Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu họ gen mã hóa nhân tố phiên mã TCP trong điều kiện bất thuận phi sinh học ở cây đậu Cicer arietinum

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

6
lượt xem 0
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học "Nghiên cứu họ gen mã hóa nhân tố phiên mã TCP trong điều kiện bất thuận phi sinh học ở cây đậu Cicer arietinum" được nghiên cứu với mục tiêu: Nghiên cứu xác định và phân tích chức năng của họ gen mã hóa nhân tố phiên mã TCP liên quan đến tính chống chịu điều kiện bất lợi ở đậu gà.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu họ gen mã hóa nhân tố phiên mã TCP trong điều kiện bất thuận phi sinh học ở cây đậu Cicer arietinum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIÊP VIỆT NAM -----& ----- TRẦN DUY CƯỜNG NGHIÊN CỨU HỌ GEN MÃ HOÁ NHÂN TỐ PHIÊN MÃ TCP TRONG ĐIỀU KIỆN BẤT THUẬN PHI SINH HỌC Ở CÂY ĐẬU CICER ARIETINUM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 94.20.201 LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI - 2023
Luận án tiến sỹ được hoàn thành tại: Viện Khoa học Nông nghiệp Việt nam Người hướng dẫn: 1. PGS. TS. Trần Đăng Khánh 2. TS. Trần Phan Lam Sơn Phản biện 1: Phản biện 2: Luận án tiến sỹ được bảo vệ tại hội đồng tiến sỹ của Viện Khoa học Nông nghiệp Việt nam Ngày...tháng....năm 2023 Luận án tiến sỹ có thể được tìm tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Quá trình biến đổi khí hậu toàn cầu tác động không nhỏ đến năng suất chất lượng lương thực. Trong đó các điều kiện bất lợi như lạnh, hạn hán và ngập mặn là ba trong số các yếu tố chính tác động trực tiếp đến sự phát triển và hạn chế năng suất cây trồng. Dưới tác động của các yếu tố ngoại cảnh bất lợi, một loạt các thay đổi về sinh lý, sinh hóa diễn ra bên trong cơ thể thực vật. Các phản ứng xảy ra bên trong cơ thể thực vật với các yếu tố tác động bất lợi phi sinh học đó là nhận diện yếu tố bất lợi, ngay sau đó tín hiệu được truyền đến các thành phần tiếp nhận, qua đó kích hoạt chức năng gene biểu hiện và kích thích các nhân tố phiên mã (TFs), sau cùng dẫn tới những thay đổi về trao đổi chất của thực vật để chống chịu với các điều kiện bất lợi tác động. Chính từ những ảnh hưởng bất lợi của hạn hán với cây trồng nói chung và cây họ đậu nói riêng, cùng với đó là vai trò quan trọng của cây họ đậu, cụ thể là cây đậu gà đối với nhu cầu lương thực trên thế giới và Việt Nam. Chúng tôi đã xây dựng luận án nghiên cứu khoa học với tiêu đề “Nghiên cứu họ gen mã hoá nhân tố phiên mã TCP trong điều kiện bất thuận phi sinh học ở cây đậu Cicer arietinum”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án Nghiên cứu xác định và phân tích chức năng của họ gen mã hoá nhân tố phiên mã TCP liên quan đến tính chống chịu điều kiện bất lợi ở đậu gà. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3.1. Ý nghĩa khoa học Luận án cho thấy nhóm nhân tố phiên mã CaTCP có liên quan đến khả năng thích ứng với stress hạn. Ngoài ra, sự biểu hiện mạnh của gen CaTCP07 ở cây Arabidopsis đã làm tăng khả năng chịu hạn của cây đậu gà. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Việc tìm kiếm, phân tích và xác định được các gen mã hoá của nhóm TF TCP trên cây đậu gà đã cung cấp nguồn vật liệu gen có giá
2 trị cho các nghiên cứu chuyên sâu hơn về gen chống chịu điều kiện ngoại cảnh bất lợi. Tìm ra được một số gen tiềm năng của nhóm TF TCP sẽ mở ra hướng mới trong việc ứng dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học để tạo ra các cây trồng mang khả năng chống chịu cao hơn khi gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi. 4. Những đóng góp mới của luận án Kết quả của luận án cho thấy nhóm TF TCP là một trong những nhóm TF có nhiều gen đáp ứng với điều kiện ngoại cảnh bất lợi trên cây đậu gà. Trong đó nhận thấy gen CaTCP07 là một gen ứng viên tiềm năng đáp ứng mạnh mẽ trong điều kiện mất nước và ABA. Kết quả cũng đã xác định được xác thành viên cụ thể của nhóm TF TCP trên cây đậu gà. Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên về nhóm TF CaTCP tại Việt Nam cũng như trên toàn thế giới. Điều này mở ra hướng mới trong việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền nhằm tạo ra các cây trồng chuyển gen chứa các gen CaTCPs tiềm năng để tăng tính chống chịu của cây trồng, từ đó nâng cao năng suất sản lượng. Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trong chương này, luận án của NCS đã trích dẫn và tổng hợp nhiều tài liệu tham khảo trong 3 nội dung chính sau: (1) Tổng quan về cây đậu gà, (2) Các nghiên cứu về cây đậu gà, (3) Họ nhân tố phiên mã TCP. Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Hạt giống đậu gà và Arabidopsis 2.1.2. Hoá chất và các thiết bị nghiên cứu 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Nhận dạng, xác định vị trí nhiễm sắc thể và phân tích các trường hợp sao chép gen của các gen CaTCPs trong bộ gen cây đậu gà. 2.3.2. Xác định đặc tính của các Protein CaTCPs 2.3.3. Phân tích cấu trúc của gen CaTCPs 2.3.4. Dự đoán các yếu tố điều hoà Cis 2.3.5. Phân tích hiện tượng gen lặp ở họ gen mã hoá TCP
3 trên đậu gà 2.3.6. Mức độ biểu hiện của gen mã hoá CaTCP bằng RT- qPCR và phân tích thồng kê 2.3.7. Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA, thiết kế mồi sử dụng cho phân tích sự biểu hiện gen ở cây đậu gà 2.3.8. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện gen CaTCP07 trong cây mô hình Arabidopsis 2.3.9. Đánh giá khả năng chịu hạn của cây chuyển gen Arabidopsis chứa gen 35S:CaTCP07 2.3.10. Thu mẫu để tác RNA kiểm tra mức độ biểu hiện của gen CaTCP07 trong cây chuyển gen dưới điều kiện xử lý mất nước 2.3.11. Đo mức độ rò rỉ ion 2.3.12. Đo nhiệt độ bề mặt lá 2.3.13. Mức độ biểu hiện của một số gen liên quan đến mã hóa các enzyme chống oxy hóa 2.3.14. Phương pháp phân tích thống kê Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định, phân bố nhiễm sắc thể và sao chép gen của CaTCP Một tìm kiếm diện rộng về cả 'kabuli' và 'desi' cơ sở dữ liệu bộ gen cây đậu gà đã cho thấy có tổng cộng 23 gen mã hóa TF CaTCP. 19 CaTCP này được phân bố trên tám nhiễm sắc thể với các tỷ lệ phần trăm khác nhau. 19 gen được mô phỏng từ CaTCP01 đến CaTCP19 theo thứ tự nhiễm sắc thể. Bốn gen CaTCP còn lại (CaTCP20 đến CaTCP23) được tìm thấy trong các vùng không định vị sau đó có thể được nhóm tới (các) nhiễm sắc thể sau khi chú thích và lắp ráp bộ gen đậu chickpea được tinh chỉnh.
4 Hình 3.1. Vị trí NST của các gen CaTCP được xác định. Bảng 3.1: Thông tin chi tiết của các gen CaTCP đã được xác định.
5 3.2. Phân tích cấu trúc của họ gen CaTCP ở Chickpea Độ dài CDS của gen CaTCP nằm trong khoảng từ 597 (CaTCP08) đến 1563 bp (CaTCP03), trong khi trình tự ADN bộ gen của chúng thay đổi từ 1056 (CaTCP08) đến 11.884 bp (CaTCP13). Cấu trúc gen của tất cả các gen CaTCP đã được nghiên cứu bằng cách đưa CDS và trình tự DNA bộ gen của từng gen CaTCP vào phân tích bằng công cụ GSDS. Kết quả là, số lượng exon được tìm thấy trong các gen CaTCP nằm trong khoảng từ một đến hai (Hình 3.2a). Kết quả mô tả đặc điểm của các tính năng protein phổ biến của CaTCP cho thấy rằng CaTCP có chiều dài protein từ 198 đến 520 gốc axit amin, mW từ 21,12 đến 54,76 kDa và pI từ 4,94 đến 9,84 (Bảng 3.2). Các giá trị GRAVY của CaTCP được phát hiện là âm, cho thấy rằng CaTCP TF là ưa nước (Bảng 3.2). Một cây phát sinh được tạo ra bằng phương pháp Neighbor- Joining (Hình 2b). Kết quả chỉ ra rằng các CaTCP sở hữu miền liên kết DNA bHLH được bảo tồn (Hình 2c) và có thể được phân loại thành hai cụm khác nhau, Loại I, cụ thể là lớp PCF và Loại II của các phân lớp CIN và CYC/TB1 (Hình 3.2b). Theo kết quả phân tích phát sinh gen của chúng tôi, phân lớp CIN có 10 thành viên, cụ thể là CaTCP01, CaTCP02, CaTCP04, CaTCP05, CaTCP12, CaTCP13, CaTCP14, CaTCP17, CaTCP19 và CaTCP22 (Hình 2b). Mặt khác, phân lớp CYC/TB1 bao gồm bốn thành viên CaTCP11, CaTCP15, CaTCP20 và CaTCP23 (Hình 3.2b). Hình 3.2: Phân tích cấu trúc và phát sinh gen của 23 thành viên CaTCP được xác định.
6 (a) Cấu trúc gen của gen CaTCP. Các gen CaTCP có hai exon và một intron được biểu thị bằng dấu hoa thị màu đỏ. (b) cây phát sinh CaTCP được xây dựng bởi phương pháp Neighbor-Joining. (c) Việc sắp xếp các miền TCP của 23 TF CaTCP cho thấy sự hiện diện của các vùng BASIC, HELIX I và HELIX II. Bảng 3.2: Đặc điểm nhận dạng CaTCP 3.3. Dự đoán các yếu tố điều hoà Cis Nhiều yếu tố phản ứng với ánh sáng nằm trong vùng khởi động của tất cả các gen CaTCP đã được xác định, cho thấy rằng các thành viên của họ gen này phụ thuộc vào ánh sáng. Ngoài ra, các motif GCN4 và Skn-1 và hộp CAT, được biết đến như là có liên quan đến biểu hiện đặc hiệu của mô, cũng được tìm thấy trong các promoter của 11 gen CaTCP, bao gồm CaTCP02, CaTCP06, CaTCP08, CaTCP12, CaTCP 13, CaTCP14 , CaTCP15, CaTCP19, CaTCP20, CaTCP22 và CaTCP23. Kết quả cho thấy một số yếu tố điều hòa liên quan đến khả năng đáp ứng hormone, chẳng hạn như yếu tố TCA liên quan đến khả năng đáp ứng axit salicylic, lõi AuxRR và hai yếu tố (cụ thể là GARE- motif và P-box) liên quan đến auxin và gibberellin. Yếu tố phản ứng với ethylene (ERE), đã được xác định trong các vùng promoter của CaTCP. Ngoài ra, hai motif phản ứng với methyl jasmonate (MeJA) (motif CGTCA và motif TGACG) cũng được ghi nhận trong các vùng
7 promoter được kiểm tra của gen CaTCP. Điều quan trọng là, yếu tố đáp ứng ABA (ABRE) đã được tìm thấy trong các promoter của các gen CaTCP01, CaTCP03, CaTCP05, CaTCP08, CaTCP09, CaTCP12, CaTCP14 và CaTCP19, cho thấy rằng các CaTCP này có thể liên quan đến việc điều chỉnh cây đậu chickpea phản ứng với các căng thẳng phi sinh học vì ABA đã được xác định như một phytohormone liên quan đến stress. Các promoter của hầu hết các gen CaTCP (20 trên 23) chứa ít nhất một yếu tố phản ứng với stress. 3.4. Biểu hiện của các gen CaTCP trong các cơ quan khác nhau trong quá trình phát triển Dựa trên 454 dữ liệu giải trình tự, sáu gen (CaTCP05, CaTCP12, CaTCP14, CaTCP19, CaTCP20 và CaTCP21) được phát hiện biểu hiện ở mức rất thấp hoặc dưới giới hạn phát hiện, trong tất cả các cơ quan chính. Một số gen CaTCP, chẳng hạn như CaTCP02, CaTCP17 và cặp đôi CaTCP09 và CaTCP10, biểu hiện các kiểu biểu hiện khác biệt ở một số cơ quan, như lá trưởng thành, nụ hoa và quả non, cho thấy rằng các gen này có các kiểu biểu hiện đặc trưng cho cơ quan. ! Hình 3.3: Biểu hiện của các gen CaTCP đã được xác định trong các cơ quan khác nhau trong quá trình sinh trưởng và phát
8 triển của đậu chickpea trong các điều kiện sinh trưởng bình thường thu được từ Cơ sở dữ liệu phiên mã Chickpea (CTDB). Hầu hết các gen CaTCP được biểu hiện khác nhau trong các mô được kiểm tra. CaTCP17 được thể hiện rất cao trong YL và FB1–FB4, trong khi CaTCP21 được thể hiện khá mạnh trong tất cả các mô được kiểm tra (Hình 3.3b). 3.5. Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP trong lá và rễ của cây đậu gà trong điều kiện khử nước và xử lý ABA. Sáu gen (CaTCP07, CaTCP11, CaTCP12, CaTCP14, CaTCP20 và CaTCP22) đã được điều hòa tăng cường bởi ít nhất gấp đôi ở lá và/hoặc rễ tiếp xúc với tình trạng mất nước, trong đó CaTCP07 và CaTCP14 được tạo ra ở cả lá và rễ bị mất nước. (Hình 3.5.1 và 3.5.2). CaTCP07 là gen được cảm ứng mạnh nhất ở lá (lần lượt là 9,8 lần và 4,7 lần sau 2 giờ và 5 giờ mất nước) và rễ (lần lượt là 4,8 lần và 8,2 lần sau 2 giờ và 5 giờ mất nước). Ngược lại, mất nước dẫn đến giảm điều chỉnh tám gen CaTCP (CaTCP03, CaTCP05, CaTCP06, CaTCP09, CaTCP10, CaTCP16, CaTCP17 và CaTCP18) trong lá và/hoặc rễ. Chúng tôi cũng ghi nhận ba gen, CaTCP15, CaTCP19 và CaTCP23, được điều hòa tăng ở rễ nhưng lại điều hòa giảm ở lá do mất nước. Sự biểu hiện của tổng số chín gen CaTCP, bao gồm CaTCP01, CaTCP05, CaTCP07, CaTCP14, CaTCP15, CaTCP16, CaTCP17, CaTCP18 và CaTCP19, đã bị thay đổi đáng kể ở lá và/hoặc rễ được xử lý bằng ABA. Bên cạnh đó, hầu hết các gen CaTCP phản ứng ABA này (tám trong số chín, ngoại trừ CaTCP01) cũng phản ứng với tình trạng mất nước ở rễ và/hoặc lá, cho thấy rằng tám CaTCP này có thể điều chỉnh cây đậu chickpea phản ứng với tình trạng khan hiếm nước theo cách phụ thuộc vào ABA. Ví dụ, CaTCP05 được điều chỉnh giảm, trong khi CaTCP19 được điều chỉnh tăng trong rễ bằng cách khử nước và xử lý ABA (Hình 3.5.1 VÀ 3.5.2). Mặt khác, một nhóm gồm hai gen (CaTCP16 và CaTCP17) và CaTCP14 đã bị ức chế và được cảm ứng tương ứng ở cả lá bị khử nước và được xử lý bằng ABA, trong khi CaTCP07 được điều chỉnh tăng đáng kể ở cả rễ và lá do mất nước và tác động ABA ngoại sinh (Hình 3.4 và 3.5).
9 Hình 3.4: Phân tích biểu hiện của các gen CaTCP trong mẫu lá cây đậu chickpea trong điều kiện mất nước và xử lý ABA bằng cách sử dụng qRT-PCR. Đối chứng là mẫu lá được tưới nước đầy đủ. Error bars cho biết giá trị SE của ba bản sao sinh học (n=3).
10 Hình 3.5: Phân tích biểu hiện của các gen CaTCP trong mẫu rễ cây đậu chickpea trong điều kiện mất nước và xử lý ABA bằng cách sử dụng qRT-PCR. Đối chứng là mẫu lá được tưới nước đầy đủ. Error bars cho biết giá trị SE của ba bản sao sinh học (n=3).
11 3.6. Phân tích mức độ biểu hiện của các gen mã hoá TCP giữa hai giống đậu gà ILC482 và Hashem 3.6.1. Mức độ biểu hiện của các gen CaTCPs ở lá và rễ của giống ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý hạn ở các thời điểm 2 giờ và 5 giờ Bảng 3.3. Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở lá trong hai giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý mất nước tại các thời điểm 2 giờ và 5 giờ sau khi xử lý. (Giá trị màu đỏ/xanh biểu thị sự tăng/giảm mức độ biểu hiện của các gen trong điều kiện xử lý mất nước, thoả mãn điều kiện mức độ biểu hiện ³|2| và P-value
12 Trong tổng số 23 gen CaTCP kiểm tra trên mẫu mô lá, các gen CaTCP07 và CaTCP14 tăng mức độ biểu hiện (thể hiện màu đỏ trên bảng 3.1) tại thời điểm 2 giờ hoặc 5 giờ sau khi tiến hành xử lý mất nước trên giống đậu gà Hashem, đồng thời có 11 gen cho thấy giảm mức độ biểu hiện tại thời điểm 2 giờ hoặc 5 giờ, đó là các gen CaTCP05, 06, 09, 10, 13, 15, 16, 17, 18, 19 và 23 (Bảng 3.6.1.1 và Hình 3.6.1.1). Bảng 3.4. Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở rễ trong hai giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý mất nước tại các thời điểm 2 giờ và 5 giờ sau khi xử lý. Tiếp tục phân tích kết quả RT-qPCR trên các mẫu rễ giống Hashem dưới điều kiện xử lý mất nước, nhận thấy có 10 gen (CaTCP07, 11, 12, 13, 14, 15, 19, 20, 22 và 23) cho thấy mức độ phiên
13 mã tăng so với cây đối chứng. Đồng thời có 3 gen (CaTCP03, 04, 05, 17 và 18) giảm mức độ biểu hiện khi xử lý mất nước tại các thời điểm 2 giờ và 5giờ. Trên mẫu lá thì giống ILC482 có 9 gen có sự thay đổi về mức độ biểu hiện, trong đó gen (CaTCP05, 09, 10, 13, 15, 17 và 18) giảm mức độ biểu hiện tại thời điểm 5 giờ, và gen (CaTCP07, 14) tăng mức độ biểu hiện tại thời điểm 5 giờ. Trong khi đó, trên mẫu rễ cây ILC482 thì có 4 gen cho thấy sự giảm mức độ biểu hiện, đó là các gen (CaTCP04, 05, 17 và 18), 10 gen cho thấy tăng mức độ biểu hiện, đó là các gen (CaTCP07, 11, 12, 13, 14, 15, 19, 20, 22 và 23) (Bảng 3.6.12 và Hình 3.6.1.2). Dựa trên các kết quả phân tích RT-qPCR của mẫu lá và rễ trên 2 giống ILC482 và Hashem dưới điều kiện mất nước tại 2 thời điểm 2 giờ và 5 giờ, kết quả cho thấy trên cả 2 giống đậu gà ILC482 và Hashem phần lớn các gen có sự thay đổi đều xuất hiện trên cả 2 giống đậu gà. 3.6.2. Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở lá và rễ của giống ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý ABA ở các thời điểm 2 giờ và 5 giờ sau khi xử lý. Theo đó, sau khi phân tích kết quả RT-qPCR của mẫu lá và rễ dưới điều kiện xử lý ABA của giống Hashem, ta thấy có 11 gen trong tổng số 23 gen phân tích cho thấy có sự thay đổi biểu hiện ít nhất 2 lần ở lá/rễ. Trong đó có 4 gen (CaTCP07, 14) có mức độ biểu hiện tăng tại thời điểm 2 giờ và/hoặc 5 giờ sau khi xử lý ABA. Đồng thời gen (CaTCP05, 15, 16 và 17) có biểu hiện giảm tại thời điểm 2 giờ và/hoặc 5 giờ (Hình 3.6.2.1 và bảng 3.6.2.1).
14 Bảng 3.5. Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở lá trong hai giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý ABA tại các thời điểm 2 giờ và 5 giờ sau khi xử lý. (Giá trị màu đỏ/xanh biểu thị sự tăng/giảm mức độ biểu hiện của các gen trong điều kiện xử lý mất nước, thoả mãn điều kiện mức độ biểu hiện ³|2| và P-value
15 Bảng 3.6. Mức độ biểu hiện của các gen CaTCP ở rễ trong hai giống đậu gà ILC482 và Hashem trong điều kiện xử lý ABA tại các thời điểm 2h và 5h. (Giá trị màu đỏ/xanh biểu thị sự tăng/giảm mức độ biểu hiện của các gen trong điều kiện xử lý mất nước, thoả mãn điều kiện mức độ biểu hiện ³|2| và P-value
16 E.coli DH5a bằng phương pháp sốc nhiệt. Dịch khuẩn tải tổ hợp được cấy trải trên đĩa LB có chứa kháng sinh Kanamycin (30 mg/L) và nuôi qua đêm ở 37 °C. Khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trường LB có chứa kháng sinh Kanamycin được kiểm tra bằng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen CaTCP07. Hình 3.10: Kết quả điện di kiểm tra thiết kế vector pENTR/D-TOPO CaTCP07 Chú thích: (A) Kết quả điện di vector pENTR/D-TOPO CaTCP07 có kích thước 3514bp. (B) Kết quả điện di phần backbone sau khi sử dụng enzyme cắt BamHI và EcoRV có kích thước 2580bp. (C) Kết quả điện di target gene (đoạn gen CaTCP07) có kích thước 1014bp. Đoạn gen CaTCP07 có trình tự chính xác được sử dụng để chuyển vào vector pGreen35S. Cụ thể, đoạn CaTCP07 trong vector tách dòng pENTR/D-TOPO được cắt bởi 2 enzyme giới hạn BamHI và EcoRV. Sản phẩm cắt của gen CaTCP07 sau đó được gắn vào vector pGreen35S. Sau đó, vector pGreen35S:CaTCP07 được biến nạp vào Agrobacterium bằng phương pháp sử dụng súng điện và nuôi chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh kanamycin (30 mg/L) ở 30°C qua đêm. Các khuẩn lạc dương tính với PCR sử dụng cặp mồi
17 đặc hiệu 35S được lựa chọn lưu giữ và sử dụng cho biến nạp vào cây Arabidopsis. 3.8. Kết quả sàng lọc bước đầu và lựa chọn các dòng cây Arabidopsis chuyển gen CaTCP07 Cấu trúc 35S:CaTCP07 được biến nạp vào cây Arabidopsis Col-0 bằng phương pháp nhúng hoa trong dịch khuẩn lây nhiễm. Các dòng Arabidopsis chuyển gen 35S:CaTCP07 ban đầu được sàng lọc và phân tích sự phân ly tính trạng theo định luật Mendel từ thế hệ T2 trên đĩa môi trường GM có bổ sung kháng sinh kanamycin (30 mg/L) để lựa chọn các dòng đồng hợp tử riêng biệt mang một bản sao của gen chuyển 35S:CaTCP07. Hình 3.11: Cây sau khi được chuyển cấu trúc 35S:CaTCP07 ở thế hệ T0
18 Hình 3.12. Chọn lọc các cây mang gen CaTCP07 Hình 3.13. Sàng lọc dòng L1, L2 mang cấu trúc 35SCaTCP07 3.9. Mức độ biểu hiện gen CaTCP07 của cây Arabidopsis chuyển gen Mẫu lá của 2 dòng chuyển gen và WT được thu tại các mốc thời điểm