bệnh là E.coli. 2. KIẾN NGHỊ Tiếp tục phát triển nghiên cứu, tối ưu hoá các phản ứng PCR đ ể có thể chẩn đoán E.coli trực tiếp trên các mẫu phân của bệnh nhân tiêu chảy.