Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu hoạt tính sinh học của lá xoài non (Mangifera indica L.) và rễ me keo (Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth.) trên mô hình chuột gây tăng glucose huyết

Chia sẻ: Elysale Elysale | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:19

Thêm vào BST

Báo xấu

16
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nội dung nghiên cứu của luận án là khảo sát ảnh hưởng của LXN và RMK đến các enzyme chuyển hóa carbohydrate gồm các enzyme là glucose-6-phosphatase (G6Pase), glucose-6- phosphate dehydrogenase (G6PDH) và lactate dehydrogenase (LDH) in vitro. Khảo sát khả năng chống stress oxy hóa và bảo vệ tế bào tụy tạng min6 khỏi sự chết do tunicamycin gây ra của LXN và RMK.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu hoạt tính sinh học của lá xoài non (Mangifera indica L.) và rễ me keo (Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth.) trên mô hình chuột gây tăng glucose huyết

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã ngành: 62 42 02 01 NGUYỄN THỊ ÁI LAN TÊN LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LÁ XOÀI NON (Mangifera indica L.) VÀ RỄ ME KEO (Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth.) TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT GÂY TĂNG GLUCOSE HUYẾT Cần Thơ, 2020
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn: PGS.TS. ĐÁI THỊ XUÂN TRANG Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp cơ sở Họp tại: Phòng Bảo vệ Luận Án Tiến Sĩ, Lầu 2, Nhà Điều Hành, Trường Đại Học Cần Thơ Vào lúc: 14 giờ, ngày 06 tháng 6 năm 2020 Phản biện 1: PGS.TS DƯƠNG XUÂN CHỮ Phản biện 2: TS. LƯU THÁI DANH Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Nguyễn Thị Ái Lan và Đái Thị Xuân Trang, 2018. Khả năng bảo vệ tế bào tụy nội tiết MIN6 của dịch chiết rễ Me keo (Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth.). Tạp chí Sinh lý học Việt Nam. 22(2): 6/2018. 2. Nguyễn Thị Ái Lan và Đái Thị Xuân Trang, 2018. Khả năng kháng oxy hóa và bảo vệ tế bào MIN6 tụy tạng của dịch trích methanol lá Xoài non (Mangifera indica L.). Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 54(7A): 85-93. 3. Nguyễn Thị Ái Lan và Đái Thị Xuân Trang, 2018. Hiệu quả hạ glucose huyết, điều hòa lipid huyết và chống huyết khối trên chuột bệnh đái tháo đường của lá Xoài (Mangifera indica L.). Tạp chí Sinh học. 40(2): 168-176. 4. Nguyễn Thị Ái Lan, Trà Lâm Tuấn Vũ và Đái Thị Xuân Trang, 2019. Khả năng kháng oxy hóa của cao methanol rễ me keo (Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth.) trên chuột bị stress oxy hóa. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 55(1A): 47-53. 5. Nguyễn Thị Ái Lan và Đái Thị Xuân Trang, 2020. Ảnh hưởng của cao chiết lá xoài non (Mangifera indica L.) đến hoạt động enzyme glucose-6-phosphatase và glucose-6- phosphate dehydrogenase. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. Đã chấp nhận đăng ngày 23/3/2020.
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Hiện nay, các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp các loại thực phẩm chức năng và thuốc mới để phục vụ cho nhu cầu chăm sóc sức khỏe của con người với giá thành rẻ hơn so với thuốc hóa học (Rai et al., 2008; Srinivasan and Subramaniyan, 2014; Watal et al., 2014). Tuy nhiên, nhiều thực vật hiện đang được sử dụng rộng rãi nhưng chưa được khoa học kiểm định, chứng minh tác dụng thật sự cũng như liều lượng phù hợp để sử dụng. Với mục đích tìm kiếm những chế phẩm thiên nhiên an toàn, rẻ tiền, có hiệu quả trong việc hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường, luận án “Nghiên cứu hoạt tính sinh học của lá xoài non (Mangifera indica L.) và rễ me keo (Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth.) trên mô hình chuột gây tăng glucose huyết” được tiến hành. 1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Đánh giá hoạt tính sinh học của cao chiết toàn phần methanol lá xoài non (Mangifera indica L.) (LXN) và cao chiết toàn phần methanol rễ me keo (Pithecellobium dulce (Roxb.) Benth.) (RMK) theo hướng hỗ trợ điều trị BĐTĐ in vitro. Đồng thời, ảnh hưởng của LXN và RMK cũng được khảo sát trên chuột nhắt trắng gây tăng glucose huyết và rối loạn lipid huyết do alloxan monohydrate (AM) gây ra. 1.2.2 Nội dung nghiên cứu 1. Định tính và định lượng thành phần hóa học của LXN và RMK in vitro. 2. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của LXN và RMK in vitro. 3. Khảo sát ảnh hưởng của LXN và RMK đến các enzyme chuyển hóa carbohydrate gồm các enzyme là glucose-6-phosphatase (G6Pase), glucose-6- phosphate dehydrogenase (G6PDH) và lactate dehydrogenase (LDH) in vitro. 4. Khảo sát khả năng chống stress oxy hóa và bảo vệ tế bào tụy tạng min6 khỏi sự chết do tunicamycin gây ra của LXN và RMK. 5. Khảo sát hiệu quả điều trị BĐTĐ của LXN và RMK. 6. Khảo sát hiệu quả điều hòa lipid huyết và biến chứng bệnh tim mạch của LXN và RMK trên chuột gây tăng glucose huyết. 7. Khảo sát hiệu quả điều hòa enzyme chuyển hóa glucose trên chuột gây tăng glucose huyết của LXN và RMK in vivo. 8. Thử nghiệm độc tính cấp của LXN và RMK trên chuột nhắt trắng. 1
1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu Lá xoài non và rễ me keo thu ở phạm vi huyện Cầu Kè, tỉnh Trà Vinh. 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành trên các enzyme thương mại G6Pase, G6PDH, LDH, min6 tụy tạng in vitro và chuột nhắt trắng gây tăng glucose huyết in vivo. 1.4 Ý nghĩa của nghiên cứu Nghiên cứu này giúp chứng minh hiệu quả điều trị BĐTĐ của lá xoài non và rễ me keo ở mức độ in vitro và in vivo. Luận án cung cấp nguồn thông tin có tính khoa học, làm tiền đề trong việc ứng dụng sử dụng lá xoài non và rễ me keo trong hỗ trợ, điều trị BĐTĐ. 1.5 Tính mới của luận án Kiểm soát các enzyme chuyển hóa glucose trong kiểm soát glucose huyết như G6Pase, G6PDH và LDH là hướng nghiên cứu về BĐTĐ còn khá mới mẻ trong nước. Một trong những nguyên nhân của BĐTĐ là sự tổn thương tụy tạng. Chính vì vậy việc bảo vệ tế bào tụy tạng (min6) là cần thiết. Tuy nhiên, trong nước các nghiên cứu về sự bảo vệ tế bào tụy tạng min6 khỏi sự chết của các cao chiết thực vật chưa được thực hiện. Lá xoài non chỉ được quan sát hình thái, chưa được nghiên cứu khả năng chống bệnh đái tháo đường trong phạm vi cả nước. Trên hệ thống NCBI pubmed chỉ có 110 nghiên cứu về lá xoài. Rễ me keo chưa được nghiên cứu khả năng chống bệnh đái tháo đường trong phạm vi cả nước và quốc tế. Trên hệ thống NCBI pubmed chỉ có 55 bài nghiên cứu về cây me keo. 2
CHƯƠNG 2: CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ PHƯƠNG TIỆN 2.1 Ly trích cao chiết toàn phần methanol lá xoài non (LXN) và rễ me keo (RMK) Lá xoài non hoặc rễ me keo được rửa sạch, cắt nhỏ và sấy khô ở nhiệt độ 50oC cho bay hơi hết nước, mẫu vật được ngâm dầm 24 giờ trong methanol. Sau đó, dịch chiết được lọc để loại bỏ cặn, giai đoạn này được thực hiện lặp lại 3 lần. Dịch chiết từ các lần ngâm được gom lại, cô quay loại bỏ dung môi và thu được cao chiết tổng của mẫu vật. 2.2 Định tính thành phần hóa học, định lượng polyphenol và flavonoid tổng của cao chiết lá xoài non và rễ me keo 2.2.1 Định tính Định tính các hợp chất hóa thực vật phổ biến có trong cao chiết LXN và RMK bằng phương pháp định tính hợp chất tự nhiên (Singleton et al., 1999). 2.2.2 Định lượng 2.2.2.1 Định lượng polyphenol tổng Hàm lượng polyphenol được xác định theo phương pháp của Singleton et al., (1999) có hiệu chỉnh. 2.2.2.2 Phương pháp định lượng flavonoid toàn phần Định lượng flavonoid toàn phần được xác định bằng phương pháp so màu AlCl3 của Bag et al., (2015). 2.3 Khảo sát hoạt tính sinh học kháng BĐTĐ in vitro 2.3.1 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của LXN và RMK in vitro 2.3.1.1 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp trung hòa DPPH Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết LXN/RMK được đánh giá thông qua khả năng trung hòa gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) theo phương pháp của Sharma et al., (2012). 2.3.1.2 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp khử sắt Khả năng kháng oxy hóa của cao chiết LXN/RMK được đánh giá thông qua khả năng khử sắt dựa vào phương pháp của Andrea et al (2017). 2.3.1.3 Khảo sát khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp trung hòa gốc ABTS+ Khả năng kháng oxy hóa của LXN/RMK được đánh giá thông qua khả năng trung hòa cation ABTS+ theo phương pháp của Nenadis et al., (2004). 3
2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết thực vật đến hoạt động của enzyme in vitro 2.3.2.1 Khảo sát hoạt động của enzyme G6Pase in vitro Hoạt động của enzyme G6Pase được thực hiện theo quy trình của Punitha et al. (2005). 2.3.2.2 Khảo sát hoạt động của enzyme G6PDH in vitro Hoạt động của enzyme G6PDH được thực hiện theo quy trình của Govindappa et al. (2015) và Negres et al. (2016). 2.3.2.3 Khảo sát hoạt động của enzyme LDH in vitro Khảo sát hoạt động của enzyme LDH được thực hiện theo quy trình của Punitha (2005) 2.3.3 Khảo sát hiệu quả bảo vệ TB tụy tạng min6 in vitro Khảo sát khả năng bảo vệ tế bào min6 khỏi quá trình chết của cao chiết LXN/RMK được tiến hành theo phương pháp Rojas et al. (2014). 2.4 Khảo sát hoạt tính sinh học kháng BĐTĐ in vivo 2.4.1 Xây dựng mô hình chuột nhắt trắng tăng glucose huyết Chuột nhắt trắng gây tăng glucose huyết bởi tiêm alloxan monohydrate (135 mg/kg khối lượng) vào phúc mạc mỗi ngày một lần trong 3 ngày. Sau 48 giờ ủ bệnh tính từ lần tiêm thứ 3, chuột được kiểm tra glucose huyết lúc đói. Chỉ tiêu glucose huyết ở chuột nhắt đạt chuẩn BĐTĐ là ≥ 250 mg/dL (Chen et al., 2015; Dra et al., 2019). 2.4.2 Khảo sát hiệu quả điều trị BĐTĐ của LXN/RMK in vivo Chuột nhắt trắng bình thường và chuột nhắt trắng gây tăng glucose huyết được chia thành 11 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức gồm 6 con chuột như sau: chuột gây tăng glucose huyết không điều trị (nhóm đối chứng bệnh lý), chuột bình thường uống nước muối sinh lý (nhóm đối chứng sinh lý), chuột gây tăng glc huyết được điều trị bằng glucophage, LXN và RMK. Thời gian thí nghiệm với mỗi nghiệm thức là 28 ngày, được tiến hành cùng lúc, trong cùng điều kiện chăm sóc. Nồng độ cao chiết thực vật được tính toán sau khi thí nghiệm độc tính cấp kết thúc. Nồng độ glucophage dùng cho thử nghiệm được tính toán dựa trên phương pháp xác định liều hiệu quả của thuốc giữa người và chuột nhắt trắng là 1/12 (Nguyễn Thượng Dong, 2014). 4
2.4.3 Khảo sát khả năng điều hòa lipid huyết trên chuột gây tăng glucose huyết của LXN và RMK Sau khi chuột kết thúc thí nghiệm sẽ được giải phẫu lấy máu tim để xét nghiệm các chỉ tiêu sinh hóa về hàm lượng lipid huyết gồm: cholesterol tổng, triglyceride, low density lipoprotein (LDL-Cho), high density lipoprotein cholesterol (HDL-Cho) và các chỉ số liên quan bệnh tim mạch như: atherogenic index (AI), coronary rish index (CRI), cardiovascular rish index (CVRI) (Kayamori và Igarashi, 1994, Noda et al., 2000, Muruganandan et al., 2007). LDL-Cho = cholesterol tổng - (HDL- Cho + (triglyceride/5)) Atherogenic index (AI) = (cholesterol tổng - HDL- Cho)/ HDL- Cho Coronary rish index (CRI) = TC/HDL Cardiovascular rish index (CVRI) = TG/HDL 2.4.4 Hiệu quả điều hòa enzyme chuyển hóa in vivo Thí nghiệm được thực hiện như thí nghiệm in vitro ở trên (đã trình bày ở mục 2.4.1; 2.4.2; 2.4.4) nhưng enzyme thương mại được thay bằng dịch đồng thể gan hoặc cơ xương của các nghiệm thức chuột thí nghiệm. 2.4.5 Khảo sát mô bệnh học gan và thận ở chuột thí nghiệm Mẫu gan hoặc thận được cố định trong dung dịch formaldehyde 4% trong thời gian 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Mẫu gan sau khi cố định được tẩm parafin và cắt mẫu có chiều dày 3 µm. Sau đó, mẫu được nhuộm bằng hematoxylin và eosin (H&E). 2.5 Khảo sát độc tính cấp của cao chiết thực vật trên chuột nhắt trắng Độc tính cấp của LXN và RMK trên chuột nhắt trắng được tiến hành khảo sát in vivo một liều cao chiết duy nhất với nồng độ 1000, 2500 và 5000 mg/kg/lần. Chỉ số LD50 (Lethal Dose of 50%, liều gây chết 50% số lượng động vật thí nghiệm) của cao chiết được xác định sau 72 giờ kết thúc thí nghiệm (Muruganandan et al., 2007, Dra et al., 2019). 2.6 Xử lý số liệu và thống kê Số liệu được trình bày bằng MEAN ± SEM. Kết quả được xử lý thống kê theo phương pháp ANOVA bằng phần mềm Minitab 16.0. Các biểu đồ được vẽ bằng phần mềm Microsoft Excel 2010. 5
CHƯƠNG 3: CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ly trích cao chiết tổng methanol lá xoài non và rễ me keo bằng phương pháp ngâm dầm Sau khi sấy khô 4 kg lá xoài non tươi, tổng khối lượng khô LXN thu được là 1 kg. Mẫu LXN có độ ẩm khá cao (75%). Hiệu suất cô quay đạt 9,5% và cao chiết methanol LXN thu được ở dạng cao mềm. Rễ me keo tươi (8 kg) sau khi sấy khô còn lại 5,1 kg. Rễ me keo có độ ẩm thấp (36,3%). Hiệu xuất cô quay (13,8%) đạt cao hơn so với LXN và cao chiết methanol RMK thu được ở dạng cao rắn. Cao chiết sau khi được cô quay được bảo quản ở 4oC. 3.2 Định tính thành phần hóa học, định lượng polyphenol và flavonoid tổng của cao chiết lá xoài non và rễ me keo 3.2.1 Định tính Kết quả định tính thành phần hóa học các hợp chất có trong cao chiết LXN gồm có: alkaloid, glycoside, flavonoid, tannin, phenol và triterpenoid. Các hợp chất như saponin, terpenoid và anthra quinone không phát hiện trong cao chiết LXN. Kết quả định tính thành phần hóa học có trong cao chiết RMK cho thấy sự có mặt của các hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau như: alkaloid, flavonoid, glycoside. phenol, tannin, saponin và triterpenoid. 3.2.2 Hàm lượng polyphenol và flavonoid tổng Hàm lượng flavonoid toàn phần (TFC) của LXN và RMK được tính tương đương mg QE/g cao chiết dựa vào phương trình chất chuẩn quercetin có dạng y = 0,0052x – 0,0088 (R² = 0,9887). Kết quả cho thấy, hàm lượng TFC của LXN (427,4 ± 4,9 mg QE/g cao chiết) thấp hơn RMK (432,9 ± 10,01 mg QE/g cao chiết). Kết quả khảo sát hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) của LXN và RMK được tính tương đương mg GAE/g cao chiết dựa theo phương trình đường chuẩn acid galic y = 0,0831x + 0,1118 (R² = 0,9838). Kết quả cho thấy rằng, hàm lượng polyphenol tổng của LXN (335,1 ± 1,84 mg GAE/g cao chiết) cao hơn so với hàm lượng TPC của RMK (246,5 ± 65,5 mg GAE/g cao chiết). 3.3 Khảo sát hoạt tính sinh học kháng BĐTĐ in vitro 3.3.1 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của LXN/RMK in vitro Kết quả cho thấy rằng, khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của LXN (EC 50 = 27,6 ± 0,88 µg/mL) cao hơn RMK (EC50 = 28,9± 0,80 µg/mL) và thấp hơn so với trolox (EC50 = 4,26 ± 0,09 µg/mL). 6
Hiệu suất khử Fe3+ thành Fe2+ của cao chiết RMK (EC50 = 69,3 ± 1,34 µg/mL) cao hơn so với LXN (EC50 = 321,4 ± 6,63 µg/mL) và thấp hơn chất chuẩn BHA (EC50 = 30,1 ± 0,72 µg/mL). Khả năng trung hòa gốc tự do ABTS+ của RMK (EC50 = 23,8 ± 2,4 µg/ mL) cao hơn LXN (EC50= 45,683 ± 0,498 µg/ mL) và thấp hơn chất chuẩn trolox (EC50 = 0,037 ± 0,004 µg/ mL). 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của LXN/RMK đến hoạt động của enzyme in vitro LXN ức chế hoạt động G6Pase (IC50 = 42,9 µg/mL), G6PDH (IC50= 82,6 µg/mL) tốt hơn so với RMK (IC50 = 56,0 µg/mL, IC50 = 92,7 µg/mL). RMK ức chế hoạt động enzyme LDH (IC50 = 122,4 µg/mL) tốt hơn so với LXN (IC50= 142,6 µg/mL). 3.3.3 Khảo sát hiệu quả bảo vệ TB tụy tạng MIN6 in vitro RMK liều 100 µg/mL được kết luận là nồng độ tốt nhất có khả năng bảo vệ tế bào min6 khỏi sự chết gây ra bởi tunicamycin khi so với LXN (500 µg/mL) 3.4 Khảo sát hoạt tính sinh học kháng BĐTĐ in vivo 3.4.1 Xây dựng mô hình chuột nhắt trắng tăng glucose huyết Glucose huyết của chuột được tiêm AM tăng khác biệt có ý nghĩa thống kê (588,1 ± 26,8 mg/dL), đạt trị số gây tăng glucose huyết ở chuột nhắt trắng (Zhao et al., 2011) và khối lượng (23,1 ± 3,02 g) giảm khác biệt có ý nghĩa thống kê so với khối lượng trước khi gây tăng glucose huyết (139,6 ± 16,6 mg/dL, 34,2 ± 3,6 g và glucose huyết). 3.4.2 Hiệu quả điều hòa glucose huyết trên chuột gây tăng glucose huyết của LXN và RMK Chuột ở nghiệm thức đối chứng bệnh lý (chuột gây tăng glucose huyết không được điều trị) xuất hiện hiện tượng chuột chết ở ngày thứ hai. Sau 7 ngày, nghiệm thức đối chứng bệnh lý chết hoàn toàn. Nghiệm thức chuột gây tăng glucose huyết được điều trị bằng thuốc biệt dược glucophage có hàm lượng glucose huyết (117,7 ± 8,6 mg/dL) giảm khác biệt có ý nghĩa thống kê so với trước khi được điều trị và khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng sinh lý. Tuy nhiên, khối lượng của chuột gây tăng glucose huyết uống glucophage (28,1 ± 5,43 g) giảm khác biệt có ý nghĩa thống kê so với chuột bình thường. Điều này chứng tỏ, việc sử dụng glucophage có khả năng hạ glucose huyết chuột gây tăng glucose huyết nhưng không phục hồi trọng lượng sau 28 ngày sử dụng. Đây là một trong những hạn chế của thuốc hóa dược hiện nay (Bảng 3.1). 7
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của LXN và RMK đến khối lượng và glucose huyết ở chuột thí nghiệm sau 28 ngày. Thông số Glucose Khối lượng Tỷ lệ Nghiệm thức huyết (g) sống (mg/dL) (%) Đối chứng bệnh lý 588,1a±26,8 23,1d±3,02 0 Đối chứng sinh lý 153,3bc±25,7 36,9a±3,83 100 c ab BT+ 450 LXN 112,7 ±8,6 31,1 ±3,42 100 c a BT + 450RMK 123,7 ±10,3 36,2 ± 2,7 100 Glucophage 117,7c±8,6 28,1bc±5,43 100 bc ab 150LXN 148,3 ±15,4 34,8 ±3,54 50 300LXN 171,8b±19,5 31,8abc±3,72 100 bc ab 450LXN 134,7 ±28,6 33,5 ±1,80 100 150RMK 144,3bc±34,5 29,8abc±2,28 100 bc bc 300RMK 127,7 ±25,9 27,8 ±3,04 100 c bc 450RMK 130,0 ±31,0 26,7 ±3,68 100 Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị. Các mẫu tự theo sau các giá trị trong cùng một cột khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%; n = 6; Đối chứng sinh lý: chuột bình thường uống nước muối sinh lý; Đối chứng bệnh lý: chuột tăng glucose huyết uống nước muối sinh lý; Glucophage: chuột gây tăng glucose huyết uống glucophage 108 mg/kg khối lượng; BT + 450 LXN/ RMK: chuột bình thường uống LXN/ RMK liều 450 mg/kg khối lượng; 150 LXN/ MK; 300 LXN/ RMK; 450 LXN/ RMK: chuột gây tăng glucose huyết uống LXN hoặc RMK liều lần lượt 150, 300 và 450 mg/kg khối lượng LXN. Nghiệm thức chuột gây tăng glucose huyết được điều trị bằng LXN liều 150 mg/kg có 50% số lượng chuột tử vong sau 7 ngày. Vậy, LXN liều 150 mg/kg được xem là không có hiệu quả ở việc điều trị chuột gây tăng glucose huyết. Nghiệm thức chuột gây tăng glucose huyết được điều trị bằng LXN liều 300 mg/kg có giá trị glucose huyết (134,7 ± 28,6 mg/dL) giảm khác biệt có ý nghĩa thống kê so với chuột gây tăng glucose huyết và khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng sinh lý. Bên cạnh đó, thể trọng chuột gây tăng glucose huyết được điều trị bằng LXN liều 300 mg/kg được phục hồi trọng lượng (33,5 ± 1,80 g) khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng sinh lý. Nghiệm thức chuột gây tăng glucose huyết được điều trị bằng RMK liều 150 mg/kg khối lượng có giá trị glucose huyết (144,3 ± 34,5 mg/dL) giảm khác biệt có ý nghĩa thống kê so với trước khi điều trị và khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng sinh lý. Bên cạnh đó, nghiệm thức chuột gây tăng glucose huyết uống RMK nồng độ 150 mg/kgkhối lượng (29,8 ± 2,28 g) khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng sinh lý. Tóm lại, RMK (150 mg/kg) có khả năng hạ glucose huyết và phục hồi khối lượng chuột gây tăng glucose huyết tốt nhất so với LXN (450 mg/kg) và glucophage. 8
3.4.3 Hiệu quả điều hòa lipid huyết trên chuột gây tăng glucose huyết của cao chiết LXN và RMK Chuột gây tăng glucose huyết có sự rối loạn chuyển hóa lipid, các thông số lipid huyết như cholesterol tổng (268,3 ± 112,6 mg/dL), triglycerid (315,6 ± 39,4 mg/dL), LDL-Cho (265,1 ± 41,4 mg/dL) cao khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng sinh lý (144,1 ± 25,3 mg/dL; 134,6 ± 39,4 mg/dL; 24,0 ± 15,6). Bên cạnh đó, hàm lượng HDL-Cho của nhóm đối chứng bệnh lý (28,3 ± 44,0 mg/dL) giảm so với nhóm đối chứng sinh lý (93,3 ± 17,0 mg/dL). Điều này có nghĩa là chuột gây tăng glucose cảm ứng bởi AM bị rối loạn lipid huyết. Cao chiết LXN (450 mg/kg) có hiệu quả tốt nhất, giảm hàm lượng TC (50%), TG (88,2%), AI (96,4%), CRI (87,8%), CVRI (91,1%) so với nghiệm thức đối chứng bệnh lý và đạt chỉ số khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với chuột bình thường. Cao chiết LXN (450 mg/kg) cũng có khả năng giảm 65,2% hàm lượng LDL-Cho ở chuột gây tăng glucose huyết, tăng chỉ số lipoprotein có lợi HDL- Cho 75,5% so với nghiệm thức đối chứng bệnh lý (Bảng 3.2). Bảng 3.2. Ảnh hưởng của cao chiết LXN và RMK đến lipid huyết ở chuột gây tăng glucose huyết. Thông số lipid Nghiệm thức TC TG LDL-C HDL-C (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL) 268,3a±11 315,6a 265,1a 28,3c Đối chứng bệnh lý 2,6 ±39,4 ±41,4 ±44,0 144,1b 134,6bcd 24,0b 93,3ab Đối chứng sinh lý ±25,3 ±39,4 ±15,6 ±17,0 145,4b 153,8bcd 32,3b 82,4b G ±35,1 ±21,9 ±43,0 ±24,5 158,3b 113,9bcd 32,6b 103ab 150 LXN ±19,3 ±13,5 ±21,8 ±2,7 129,3b 75,2d 75,2b 92,0ab 300 LXN ±11,7 ±4,8 ±4,9 ±9,3 b cd b 136,4 92,2 92,2 95,2ab 450 LXN ±29,5 ±19,6 ±19,6 ±17,2 153,8b 184,4b 18,0b 126,8a 150 RMK ±21,9 ±89,3 ±27,4 ±42,5 155,7b 112,1bcd 28,4b 104,9ab 300 RMK ±36,1 ±68,0 ±11,7 ±27,4 149,3b 126,8bcd 27,24b 97,8b 450 RMK ±10,6 ±42,5 ±18,4 ±14,9 Ghi chú: Các mẫu tự theo sau các giá trị trong cùng một cột khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. n = 6; Đối chứng sinh lý: chuột bình thường uống nước muối sinh lý; Đối chứng bệnh lý: chuột gây tăng glucose huyết uống nước muối sinh lý; G: gây tăng glucose huyết uống glucophage 108 mg/kg khối lượng; BT + 450 LXN/ RMK: chuột bình thường uống LXN/ RMK liều 450 mg/kg khối lượng;150 LXN/ MK; tăng glc huyết + 300 LXN/ RMK; 450 LXN/ RMK: chuột gây tăng glucose huyết uống LXN hoặc RMK liều lần lượt 150, 300 và 450 mg/kg khối lượng LXN. 9
Cao chiết RMK ở nồng độ 150 mg/kg được kết luận là có hiệu quả tốt nhất, hàm lượng cholesterol tổng, triglycerid, LDL-Cho và chỉ số động mạch giảm lần lượt 42,0%; 64,4%; 89,7% và 95,2% so với nhóm đối chứng bệnh lý và đạt chỉ số khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với chuột bình thường. Ngoài ra, ở nghiệm thức này, chuột có khả năng tăng chỉ số lipoprotein có lợi HDL-Cho 348% so với nghiệm thức đối chứng bệnh lý. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của LXN và RMK đến chỉ số tim mạch chuột thí nghiệm Nghiệm thức AI CRI CVRI b b Đối chứng sinh lý 0,55 ±0,16 1,56 ±0,16 1,46b±0,28 Đối chứng bệnh lý 11,7a±1,57 12,7a±1,57 11,3a±1,80 G 0,89b±0,79 1,89b±0,79 2,00b±0,59 150LXN 0,69b±0,40 1,60b±0,39 1,18b±0,42 300 LXN 0,42b±0,16 1,41b±0,16 0,82b±0,80 450 LXN 0,43b±0,74 1,43b±0,07 1,01b±0,33 150 RMK 0,31b±0,43 1,31b±0,43 1,48b±0,69 300 RMK 0,49b±0,07 1,49b±0,07 1,03b±0,48 450 RMK 0,55b±0,16 1,55b±0,16 1,37b±0,63 Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị. Các mẫu tự theo sau các giá trị trong cùng một cột khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%; n = 6; Đối chứng sinh lý: chuột bình thường uống nước muối sinh lý; Đối chứng bệnh lý: chuột gây tăng glucose huyết uống nước muối sinh lý; G: chuột gây tăng glucose huyết uống 170 mg/kg khối lượng thuốc biệt dược glucophage; 150 LXN/ RMK: chuột gây tăng glucose huyết uống 150 mg/kg khối lượng LXN/ RMK; 300 LXN/ RMK: chuột gây tăng glucose huyết uống 300 mg/kg khối lượng LXN/ RMK; + 450 LXN/ RMK: chuột gây tăng glucose huyết uống 450 mg/kg khối lượng LXN/ RMK. 10
3.4.4 Hiệu quả điều hòa enzyme chuyển hóa glucose in vivo 3.4.4.1 Enzyme G6Pase Kết quả khảo sát khả năng điều hòa G6Pase ở gan chuột gây tăng glucose huyết được trình bày ở Bảng 3.4. Bảng 3.4 Kết quả điều hòa enzyme G6Pase trên gan chuột thí nghiệm. Phần trăm ức chế hoạt Hàm lượng Pi Nghiệm thức động enzyme (mg/dL) (%) Đối chứng sinh lý 3,32b±0,34 - Đối chứng bệnh lý 8,30a±0,34 0 G 1,75d±0,50 89,9abc±2,23 150 LXN 2,48c±0,24 85,7c±1,90 300 LXN 2,30c±0,71 86,4c±6,20 450 LXN 1,40e±0,30 91,7a±3,50 150 RMK 3,16b±0,39 89,8c±2,61 300 RMK 2,42c±0,18 91,3ab±2,62 450 RMK 2,48c±0,52 91,1ab±2,31 Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị. Các mẫu tự theo sau các giá trị trong cùng một cột khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%; n = 6; Đối chứng sinh lý: chuột bình thường uống nước muối sinh lý; Đối chứng bệnh lý: chuột gây tăng glucose huyết uống nước muối sinh lý; G: chuột gây tăng glucose huyết uống 170 mg/kg khối lượng thuốc biệt dược glucophage; 150 LXN/ RMK: chuột gây tăng glucose huyết uống 150 mg/kg khối lượng LXN/ RMK; 300 LXN/ RMK: chuột gây tăng glucose huyết uống 300 mg/kg khối lượng LXN/ RMK; + 450 LXN/ RMK: chuột gây tăng glucose huyết uống 450 mg/kg khối lượng LXN/ RMK. Việc ức chế quá mức hoạt động G6Pase sẽ dẫn đến tình trạng hạ glucose huyết, hôn mê. Để lựa chọn nồng độ tốt nhất để điều hòa hoạt động G6Pase cần kết hợp so sánh hoạt động của enzyme G6Pase ở gan với nghiệm thức đối chứng sinh lý. Glucophage có khả năng giảm hoạt động G6Pase ở gan chuột gây tăng glucose huyết nhưng thấp khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng sinh lý. LXN ở nồng độ 450 mg/kg có khả năng giảm hoạt động enzyme G6Pase tốt nhất nhưng lại thấp khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng sinh lý. RMK (150 mg/kg) có khả năng điều hòa hoạt động enzyme G6Pase ở gan chuột gây tăng glucose huyết thấp khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng bệnh lý và khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng sinh lý. Vậy, RMK nồng độ 150 mg/kg là tốt nhất so với LXN và glucophage để sử dụng trong việc điều chỉnh hoạt động enzyme G6Pase để kiểm soát hàm lượng glucose tạo ra ở gan chuột gây tăng glucose huyết. 3.4.4.2 Enzyme G6PDH Hàm lượng NADPH ở nghiệm thức đối chứng bệnh lý (356,2 ± 66,8 µmol/mL) giảm khoảng 123% so với nghiệm thức đối chứng sinh lý (794,4 ± 198,1 µmol/mL). 11
Điều này chỉ ra rằng, hoạt động enzyme G6PDH ở gan chuột đã bị suy giảm nghiêm trọng khi gây tăng glucose huyết. Ở liều 450 mg/kg LXN có khuynh hướng phục hồi hoạt động enzyme G6PDH (15,8%) tuy nhiên sự phục hồi này không làm cho G6PDH hoạt động bình thường như ở nghiệm thức đối chứng sinh lý. Liều 300 mg/kg cao chiết RMK có khuynh hướng phục hồi khoảng 117,1% hoạt động của enzyme G6PDH so với nghiệm thức đối chứng bệnh lý. Liều 450 mg/kg cao chiết RMK có khả năng tăng 210,9% hoạt động của enzyme G6PDH ly trích từ gan chuột gây tăng glucose huyết khi so với với nghiệm thức đối chứng bệnh lý. Bên cạnh đó khi so với hoạt động của enzyme G6PDH ở nghiệm thức chuột gây tăng glucose huyết được điều trị liều 450 mg/kg (1107,5 ± 442,7 µmol mL) cũng tăng 28,3% so với nghiệm thức đối chứng sinh lý (794,4 ± 198,1 µmol/mL). Bảng 3.5 Ảnh hưởng của LXN và RMK đến hoạt động enzyme G6PDH ở gan chuột thí nghiệm Hàm lượng Phần trăm tăng hoạt NADPH Nghiệm thức động enzyme (µmol/dL) G6PDH (%) Đối chứng sinh lý 794,4b±198,1 - Đối chứng bệnh lý 356,2cd±66,8 0 G 315,8d±71,3 -11,3 150 LXN 332,2cd±38,9 -6,7 300 LXN 304,4d±62,0 -14.5 450 LXN 412,4cd±94,3 +15,8 150 RMK 300,3d±86,2 -15,7 300 RMK 773,3b±35,6 + 117,1 450 RMK 1107,5a±442,7 + 210,9 Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị. Các mẫu tự theo sau các giá trị trong cùng một cột khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%; n = 6; Đối chứng sinh lý: chuột bình thường uống nước muối sinh lý; Đối chứng bệnh lý: chuột gây tăng glucose huyết uống nước muối sinh lý; G: chuột gây tăng glucose huyết uống 170 mg/kg khối lượng thuốc biệt dược glucophage; 150 LXN/ RMK: chuột gây tăng glucose huyết uống 150 mg/kg khối lượng LXN/ RMK; 300 LXN/ RMK: chuột gây tăng glucose huyết uống 300 mg/kg khối lượng LXN/ RMK; + 450 LXN/ RMK: chuột gây tăng glucose huyết uống 450 mg/kg khối lượng LXN/ RMK. Tuy nhiên, sản phẩm NADPH của quá trình chuyển hóa G6PDH là một trong những nguồn nguyên liệu cần thiết cho quá trình tích tụ mỡ trắng ở các mô. Sự biểu hiện quá mức của enzyme G6PDH sẽ dẫn đến tình trạng béo phì. Thực tế, bệnh béo phì và BĐTĐ type 2 đã được chứng minh có mối quan hệ mật thiết với nhau (Park et al., 2017). Ngược lại, sự ức chế quá mức G6PDH được chứng minh là nguyên nhân gây tăng stress oxy hóa, chết tế bào và giảm sự tiết insulin của tế bào tụy tạng (Barbara 12
et al., 2016). Vậy, liều 450 mg/kg khối lượng RMK có thể sẽ gây ra biến chứng béo phì ở chuột gây tăng glucose huyết vì đã làm tăng hoạt động của enzyme G6PDH khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức đối chứng sinh lý. Từ những kết quả này kết luận rằng, nồng độ 300 mg/kg khối lượng RMK là liều tốt nhất để điều hòa hoạt động G6PDH ở chuột gây tăng glucose huyết. 3.4.4.3 Enzyme LDH Hàm lượng NADPH sau phản ứng của nghiệm thức đối chứng bệnh lý (7,86 ± 0,72 µmol/mL) giảm khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng sinh lý. Điều này cho thấy rằng, hoạt động của enzyme LDH ở cơ xương chuột gây tăng glucose huyết cảm ứng bởi AM tăng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng sinh lý. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của (Forbes et al., 2013). Cao chiết LXN và RMK đã không góp phần điều hòa hoạt động enzyme LDH ở cơ xương chuột gây tăng glucose huyết ở các nồng độ khảo sát (150, 300, 450 mg/kg). Bảng 3.6 Ảnh hưởng của cao chiết LXN và RMK đến hoạt động enzyme LDH ở cơ xương chuột thí nghiệm. Nghiệm thức Hàm lượng NADH (µmol/mL) Đối chứng sinh lý 9,43a±0,8 Đối chứng bệnh lý 7,86b±0,72 G 6,89bc±0,14 150 LXN 6,76cd±0,75 300 LXN 7,50bc±0,53 450 LXN 7,09bcd±0,48 150 RMK 6,5cd±0,39 300 RMK 6,76cd±0.81 450 RMK 7,05bc±0,48 Ghi chú: kết quả ± với độ lệch chuẩn của từng giá trị. Các mẫu tự theo sau các giá trị trong cùng một cột khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%; n = 6; Đối chứng sinh lý: chuột bình thường uống nước muối sinh lý; Đối chứng bệnh lý: chuột gây tăng glucose huyết uống nước muối sinh lý; G: chuột gây tăng glucose huyết uống 170 mg/kg khối lượng thuốc biệt dược glucophage; 150 LXN/ RMK: chuột gây tăng glucose huyết uống 150 mg/kg khối lượng LXN/ RMK; 300 LXN/ RMK: chuột gây tăng glucose huyết uống 300 mg/kg khối lượng LXN/ RMK; + 450 LXN/ RMK: chuột gây tăng glucose huyết uống 450 mg/kg khối lượng LXN/ RMK. 3.4.5 Khảo sát mô bệnh học gan và thận ở chuột gây tăng glucose huyết 3.4.5.1 Ảnh hưởng của LXN và RMK đến cấu trúc mô học gan Kết quả phân tích cấu trúc mô gan cho thấy, gây tăng glucose huyết gây nên hai dạng tổn thương chính lên cấu trúc mô gan chuột bình thường, bao gồm: sự thoái hóa mỡ dẫn tới xơ hóa mô gan và thoái hóa hạt đồng thời gây nên sự hoại tử diện rộng trên cấu trúc mô. Việc điều trị bằng glucophage cho hiệu quả phục hồi thấp. Cao chiết LXN liều điều trị 450 mg/kg có khả năng phục hồi tốt tổn thương gan do tăng glucose 13
huyết. Cao chiết RMK có khả năng phục hồi các tổn thương gan do đái tháo đường và đạt hiệu quả tốt nhất ở nồng độ 300 mg/kg. 3.4.5.2 Ảnh hưởng của LXN và RMK đến cấu trúc mô học thận Cấu trúc mô thận chuột đối chứng bệnh lý có những tổn thương điển hình bao gồm tổn thương cầu thận, tổn thương màng nền ống thận và động mạch thận. Ở nồng độ 450 mg/kg, LXN cho hiệu quả điều trị tốt, sự tái tạo cấu trúc ống gần như hoàn toàn và không nhận thấy dấu hiệu của tổn thương do thoái hóa bào tương và hoại tử ống. Cao chiết RMK ở nồng độ 300 mg/kg cải thiện tình trạng ống bị tổn thương tốt hơn các nồng độ còn lại, các ống xếp sát vào nhau và thấy rõ màng nền ống thận. 3.5 Khảo sát độc tính cấp của LXN và RMK LXN và RMK được kết luận là không gây độc. LXN hoặc RMK liều cao (1000, 2500, 5000 mg/kg khối lượng) được khẳng định không ảnh hưởng glucose huyết và trọng lượng chuột, không gây tổn thương tế bào gan, không có dấu hiệu của nhiễm trùng cũng như không ảnh hưởng đến chức năng tạo máu trên chuột. Bảng 4. 1. Ảnh hưởng độc tính cấp của LXN và RMK trên chuột thí nghiệm Trước khi thử độc Sau khi thử độc Nghiệm thức Glucose Glucose huyết Trọng lượng Trọng lượng (g) huyết (mg/dL) (g) (mg/dL) Đối chứng sinh lý 32.0b ± 0.94 124,2a±13,6 35,0a±0,94 137a±33,46 BT+1000LXN 31.0b±1,12 150,3ab±20,0 35,0a ±1,23 114,7ab±29,9 BT+2500LXN 32.0b±0,82 158,9a±19,0 35,0a±2,50 75,2b±22,5 BT+5000LXN 31,2b±1,37 116,7ab±21,1 34,0a±2,70 110,8ab±33,8 BT+1000RMK 31,2a±1,25 116,7ab±21,1 33,8a±3,40 100,8ab±17,0 BT+2500RMK 31,5b±1,40 113,2ab±24,0 32,1a±2,70 136,5a±49,3 BT+5000RMK 31,3b±1,54 134,3ab±20,9 34,0a±2,30 130,7ab±39,0 Ghi chú: n = 6, các giá trị có mẫu tự theo sau giống nhau trong cùng một cột thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.Đối chứng sinh lý: chuột bình thường*uống nước muối sinh lý; BT + 1000 LXN; BT + 2500 LXN, BT + 5000 LXN: chuột bình thường uống LXN liều lần lượt 1000, 2500 và 5000 mg/kg khối lượng. BT + 1000 RMK; BT + 2500 RMK, BT + 5000 RMK: chuột bình thường uống RMK liều lần lượt 1000, 2500 và 5000 mg/kg khối lượng. 3.5.1 Ảnh hưởng của LXN và RMK đến cấu trúc mô học gan và thận 3.5.1.1 Ảnh hưởng của LXN và RMK đến cấu trúc mô học gan LXN (1000, 2500, 5000 mg/kg) thể hiện những tổn thương nghiêm trọng trong cấu trúc mô gan. Cao chiết RMK (1000, 2500, 5000 mg/kg) không ảnh hưởng mô gan chuột. 14
3.5.1.2 Ảnh hưởng của LXN và RMK đến cấu trúc mô học thận LXN và RMK (1000, 2500, 5000 mg/kg) đều có ảnh hưởng tiêu cực đến cấu trúc thận chuột bình thường. 15
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 3.6 Kết luận Từ những kết quả luận án đã đạt được cho thấy rằng, LXN và RMK đều có khả năng chống oxy hóa, bảo vệ tế bào tụy tạng min6 khỏi sự chết, ức chế hoạt động enzyme G6Pase, G6PDH, LDH in vitro. Tuy nhiên, RMK mang lại hiệu quả tốt hơn so với LXN. Bên cạnh đó, LXN và RMK cũng có tác dụng hạ glucose huyết, điều hòa lipid huyết và các enzyme G6Pase (gan), G6PDH (gan) và chống biến chứng bệnh tim mạch trên chuột gây tăng glucose huyết in vivo. LXN và RMK có khả năng phục hồi mô gan và thận ở chuột gây tăng glucose huyết. 3.7 Kiến nghị Tinh chất LXN và RMK có hoạt tính sinh học tham gia vào quá trình hạ glucose huyết và chống rối loạn chuyển hóa lipid, hạn chế biến chứng bệnh tim mạch trên chuột gây tăng glucose huyết cần được ly trích. Khảo sát và so sánh hoạt tính sinh học LXN giữa các giống xoài ở đồng bằng sông Cửu Long nhằm chọn ra giống xoài mang lại giá trị sinh học trong việc hỗ trợ điều trị gây tăng glucose huyết và hạn chế biến chứng gây tăng glucose huyết tốt nhất trên người. Khảo sát và so sánh hoạt tính sinh học giữa lá xoài già và lá xoài non. Khảo sát hiệu quả hoạt tính sinh học của LXN kết hợp với RMK. 16