Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Bảo vệ thực vật: Đánh giá hoạt tính đối kháng của một số cây thực vật bậc cao đối với cỏ dại

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

11
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài "Đánh giá hoạt tính đối kháng của một số cây thực vật bậc cao đối với cỏ dại" thu thập và đánh giá hoạt tính đối kháng thực vật của cây lạc dại, cây liêm hồ đằng, cây tơ hồng xanh, cây gai, cây cỏ may trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và trên đồng ruộng; xác định được hoạt tính đối kháng từ dịch chiết của các cây thử nghiệm đến khả năng ức chế sự nảy mầm, sinh trưởng của hạt cỏ lồng vực và các hạt chỉ thị.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Bảo vệ thực vật: Đánh giá hoạt tính đối kháng của một số cây thực vật bậc cao đối với cỏ dại

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHAN TRUNG THẮNG ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA MỘT SỐ CÂY THỰC VẬT BẬC CAO ĐỐI VỚI CỎ DẠI Ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 9 62 01 12 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2023
Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn: PGS.TS. Trần Đăng Khánh PGS.TS. Nguyễn Văn Viên Phản biện 1: PGS.TS. Ngô Bích Hảo Hội Bảo vệ thực vật Phản biện 2: PGS.TS. Đồng Huy Giới Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 3: TS. Lại Tiến Dũng Viện Bảo vệ thực vật Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện, họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ phút, ngày tháng năm 2023 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Trung tâm Thông tin - Thư viện Lương Định Của, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU Việt Nam là đất nước có điều kiện khí hậu nhiệt đới, á nhiệt đới, được biết đến là trung tâm đa dạng sinh học thực vật, có nguồn tài nguyên thực vật phong phú với hơn 16.000 loài cây khác nhau (Biodivn, 2017). Trong số đó, nhiều loài thuộc nhóm cây xâm lược, nhóm họ đậu đỗ và cây dược liệu. Tuy nhiên, hiện nay có rất ít nghiên cứu về đánh giá tính đối kháng thực vật của các loài cây này cũng như tách chiết các hoạt chất đối kháng phục vụ công tác phòng trừ cỏ dại trên đồng ruộng. Đây là nguồn vật liệu vô cùng quý giá cần được khai thác và phát triển. Cỏ dại là thực vật không mong muốn làm giảm năng suất cây trồng đáng kể. Để kiểm soát cỏ dại, một số phương pháp truyền thống được áp dụng bao gồm làm cỏ bằng tay, sử dụng nước, làm đất hay kỹ thuật thâm canh đã được áp dụng. Tuy nhiên, những phương pháp này thường phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, tốn thời gian công sức và không phù hợp với xu thế đô thị hóa như ở nước ta. Hiện nay, xu hướng tăng cường sử dụng nông dược và thuốc diệt cỏ tổng hợp ngày càng trở nên phổ biến. Thực tế, sử dụng thuốc diệt cỏ có thể giảm thiểu thời gian kiểm soát cỏ dại và ổn định năng suất cây trồng. Tuy nhiên, việc lạm dụng và phụ thuộc vào thuốc diệt cỏ để phòng trừ cỏ dại hiện đang là một vấn đề nghiêm trọng tại nước ta, dẫn đến ô nhiễm môi trường đặc biệt là môi trường đất (mất cân bằng hệ vi sinh vật đất, thay đổi tính chất lý hóa cũng như làm giảm các chất dinh dưỡng trong đất), các sản phẩm nông nghiệp không an toàn và ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Nông nghiệp thế giới đang phải đương đầu để kiểm soát sự xâm lấn cỏ dại và đã xuất hiện cỏ dại kháng thuốc diệt cỏ, do vậy cần phải phát triển nhiều loại thuốc diệt cỏ mới hoặc tăng nồng độ sử dụng. Hiện nay, theo thống kê trên thế giới có khoảng 30.000 loài cỏ dại gây ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất cây trồng (Manisankar & cs., 2022). Ở Hoa Kỳ, người ta ước tính rằng cỏ dại gây thiệt hại khoảng 33 tỉ USD cho sản lượng cây trồng và hàng năm người dân phải chi khoảng 6,2 tỉ USD để phòng trừ cỏ dại. Ở Australia, tổng chi phí cho phòng trừ cỏ dại là khoảng 3,3 tỉ đô la Úc mỗi năm, với thiệt hại năng suất tương đương 2,7 triệu tấn ngũ cốc (Chauhan, 2021). Ở nước ta, việc sử dụng thuốc diệt cỏ tổng hợp để quản lý cỏ dại tăng đáng kể từ đầu những thập niên 90 và tăng mạnh lên 42,000 tấn/ năm vào năm 2013, tương đương 300 triệu USD và tăng gấp đôi trong những năm gần đây (Thanh & Tran, 2020). 1
Tính đối kháng thực vật (allelopathy) có thể được hiểu một cách đơn giản là khả năng ức chế hoặc kích thích sinh trưởng của cây trồng này sang cây trồng khác thông qua con đường hóa sinh. Trong tự nhiên, thực vật xanh sản xuất nhiều sinh chất thứ cấp được gọi là chất đối kháng thực vật, nhiều chất trong số này có khả năng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của những thực vật bên cạnh. Các thực vật ức chế cỏ dại thông qua việc giải phóng các độc tố vào môi trường bằng cách tiết dịch gốc hoặc từ sự phân hủy tàn dư thực vật đã được Kalisz & cs. (2021) chứng minh trên khoảng 200 loài. Hoạt chất đối kháng (allelochemicals) là hoạt chất thứ cấp đóng vai trò quan trong trong sự tương tác giữa cây trồng với cây trồng, giữa cây trồng với vi sinh vật và côn trùng. Trong đó, nhiều chất liên quan đến hoạt tính đối kháng gây ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất và hệ thống sinh trưởng của thực vật bằng acid shikimic hoặc acid acetate (Rizvi & Rizvi, 1992; Kong & cs., 2019). Nhiều chất đối kháng đã được tách chiết, tinh sạch và xác định từ các loài thực vật bậc cao thường thuộc nhóm acid phenolics và nhóm dẫn xuất, terpenoids, sterols, fatty acids, lactones, amino acids. Theo thông tin cập nhật nhất, cho tới nay có khoảng 100.000 chất thứ cấp liên quan đến tính đối kháng đã được xác định (Latif & cs., 2017). Một số chất đối kháng đang được sử dụng để quản lý cỏ dại như nguồn thuốc diệt cỏ sinh học bao gồm hoạt chất glucosinolate, sorgoleone, momilactones, artemisinin, leptospermone được thanh lọc từ Brassica sp., Sorghum bicolor L., (Oryza sativa L, Artemisia annual L., Callistemon citrinus (Latif & cs., 2017). Để giảm thiểu sự lệ thuộc vào thuốc điệt cỏ tổng hợp, đồng thời phát triển và duy trì nền nông nghiệp bền vững, thân thiện với môi trường là nhiệm vụ cấp bách của các nhà khoa học hoạt động trong lĩnh vực nông nghiệp. Phòng trừ cỏ dại bằng phương pháp sinh học vẫn là lĩnh vực mới và chưa được tập trung nghiên cứu nhiều ở nước ta. Xuất phát từ những lý do nêu trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Đánh giá hoạt tính đối kháng của một số cây thực vật bậc cao đối với cỏ dại”. Kết quả của đề tài sẽ cung cấp nguồn thông tin hữu ích và nguồn vật liệu quý giá có hoạt tính và hoạt chất đối kháng cao phục vụ nghiên cứu sâu hơn để tổng hợp thành thuốc diệt cỏ sinh học (bioherbicide) trên quy mô công nghiệp để phòng trừ cỏ dại trong tương lai gần. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.2.1. Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu đánh giá hoạt tính đối kháng thực vật của cây lạc dại (Arachis pintoi Krapov. & W.C.Greg.), liêm hồ đằng (Cissus sicyoides L.), tơ hồng xanh (Cassytha 2
filiformis L.), lá gai (Boehmeria nivea (L.) Gaudich.), cỏ may (Chrysopogon aciculatus (Retz.) Trin.) đối với cỏ dại. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể - Thu thập và đánh giá hoạt tính đối kháng thực vật của cây lạc dại, cây liêm hồ đằng, cây tơ hồng xanh, cây gai, cây cỏ may trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và trên đồng ruộng. - Xác định được hoạt tính đối kháng từ dịch chiết của các cây thử nghiệm đến khả năng ức chế sự nảy mầm, sinh trưởng của hạt cỏ lồng vực và các hạt chỉ thị. - Phân tích và xác định một số hoạt chất đối kháng thực vật từ chiết xuất của các cây thử nghiệm. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu - Cây lạc dại (Arachis pintoi Krapov. & W.C.Greg.), liêm hồ đằng (Cissus sicyoides L.), tơ hồng xanh (Cassytha filiformis L.), lá gai (Boehmeria nivea (L.) Gaudich.), cỏ may (Chrysopogon aciculatus (Retz.) Trin.). - Cỏ lồng vực nước (Echinochloa crus-galli L.). 1.3.2. Địa điểm nghiên cứu + Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; + Bộ môn Kỹ thuật Di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam; + Phòng thí nghiệm sinh lý thực vật và hóa sinh (Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry), Trường Sau đại học về Hợp tác và Phát triển Quốc tế (Graduate School for Internatinal Development and Cooperation), Đại học Hiroshima, Nhật Bản. 1.3.3. Thời gian nghiên cứu Nghiên cứu sinh thực hiên nghiên cứu từ tháng 10/2016 đến tháng 05/2021. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Đề tài nghiên cứu đánh giá và xác định về tính đối kháng thực vật của một số thực vật bậc cao lần đầu tiên tại Việt Nam như cây lạc dại (A. pintoi), liêm hồ đằng (C. sicyoides), tơ hồng xanh (C. filiformis), lá gai (B. nivea), cỏ may (C. aciculatus). 3
Các loài thực vật thu thập lần đầu tiên được đánh giá tính đối kháng thực vật trong đủ cả ba điều kiện là trong phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng ruộng. Ba loại cây thử nghiệm (có tổng số điểm phân hạng cao nhất) được lựa chọn để sử dụng là nguồn vật liệu để thực hiện các thí nghiệm dịch chiết, xác định hoạt chất đối kháng thực vật gồm cây lạc dại, thân gai và lá gai. - Luận án này đã xác định được hàm lượng gây ức chế 50% (IC50) của dịch chiết bằng ethyl acetate của cây gai và dịch chiết bằng methanol, hexan, ethyl acetate của cây lạc dại đối với sự nảy mầm và sinh trưởng của thực vật chỉ thị (cỏ lồng vực nước (E. crus-galli) và xà lách (lactuca sativa). Trên chỉ thị cỏ lồng vực nước (E. crus-galli), cao chiết ethyl acetate từ lá gai có giá trị ức chế mạnh nhất, với giá trị IC50 ở chỉ tiêu chiều dài rễ và thân lần lượt là 3,96 và 9,3 mg/ml. - Luận án này đã phát hiện các hợp chất thứ cấp liên quan tới tính đối kháng thực vật bao gồm: 04 hợp chất từ cao chiết methanol của cây lạc dại thuộc các nhóm fatty acids, fatty acid methyl esters, pyrroles; 09 hợp chất từ cao chiết hexan của cây lạc dại thuộc các nhóm fatty acids, fatty acid methyl esters, triterpenoids; 05 hợp chất từ cao chiết ethyl acetate của cây lạc dại thuộc các nhóm pyranones, benzofurans, dialkyl ethers, fatty acids, fatty acids esters; 04 hợp chất từ cao chiết ethyl acetate của thân gai thuộc các nhóm phenols, phenolic acids, fatty acids; 04 hợp chất từ cao chiết ethyl acetate của lá gai nhóm phenolic acids, coumarins và fatty acids. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học Luận án đã cũng cấp dẫn liệu khoa học về các hợp chất đối kháng thực vật, hàm lượng phenolic tổng số và flavonoid tổng số từ dịch chiết bằng ethyl acetate của cây gai và bằng methanol, hexan, ethyl acetate của cây lạc dại. Đây là nguồn tư liệu làm căn cứ giúp cho các nhà nghiên cứu lựa chọn vật liệu nhằm chiết xuất các hợp chất đối kháng ức chế sự phát triển của cỏ dại. Luận án đã cung cấp dẫn liệu khoa học mới về tính đối kháng thực vật của các cây thử nghiệm (cây lạc dại, cây gai, liêm hồ đằng, tơ hồng xanh, cỏ may) đối với cỏ lồng vực trong điều kiện phòng thí nghiệm, trong nhà lưới và trên đồng ruộng. Kết quả của nghiên cứu này góp phần phát triển các thí nghiệm sàng lọc, xác định các cây trồng có tính đối kháng thực vật và có thể đáp ứng các tiêu chí là chi phí thấp, nhanh chóng, dễ thực hiện, ứng dụng rộng rãi cho nhiều loài mục tiêu, có thể tái sử dụng và dễ thực hiện thống kê, đồng thời không đòi hỏi quá cao về thời gian và không gian thực hiện. 4
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của luận án đóng góp cho việc tìm ra những nguồn vật liệu mới nhằm tạo ra các sản phẩm, chế phẩm sinh học phòng chống cỏ dại, giúp giảm thiểu việc sử dụng thuốc diệt cỏ hoá học, giảm thiểu tác nhân gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe con người, tạo ra các sản phẩm nông nghiệp an toàn, đồng thời hướng tới phát triển và duy trì một nền nông nghiệp bền vững. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ TÍNH ĐỐI KHÁNG THỰC VẬT CỦA THỰC VẬT BẬC CAO 2.1.1. Nguồn gốc thuật ngữ “Đối kháng thực vật” (allelopathy) Thuật ngữ “Đối kháng thực vật” (allelopathy) được giới thiệu bởi Molisch năm 1937. Năm 1996, Hiệp hội Allelopathy Quốc tế (International Allelopathy Society) đã đưa ra định nghĩa về allelopathy như sau: Bất kỳ quá trình nào liên quan đến các chất chuyển hóa thứ cấp được tạo ra bởi thực vật, vi sinh vật, virus và nấm có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và phát triển của hệ thống nông nghiệp và sinh học (trừ động vật), kể cả tích cực và tác động tiêu cực (Torres & cs., 1996). 2.1.2. Các nghiên cứu về tính đối kháng thực vật của thực vật bậc cao trên thế giới Theo Nghiêm Nhật Mai (2017), thực vật bậc cao là các nhóm thực vật chủ yếu đã lên cạn, do đó các mô hóa gỗ để truyền dẫn nước, khoáng chất và các sản phẩm quang hợp trong cơ thể, có sự xen kẽ thế hệ bào tử và giao tử trong sinh sản. Trong văn liệu khoa học, thực vật bậc cao được đề cập dưới tên gọi khác nhau như Telomophyta, Embryophyta, Cormophyta, Tracheophyta. Nét chung của thực vật bậc cao hay thực vật có mạch là cấu trúc sinh thế có dạng đặc biệt gọi là cây, gồm ba bộ phận cơ bản: rễ, thân và lá. Chúng có những đặc điểm cơ bản, phân biệt so với thực vật bậc thấp: Có mạch và các mô mạch đảm nhiệm chức năng tuần hoàn dưỡng chất trong cây. Đặc điểm này có được do quá trình lịch sử tiến hóa của giới thực vật, cho phép thực vật bậc cao có kích thước to lớn hơn so với thực vật bậc thấp (tức thực vật không mạch hay tân thực vật). Trong thực vật bậc cao, pha thế hệ chủ yếu là thể bào tử, thông thường là dạng lưỡng bội với hai bộ nhiễm sắc thể trên mỗi tế bào. Điều này khác biệt so với thực vật bậc thấp là loại có pha thế hệ chủ yếu là thể giao tử, tức là dạng đơn bội với một bộ nhiễm sắc thể trên mỗi tế bào. 5
Chủ đề nghiên cứu tính đối kháng thực vật đã nhận được nhiều sự quan tâm từ các nhà khoa học trên thế giới kể từ khi một số nghiên cứu đã chứng minh rằng ứng dụng tính đối kháng và hoạt chất đối kháng thực vật có thể thay thế thuốc diệt cỏ tổng hợp trong công tác phòng trừ cỏ dại (Kato-Noguchi & Peter, 2013). Nhiều loài thực vật bậc cao trong tự nhiên biểu hiện tiềm năng đối kháng đáng kể khi được kết hợp sử dụng trong công tác phòng trừ cỏ dại trên đồng ruộng. Một số nghiên cứu trước đó trên thế giới đã khai thác tiềm năng đối kháng thực vật để kiểm soát cỏ dại, trong đó, Ndam & cs. (2014) đã sàng lọc tính đối kháng của hơn 300 loài thực vật bậc cao thu thập ở Nhật Bản, Cameroon. Trong đó đã xác định được 26 loài thuộc nhóm cây họ đậu, 19 loài cây xâm lược bao gồm cả cỏ dại có hoạt tính đối kháng cao, ức chế sinh trưởng của cây chỉ thị. Nghiên cứu về tính đối kháng của một số cây trồng chính cũng đã được thực hiện ở nhiều nước trên thế giới, trong đó lúa được nghiên cứu nhiều nhất. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng ứng dụng tính đối kháng và hoạt chất đối kháng thực vật có thể thay thế thuốc diệt cỏ tổng hợp trong công tác phòng trừ cỏ dại (Kato- Noguchi & Peter, 2013). 2.1.3. Các nghiên cứu về tính đối kháng thực vật của thực vật bậc cao tại Việt Nam Trong thực tế, ở nước ta những nghiên cứu về tính đối kháng của cây thực vật bậc cao vẫn chưa được thực hiện nhiều, một số nghiên cứu trước đó của nhóm tác giả như Hong & cs. (2003, 2004), Xuan & cs. (2005), Khanh & cs. (2013), đã sàng lọc tính đối kháng của hơn 60 loài thực vật bậc cao dựa trên một số chỉ tiêu; (i) tính xâm lược và diện tích của thực vật trong hệ sinh thái; (ii) thực vật chọn lọc có ít cỏ dại sinh trưởng ở dưới tán lá; (iii) truyền thống được sử dụng làm phân xanh hay diệt cỏ hoặc côn trùng, hoặc sử dụng làm dược liệu (Hong & cs., 2003). 2.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CÁC HỢP CHẤT ĐỐI KHÁNG CỦA THỰC VẬT BẬC CAO VÀ PHƯƠNG THỨC TÁC ĐỘNG 2.2.1. Các nghiên cứu về các hoạt chất đối kháng thực vật trên thế giới Trong tự nhiên, thực vật xanh sản xuất nhiều sinh chất thứ cấp được gọi là hợp chất đối kháng thực vật (allelochemicals), nhiều chất trong số này có khả năng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của những thực vật bên cạnh. Cho tới nay, có khoảng 100.000 chất thứ cấp liên quan đến tính đối kháng đã được xác định (Latif & 6
cs., 2017). Một số chất đối kháng đang được sử dụng để quản lý cỏ dại như thuốc diệt cỏ sinh học bao gồm hoạt chất glucosinolate, sorgoleone, momilactones, artemisinin, leptospermone được chiết xuất từ chi cải (Brassica sp.), cao lương (Sorghum bicolor L.), lúa (Oryza sativa L.), ngải hoa vàng (Artemisia annual L.), tràm liễu (Callistemon citrinus) (Latif & cs., 2017). 2.2.2. Phương thức tác động của các hợp chất đối kháng Thực vật mang tính đối kháng thường tiết ra các chất chuyển hóa thứ cấp đi vào hệ rễ, ảnh hưởng đến sự phát triển của thực vật trong vùng lân cận (Akemo & cs., 2000). Trong tự nhiên, thực vật được công nhận có tiềm năng đối kháng thuộc các nhóm sau: (a) khí gây độc tế bào (cytotoxic gases), (b) axit hữu cơ, (c) axit thơm, (d) lacton đơn không bão hòa (simple unsaturated lactones), (e) coumarin, (f) quinon, (g) flavonoid, (h) tannin, (i) alkaloid, và (j) terpenoit và steroid (Mushtaq & Siddiqui, 2018). PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Thu thập và đánh giá ảnh hưởng của các cây thử nghiệm gồm có cây lạc dại, cây liêm hồ đằng, cây tơ hồng xanh, cây gai, cây cỏ may đến sự sinh trưởng và này mầm của hạt cỏ lồng vực (Echinochloa crus-galli L.), hạt thóc (Oryza sativa), hạt đỗ xanh (Vigna radiate L.) trong điều kiện phòng thí nghiệm, điều kiện nhà lưới và trên đồng ruộng; Đánh giá tính đối kháng thực vật của của các cây thử nghiệm từ dịch chiết xuất. - Xác định hàm lượng tổng Phenolic tổng số và hàm lượng tổng Flavonoid tổng số trong chiết xuất của các cây thử nghiệm; So sánh giữa tính đối kháng thực vật với hàm lượng phenolic tổng số và hàm lượng flavonoid tổng số. - Phân tích và xác định các hoạt chất thứ cấp từ dịch chiết của các cây thử nghiệm bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS (Gas Chromatography- Mass Spectometry). 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1. Phương pháp thu thập vật liệu Tham khảo phương pháp được mô tả của Hoàng Chung (2009). Thu thập mẫu: Thu thập 10 kg/loại mẫu. Mỗi loại mẫu được thu tại 3 điểm trong khu vực diện tích 50 m2. 7
Nguyên tắc thu mẫu: Mỗi cây thu 03 mẫu. Khi thu mẫu ghi chép đặc điểm dễ nhận biết ngoài thiên nhiên như đặc điểm, kích thước cây, màu sắc hoa, quả, có hay không có nhựa mủ,… Mẫu được thu thập và dán nhãn ghi thông tin : loại mẫu, địa điểm thu thập, thời điểm thu thập, tọa độ thu thập. 3.2.2. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn vật liệu thu thập đến sự sinh trưởng của hạt chỉ thị trong điều kiện phòng thí nghiệm Theo phương pháp được mô tả của Khanh & cs. (2009); Kabir & cs. (2010); Akil (2017); Zaïri & cs. (2020). Môi trường sử dụng: Môi trường thạch 5%. Thành phần: Thạch (agar), nước cất. Phương pháp: Hấp khử trùng môi trường chứa bột cây thử nghiệm tại 1210C trong 15 phút. Sau khi hấp, để nguội 45-50◦C đổ 250ml/cốc nhựa. 20 hạt của từng loại cây chỉ thị được đặt trên mặt môi trường thạch. Công thức đối chứng chỉ sử dụng agar và nước cất. Mỗi công thức được tiến hành với 3 lần nhắc lại. Các mẫu thí nghiệm được để trong tủ điều tiết sinh trưởng ở nhiệt độ 25°C, 4000 lux, thời gian chiếu sáng: 9:00–17:00 h, độ ẩm: 75%. Sau 7 ngày các chỉ tiêu: tỷ lệ nảy mầm, chiều dài thân, độ dài rễ, khối lượng tươi, khối lượng khô của các cây chỉ thị được đo đếm so với đối chứng. 3.2.3. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn vật liệu thu thập đến sự sinh trưởng của hạt chỉ thị trong điều kiện nhà lưới Theo phương pháp được mô tả của Khanh & cs. (2009); Kabir & cs. (2010). Phương pháp: 03 kg đất được bổ sung vào chậu nhựa (đường kính 25cm, dung tích 7 lít) và được làm ẩm với 1 lít nước. Hạt cỏ lồng vực được tráng nhiều lần bằng nước cất. Mỗi chậu thí nghiệm được gieo đều 20 hạt cỏ lồng vực trên bề mặt đất trong chậu. Hai mươi hạt cỏ lồng vực được đặt thành 5 x 4 (hạt x hàng) trên đất ẩm. Bột cây thử nghiệm được bón đều trên bề mặt chậu thí nghiệm với các công thức có liều lượng: 200, 150, 100 và 50 g/m2. Chậu đối chứng chỉ sử dụng nước. Mỗi công thức được nhắc lại 3 lần với liều lượng 50; 100; 150; 200 g/m2. Các chậu thí nghiệm được đặt trong điều kiện nhà lưới, nhiệt độ 25- 30oC. Sau 30 ngày đo đếm tỷ lệ nảy mầm, cân khối lượng tươi, khối lượng khô, đo chiều dài thân của cỏ lồng vực ở từng chậu thí nghiệm được đo đếm và so sánh với đối chứng. 8
3.2.4. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn vật liệu thu thập đến sự sinh trưởng của hạt cỏ lồng vực trong điều kiện trên đồng ruộng Theo phương pháp được mô tả của Khanh & cs. (2009); Kabir & cs. (2010). Phương pháp: Ruộng thí nghiệm được phân lô với kích thước 1m x 1m (Mỗi ô 1m2 là 1 công thức), lặp lại 3 lần, không sử dụng thuốc diệt cỏ. Mạ 15 ngày tuổi được cấy vào mỗi lô thí nghiệm với mật độ: hàng cách hàng 20 cm, cây cách cây 10 cm (20cm x 10cm). 50 hạt cỏ lồng vực được gieo đều vào các ô thí nghiệm, xen đều giữa mỗi hàng mạ. Các công thức được bố trí theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên, với các liều lượng 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 t.ha-1. Lô thí nghiệm đối chứng không xử lý bất cứ thuốc diệt cỏ hay xử lý bột cây thử nghiệm. 30 ngày sau khi xử lý, cân khối lượng tươi, trọng lượng khô, đo chiều dài thân cỏ của cỏ được thu thập và xác định 3.2.5. Đánh giá ảnh hưởng của nguồn vật liệu thu thập đến cỏ tự nhiên và năng suất của lúa trong điều kiện trên đồng ruộng Theo phương pháp được mô tả của Khanh & cs. (2009); Kabir & cs. (2010). Ruộng thí nghiệm được phân lô với kích thước 1m x 1m (Mỗi ô 1m2 là 1 công thức), lặp lại 3 lần. Mạ 15 ngày tuổi được cấy vào mỗi lô thí nghiệm với mật độ: hàng cách hàng 20 cm, cây cách cây 10 cm (20cm x 10cm). Các công thức được bố trí theo kiểu khối đầy đủ ngẫu nhiên với các liều lượng 50; 100; 150; 200 g/m2. LCBT: Lô thí nghiệm chỉ làm cỏ bằng tay, thời gian làm cỏ vào ngày thứ 7 và 15 sau khi cấy mạ; TDC: Lô thí nghiệm sử dụng thuốc trừ cỏ, thuốc trừ cỏ sử dụng là Butoxim 60EC (Butachlor 600 g/l) với nồng độ 01 lít/ha, thời gian phun thuốc vào ngày thứ 05 sau khi cấy mạ; ĐC: Lô thí nghiệm đối chứng không xử lý bất cứ thuốc diệt cỏ, làm cỏ hay xử lý bột cây thu thập. 30 ngày sau khi cấy, cân khối lượng khô của cỏ được thu thập và xác định. Sau 110 ngày, lúa ở các lô thí nghiệm được thu thập để tính toán năng suất. 3.2.6. Phương pháp chiết xuất các vật liệu có tiềm năng đối kháng thực vật cao nhất Theo phương pháp được mô tả của Quan (2016). Dịch chiết được cô đặc trong chân không bằng máy bay hơi chân không Rotavapor® R-300 (Nihon Buchi K.K., Tokyo, Japan) ở nhiệt độ 45 oC tạo ra cao chiết xuất tổng. Cao chiết xuất tổng tiếp tục được pha với nước cất và lần lượt được phân tách pha lỏng bằng các dung môi 9
hexane và ethyl acetate (EtOAc). Sau khi lọc, các dịch chiết thu được đều được cô đặc bằng máy bay hơi chân không ở nhiệt độ 45oC. Cao chiết xuất bằng hexane, ethyl acetate và methanol (cao chiết xuất tổng) được sử dụng cho các thí nghiệm đánh giá tính đối kháng thực vật (allelopathy), thí nghiệm xác định hàm lượng phenolic và flavonoid tổng số. 3.2.7. Đánh giá tính đối kháng thực vật (allelopathy) của dịch chiết xuất từ các loại vật liệu Theo phương pháp được mô tả của Xuan & cs. (2006); Minh & cs. (2019). Dung dịch thạch agar 0.5% được chuẩn bị với nước cất. Bơm 1 mL dung dịch thạch 0.5% vào các giếng của đĩa nuôi cấy. Đĩa giấy (có đường kính phù hợp với các giếng) được thấm đều bằng 300 µL dung dịch chiết xuất của các cây thử nghiệm với dải nồng độ khác nhau. Mẫu đối chứng chỉ thấm đều bằng methanol. Mỗi công thức được lặp lại 3 lần. Sau đó đĩa giấy được để khô trong 2h ở nhiệt độ phòng (nhằm bốc hơi hết methanol). Đặt đĩa giấy lên bề mặt thạch đã nguội trong các giếng. Gieo hạt chỉ thị lên bề mặt các đĩa giấy với số lượng là 06 hạt/đĩa giấy. Sau đó, bơm 200 µL nước cất lên bề mặt đĩa giấy. Sau đó đĩa nuôi cấy được cho vào buồng sinh trưởng thực vật Biotron (growth chamber), với cài đặt ngày/đêm lần lượt: nhiệt độ 28/25oC, thời gian 16/8h, ánh sáng 4000 lux. Hàng ngày bổ sung 100 µL nước cất vào mỗi giếng. Sau 05 ngày tiến hành đo đếm các chỉ số về chiều dài thân, chiều dài rễ của các hạt chỉ thị trong các giếng. 3.2.8. Xác định hàm lượng Phenolic tổng số Theo phương pháp được mô tả của Quan (2016). Các mẫu dịch chiết được hoà tan vào methanol để đạt nồng độ 1000ppm. Thuốc thử Folin-Ciocalteu 10% được pha loãng bằng nước cất. Lần lượt cho 20μL dung dịch gallic acid (nồng độ 5, 10, 25, 50 và 100 μg/ml) vào 100 μL thuốc thử Folin 10% và để phản ứng trong 3 phút; sau đó, thêm tiếp vào 80 μl dung dịch Na2CO3 7,5%. Sau 30 phút phản ứng ở nhiệt độ phòng, độ hấp thụ được xác định bằng máy đo quang phổ (Thermo Scientific, Multiskan™ GO Microplate Spectrophotometer) ở bước sóng 765 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Giá trị OD được ghi nhận và tiến hành vẽ đường thẳng hiệu chuẩn để sử dụng xác định hàm lượng phenolic tổng số trong các mẫu cao chiết. Các mẫu dịch chiết được hoà tan vào methanol để đạt nồng độ 1000ppm. Các mẫu cao chiết (1000 ppm) được tiến hành tương tự như đối với dung dịch gallic acid. 10
3.2.9. Xác định hàm lượng Flavonoid tổng số Theo phương pháp được mô tả của Quan (2016). Chất chuẩn rutin được chuẩn bị trong methanol với các nồng độ 6,25; 12,5; 25; 50 và 100 μg/mL; dung dịch AlCl3 2% được pha trong nước cất. Lần lượt cho 100 μl mẫu/hoặc chất chuẩn đã chuẩn bị vào 100 μl AlCl3 2% và để phản ứng trong 15 phút ở nhiệt độ phòng trong. Sau 15 phút, tiến hành xác định độ hấp thụ bằng máy đo quang phổ (Thermo Scientific, Multiskan™ GO Microplate Spectrophotometer) ở bước sóng 430 nm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả OD được ghi nhận và tiến hành vẽ đường thẳng hiệu chuẩn để sử dụng xác định hàm lượng flavonoid trong các mẫu cao chiết. Các mẫu dịch chiết của cây thử nghiệm được tiến hành tương tự với rutin. 3.2.10. Phân tích các hoạt chất thứ cấp trong vật liệu bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) Theo phương pháp được mô tả của Xuan & cs. (2018). Hệ thống GC-MS (JMS- T100 GCV, JEOL Ltd., Tokyo, Nhật Bản) được kết nối với bộ lấy mẫu tự động và cột DB-5MS, chiều dài 30 m, id 0.25 mm, độ dày màng 0.25 µm (Agilent Technologies, J &WScientific Products, Folsom, CA, USA). 3.2.11. Phương pháp phân hạng giá trị ức chế trung bình trong các thí nghiệm Các giá trị ƯCTB (%) sẽ được phân hạng thành 3 mức độ ức chế: Giá trị ƯCTB
4.1.1.1. Thí nghiệm trong điều kiện phòng thí nghiệm Mục đích thực hiện thí nghiệm này nhằm đánh giá sự ảnh hưởng từ bột vật liệu tới sự nảy mầm và sinh trưởng của hạt cây chỉ thị trong điều kiện kiểm soát nhiệt độ, cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng và độ ẩm. ƯCTB (%) sẽ được tính toán dựa trên các nghiệm thức các chỉ tiêu: tỷ lệ nảy mầm, chiều dài thân, độ dài rễ, khối lượng tươi, khối lượng khô của các cây chỉ thị so với đối chứng. a. Chỉ thị hạt thóc (Oryza sativa) Trong điều kiện tự nhiên ngoài đồng ruộng, sự sinh trưởng của cây lúa luôn tồn tại với sự cạnh tranh dinh dưỡng từ cỏ dại. Chính vì vậy, thí nghiệm trên hạt thóc (Oryza sativa) cũng là một căn cứ để đánh giá sự ảnh hưởng của bột vật liệu tới cây lúa, thể hiện mối tương quan giữa sự ức chế cỏ dại và sự sinh trưởng của lúa. Đối với các thí nghiệm trên hạt thóc (Oryza sativa), các vật liệu biểu hiện ức chế không đáng kể ở nồng độ 6,2 g/l, ngoại trừ lá liêm hồ đằng ức chế sự sinh trưởng của hạt thóc (Oryza sativa) ngay cả ở nồng độ thấp với ƯCTB tới 25,66%. Hình 4.1. So sánh các giá trị ức chế trung bình tại các nồng độ của các cây thử nghiệm trong điều kiện phòng thí nghiệm trên hạt thóc (Oryza sativa) Chú thích: Giá trị ƯCTB
b. Chỉ thị hạt cỏ lồng vực (E. crus-galli) Hình so sánh 4.2 cho thấy tại nồng độ thấp 6,2 g/l, các vật liệu từ cây liêm hồ đằng và tơ hồng xanh kích thích sự sinh trưởng của cỏ lồng vực (E. crus-galli), với ƯCTB cao nhất tới 21,26% khi xử lý bột lá liêm hồ đằng. Tại nồng độ 12,5 g/l, ƯCTB cao nhất lần lượt là: thân gai, lá gai, cỏ may, lạc dại, thân liêm hồ đằng. Tại nồng độ 25 g/l, các vật liệu đều thể hiện tính ức chế với cỏ lồng vực (E. crus-galli), với ƯCTB cao nhất của thân gai, lá gai, lạc dại, thân liêm hồ đằng, tơ hồng xanh. Còn tại nồng độ cao nhất 50g/l, ƯCTB cao nhất lần lượt là thân gai, lá gai, cỏ may, lạc dại, thân liêm hồ đằng. Như vậy có thể thấy tại các nồng độ trong điều kiện phòng thí nghiệm thì bột thân gai, lá gai luôn ức chế cỏ lồng vực (E. crus-galli) với giá trị ƯCTB cao. Hình 4.2. So sánh các giá trị ức chế trung bình tại các nồng độ của các cây thử nghiệm trong điều kiện phòng thí nghiệm trên hạt cỏ lồng vực (E. crus-galli) Chú thích: Giá trị ƯCTB
Tại nồng độ 25 g/l, ƯCTB của các vật liệu có giá trị cao nhất lần lượt là: lá gai, thân gai, lạc dại, lá liêm hồ đằng, thân liêm hồ đằng. Tương tự tại nồng độ 50 g/l, có thể dễ dàng nhận thấy các vật liệu cho ƯCTB cao nhất lần lượt là: lá gai, thân gai, lạc dại, lá liêm hồ đằng, thân liêm hồ đằng. Hình 4.3. So sánh các giá trị ức chế trung bình tại các nồng độ của các cây thử nghiệm trong điều kiện phòng thí nghiệm trên hạt đỗ xanh (Vigna radiate) Chú thích: Giá trị ƯCTB
Hình 4.4. So sánh các giá trị ức chế trung bình tại các nồng độ của các cây thử nghiệm trong điều kiện nhà lưới trên cỏ lồng vực (E. crus-galli) Chú thích: Giá trị ƯCTB
Hình 4.5. So sánh các giá trị ức chế trung bình tại các nồng độ của các vật liệu trong điều kiện đồng ruộng trên cỏ lồng vực (E. crus-galli) Chú thích: Giá trị ƯCTB
b. Đánh giá ảnh hưởng của bột vật liệu đến cỏ tự nhiên Trong thí nghiệm đồng ruộng xử lý bột vật liệu và để cỏ mọc tự nhiên cho thấy tại liều lượng 50 g/m2 thì các mẫu từ cây liêm hồ đằng, tơ hồng xanh và cỏ may vẫn thể hiện sự kích thích sinh trưởng tới cỏ tự nhiên rõ rệt nhất, với ƯCTB của thân liêm hồ đằng tới -32,72%. Tại liều lượng 150 g/m2, các mẫu cây thử nghiệm đều ức chế tới sự phát triển của cỏ tự nhiên, trong đó ƯCTB của lá gai tới 53,51%. Tại liều lượng cao nhất, ƯCTB cao nhất của các vật liệu là: lá gai, thân gai, lạc dại, tơ hồng xanh. 4.1.1.4. Phân hạng giá trị ức chế trung bình của các mẫu cây thử nghiệm trong các thí nghiệm Bảng 4.1 cho thấy giá trị phân hạng ƯCTB của các mẫu cây thử nghiệm từ cao tới thấp, lần lượt là: lá gai (54 điểm), thân gai (46 điểm), lạc dại (45 điểm), lá liêm hồ đằng (40 điểm), cỏ may (39 điểm), tơ hồng xanh (37 điểm), thân liêm hồ đằng (36 điểm), rễ liêm hồ đằng (36 điểm). Giá trị phân hạng này sẽ là căn cứ để lựa chọn các mẫy cây thử nghiệm có tiềm năng đối kháng thực vật cao nhất phục vụ cho các thí nghiệm sử dụng dịch chiết từ vật liệu và các phân tích hóa sinh. Bảng 4.1. Phân hạng giá trị ức chế trung bình của các mẫu cây thử nghiệm trong các thí nghiệm LAB LAB LAB NL ĐR ĐR Cỏ Phân hạng ĐX THÓC CLV CLV CLV tự nhiên (điểm) LG 10 8 8 10 9 9 54 TG 8 6 9 8 7 8 46 LD 8 7 8 9 6 7 45 LLHĐ 8 10 6 6 5 5 40 CM 6 8 7 6 6 6 39 THX 6 7 6 6 6 6 37 TLHĐ 7 6 6 6 6 5 36 RLHĐ 7 6 6 6 5 6 36 Chú thích : LAB : thí nghiệm trong điều kiện trong phòng, ĐR : Thí nghiệm trên đồng ruộng ; NL: Thí nghiệm trong nhà lưới; LG: lá gai; TG: thân gai; LD: lạc dại; LLHĐ: lá liêm hồ đằng; TLHĐ: thân liêm hồ đằng; RLHĐ: rễ liêm hồ đằng; CM: cỏ may; THX: tơ hồng xanh. 4.2. ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐỐI KHÁNG THỰC VẬT CỦA DỊCH CHIẾT XUẤT TỪ MẪU CÂY THỬ NGHIỆM 4.2.1. Chỉ thị hạt rau xà lách (Lactuca sativa) Kết quả tại bảng 4.2 cho thấy trên chỉ thị hạt xà lách (Lactuca sativa), tại tất cả các nghiệm thức thì cao chiết xuất từ lá gai đều cho IC50 thấp hơn so với thân gai. Qua đó cũng cho thấy tại chỉ tiêu chiều dài rễ và chiều dài thân, cao chiết xuất ethyl 17
acetate từ lá gai cho IC50 rất thấp, lần lượt là 1,19 và 1,1 mg/ml. Điều đó cho thấy lá gai là nguồn vật liệu có tiềm năng rất lớn trong khai thai tính đối kháng thực vật. Bảng 4.2. Nồng độ ức chế 50% (IC50) từ dịch chiết của cây gai và lạc dại đối với sự nảy mầm và sinh trưởng của hạt rau xà lách (Lactuca sativa) IC50 (mg/ml) Chiều dài rễ Chiều dài thân LG- ethyl acetate 1,19c ± 0,01 1,1d ± 0,02 LD- methanol 3,72a ± 0,22 3,91a ± 0,29 LD- hexan 1,7bc ± 0,02 1,54cd ± 0,04 LD- ethyl acetate 2,01bc ± 0,13 2,03b ± 0,25 TG- ethyl acetate 2,64ab ± 0,99 1,68bc ± 0,09 Chú thích: Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD (độ lệch chuẩn). Nghĩa là các giá trị có các chữ cái viết thường khác nhau biểu thị sự khác biệt đáng kể trong cùng một cột (p