Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật

Chia sẻ: Nguyễn Xuân Vũ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:13

Thêm vào BST

Báo xấu

1.216
lượt xem 222
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia thực phẩm có giá trị. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ. Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật

1 Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật Nguyễn Hoàng Lộc Viện Tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế 1. Các hợp chất thứ cấp thực vật Thực vật là nguồn cung cấp các hợp chất dùng làm dược liệu hoặc phụ gia thực phẩm có giá trị. Những sản phẩm này được biết như là các chất trao đổi thứ cấp, thường được hình thành với một lượng rất nhỏ trong cây và chức năng trao đổi chất chưa được biết đầy đủ. Chúng dường như là sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật. Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20 (Rao và cs 2002). Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside. Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm: codein, nicotine, caffeine và morphine. Một số loài thực vậ - - (họ Solanaceae). Người ta thường gặp trong một cây tập hợp các alkaloid có cấu trúc hóa học gần giống nhau. Đôi khi toàn câ - - (họ Taxaceae). dụng lên mạch máu (hydrastin, ephedrin...), một số khác tác dụng dụng làm thuốc chữa bệnh (Misawa, 1994). Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid, được sử dụng như chất mùi, chất thơm và dung môi. Giống như những , ví dụ monoterpene chứa 2 đơn vị isoprene, sesquiterpene chứa 3 đơn vị isoprene, diterpene chứa 4 đơn vị isoprene (Lee 2001). Các glycoside bao gồm các hợp chất phenol và flavonoid, saponin và các cyanogenic glycoside, một số trong chúng được sử dụng làm thuốc nhuộm, chất mùi thực phẩm và dược phẩm (Lee 2001). 2. Nuôi cấy tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các hợp chất có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học. Những năm gần đây, sự phát triển của các hợp chất thứ cấp quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi nhất trong lĩnh vực nghiên cứu này. Ưu thế về mặt nguyên lý của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung
2 cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy (Mulbagal and Tsay, 2004). Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái. Nhiều hợp chất thứ cấp được sản xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mô có khả năng phân hóa cao như rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành không xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất thứ cấp có khuynh hướng ngưng tạo thành trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có sự tiếp xúc với môi trường khác với các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối để tạo thành các chất thứ cấp (Lee 2001). Nuôi cấy tế bào huyền phù thường khởi đầu bằng cách đặt các khối callus dễ vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy). Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáy của môi trường. Sau một thời gian ngắn trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các mẫu nuôi cấy còn thừa chưa phát triển và các tế bào chết. Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền phù hoàn hảo, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. Mức độ tách rời của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thành phần môi trường (Misawa, 1994). Bên cạnh nuôi cấy tế bào huyền phù, nuôi cấy callus (trên môi trường rắn) có ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu nhưng nhược điểm là thể tích nuôi cấy bé nên khó phát triển ở quy mô công nghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn dinh dưỡng, những sản phẩm do mẫu nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ xung quanh dẫn đến làm chậm sự sinh trưởng của tế bào. Vì thế, nuôi cấy tế bào huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì có thể duy trì và thao tác tương tự với các hệ thống lên men vi sinh vật ngập chìm trong môi trường lỏng. 3. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật Sự tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật giúp nhân giống các cây trồng có giá trị và tách chiết các hóa chất quý hiếm mang lại nhiều ý nghĩa về mặt thương mại. Phương pháp này sẽ mở rộng và tăng khả năng thu hồi các hóa chất giá trị có nguồn gốc thực vật, một sự thay thế từ quy mô nông nghiệp truyền thống lên quy mô công nghiệp trong sản xuất các hợp chất thứ cấp (Dicosmo và Misawa 1995). Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được khởi xướng từ cuối những năm 60 của thế kỷ 20 như là một công cụ hữu ích để nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật. Kỹ thuật này được phát triển với mục tiêu cải thiện hiệu suất các sản phẩm có hoạt tính sinh học. Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên những lý do sau: (1) tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và điều kiện đất trồng; (2) phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng); (3) có thể chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau; (4) với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng của
3 tế bào và điều hòa quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên. Bên cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy nuôi cấy tế bào huyền phù của thực vật cũng được sử dụng để sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp (Fisher và cs 1999). Trong nuôi cấy tế bào, việc chọn lựa cẩn thận các tế bào có khả năng phát triển và điều kiện nuôi cấy tối ưu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy một vài sản phẩm ở mức cao hơn. Để thu được hiệu suất cao cho khai thác thương mại, người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau trong nỗ lực tập trung vào việc kích thích hoạt động sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy (Rao 2000, Dixon 1999). Tế bào nuôi cấy tích lũy một lượng lớn hợp chất thứ cấp chỉ khi ở những điều kiện đặc biệt như (1) chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp, (2) chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao, (3) bổ sung tiền chất nuôi cấy và (4) các chất kích kháng bảo vệ thực vật (Mulbagal and Tsay 2004). Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy. Các thông số hóa học và vật lý như thành phần và pH môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc khuấy, và ánh sáng ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiên cứu nhiều (Goleniowski và Trippi 1999, Lee và Shuler 2000, Wang và cs 1999). Một vài sản phẩm tích lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu. Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy. Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao. Các tế bào thực vật trong nuôi cấy là một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập. Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy đã được Berlin và Sasse công bố năm 1985, và sau đó phương thức này đã được ứng dụng rộng rãi. Chẳng hạn, một dòng tế bào của cây bát tiên (Euphorbia milli) sau 24 lần chọn lọc đã tích lũy gấp khoảng 7 lần lượng anthocyanin được sản xuất từ nuôi cấy tế bào bố mẹ (Yamamoto và cs 1982). Yamada và Sato (1981) đã chọn lọc được một dòng tế bào của Coptis japonica có khả năng sinh trưởng gấp 6 lần trước đây sau 3 tuần nuôi cấy và lượng berberin đạt tới 1,2 g/L. Cung cấp tiền chất (precursor feeding). Bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy cũng có thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng lượng sản phẩm cuối cùng. Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ. Tăng cường kích thích hoặc bổ sung tiền chất hoặc các hợp chất tương tự mang lại hiệu quả trong nhiều trường hợp (Silvestrini và cs 2002; Moreno và cs 1993). Chẳng hạn, bổ sung phenylalanine khi nuôi cấy tế bào huyền phù cây Salvia officinalis đã kích thích tạo ra rosmarinic acid, cung cấp ferulic acid trong nuôi cấy tế bào cây Vanilla planifolia đã tăng tích lũy valnillin, hoặc bổ sung leucine dẫn đến việc tăng các monoterpen dễ bay hơi trong nuôi cấy Perilla frutiscens (Mulbagal and Tsay 2004). Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation). Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh. Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp. Sử dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử dụng các elicitor sinh học và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích hình thành các
4 hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao (DiCosmo và Tallevi, 1985). 4. Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học Những năm gần đây, thuốc truyền thống trở thành một đề tài quan trọng mang tính toàn cầu. Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trong điều trị nhưng các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc vẫn được dùng phổ biến do yếu tố lịch sử và văn hóa. Theo các đánh giá về mặt khoa học, nhiều loài thảo mộc có thể ứng dụng trong y học. Vấn đề đặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc đang biến mất nhanh chóng do sự không ổn định của điều kiện môi trường và các yếu tố khác. Như vậy, thật khó có một nguồn nguyên liệu đủ lớn để tách chiết các hợp chất thứ cấp dùng trong dược phẩm. Điều này cảnh báo cho ngành công nghiệp cũng như các nhà khoa học cần tính đến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật như một sự thay thế khác để cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm này. Bảng 2 giới thiệu sản phẩm của một số cây dược liệu quan trọng đã được sản xuất từ nuôi cấy callus và tế bào huyền phù (Mulbagal and Tsay 2004). Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới có khả năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cây thông đỏ Pacific (Taxus brevifolia). Đến năm 1983, taxol được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư buồng trứng. Sau đó, FDA đã cho phép sử dụng taxol trong điều trị các trường hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú. Ngoài ra, taxol cũng có tác dụng đối với các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác (Wickremesinhe và Arteca 1993 và 1994), và nó được xem như là chất đầu tiên của một nhóm mới trong hóa trị liệu ung thư (Cragg và cs 1993). Tuy nhiên, sử dụng taxol trong điều trị bị hạn chế do chỉ tách chiết được một lượng rất ít từ vỏ của cây thông đỏ tự nhiên. Lớp vỏ mỏng này chứa khoảng 0,001% taxol tính theo khối lượng khô. Ở cây 100 năm tuổi trung bình chỉ thu được 3 kg vỏ (khoảng 300 mg taxol), lượng này ứng với một liều trong toàn đợt điều trị ung thư. Sở dĩ nguồn taxol khan hiếm như vậy là do các cây tự nhiên sinh trưởng rất chậm (Cragg và cs 1993). Do đó, cần có những nguồn khác để thay thế mới đáp ứng được nhu cầu sử dụng ngày càng tăng trong y học. Nuôi cấy tế bào các loài Taxus được xem như là một phương pháp ưu thế để cung cấp ổn định nguồn taxol và dẫn xuất taxane của nó (Slichenmyer và Von Hoff 1991). Hiện nay, việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào các loài Taxus đã trở thành một trong những ứng dụng rộng rãi của nuôi cấy tế bào thực vật và đang tạo ra các giá trị thương mại to lớn. Fett- Neto và cs (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và một số yếu tố khác lên sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T. cuspidata. Srinivasan và cs (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào của T. baccata. Lee và cs (1995) đã nghiên cứu sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây T. mairei, một loài được tìm thấy tại Đài Loan ở độ cao 2000 m so với mực nước biển. Các dòng tế bào thu được từ callus có nguồn gốc thân và lá, và một trong những dòng này sau khi được bổ sung các tiền chất vào môi trường nuôi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ có khoảng 200 mg taxol. Tsay và cs (1994) đã nghiên cứu sản xuất imperatorin từ nuôi cấy tế bào huyền phù của cây Angelica dahurica var. Formosana. Đây là một loài cây bản địa lâu năm ở Đài Loan, được
5 sử dụng để chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến. Imperatorin được xem là thành phần hoạt động chính trong điều trị các bệnh về da. Nếu sản xuất cây Angelica dahurica var. formosana bằng phương pháp nhân giống truyền thống sẽ mất một thời gian dài mới có thể đáp ứng được nhu cầu. Vì vậy, phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù sản xuất imperatorin đã được chọn lựa sử dụng. Nghiên cứu đã cho thấy trong chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù, sản phẩm imperatorin đạt giá trị cực đại trong khoảng giữa 10 và 14 ngày. Benzylamino purine ở nồng độ từ 0,5-1,0 mg/L đã kích thích tổng hợp imperatorin, một tỷ lệ thích hợp ammonium nitrate và nitrate (2:1) cũng như tăng nồng độ phosphate từ 1-2 mM sẽ làm tăng lượng impertatorin. Glucose là nguồn carbon tốt hơn saccharose và fructose về hiệu quả sản xuất imperatorin. Vai trò của elicitor cũng đã được khảo sát, bổ sung thêm vanadyl sulphate trong môi trường sẽ tăng tích lũy imperatorin, quyết định nồng độ và thời gian sinh trưởng của tế bào. Bổ sung vanadyl sulphate ở nồng độ 30 mg/L vào môi trường đã cho hiệu quả tốt nhất sau 10 ngày nuôi cấy. Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7 vào môi trường, quá trình tổng hợp imperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 10. Hàm lượng imperatorin sản xuất bởi phương thức này đạt 460 µg khối lượng tươi cao hơn đối chứng 140 lần. Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây Coptis japonica và vỏ của cây Phellondendron amurense. Berberine chloride được sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêu hóa. Để thu được nguyên liệu thô từ rễ cây Coptis phải mất 5-6 năm. Yamada và Sato (1981) C. japonica. Sau đó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản) đã cải thiện được năng suất bằng cách thêm 10-8 M gibberellic acid vào môi trường, hiệu suất rất nhiều tới 1,66 g/L (Misawa 1994). Rễ của cây Panax ginseng, một loại thảo dược lâu năm còn gọi là nhân sâm được sử dụng rộng rãi như một vị thuốc bổ, một dược phẩm quý giá, có tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, bệnh đái đường, sapogenin khác nhau. Trong đó, ginsenoside-Rb có hoạt tính an thần, còn Rg có hoạt tính kích thích. Từ 1973, Furuya và cs đã nuôi cấy mô callus P. ginseng để phân lập saponins và sapogenins. Năm 1994, Choi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy P. ginseng trên quy mô công nghiệp. Đến nay, đây là một trong các đối tượng được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Merkli và cs (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum bằng cách gây nhiễm chủng A4 của Agrobacterium rhizogenes. Các rễ tơ này đã sản xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp (semi-synthesis) của các hormone steroid. Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,040 % khối lượng khô gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A4 8 tháng tuổi (0,024 %). Các tác giả này đã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol, pH môi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin. Kết quả cho thấy bổ sung 40 mg/L chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ tăng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần so với đối chứng. Yeh và cs (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây Dioscorea doryophora. Phương pháp này được sử dụng như một cách thay thế quá trình tổng hợp steroid. Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập bằng cách đưa callus vào môi trường có 0,2 mg/L 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Nồng độ saccharose tối thích cho tổng hợp diosgenin là 3%. Lượng diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2% khối
6 lượng khô. Sản xuất diosgenin từ cây D. doryophora bằng nuôi cấy tế bào huyền phù hiện nay đã được ứng dụng trên quy mô công nghiệp. Gentiana davidii var. formosana là thảo mộc bản địa sống lâu năm ở Đài Loan. Từ xưa nó đã được sử dụng như một loại thuốc thô sơ trong y học cổ truyền Trung Quốc nhằm ngăn chặn béo phì và lão hóa, bảo vệ phổi khỏi các chất độc (Zheng và cs 1997). Secoiridoid glycoside là hợp chất chính với đặc tính y học ở trong rễ của chi Gentiana (Skrzypczak và cs 1993). Chueh và cs (2000) nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù của G. davidii var. formosa để sản xuất gentipicroside và swertiamarin, hai dược chất quan trọng. Tế bào huyền phù sinh trưởng tối ưu khi nuôi cấy callus trong môi trường bổ sung 1,2 mg/L kinetin và 3% saccharose, pH 4,2-5,2, tốc độ lắc 80-100 vòng/phút. Sự tích lũy cao nhất 2 hợp chất swertiamarin và gentipicroside trong tế bào được xác định lần lượt sau 12 và 24 ngày nuôi cấy. Miyasaka và cs (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi cấy callus cây Salvia miltiorrhiza. Salvia là một chi quan trọng của họ Lamiaceae và một vài loài của Salvia mọc hoang dại trên khắp thế giới dùng làm thuốc dân gian. Hiệu quả của BA đối với việc hình thành cryptotanshinone trong nuôi cấy callus S.miltiorrhiza đã được khảo sát. Callus sơ cấp được tạo ra từ nuôi cấy mảnh lá ở trong tối trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D. Callus sau đó phát triển nhanh hơn trên môi trường có 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA. Kết quả phân tích HPLC cho thấy callus chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối lượng khô). Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cấy cho kết quả là lượng cryptotanshinone trong callus tăng lên. Nồng độ cao nhất của cryptotanshione thu được trong callus nuôi cấy trên môi trường có 0,2 mg/L BA trong 6 ngày là 4,59 mg/g khối lượng khô (Wu và cs 2003). chi thuộc họ Solanaceae như: Duboisia, Scopolia, Atropa, Hyoscyamus và Datura. những năm 1960 (Misawa, 1994). Tuy nhiên, hàm lượng của scopolamine và hyoscyamine trong tế bào nuôi cấy thường rất thấp. Sau này, Tabata và cs (1971) đã bổ sung tropic acid vào dịch huyền phù nuôi cấy Scopolia japonica lên 15 lần. Shikonin, một loại sắc tố đỏ có khả năng diệt khuẩn, có trong rễ cây Lithospermum erythrorhizon . Tuy nhiên, người ta đã tạo được dòng tế bào rễ cây Lithospermum có khả năng tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất shikonin. Công nghệ này cho phép trong một chu kỳ nuôi cấy thu hoạch tới 5 kg hoạt chất và giúp giảm nhiều giá thành của shikonin. Podophyllotoxin là một aryltetralin lignan chống khối u được tìm thấy ở các cây Podophyllum peltatum và Podophyllum hexandrum. Nó cũng được dùng để tổng hợp các dẫn xuất etoposide và teniposide, sử dụng rộng rãi trong điều trị chống khối u (Issell và cs 1984). Tuy nhiên, trong tự nhiên những cây này sinh trưởng rất chậm và vì thế đã hạn chế việc cung cấp podophyllotoxin, bắt buộc chúng ta phải hướng tới một phương thức thay thế khác. Nuôi cấy tế bào để sản xuất podophyllotoxin đã được Kadkade và cs thực hiện lần đầu tiên vào năm 1981 và 1982. Woerdenberg và cs (1990) đã dùng một phức hợp precursor là coniferyl alcohol
7 và b-cyclodextrin bổ sung trong môi trường nuôi cấy tế bào huyền phù của P. hexandrum. Bổ sung phức hợp 3 mM coniferyl alcohol đã tăng hiệu suất podophyllotoxin lên 0.013% theo khối lương khô, trong khi các nuôi cấy không có precursor chỉ sản xuất được 0.0035% podophyllotoxin. Smollny và cs (1992) đã thông báo callus và tế bào huyền phù của Lilium album đã sản xuất được 0.3% podophyllotoxin. Kết luận Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ra một bước tiến xa trong khoa học thực vật. Việc phát triển và sử dụng các công cụ di truyền cũng như sự hiểu biết ngày càng sâu sắc hơn về bản chất của tế bào và các phương thức điều hòa quá trình chuyển hóa trao đổi chất thứ cấp là cơ sở cho việc sản xuất chúng ở quy mô thương mại. Do nhu cầu sử dụng các sản phẩm tự nhiên trong y-dược ngày càng tăng nhưng sản lượng của chúng ở cây trồng tự nhiên lại rất thấp đã thúc đẩy sự phát triển không ngừng của công nghệ nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn. Tuy nhiên, các con đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn trong thực vật cũng như trong nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn là rất phức tạp. Vì vậy, các thông tin ở mức độ tế bào và phân tử của các quá trình chuyển hóa là rất cần thiết cho sự phát triển của sản xuất công nghiệp. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện ở các điều kiện khác nhau để giải thích các hiện tượng xuất hiện trong quá trình sản xuất các chất trao đổi thứ cấp từ các tế bào thực vật nuôi cấy in vitro. Các kết quả này cũng đã cho thấy các hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật có tiềm năng rất lớn cho việc khai thác thương mại các chất trao đổi thứ cấp. Bảng 2. Các hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy mô và tế bào thực vật (Mulbagal and Tsay 2004) Loài thực vật Hợp chất thứ cấp Dạng nuôi Tham khảo cấy Agave amaniensis Saponins Callus Andrijany và cs 1999 Ailanthus altissima Alkaloids Huyền phù Anderson và cs 1987 Ailanthus altissima Canthinone alkaloids Huyền phù Anderson và cs 1986 Allium sativum Alliin Callus Malpathak và David 1986 Aloe saponaria Tetrahydroanthracene Huyền phù Yagi và cs 1983 glucosides Ambrosia tenuifolia Altamisine Callus Goleniowski và Trippi 1999 Anchusa officinalis Rosmarinic alkaloids Huyền phù De-Eknamkul và Ellis 1985 Brucea javanica Canthinone alkaloids Huyền phù Liu và cs 1990 Bupleurum falcatum Saikosaponins Callus Wang và Huang 1982
8 Camellia sinensis Theamine, dẫn xuất của Huyền phù Orihara và Furuya 1990 -glutamyl Canavalia ensiformis L-Canavanine Callus Ramirez và cs 1992 Capsicum annuum Capsaicin Huyền phù Johnson và cs 1990 Cassia acutifolia Anthraquinones Huyền phù Nazif và cs 2000 Catharanthus roseus Indole alkaloids Huyền phù Moreno và cs 1993 Catharanthus roseus Catharanthine Huyền phù Zhao và cs 2001 Choisya ternata Furoquinoline alkaloids Huyền phù Sejourne và cs 1981 Chrysanthemum Pyrethrins Callus Rajasekaran và cs 1991 cinerariaefolium Chrysanthemum Chrysanthemic acid và Huyền phù Kuel và cs 1985 cinerariaefolium pyrethrins Cinchona L. Alkaloids Huyền phù Koblitz và cs 1983 Cinchona robusta Robustaquinones Huyền phù Schripsema và cs 1999 Cinchona sp. Anthraquinones Huyền phù Wijnsma và cs 1985 Cinchona succirubra Anthraquinones Huyền phù Khouri và cs 1987 Citrus sp. Naringin, Limonin Callus Barthe và cs 1987 Coffea arabica Caffeine Callus Waller và cs 1983 Cornus kousa Polyphenols Huyền phù Ishimaru và cs 1993 Corydalis ophiocarpa Isoquinoline alkaloids Callus Iwasa và Takao 1982 Croton sublyratus Plaunotol Callus Morimoto và Murai 1989 Cruciata glabra Anthraquinones Huyền phù Dornenburg và Knorr 1996 Cryptolepis buchanani Cryptosin Callus Venkateswara và cs 1987 Digitalis purpurea Cardenolides Huyền phù Hagimori và cs 1982 Dioscorea deltoidea Diosgenin Huyền phù Heble và Staba 1980 Dioscorea doryophora Diosgenin Huyền phù Huang và cs 1993 Duboisia leichhardtii Tropane alkaloids Callus Yamada và Endo 1984 Ephedra spp. L-Ephedrine, D- Huyền phù O’Dowd và cs 1993 pseudoephedrin Eriobotrya japonica Triterpenes Callus Taniguchi và cs 2002 Eucalyptus tereticornis Sterol và hợp chất Callus Venkateswara và cs 1986 phenolic Eucommia ulmoides Chlorogenic acid Huyền phù Wang và cs 2003
9 Fumaria capreolata Isoquinoline alkaloids Huyền phù Tanahashi và Zenk 1985 Gentiana sp. Secoiridoid glycosides Callus Skrzypczak và cs 1993 Ginkgo biloba Ginkogolide A Huyền phù Carrier và cs 1991 Glehnia littoralis Furanocoumarin Huyền phù Kitamura và cs 1998 Glycyrrhiza echinata Flavonoids Callus Ayabe và cs 1986 Glycyrrhiza glabra var. Triterpenes Callus Ayabe và cs 1990 glandulifera Hyoscyamus niger Tropane alkaloids Callus Yamada và Hashimoto 1982 Isoplexis isabellina Anthraquinones Huyền phù Arrebola và cs 1999 Linum flavum 5-Methoxypodophyllo- Huyền phù Uden và cs 1990 toxin Lithospermum erythrorhizon Dẫn xuất của shikonin Huyền phù Fujita và cs 1981 Lithospermum erythrorhizon Dẫn xuất của shikonin Huyền phù Fujita và cs 1990 Lycium chinense Cerebroside Huyền phù Jang và cs 1998 Morinda citrifolia Anthraquinones Huyền phù Zenk và cs 1975 Morinda citrifolia Anthraquinones Huyền phù Bassetti và cs 1995 Mucuna pruriens L-DOPA Huyền phù Wichers và cs 1993 Mucuna pruriens L-DOPA Callus Brain K. R. 1976 Nandina domestica Alkaloids Callus Ikuta và Itokawa 1988 Nicotiana rustica Alkaloids Callus Tabata và Hiraoka 1976 Nicotiana tabacum Nicotine Huyền phù Mantell và cs 1983 Nothapodytes foetida Camptothecin Callus Thergane và cs 2003 Ophiorrhiza pumila Camptothecin dạng Callus Kitajima và cs 1998 alkaloids Panax ginseng Saponins và sapogenins Callus Furuya và cs 1973 Panax notoginseng Ginsenosides Huyền phù Zhong và Zhu 1995 Papaver bracteatum Thebaine Callus Day và cs 1986 Papaver somniferum Morphine, Codeine Huyền phù Siah và Doran 1991 Peganum harmala Β-Carboline alkaloids Huyền phù Sasse và cs 1982 Phytolacca americana Betacyanin Huyền phù Sakuta và cs 1987 Picrasma quassioides Quassin Huyền phù Scragg và Allan, 1986 Podophyllum hexandrum Podophyllotoxin Huyền phù Uden và cs 1989, Chattopadhyay và cs
10 2002 Polygala amarella Saponins Callus Desbene và cs 1999 Portulaca grandiflora Betacyanin Callus Schroder và Bohm 1984 Polygonum hydropiper Flavonoids Huyền phù Nakao và cs 1999 Ptelea trifoliata Dihydrofuro [2,3-b] Callus Petit-Paly và cs 1987 quinolinium alkaloids Rauwolfia sellowii Alkaloids Huyền phù Rech và cs 1998 Rauwolfia serpentina Reserpine Huyền phù Yamamoto và Yamada, 1986 R. serpentina × Rhazya 3-Oxo-rhazinilam Callus Gerasimenko và cs 2001 stricta Ruta sp. Acridone, furoquinoline Callus Baumert và cs 1992 alkaloids và coumarins Salvia fruticosa Rosmarinic acid Callus và Karam và cs 2003 huyền phù Salvia miltiorrhiza Lithospermic acid B và Callus Morimoto và cs 1994 rosmarinic acid Salvia miltiorrhiza Cryptotanshinone Callus Morimoto và cs 1994 Sapium sebiferum Tannin Callus và Neera và Ishimaru, 1992 huyền phù Scopolia parviflora Alkaloids Callus Tabata và cs 1972 Scutellaria columnae Phenolics Callus Stojakowska và Kisiel 1999 Solanum chrysotrichum Spirostanol saponin Huyền phù Villarreal và cs 1997 Solanum laciniatum Solasodine Huyền phù Chandler và Dodds 1983 Solanum paludosum Solamargine Huyền phù Badaoui và cs 1996 Stizolobium hassjoo L-DOPA Huyền phù Huang và cs 2002 Tabernaemontana Alkaloids Huyền phù Sierra và cs 1992 divaricata Taxus spp. Taxol Huyền phù Wu và cs 2001 Taxus baccata Taxol, baccatin III Huyền phù Cusido và cs 1999 Taxus cuspidata Taxoids Huyền phù Ketchum và cs 2003 Tecoma sambucifolium Phenylpropanoid Callus Pletsch và cs 1993 glycosides
11 Thalictrum minus Berberin Huyền phù Kobayashi và cs 1987 Thalictrum minus Berberin Huyền phù Nakagawa và cs 1986 Torreya nucifera var. Diterpenoids Huyền phù Orihara và cs 2002 radicans Trigonella foenumgraecum Saponins Huyền phù Brain và Williams 1983 Tài liệu tham khảo 1. Berlin J, Sasse F (1985) Selection and screening techniques for plant cell cultures. Advanced Biochemistry and Engineering 31: 99-132. 2. Bruneton J (1995) Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants. Intercept UK, 522. 3. Choi KT, Ahn IO, Park JC (1994) Production of ginseng saponin in tissue culture of ginseng (Panax ginseng C.A. Mayer). Russian Journal of Plant Physiology. 41: 784-788. 4. Chueh FS, Chen CC, Sagare AP, and Tsay HS (2000) Quantitative determination of secoiridoid glucoside in in vitro propagated plants of Gentiana davidii var. formosana by high performance liquid chromatography. Planta Medica 67: 70-73. 5. Cragg GM, Schepartz SA, Suffuess M, Grever MR (1993) The taxol supply crisis. New NCI policies for handling the large-scale production of novel natural product anticancer and anti-HIV agents, Journal of Natural Products 56: 1657-1668. 6. Dicosmo F and Tower GHN (1984) Stress and secondary metabolism in ciltured plant cells. In: Recent Adv Phytochem 18 (eds) Timmerman SC and Loewus FA. Plenum Press, NewYork: 97- 175. 7. Dicosmo F, Misawa M (1995) Plant cell and tissue culture: Alternatives for metabolite production, Biotechnology Advance 13 (3): 425-453. 8. Dixon RA (1999) Plant natural products: the molecular genetic basis of biosynthetic diversity. Current Opinion in Biotechnology 10: 192-197. 9. Fett-Neto AG, Stewart JM, Nicholson SA, Pennington JJ, and DiCosmo F (1994) Improved taxol yield by aromatic carboxylic acid and and amino acid feeding to cell cultures of T. cuspidata. Biotechnology Bioengineering 44: 967-971. 10. Fischer R, Liao YC, Hoffmann K, Schillberg S, Emans N (1999) Molecular farming of recombinant antibodies in plants. Biological Chemistry 380: 825-839. 11. Furuya T, Kojima H, Syono K, Ishii T, Uotani K (1973) Isolation of saponins and sapogenins from callus tissue of Panax ginseng. Chem Pharm Bull 21(1): 98-101. 12. Goleniowski M, Trippi VS (1999) Effect of growth medium composition on psilostachyinolides and altamisine production. Plant Cell Tissue and Organ Culture 56: 215-218. 13. Hu ZB and Alfermann AW (1993) Diterpenoid production in hairy root cultures of Salvia miltiorrhiza. Phytochemistry 32: 699-703. 14. Issell BF, Rudolph AR, and Louie AC (1984) Etoposide (VP-16-213): An overview. In BF Issell, FM Muggia, and SK Carter (eds.), Etoposide (VP-16-213)-Current status and new developments. Academic Press Inc, Orlando. 15. Kadkade PG (1981) Formation of podophyllotoxin by Podophyllum peltatum tissue cultures. Naturwiss 68: 481-482. 16. Kadkade PG (1982) Growth and podophyllotoxin production in callus tissues of Podophyllum peltatum. Plant Sci Lett 25: 107-115. 17. Lee JM (2001) Biochemical Engineering. Prentice Hall, Inc. USA.
12 18. Lee CY, Lin FL, Yang CT, Wang LH, Wei HL, and Tsay HS (1995) Taxol production by cell cultures of Taxus mairei. Proc. Symp. on Development and Utilization of Resources of Medicinal Plants in Taiwan, Taiwan Agricultural Research Institute, Taiwan. TARI Special Publication 48: 137-148. 19. Lee CWT, Shuler ML (2000) The effect of inoculum density and conditioned medium on the production of ajmalcine and catharanthine from immobilizes Catharanthus roseus cells. Biotechnology Bioengineering 67: 61-71. 20. Merkli A, Christen P, and Kapetanidis I (1997) Production of diosgenin by hairy root cultures of Trigonella foenum-graecum L. Plant Cell Reports 16(9): 632-636. 21. Misawa M (1994), “Plant tissue culture: An alternative for production of useful metabolite”, FAO Agricultural services bulletin, 108. 22. Miyasaka H, Nasu M, and Yoneda K (1989) Salvia miltiorrhiza: In vitro production of cryptotanshinone and feruginol. In: Biotechnology in agriculture and forestry. 7, Medicinal and Aromatic Plants II ed. By Bajaj YPS. Springer-Verlag Berlin, Heidelberg: 417- 430. 23. Moreno PRH, Heijden R, Verpoorte R (1993) Effect of terpenoid precusor feeding and elicitation on formation of indole alkaloids in cell suspension cultures of Catharanthus roseus. Plant Cell Reports, 12: 702-705. 24. Mulbagal V, Tsay HS (2004) Plant cell cultures-an alternative and efficient source for the production of biologically important secondary metabolites. International Journal of Applied Science and Engineering 2(1): 29-48. 25. Rao SR (2000) Biotechnological production of phyto-pharmaceuticals. Journal of Biochemistry Molecular Biology Biophysics 4: 73-102. 26. Shimomura K, Kitazawa T, Okamura N, and Yagi A (1991) Tanshinone production in adventitious roots and regenerates of Salvia miltiorrhiza. Journal of Natural Products 54: 1583. 27. Skrzypczak L, Wesolowska M, and Skrzypczak E (1993) Gentiana species XII: In vitro culture, regeneration, and production of secoirridoid glucosides. In Y.P.S. Bajaj (ed.), Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol. 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 172-186. 28. Slichenmyer WJ, Von Horf DD (1991) Taxol: a new and effective anticancer drug. Anti-Cancer Drugs 2: 519-530. 29. Smollny T, Wichers H, De Rijk T, Van Zwam A, Shasavari A, and Alfermann AW (1992) Formation of lignans in suspension cultures of Linum album. Planta Med Suppl 58: A622. 30. Srinivasan V, Pestchanker L, Hirasuma MT, Taticek RA, and Shuler ML (1995) Taxol production in bioreactors; kinetics of biomass accumulation, nutrient uptake, and taxol production by cell suspensions of Taxus baccata. Biotechnol Bioeng 47: 666-676. 31. Silvestrini A, Pasqua S, Botta B, Monacelli B, Heijden R, Verpoorte R (2002) Effect of alkaloid precusor feeding on a Camptotheca acuminata cell line. Plant Physiology and Biochemistry 40: 749-753. 32. Tabata M, Yamamoto H, and Hiraoka N (1972) Les Cultures de Tissus de Plantes. Colloques internationaux de CNRS. No 193. 33. Tsay HS, Chang WD, Chen CC, and Chang YS (1994) The production of imperatorin from Angelica dahurica var. formosana by cell suspesion culture. J Agric Assoc China. 168: 32-48. 34. Tsay HS (1999) Tissue culture technology of medicinal herbs and its application of medicinal herbs and its application in Taiwan. In: CH Chou, GR Waller, and C Reinhardt (eds.), Biodiversity and Allelopathy: from Organisms to Ecosystems in the Pacific. Academia Sinica, Taipei, Taiwan. 137-144. 35. Verpoorte R (1998) Exploration of nature’s chemodiversity: the role of secondary metabolites as leads in drug development. Drug Discovery Today 3: 232-238.
13 36. Yamada Y, and Sato F (1981) Production of berberine in cultured cells of Coptis japonica. Phytochemistry 20: 545-547. 37. Yamamoto Y, Mizuguchi R, Yamada Y (1982) Selection of a high and stable pigment-producing strain in cultured Euphorbia millii cells. Theoretical and Applied Genetics 61: 113-116. 38. Yeh FT, Huang WW, Cheng CC, Na C, and Tsay HS (1994) Tissue culture of Dioscorea doryophora Hance. II. Estabilshment of suspension culture and the measurement of diosgenin content. Chinese Agronomy Journal 4: 257-268. 39. Wang HQ, Yu JT and Zhong JJ (1999) Significant improvement of taxane production in suspension cultures of Taxus chinensis by sucrose feeding strategy. Process Biochemistry 35: 479- 483. 40. Wani MC, Taylor HL, Wall ME, Coggon P, and McPhail AT (1971) Plant antitumor agents VI. The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia. Journal of American Chemical Society 93: 2325-2327. 41. Wickremesinhe ERM, Arteca RN (1993) Taxus callus cultures: Intiation, growth optimization, characterization and taxol production. Plant Cell Tissue and Organ Culture 35: 181-193. 42. Wickremesinhe ERM, Arteca RN (1994) Taxus cell suspension cultures: optimizing growth and production of taxol. Journal of Plant Physiology 144: 183-188. 43. Woerdenbag HJ, Van Uden W, Frijlink HW, Lerk CF, Pras N, and Malingre ThM (1990) Increased podophyllotoxin production in Podophyllum hexandrum cell suspension cultures after feeding coniferyl alcohol as a  -cyclodextrin complex. Plant Cell Rep 9: 97-100. 44. Wu CT, Vanisree M, Satish MN, Chen CL, Yang TF, and Tsay HS (2003) Isolation and quantitative analysis of cryptotanshinone, an active quinoid diterpene formed in the callus of Salvia miltiorrhiza Bunge. Biological and Pharmaceutical Bulletin 26(6): 845-848. 45. Zheng HZ, Dong ZH, and She J (1997) Longdan. In: Modern Study of Traditional Chinese Medicine 2: 1398-1408. Beijing Xue Yuan Press, Beijing, China.