THIẾT KẾ TRÌNH TỰ MỒI TRONG PHẢN ỨNG PCR BẰNG FASTPCR VÀ DNA CLUB

Chia sẻ: Vũ Minh Dương | Ngày: | Loại File: PPT | Số trang:47

Thêm vào BST

Báo xấu

820
lượt xem 140
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của bài học: Thiết kế được những trình tự primer cho những trình tự DNA khuôn (vi sinh vật, virus và các động vật khác); phân tích được những thông số của primer qua các phần mềm. PCR là một kỹ thuật duy nhất để khuếch đại một mẫu DNA mong muốn khuếch đại( ví dụ những đoạn gene của vi sinh vật, vi khuẩn hay những đoạn gene của người và những động vật khác).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: THIẾT KẾ TRÌNH TỰ MỒI TRONG PHẢN ỨNG PCR BẰNG FASTPCR VÀ DNA CLUB

THIẾT KẾ TRÌNH TỰ MỒI TRONG PHẢN ỨNG PCR BẰNG FASTPCR VÀ DNA CLUB
Mục tiêu của bài học  Thiết kế được những trình tự primer cho những trình tự DNA khuôn (vi sinh vật, virus và các động vật khác)  Phân tích được những thông số của primer qua các phần mềm 2 Tì kim rnh ự i họ m ế tì t snh c
Quá trình sao chép DNA trong tế bào 3 Gi it ệ mô họ ớ hiu n c
Qui trình phản ứng PCR Thu nhận mẫu Các vi sinh vật, động vật Kỹ thuật PCR lần đầu tiên được Mullis và cộng sự mô tả vào năm 1986 và cũng do chính phát minh này Mullis đã được trao giải nobel vào năm 1993 4 Gi it ệ mô họ ớ hiu n c
Thành phần trong phản ứng PCR Phản ứng PCR được thực hiện khi có:  DNA mẫu  Primers (mồi xuôi và ngược dài khoảng 18-30 bp không bắt cặp bổ sung )  Taq polymerase ( emzyme chịu nhiệt tách từ vi khuẩn suối mước nóng Thermus aquaticus )  4 loại deoxiribomucleotid triphọtphat (dATP , dCTP, dTTP , dGTP) ,  Dung dịch đệm và Mg2+ 5 Gi it ệ mô họ ớ hiu n c
MÁY PCR PCR là một kỹ thuật duy nhất để khuếch đại một mẫu DNA mong muốn khuếch đại (ví dụ những đoạn gene của vi sinh vật, vi khuẩn hay những đoạn gene của người và những động vật khác) 6 Gi it ệ mô họ ớ hiu n c
Nguyên tắc trong phản ứng PCR Biến tính Bắt cặp Kéo dài 7 Gi it ệ mô họ ớ hiu n c
Nguyên tắc trong phản ứng PCR Phản ứng PCR gồm có 3 giai đoạn: • Biến tính DNA mẫu T=940C • Bắt cặp mồi Tm = 550C-650C • Giai đoạn kéo dài, tổng hợp DNA mới T kéo dài =700C 8 Gi it ệ mô họ ớ hiu n c
Mục đích, nguyên tắc  Mồi là những đoạn nucleotide ngắn, bắt cặp bổ sung với đầu 5' hay đầu 3' của mạch DNA khuôn mẫu. Mồi được thiết kế dựa vào 2 vùng trình tự đã được biết, nằm ở hai đầu của đoạn gen cần khuếch đại. Forward primer Reverse primer Đoạn DNA cần khuếch đại 9 Gi it ệ mô họ ớ hiu n c
Primer là gì?  Primer là một đoạn ngắn oligonucleotide nó là khả năng bắt cặp bổ sung với DNA khuôn  Primer sẽ bắt cặp với đoạn DNA khuôn (DNA mục tiêu) cần khuếch đại số lượng lớn DNA 10 Tì kim rnh ự i họ m ế tì t snh c
Đặc tính của primer 1. Tính chuyên biệt 2. Tính ổn định nhiệt độ của phản ứng 3. Tính tương thích cặp primer 11 Gi it ệ mô họ ớ hiu n c
Tính chuyên biệt  Chỉ có duy nhất một vị trí bắt cặp của primer trên khuôn DNA. Template DNA 5’...TCAACTTAGCATGATCGGGTA...GTAGCAGTTGACTGTACAACTCAGCAA...3 ’ CAGTCAACTGCTAC GTTGAACGTA GTTGAACGTA  Primer càng dài thì nó càng thể hiện tính duy nhất và nhiệt độ nóng chảy, nhiệt độ bắt cặp càng cao. Để đảm bảo tính duy nhất chiều dài của primer 17-28 base.  Thành phần (G+C) trung bình khoảng từ 50-60% sẽ cho ta nhiệt độ lai Gi it ệ mô họ ớ hiu n c 12
Tính chuyên biệt Tỷ lệ G/C trung bình khoảng từ 50-60% sẽ cho ta nhiệt độ lai thích hợp 13 Gi it ệ mô họ ớ hiu n c
Nhiệt độ của primer 1. Nhiệt độ nóng chảy: Tmealt: Nhiệt độ nóng chảy là nhiệt độ của mồi khi chưa bắt cặp với DNA khuôn Tmprimer=59.9+0.41*(%GC)-600/(chiều dài nucleotide) khi mồi chưa bắt cặp với DNA, thường nhiệt độ nóng chảy từ 55-650C. 2. Nhiệt độ bắt cặp: Tanneal:Là nhiệt độ của đoạn mồi bắt cặp với DNA khuôn Tanneal= Tm-primer -40C 14 Gi it ệ mô họ ớ hiu n c
Tính ổn định  Nhiệt độ nóng chảy của mồi Tm và nhiệt độ bắt cặp của mồi T anneal là hai yếu tố quan trọng để đảm bảo phản ứng PCR thành công và thu được sản phẩm khuếch đại (một số lượng lớn bản sao của đoạn DNA dùng làm khuôn ban đầu).  Việc tính toán bằng phương pháp thủ công để kiểm tra các yêu cầu trên cho mỗi đoạn mồi dự định thiết kế là rất tốn thưòi gian và công sức. Công việc này trở nên dễ dàng và nhanh chóng nhờ các phần mềm thiết kế mồi. 15 Gi it ệ mô họ ớ hiu n c
Tính ổn định Cấu trúc kẹp tóc 16 Gi it ệ mô họ ớ hiu n c
Thiết kế mồi Trình tự DNA khuôn 1. Lấy các thông số từ phần Thiết kế mềm Thông số của Primer 2. Kiểm tra đặc phản ứng PCR hiệu của Primer bằng blast Các qui tắc chọn primer 17 Gi it ệ mô họ ớ hiu n c
Làm thế nào để biết trình tự khuôn  Giải trình tự DNA hoặc RNA của các sinh vật (chúng ta sẽ biết tự nucleotide của sinh vật) từ đó thiết kế phản ứng mồi theo trình tự đã giải.  Chúng ta có thể lấy trình tự nucleotide của các sinh vật trên cơ sở dữ liệu NCBI rồi từ đó thiết kế những primer qua những phần mềm thiết kế PCR 18 Gi it ệ mô họ ớ hiu n c
Trình tự DNA khuôn - Trình tự đích quan trọng trong phát hiện vi sinh vật - Trình tự vừa có vùng bảo tồn cao cho một nhóm vi sinh vật và vừa có vùng biến động đặc trưng cho từng loài riêng biệt Ví dụ 1: Các loài Ecoli co gen mã hóa ngoại độc tố: ST (heat stable) và heat labile (LT) bảo tồn cao Ví dụ 2: Enterotoxigenicm kim trình tự si(ETEC), Enteropathogenic19 Tì E. coli nh ọ ế hc
Tính tương thích Mồi làm việc theo cặp, mồi xuôi và mồi ngược. Chúng sử được sử dụng trong cùng điều kiện của phản ứng PCR. ột đặc điểm phải chú ý nhất về sự hòa hợp này là nhiệt độ bắt cặp (Tanneal) Nhiệt độ này thể hiện sự tương thích giữa mồi xuôi và mồi ngược 20 Gi it ệ mô họ ớ hiu n c