Sử dụng phương pháp sinh học phân tử để phát hiện và xác định nấm gây

Chia sẻ: Nguyễn Thị Phương Anh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

116
lượt xem 18
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bạch đàn là loài cây phổ biến tại bang Tasmania (Australia), chiếm khoảng 883.000 ha trong tổng số 3,17 triệu ha rừng tự nhiên tại bang này, bao gồm loài E. obliqua. Gỗ bạch đàn được sử dụng để đóng đồ gia dụng, trong công nghiệp được dùng làm nguyên liệu giấy. Tuy nhiên, một số loài nấm gây mục gỗ tấn công cây bạch đàn sống, một số khác lại gây hại trên gỗ gia dụng, gỗ thành phẩm. Nấm mục gỗ gây cho gỗ bị biến chất, làm mất màu, mất trọng lượng...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Sử dụng phương pháp sinh học phân tử để phát hiện và xác định nấm gây

Sử dụng phương pháp sinh học phân tử để phát hiện và xác định nấm gây bệnh mục gỗ bạch đàn eucalyptus obliqua L. Her I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bạch đàn là loài cây phổ biến tại bang Tasmania (Australia), chiếm khoảng 883.000 ha trong tổng số 3,17 triệu ha rừng tự nhiên tại bang này, bao gồm loài E. obliqua. Gỗ bạch đàn được sử dụng để đóng đồ gia dụng, trong công nghiệp được dùng làm nguyên liệu giấy. Tuy nhiên, một số loài nấm gây mục gỗ tấn công cây bạch đàn sống, một số khác lại gây hại trên gỗ gia dụng, gỗ thành phẩm. Nấm mục gỗ gây cho gỗ bị biến chất, làm mất màu, mất trọng lượng và độ bền. Xác định được nấm bệnh và các đặc điểm sinh thái của chúng sẽ mang lại các lợi ích quản lý. Có rất nhiều loài nấm không thể nuôi cấy trong điều kiện phòng thí nghiệm (Johannesson và Stenlid 1999) bởi vậy một số kết quả phân lập nấm bệnh không phản ánh chính xác loài nấm gây bệnh trong mô thực vật. Bên cạnh đó, hầu hết các loài nấm thuộc lớp Basidiomycetes, loài nấm gây mục gỗ chủ yếu, có thể phân lập được nhưng hệ sợi lại không sinh ra bào tử hữu tính, đó là đặc điểm chính để xác định bằng phương pháp hình thái (Nobles 1948). Đã có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định nấm gây bệnh mục gỗ, như phân lập sợi nấm và xác định bằng hình thái sợi, nhuộm màu hóa học, cộng hưởng phân tử từ, phương pháp huyết thanh (hay phương pháp ELISA) (Jasalavich 2000). Bên cạnh đó, phương pháp phân tử PCR
(Polymerase Chain Reaction) có thể sử dụng để khuyếch đại các phân đoạn điển hình của DNA, ưu điểm của phương pháp này là cho kết quả nhanh, chính xác và phát hiện nấm bệnh ở giai đoạn rất sớm mà một số phương pháp trên không thể áp dụng. Phát hiện nấm bệnh bởi phương pháp PCR và xác định nấm bệnh bằng phương pháp xác định trình tự chuỗi trực tiếp từ các mẫu mô thực vật sẽ tránh được các bước khó khăn trong phân lập và duy trì sợi nấm tinh khiết trên môi trường nhân tạo. Vùng sao chép nội bộ ITS (internal transcribed spacer) của ri-bô-xôm DNA là vùng phù hợp cho sự phân biệt các loài nấm (Mitchell et al. 1995). Bài viết này trình bày kết quả nghiên cứu về phương pháp sinh học phân tử được áp dụng để phát hiện và xác định nấm gây bệnh mục gỗ bạch đàn E. obliqua tại bang Tasmania. II. NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Nội dung Phát hiện nấm trong mẫu gỗ mục bằng kỹ thuật DNA.- Giám định nấm gây bệnh mục gỗ bạch đàn E. obliqua bằng kỹ thuật DNA. 2. Vật liệu Đề tài sử dụng 26 mẫu gỗ mục được lấy mẫu từ các khúc gỗ mục ở giai đoạn trung bình của rừng bạch đàn E. obliqua tại Tasmania để xác định nấm mục gỗ bằng phương pháp phân tử và được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, khoa Khoa học Nông nghiệp, trường Đại học Tasmania, Australia.
3. Phương pháp Tách DNA: Lấy phoi gỗ mục được thực hiện theo phương pháp của Jasalavich và đồng tác giả (2000) bằng cách sử dụng khoan sách tay. Phương pháp khử trùng bề mặt và thay thế mũi khoan trong mỗi lần khoan được áp dụng để tránh sự lấy nhiễm DNA giữa các mẫu gỗ. Tách DNA của các loài nấm mục gỗ sử dụng phương pháp glassmilk của Glen và đồng tác giả (2002). Cho một lượng nhỏ phoi gỗ đến vạch 200 µl trên ống eppendorf 1.5 ml. Tán nhỏ các vật liệu trên trong ống eppendorf bằng chày kết hợp với nitơ lỏng. Thêm vào đó khoảng 300-500 µl chất tách chiết DNA (Reader & Broda 1985). Ống eppendorf được ủ trong bể nước ở nhiệt độ 65oC trong 60 phút. Sau đó được ly tâm với tốc độ 14,000 vòng/phút trong 15 phút. Khoảng 200 µl dịch nổi được chuyển sang ống eppendorf mới trong có chứa 800 µl NaI 100% (trạng thái lạnh) và 7 µl glassmilk. Hỗn hợp được làm lạnh và lắc đều trong vòng 15 phút để DNA gắn vào glassmilk, sau đó được ly tâm với tốc độ 14,000 vòng/phút trong 10 giây. Phần kết tủa được rửa sạch bằng dung dịch đệm và cồn. Sau đó hỗn hợp được ly tâm, tách phần kết tủa và làm khô. Phần kết tủa được hòa tan trong 25 µl dung dịch TE (10 mM Tris HCl pH8, 1 mM EDTA), hỗn hợp được ủ trong bể nước ở 45oC trong vòng 5 phút. Ống eppendorf được ly tâm ở 14,000 vòng/phút trong 2 phút, phần hỗn hợp chứa DNA được chuyển sang ống eppendorf mới, bảo quản ở 4oC. Khuyếch đại PCR: Vùng ITS 1 và 2 được khuyếch đại từ DNA vừa thu trên bằng cặp mồi được thiết kế điển hình cho nấm ITS1-F (Gardes và Bruns 1993) và ITS4 (White et
al. 1990). Trong 50 µl phản ứng PCR, 10 µl DNA được sử dụng như bản mẫu. Mỗi phản ứng PCR gồm có 1x polymerase chất đệm (Fisher Biotec), 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 0.25 µM cho mỗi loại mồi, và 0.08 U TTH+ polymerase (Fisher Biotec) và 0.2 mg/ml chất BSA (Bovine Serum Albumin, Fisher Biotec). Thông số khuyếch đại PCR như sau: bước khởi đầu tách đôi sợi DNA ở 95oC trong 3 phút. Sau đó là 35 chu kỳ: tách sợi DNA ở 94oC trong 30 giây, gắn mồi ở 55oC trong 30 giây, kéo dài ở 72oC trong 30 giây, ở chu kỳ cuối cùng sự kéo dài được thực hiện ở 72oC trong 7 phút. Phản ứng được thực hiện trên máy PCR loại PTC 225 Peltier Thermal Cycler. Điện ly: các sản phẩm PCR được điện ly trên bản gel (2,5% agarose) ở 4 volts/cm, trong 30 phút. Thang DNA 100bp (Fisher Biotec) được sử dụng để ước lượng kích cỡ DNA. Bản gel được nhuộm trong ethidium bromide (1µg/1ml), lắc ở tốc độ chậm trong 15 phút. DNA được quan sát dưới tia cực tím và được chụp ảnh với máy ảnh Kodak EDAS290. Tách dòng nấm từ sản phẩm PCR: Sau khi được khuyếch đại (PCR), các sản phẩm PCR từ các mẫu gỗ mục có nhiều dải DNA trên bản gel được tách dòng bằng bộ kít tách dòng, sử dụng véc-tơ pGEMR-T (Promega). Quá trình gắn DNA vào véc-tơ pGEMR-T được tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm (các dòng) sau đó được phân tích biến động chuỗi bằng phương pháp PCR – RFLP. Các enzym giới hạn Hinf I và Tag I được sử dụng riêng rẽ để cắt các dòng. Sản phẩm cắt được điện ly trên bản gel 25 cm với 2.5% Hi-Resolution agarose (Progen Industries
Limited) ở 100 volts trong 5 giờ. Các dòng của mỗi mẫu gỗ được phân nhóm dựa trên hình thái PCR-RFLP và đại diện của mỗi nhóm được khuyếch đại PCR (như trên) và xác định trình tự chuỗi. Xác định trình tự chuỗi phân tử DNA: 90-100 µl sản phẩm PCR được làm sạch bằng bộ kít MO BIO Laboratories, Inc. UltraCleanTM PCR Lean-up. Phản ứng xác định trình tự chuỗi: sử dụng bộ kít Quick Start với một số thay đổi như sau: Mỗi phản ứng xác định trình tự chuỗi DNA gồm 10 µl, trong đó sử dụng 3-5 µl DNA mẫu cùng với 3.2 pmol mồi (ITS1-F) và 2 µl DTCS Quick Start Master Mix. Kết tủa bằng cồn: 0.25 µl của 20 mg/ml glycogen, 2 µl của 3 M Sodium Acetate và 2 µl của 100 mM Na2-EDTA được bổ xung vào mỗi phản ứng. Trình tự chuỗi DNA được xác định trên hệ thống phân tích gen và được sửa trên phần mềm Chromas Lite, phiên bản 2.0, 2004. Các chuỗi DNA được sắp xếp trên ClustalW (Thompson et al. 1994). Sau đó các chuỗi DNA này được so sánh sự giống nhau với các dữ liệu trên ngân hàng gen, sử dụng phần mềm BLAST (Altschul et al. 1997) trên BioManager (ANGIS 2005) và với các dữ liệu cá nhân, sử dụng phần mềm FASTA, phiên bản 3.4 (Pearson và Lipman 1998). Ngoài ra phân tích sự tiến hóa cũng được thực hiện. Các chuỗi DNA mẫu và DNA tham khảo được sắp xếp với nhau, biểu đồ Dendrogram được tạo trên phần mềm ClustalW và DNA ml trên phần mềm Phylip (ANGIS 2005; Felsenstein 1998) sau đó được xem trên phần mềm TreeView, phiên bản 1.6.6.