Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu màng bao kết hợp vi khuẩn phân giải lân tạo phân bón vô cơ tan chậm sử dụng cho cây trồng

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

10
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học "Nghiên cứu màng bao kết hợp vi khuẩn phân giải lân tạo phân bón vô cơ tan chậm sử dụng cho cây trồng" được nghiên cứu với mục tiêu: Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan và khảo sát điều kiện tối ưu tạo vi hạt calcium sodium alginate; Tổng hợp màng polymer phân hủy sinh học; Cố định vi khuẩn phân giải lân trong vi hạt calcium sodium alginate; Tạo chế phẩm phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân và bước đầu thử nghiệm phân bón cho cây trồng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu màng bao kết hợp vi khuẩn phân giải lân tạo phân bón vô cơ tan chậm sử dụng cho cây trồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH **************** BÙI ĐOÀN PHƯỢNG LINH NGHIÊN CỨU MÀNG BAO KẾT HỢP VI KHUẨN PHÂN GIẢI LÂN TẠO PHÂN BÓN VÔ CƠ TAN CHẬM SỬ DỤNG CHO CÂY TRỒNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2023
Luận án được hoàn thành tại: Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Huỳnh Thanh Hùng TS. Nguyễn Ngọc Hà Người phản biện: Phản biện 1: .................................................................................................. .................................................................................................. Phản biện 2: .................................................................................................. .................................................................................................. Phản biện 3: .................................................................................................. .................................................................................................. Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp tại: Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh Vào hồi...........giờ........ngày.........thán........năm 2023. Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong nông nghiệp phân bón vô cơ có vai trò hết sức quan trọng và không thể thiếu đối với cây trồng. Tuy nhiên, hiệu suất sử dụng của nhiều loại phân bón vô cơ hiện nay chưa cao do quá trình hòa tan, bay hơi, rửa trôi của phân diễn ra nhanh và do phân bị cố định vào đất làm cho cây trồng không hấp thu được hoặc không kịp hấp thu, dẫn tới lãng phí, gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng tới hệ vi sinh vật có ích trong đất (Naz và Sulaiman, 2016). Một số nghiên cứu đã cho thấy một trong những cách kiểm soát tốc độ phóng thích của phân bón vô cơ là cần tìm ra những vật liệu phù hợp để tạo ra một lớp màng bao bên ngoài của phân. Lớp màng bao này có tác dụng hạn chế tới mức thấp nhất sự thất thoát chất dinh dưỡng, cũng như giảm sự cố định của phân bón vào đất. Từ đó, giúp tăng hiệu suất sử dụng phân bón, giảm chi phí, nâng cao năng suất cây trồng, giảm thiểu tác động của phân bón đến môi trường (Shaviv, 2001; Trenkel, 2010; Azeem và ctv, 2014). Lân là nguyên tố đa lượng cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển bình thường của cây trồng nói riêng và sinh vật nói chung. Lân là thành phần cấu tạo của nhiều chất hữu cơ quan trọng trong cây. Ngoài ra, lân còn có vai trò tạo môi trường đệm, ảnh hưởng đến khả năng hút các chất khoáng khác của cây (Bùi Trang Việt, 2000; Hoàng Minh Tấn và ctv, 2004). Tuy lân có nhiều trong đất, nhưng chủ yếu ở dạng không hòa tan nên cây trồng vẫn có thể bị thiếu lân. Trong nông nghiệp, để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho cây trồng, lân thường được bổ sung vào đất dưới dạng phân lân hóa học nhưng có tới hơn 80% lượng phân này bị cố định lại trong đất bởi các phức hợp kim loại - cation và trở thành dạng khó tiêu hoặc bị rửa trôi gây ra những vấn đề về môi trường và làm tăng chi phí trong sản xuất nông nghiệp (Sharpley, 1995; Gyaneshwar và ctv, 2002; Syers và ctv, 2011). Trong tự nhiên, cây trồng muốn hấp thu được các dạng lân khó tiêu này trong đất thường cần có sự hỗ trợ của các vi sinh vật, nhất là các vi khuẩn có khả năng chuyển hóa lân khó tan để tạo ra các dạng lân dễ tan (Bhattacharyya và Jha, 2012). Để hạn chế những tác động không có lợi của phân bón hóa học đối với môi trường và để tăng hiệu suất sử dụng lân thì việc sử dụng các vi sinh vật có ích trong đó có vi khuẩn chuyển hóa lân bổ sung vào trong đất là một trong những giải pháp thân thiện với môi trường và hữu hiệu giúp quản lý sự thiếu hụt lân trong đất nông nghiệp (Sharma và ctv, 2013; Santana và ctv, 2016; Kalayu, 2019). Trên thế giới những công trình khoa học nghiên cứu về kiểm soát tốc độ phóng thích của phân thông qua lớp màng bao bên ngoài đã được nghiên cứu từ những năm sáu mươi của thế kỷ trước. Hiện nay, ở những nước tiên tiến trên thế giới đã tạo ra được những sản phẩm phân bón tan chậm với màng bao ở quy mô thương mại, sản xuất công nghiệp. Ở Việt Nam, những nghiên cứu khoa học về lĩnh vực này còn chưa nhiều, mặc dù hiện nay ở nước ta cũng có những sản phẩm phân bón vô cơ tan chậm nhờ màng bao bên ngoài được tạo ra bởi các nguyên liệu khác nhau nhưng phần lớn là nhập khẩu về chủ yếu sử dụng trên hoa lan, cây cảnh. Mặt khác, lĩnh vực nghiên cứu tạo ra sản phẩm phân bón trong đó có sự kết hợp giữa phóng thích chất dinh dưỡng chậm và hoạt động của vi sinh vật còn rất hạn chế. Vì đây là lĩnh vực còn khá mới mẻ và vấn đề lớn cần giải quyết là phải tìm ra được phương pháp để
kéo dài thời gian sống của vi sinh vật trên màng bao phân cũng chưa được nghiên cứu rộng rãi. Từ những vấn đề nêu trên, đề tài: “Nghiên cứu màng bao kết hợp vi khuẩn phân giải lân tạo phân bón vô cơ tan chậm sử dụng cho cây trồng” được thực hiện. Kết quả của đề tài sẽ góp phần vào hướng nghiên cứu ở Việt Nam là tạo ra được phân bón vô cơ tan chậm (controlled release fertilizers) kết hợp vi sinh vật có ích giúp tăng hiệu quả sử dụng phân bón vô cơ, bổ sung nguồn vi sinh vật có ích cho đất, có ý nghĩa về kinh tế và góp phần vào giải quyết vấn đề về ô nhiễm môi trường do nông nghiệp gây ra. 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài Tạo được phân vô cơ tan chậm với màng bao tạo bởi polymer phân hủy sinh học có kết hợp vi khuẩn phân giải lân và bước đầu thử nghiệm hiệu quả trên cây trồng cạn ở điều kiện nhà lưới. 3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 5/2017 đến tháng 8/2022 tại Bộ môn Sinh học - Trường đại học Đồng Nai, Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Phòng Công nghệ Sinh học Vật liệu và Nano - Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành Phố Hồ Chí Minh. 4. Đối tượng nghiên cứu của đề tài Các vật liệu tạo màng phân tan chậm gồm: polyurethane, bentonite, CMC, PVA, sodium alginate, paraffin, urea và glycerol. Các chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa lân vô cơ khó tan được phân lập từ đất ở Đồng Nai (huyện Xuân Lộc, Nhơn Trạch, Long Khánh), Thành phố Hồ Chí Minh (Thủ Đức, Cần Giờ), Long An. Đối tượng cây trồng chính trong nghiên cứu là cây đậu phộng (Arachis hypogaea L.). 5. Giới hạn phạm vi nghiên cứu của đề tài Nghiên cứu một số điều kiện tối ưu để đưa thành công vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan lên màng bao phân vô cơ tan chậm đảm bảo vi khuẩn vẫn sống sau một thời gian nhất định. Phân vô cơ dùng để làm lõi phân tan chậm là phân vô cơ có chứa đạm và lân là phân DAP (16%N - 45%P2O5) của Công ty Cổ phần DAP – VINACHEM (DAP Đình Vũ), nghiên cứu sự phóng thích chất dinh dưỡng có trong phân theo thời gian là đạm và lân. Bước đầu thử nghiệm hiệu quả của phân vô cơ tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân trên cây trồng cạn là cây đậu phộng ở điều kiện nhà lưới. 6. Nội dung nghiên cứu của đề tài Đề tài có 4 nội dung nghiên cứu chính: Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan và khảo sát điều kiện tối ưu tạo vi hạt calcium sodium alginate. Nội dung 2: Tổng hợp màng polymer phân hủy sinh học. Nội dung 3: Cố định vi khuẩn phân giải lân trong vi hạt calcium sodium alginate. Nội dung 4: Tạo chế phẩm phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân và bước đầu thử nghiệm phân bón cho cây trồng.
7. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài  Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài đóng góp thêm cho phương pháp nghiên cứu ứng dụng hiệu quả vi sinh vật có ích trong nông nghiệp, đồng thời tạo tiền đề khoa học cho các nghiên cứu tiếp tục để phát triển phân bón thế hệ mới cho mục tiêu tăng cả hiệu quả kinh tế lẫn bảo vệ môi trường trong nông nghiệp.  Ý nghĩa thực tiễn Các kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần vào hướng nghiên cứu chế tạo thành công phân vô cơ tan chậm kết hợp vi sinh vật, qua đó nâng cao chất lượng, hiệu quả của phân bón vô cơ và giúp bổ sung một lượng vi sinh vật có ích cho đất. Đề tài này phù hợp với khuynh hướng hiện nay là gắn kết nghiên cứu khoa học cơ bản, phát triển và ứng dụng những kết quả đó vào thực tiễn sản xuất. Kết quả của đề tài có thể ứng dụng trong thực tiễn để sản xuất phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân, góp phần phát triển nông nghiệp bền vững, tăng hiệu quả kinh tế cho người nông dân trong canh tác nông nghiệp. 8. Tính mới của luận án Phân lập được 60 chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa lân vô cơ khó tan, trong đó có 3 chủng vi khuẩn có khả năng chịu được nồng độ muối 2% NaCl. Trên môi trường PVK bổ sung 3% NaCl và 4% NaCl chỉ có một chủng vi khuẩn xuất hiện vòng phân giải lân. Xác định được vật liệu phân hủy sinh học chính để làm màng bao phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân là polyurethane, bentonite, CMC, PVA, parafin và sodium alginate. Tạo được vi hạt cố định vi khuẩn bằng calcium sodium alginate giúp tăng khả năng chống chịu của vi khuẩn với điều kiện bất lợi, qua đó kéo dài thời gian tồn tại của vi khuẩn trên màng bao phân. Tạo được phân bón vô cơ tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân, qua thử nghiệm trên cây đậu phộng trồng trong điều kiện nhà lưới bước đầu cho thấy phân có ảnh hưởng tốt tới sự phát triển chiều cao, số cành, khả năng hình thành nốt sần và các yếu tố cấu thành năng suất của cây đậu phộng. 9. Bố cục luận án Luận án gồm 146 trang, có 3 chương, 32 bảng số liệu và 44 hình. Luận án tham khảo tổng cộng 209 tài liệu, trong đó có 57 tài liệu tiếng Việt và 152 tài liệu tiếng Anh.
Chương 1 TỔNG QUAN 1. 1. Phân bón tan chậm 1.1.1. Khái niệm Phân bón tan chậm là loại phân bón mà trong đó chất dinh dưỡng được phóng thích chậm hơn so với phân bón thông thường và ít nhiều có được kiểm soát thông qua việc tính toán tỷ lệ, mô hình và thời gian phóng thích chất dinh dưỡng trong quá trình tạo phân, cũng như việc lựa chọn vật liệu để tạo ra phân (Shaviv, 2001). 1.1.2. Phân biệt một số loại phân bón tan chậm Phân không bọc tan chậm (Slow release fertilizers - SRFs) là loại phân bón tan chậm không vỏ bọc có tỷ lệ, mô hình, thời gian phóng thích chất dinh dưỡng không dự đoán, không kiểm soát được và có tính tan trong nước giới hạn. Sự hòa tan của phân phụ thuộc vào bản chất của chất nền tạo ra phân, kích thước hạt phân và lượng nước có sẵn. Phân dễ bị tác động bởi các điều kiện xử lý như lưu trữ, vận chuyển và phân phối trên đồng ruộng; hoặc bởi các điều kiện môi trường như độ ẩm, nhiệt độ và hoạt động của vi sinh vật (Trenkel, 2010; Lawrencia và ctv, 2021). Phân bọc tan chậm (controlled release fertilizers - CRFs) là loại phân bón tan chậm có vỏ bọc có tỷ lệ, mô hình và thời gian phóng thích chất dinh dưỡng có thể dự đoán được trong giới hạn nhất định. Tốc độ phân giải dưỡng chất của phân phụ thuộc vào độ dày hay mỏng của lớp vỏ bọc (Trenkel, 2010; Lawrencia và ctv, 2021). Phân bón vô cơ có độ hòa tan thấp gồm các loại phân bón như đá phosphate PAPR (partially acidulated phosphate rock) hay các phân bón phosphate amoni kim loại có công thức chung MeNH4PO4.xH2O (với Me là các kim loại có hóa trị hai như Mg, Fe, Zn hoặc Mn) hay là sản phẩm ngưng tụ của urea - aldehyde. Tuy nhiên loại phân bón này trong thực tế được sử dụng rất hạn chế (Shaviv, 2001; Lawrencia và ctv, 2021). 1.1.3. Phân bọc tan chậm (CRFs) 1.1.3.1. Cấu tạo phân bọc tan chậm và cơ chế phóng thích chất dinh dưỡng của phân bọc tan chậm Một hạt phân bọc tan chậm CRFs thường có cấu tạo gồm 2 phần chính: phần bọc bên ngoài là lớp màng bao có độ dày mỏng khác nhau tùy theo yêu cầu về thời gian phóng thích, phần nhân bên trong có chứa các khoáng chất như: N, P, K, Bo,… (Azeem và ctv, 2014; Lawrencia và ctv, 2021). Phân bọc tan chậm có đặc điểm là sau khi bón vào đất, nước sẽ thấm qua lớp màng bao đi vào bên trong hạt phân, khi đó các khoáng chất sẽ hòa tan vào nước và khuếch tán qua lớp màng bao ra môi trường để cung cấp cho cây sử dụng. Quá trình phóng thích của các khoáng hòa tan bên trong hạt phân tiếp tục cho đến khi các thành phần khoáng này được phóng thích ra môi trường hoàn toàn, lớp màng bao còn lại sẽ phân hủy từ từ theo thời gian tùy theo bản chất của loại vật liệu làm màng bao phân (Du và ctv, 2006; Lubkowski và Grzmil, 2007; Wu và Liu, 2008; Azeem và ctv, 2014; Irfan và ctv, 2018; Lawrencia và ctv, 2021).
1.1.3.2. Tiêu chí đánh giá phân bọc tan chậm Theo AAPFCO (Association of American Plant Food Control Officials) (1997) và tiêu chí đưa ra của CEN (European Standardization Committee)/TC260 (1998) thì phân bón tan chậm CRFs là loại phân bón mà chất dinh dưỡng hoặc các chất dinh dưỡng trong phân được phóng thích thông qua một lớp màng bao ở nhiệt độ phòng đáp ứng được một trong ba tiêu chí sau: không quá 15% các chất khoáng được phóng thích trong vòng 24 giờ, không quá 75% các chất khoáng được phóng thích trong vòng 28 ngày và ít nhất 75% các chất khoáng được phóng thích trong khoảng thời gian đã định. Ngoài ra một số tiêu chí khác cũng được đưa ra đối với phân bọc tan chậm như hiệu quả sử dụng phân, thân thiện với môi trường và tiết kiệm chi phí (Lawrencia và ctv, 2021). 1.2. Lân trong đất và vi sinh vật phân giải lân 1.2.1. Các dạng lân trong đất và vai trò của lân đối với cây trồng Lân là một chất dinh dưỡng đa lượng cần thiết cho hoạt động bình thường của cây, đặc biệt là cây trồng ở đất vùng nhiệt đới với lượng lân trong đất thấp. Lân chiếm từ 0,2 - 0,8 trọng lượng khô của thực vật. Lân là thành phần cấu tạo của nhiều chất hữu cơ quan trọng trong cây, quyết định di truyền, cấu tạo tế bào, phân chia tế bào, sự sinh trưởng, phát triển, trao đổi chất và năng lượng, cũng như hoạt động sinh lý, sinh hóa của cây bao gồm cả quá trình quang hợp. Lân tham gia vào thành phần cấu tạo của vật liệu di truyền (DNA, RNA), các hợp chất cao năng (ATP, ADP,...), màng tế bào (phospholipid), enzyme oxi hóa khử (NAD, NADP, FAD, FMN), các esterphosphoric trong các sản phẩm trung gian của quá trình trao đổi chất (hexozophosphate, triophosphate, pentozophosphate...). Lân đóng vai trò quan trọng trong mọi khía cạnh của sự tăng trưởng và phát triển của cây trồng như sự phát triển của rễ, thân, quá trình hình thành hoa, quả, hạt. Khi được bón đủ lân, cây sẽ sinh trưởng phát triển xanh tốt, khỏe mạnh, năng suất cao, chất lượng nông phẩm tốt (Bùi Trang Việt, 2000; Hoàng Minh Tấn và ctv, 2004; Santana và ctv, 2016; Kalayu, 2019). Lân cần thiết cho tất cả các loại cây trồng nhưng hiệu quả nhất trên cây họ đậu lấy dầu như cây đậu phộng. Quá trình dinh dưỡng lân liên quan chặt chẽ với quá trình dinh dưỡng đạm. Đối với cây họ đậu, lân kích thích bộ rễ phát triển, rất cần cho sự hình thành nốt sần, tăng cường khả năng hút đạm của cây. Khi thiếu lân, quá trình sinh trưởng và phát triển của cây sẽ bị ảnh hưởng, nhất là đối với cây họ đậu (Chu Thị Thơm và ctv, 2006; Đường Hồng Dật, 2007; Santana và ctv, 2016; Kalayu, 2019). Trong đất lân tồn tại ở hai dạng là lân hữu cơ và lân vô cơ. Lân hữu cơ có trong đất có nguồn gốc từ tàn tích của động, thực vật và vi sinh vật, gồm có: phitin, acid nucleic, nucleoprotein, phosphatid, saccharose phosphate….Những hợp chất lân hữu cơ này được vi sinh vật phân giải tạo thành các hợp chất lân vô cơ khó tan, một số ít được tạo thành dạng dễ tan. Lân vô cơ thường ở trong các dạng khoáng như apatit, phosphoric, phosphate sắt, phosphate nhôm hoặc do con người bón phân lân vào đất. Khoảng 75% - 90% lượng lân hóa học được bón vào trong đất đều nhanh chóng bị cố định trong đất bởi các cation kim loại. Hầu hết các loại đất đều chứa một lượng lân đáng kể nhưng phần lớn chúng ở dạng khó tan và cây trồng không thể hấp thụ trực tiếp được mà chỉ hấp thụ được khi chúng ở dạng dễ tan (Rodrıguez và́ Fraga, 1999; Kalayu, 2019).
1.2.2. Vai trò của vi sinh vật phân giải lân Phần lớn lượng lân trong tự nhiên ở dạng khó hòa tan nên cây trồng rất khó hấp thu và sử dụng. Tuy nhiên, trong thực tế nhiều loại vi sinh vật có khả năng phân giải lân khó tan thành dạng dễ tan giúp cho cây trồng hấp thu dễ hơn (Bhattacharyya và Jha, 2012; Kalayu, 2019). Vi sinh vật phân giải lân là các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa hợp chất hữu cơ và lân vô cơ khó tan thành dễ tiêu đối với cây trồng. Các kết quả nghiên cứu đã xác định một số vi sinh vật có khả năng phân giải nhiều hợp chất lân khó tan khác nhau, giúp nâng cao hiệu quả sử dụng lân cho cây trồng. Nhiều vi sinh vật phân giải lân có khả năng tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật, một số khác có khả năng đối kháng vi sinh vật gây bệnh ở vùng rễ cây trồng, Phân bón vi sinh vật phân giải lân đã được nghiên cứu sản xuất sử dụng trong thực tế mang lại hiệu quả kinh tế được nông dân đánh giá cao. Các dòng vi khuẩn có hoạt tính phân giải lân như: Pseudomonas, Burkholderia, Agrobacterrium, Bacillus, Rhizobium, Achromobacter, Micrococcus, Aereobacter, Flavobacterium (Aleksandrov và ctv, 1967; Goldstein,1986; Kalayu, 2019). Trong toàn bộ quần thể vi sinh vật phân giải lân có trong đất thì vi khuẩn phân giải lân chiếm 1% – 50% và nấm phân giải lân chiếm 0,1% - 0,5%. Vi sinh vật phân giải lân tồn tại khắp các loại đất nhưng tỷ lệ của chúng trong đất tùy thuộc vào từng loại đất. Phần lớn vi sinh vật phân giải lân được phân lập ở vùng đất xung quanh rễ của nhiều loại cây trồng (Selvi và ctv, 2017; Kalayu, 2019). 1.3. Cố định tế bào vi sinh vật Cố định tế bào là một thuật ngữ chung dùng để mô tả sự bắt giữ vật lý các tế bào vi sinh vật sống trong một vùng không gian xác định nhằm hạn chế sự di chuyển tự do của tế bào vi sinh vật nhưng vẫn đảm bảo các đặc tính khác của vi sinh vật với môi trường xung quanh. Kỹ thuật cố định tế bào là kỹ thuật bao bọc hoặc định vị các tế bào còn nguyên vẹn lên một vùng không gian nhất định nhằm bảo vệ các hoạt tính xúc tác mong muốn (Karel và ctv, 1985; Żur và ctv, 2016). Kỹ thuật cố định tế bào bắt chước hiện tượng hình thành màng sinh học của vi sinh vật xảy ra trong tự nhiên được hình thành bởi các cộng đồng vi sinh vật được bao bọc trong ma trận ngậm nước tạo bởi các hợp chất polymer ngoại bào do chúng tự sản xuất ra tạo thành nhiều lớp tế bào. Sự tạo thành màng sinh học giúp vi sinh vật tự nó có khả năng gắn lên trên những bề mặt khác nhau trong tự nhiên (Abdelmajeed và ctv 2012; Flemming và ctv, 2016; Ge và ctv, 2016). Phương pháp cố định tế bào hiện nay gồm các phương pháp chính là: cố định tế bào trên bề mặt chất mang rắn, nhốt tế bào trong gel tạo bởi các polymer, keo tụ tế bào, nhốt tế bào bên trong hệ sợi, cố định tế bào bằng cách tạo vi nang (Karel và ctv, 1985; Pilkington và ctv, 1998; Martynenko và Gracheva, 2003; Abdelmajeed và ctv 2012; Bouabidi và ctv, 2019). 1.4. Tình hình nghiên cứu phân bón tan chậm và phân bón tan chậm kết hợp vi sinh vật Qua tìm hiểu các nghiên cứu cho thấy phân bón tan chậm ngày càng được các nhà khoa học quan tâm và đẩy mạnh nghiên cứu để sử dụng rộng rãi hơn trong thực tế không chỉ ở trên thế giới mà ở cả Việt Nam. Các nhà khoa học vẫn tiếp tục nghiên cứu tìm các vật liệu phù hợp làm màng bao phân bón để kiểm soát tốc độ phóng thích của phân với xu hướng là các vật liệu phải rẻ, có khả năng phân hủy sinh học, thân thiện với môi trường. Mặt khác, một
số nghiên cứu vẫn đang tiếp tục đánh giá hiệu quả sử dụng phân bón tan chậm trong thực tế và tìm cách cải thiện hiệu quả của các loại phân bón tan chậm đã được chế tạo và đang sử dụng. Ngoài ra, một số các nghiên cứu cũng đi theo hướng nghiên cứu để giúp hiểu rõ cơ chế, phát triển các mô hình động học của quá trình giải phóng chất dinh dưỡng của phân tan chậm. Qua tìm hiểu về các nghiên cứu trên thế giới về chế tạo phân vô cơ tan chậm có chứa vi sinh vật trên màng bao phân cho thấy các nghiên cứu còn rất hạn chế, tác giả chỉ tìm thấy được một công bố về bằng sáng chế tại Mỹ cho nghiên cứu về phân bón tan chậm với lớp màng bao có chứa vi sinh vật của Venkatramesh và ctv vào năm 2021. Còn ở Việt Nam chưa thấy công bố nghiên cứu của tác giả khác về phân bón tan chậm kết hợp vi sinh vật. Các nghiên cứu về chế tạo và đánh giá phân bón vô cơ tan chậm có cố định vi sinh vật trên màng bao của các tác giả khác ở thế giới và Việt Nam cũng chưa thấy công bố. CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Các mẫu đất được thu thập tại Đồng Nai, Thành phố Hồ Chí Minh, Long An để tiến hành phân lập vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan. Môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn: môi trường Pikovskaya (PVK), môi trường LB Các hóa chất, nguyên liệu chế tạo phân vô cơ tan chậm: PVA, CMC, glycerol, urea, polyurethane, bentonite, phân DAP Đình Vũ, calcium chloride, sodium alginate. Các hóa chất, vật liệu dùng trong các thí nghiệm: glucose, KCl, NaCl, Ca3(PO4)2, chitosan, thuốc nhuộm Crystal violet, dung dịch lugol, thuốc thử Fuchsin, (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, MnSO4, FeSO4, cao nấm men,... Giống đậu phộng L29 do Trung tâm Nghiên cứu và phát triển đậu đỗ cung cấp. Các loại phân bón: vôi bột nông nghiệp Xuân Đào (76,1% CaO), phân kali Phú Mỹ (61% K2O), phân DAP Đình Vũ (16% N : 45% P2O5). Dụng cụ, thiết bị: đĩa petri, bình tam giác, đèn cồn, que cấy vi sinh, bình hút ẩm, pippetman, giấy lọc, cân bốn số lẻ, ống đong các loại, máy lắc, tủ cấy, nồi hấp khử trùng, máy ly tâm, máy đo pH, máy đo OD, kính hiển vi quang học, tủ lạnh, tủ ấm, tủ mát, máy kiểm tra tính chất cơ học của vật liệu nano, kính hiển vi điện tử quét (SEM), máy Homogenizer (Bibby Scientific, Anh), máy phân tích kích thước hạt LS 13 320 (Beckman Coulter, Mỹ), máy đo độ bền vật liệu U9815A Keysight UTM T150 (Keysight Technologies, Mỹ),... 2.2. Phương pháp nghiên cứu Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên một nhân tố với các nghiệm thức khác nhau, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Kết quả của các thí nghiệm được tính toán và xử lý bằng phần mềm Excel. Phân tích ANOVA và trắc nghiệm phân hạng bằng phần mềm Minitab 18. 2.2.1. Nội dung 1: Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải lân và khảo sát điều kiện tối ưu tạo vi hạt calcium sodium alginate Mẫu đất được thu thập tại Đồng Nai (Xuân Lộc, Nhơn Trạch, Long Khánh), Thành phố Hồ Chí Minh (Thủ Đức, Cần Giờ), Tân Trụ - Long An. Trong đó các mẫu đất thu từ Nhơn Trạch, Cần Giờ, Tân Trụ là đất bị nhiễm mặn. Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn
phân giải lân từ đất trên môi trường thạch đĩa. Định danh chủng vi khuẩn thông qua nhuộm Gram, quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào bằng kính hiển vi và giải trình tự tại công ty Nam Khoa Bioteck. Phân tích kết quả giải trình tự bằng phần mềm sequencing analysis 5.3 và so sánh kết quả trên ngân hàng gen NCBI. Kết quả giải trình tự được hiệu chỉnh và tra cứu độ tương đồng nhờ công cụ 16S-based ID trên EzBioCloud và công cụ BLAST trên NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast). Phân tích quan hệ di truyền bằng phần mềm MEGAX với trình tự các loài vi khuẩn hiện có trên Genbank. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate, nồng độ calcium chloride và khối lượng phân tử sodium alginate đến kích thước hạt chứa vi khuẩn nhằm đưa ra một quy trình hoàn thiện và tối ưu cho quá trình cố định vi khuẩn. Kích thước của vi hạt calcium sodium alginate phải đủ nhỏ để thuận lợi cho quá trình tạo màng bao, cũng như khống chế được độ dày của màng bao ở mức hiệu quả, đồng thời vẫn phải đảm bảo được độ bền vững của cấu trúc vi hạt, mật độ vi khuẩn phù hợp và khả năng ứng dụng cũng như hiệu quả kinh tế. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate, nồng độ calcium chloride và khối lượng phân tử sodium alginate đến kích thước vi hạt calcium sodium alginate thông qua việc so sách kích thước vi hạt thu được ở nồng độ sodium alginate, nồng độ calcium chloride và khối lượng phân tử sodium alginate khác nhau. 2.2.2. Nội dung 2: Tổng hợp màng polymer phân hủy sinh học Phương pháp dung dịch là phương pháp được lựa chọn để tạo màng polymer vì đây là phương pháp kinh tế, đơn giản, dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm. Phương pháp dung dịch là phương pháp trộn và hòa tan các polymer trong nước hoặc trong các dung môi (Nguyễn Văn Khôi, 2007; Han và ctv, 2009; Nguyễn Thị Thu Thảo, 2013; Ngô Thị Minh Phương và ctv, 2018). Các màng được tạo ra gồm: màng PVA, màng CMC, màng polymer tạo ra bởi sự kết hợp giữa CMC với PVA, urea và glycerol. Khảo sát khả năng phân hủy sinh học của màng polymer tạo ra bởi sự kết hợp giữa CMC với PVA, urea và glycerol qua quan sát sự thay đổi hình thái cấu trúc bề mặt của màng, sự hiện diện của vi sinh vật và độ giảm khối lượng của màng. Khảo sát mức độ hấp thụ nước của màng CMC kết hợp với PVA, urea và glycerol chứa và không chứa vi hạt calcium sodium alginate để đánh giá ảnh hưởng vi hạt calcium sodium alginate đến khả năng hấp thụ nước của màng tạo bởi CMC kết hợp kết hợp với PVA, urea và glycerol. 2.2.3. Nội dung 3: Cố định vi khuẩn phân giải lân trong vi hạt calcium sodium alginate Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến nhân sinh khối chủng vi khuẩn được lựa chọn nhằm xác định thời gian nuôi cấy thích hợp để thu được mật số vi khuẩn ≥ 109 CFU/mL. Cố định vi khuẩn phân giải lân trong vi hạt calcium sodium alginate bằng phương pháp nhốt sử dụng calcium chloride và sodium alginate. Xác định mật số vi khuẩn trong vi hạt calcium sodium alginate, xác định hoạt tính phân giải lân của vi khuẩn được cố định trong vi hạt calcium sodium alginate, chứng minh vi khuẩn được bảo vệ trước điều kiện bất lợi của môi trường khi được cố định trong vi hạt calcium sodium alginate.
2.2.4. Nội dung 4: Tạo chế phẩm phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân và bước đầu thử nghiệm phân bón cho cây trồng Tạo màng bao bởi các loại polymer và khảo sát quá trình tan theo thời gian của phân trong nước nhằm xác định thứ tự các lớp màng bao để xây dựng quy trình chế tạo phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân. Tạo chế phẩm phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân với các lớp màng bao khác nhau bằng thiết bị trống quay, thiết bị vo viên. Phân tích hình thái bề mặt viên phân tan chậm bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM). Đánh giá khả năng sống của vi khuẩn phân giải lân trên màng bao của phân tan chậm theo thời gian và chọn lọc chủng vi khuẩn phân giải lân có khả năng chịu được nồng độ muối cao. So sánh hoạt tính phân giải lân của vi khuẩn tự do, vi khuẩn cố định trên màng tạo bởi PVA, CMC, urea và glycerol. Khảo sát khả năng phóng thích chất dinh dưỡng của phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân trong mô hình mô phỏng điều kiện tự nhiên để chứng minh khả năng phóng thích chất dinh dưỡng chậm theo thời gian của phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân trong điều kiện mô phỏng thực tế. Đánh giá mức độ phân hủy sinh học của màng bao phân tan chậm. Ứng dụng thử nghiệm phân bón tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân cho cây đậu phộng trong điều kiện nhà lưới để đánh giá hiệu quả của phân bón vô cơ tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân. Các chỉ tiêu theo dõi, đánh giá gồm: chiều cao cây ở thời điểm ra hoa rộ (ở thời điểm 30 sau khi cây mọc) và thời điểm thu hoạch (ở thời điểm 110 ngày sau khi cây mọc); tổng số cành trên cây lúc thu hoạch; số cành cấp một/cây mọc từ thân chính lúc thu hoạch; nốt sần được tại thời điểm ra hoa rộ và đâm tia tạo quả (ở thời điểm 40 ngày sau khi cây mọc); các yếu tố cấu thành năng suất của cây đậu phộng. Hạt giống đậu phộng được trồng trong chậu đất đã chuẩn bị. Mỗi chậu đất trồng 1 cây. Mỗi công thức phân bón là một nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 30 cây. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 6 công thức, trong đó nghiệm thức 2 là nghiệm thức đối chứng. Các nghiệm thức phân phân bón tan chậm kết hợp vi khuẩn chuyển hóa lân thử nghiệm trên cây đậu phộng trồng gồm: - NT1 : 500 kg vôi/ha + 60 kg K2O/ha (không bón đạm, lân). - NT2: 500 kg vôi/ha + 60 kg K2O/ha + 32 kg N/ha + 85 kg P2O5/ha (sử dụng phân DAP (16%N - 45%P2O5) của Công ty Cổ phần DAP – VINACHEM để cung cấp N và P2O5). - NT3: 500 kg vôi/ha + 60 kg K2O/ha + 32 kg N/ha + 85 kg P2O5/ha (sử dụng phân tan chậm có chứa vi khuẩn để cung cấp N và P2O5 tương đương ở NT2). - NT4: 500 kg vôi/ha + 60 kg K2O/ha + 25,6 kg N/ha + 68 kg P2O5/ha (sử dụng phân tan chậm có chứa vi khuẩn để cung cấp N và P2O5 đạt 80% so với NT2). - NT5: 500 kg vôi/ha + 60 kg K2O/ha + 19,2 kg N/ha + 51 kg P2O5/ha (sử dụng phân tan chậm có chứa vi khuẩn để cung cấp N và P2O5 đạt 60% so với NT2). - NT6: 500 kg vôi/ha + 60 kg K2O/ha + 12,8 kg N/ha + 34 kg P2O5/ha (sử dụng phân tan chậm có chứa vi khuẩn để cung cấp N và P2O5 đạt 40% so với NT2).
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn chuyển hóa lân vô cơ khó tan và khảo sát điều kiện tối ưu tạo vi hạt calcium sodium alginate Từ 90 mẫu đất thu từ Xuân Lộc, Nhơn Trạch, Long Khánh, Thủ Đức, Cần Giờ và Long An đã phân lập được 60 chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải lân vô cơ khó tan, trong đó có 37 chủng vi khuẩn Gram dương, 23 chủng vi khuẩn Gram âm, đa số chủng vi khuẩn có dạng hình que, chỉ có 7 chủng vi khuẩn có dạng hình cầu. Kết quả đánh giá hoạt tính phân giải lân khó tan của các chủng vi khuẩn thu nhận được dựa trên đường kính vòng phân giải trên môi trường PVK cho thấy có 16 chủng vi khuẩn phân giải lân có đường kính vòng phân giải < 5 mm, 33 chủng vi khuẩn phân giải lân có đường kính vòng phân giải 5 mm – 10 mm và 11 chủng vi khuẩn phân giải lân có đường kính vòng phân giải > 10 mm. Đa số các chủng vi khuẩn phân lập được đều có đường kính vòng phân giải lân đạt ổn định và lớn nhất ở thời điểm nuôi cấy tương ứng với 192 giờ - 240 giờ. Kết quả định tính khả năng chuyển hóa lân vô cơ khó tan dựa trên đường kính vòng phân giải trên môi trường PVK bước đầu chọn được chủng vi khuẩn PSM57 có kích thước vòng phân giải lớn nhất tương ứng là 13,6 mm được xác định là Paraburkholderia silvatlantica (tên cũ Burkholderia silvatlantica) để sử dụng cho một thí nghiệm chứng minh khả năng bảo vệ vi khuẩn của vi hạt calcium soldium alginate. Nồng độ 1% của sodium alginate có khối lượng phân tử 100 kDa và calcium chloride 1% là thông số tối ưu cho quá trình tạo vi hạt calcium sodium alginate có kích thước thích hợp cho mục đích cố định vi khuẩn vào màng bao polymer dùng để tạo màng cho phân tan chậm kết hợp vi sinh vật. 3.2. Nội dung 2: Tổng hợp màng polymer phân hủy sinh học Các thông số về khả năng đàn hồi, độ dãn dài và độ bền của Polyvinyl alcohol (PVA) và cacboxymethyl cellulose (CMC) cho thấy các polymer này có thể được sử dụng làm vật liệu tạo màng bao phân bón tan chậm. Khi thực hiện thao tác tách màng ra khỏi khuôn thì màng được tạo ra từ CMC giòn, dễ vỡ. Do vậy, để tạo màng có sử dụng CMC nên kết hợp CMC với một số thành phần khác để cải thiện tính chất của màng và giúp cho màng có tính chất mới. Sự phối trộn giữa các polymer giúp cải thiện tính chất cơ lý của màng tạo ra. Sự kết hợp thêm polyvinyl alcohol, glycerol và urea có ảnh hưởng đến khả năng tạo màng của cacboxymethyl cellulose. Tỷ lệ phần trăm (CMC : PVA: glycerol : urea) = ( 30: 60 : 5 : 5) là nghiệm thức được lựa chọn để làm màng bao phân kết hợp vi khuẩn phân giải lân vô cơ khó tan. Màng được tạo ra bởi CMC kết hợp với PVA, urea và glycerol có khả năng phân hủy sinh học. Sự hiện diện của vi hạt calcium sodium alginate trên màng tạo bởi CMC kết hợp với PVA, urea và glycerol có làm tăng khả năng hấp thụ nước và kéo dài thời gian phân rã của màng. Đây cũng là những khía cạnh thuận lợi để định hướng tạo thành công phân bón tan chậm có kiểm soát kết hợp vi sinh vật sử dụng cho cây trồng.
3.3. Nội dung 3: Cố định vi khuẩn phân giải lân trong vi hạt calcium sodium alginate Xác định được thời gian nhân sinh khối tối ưu để thu được mật số vi khuẩn cao nhất đối với chủng vi khuẩn PSM57 là 48 giờ. Phương pháp tạo vi hạt cố định vi khuẩn bằng phương pháp nhốt sử dụng calcium sodium alginate vẫn đảm bảo vi khuẩn còn hoạt tính và giúp bảo vệ vi khuẩn trước tác động của điều kiện bất lợi bên ngoài. Mặt khác, vi hạt cũng giúp cố định được lượng lớn vi khuẩn bên trong so với mật số vi khuẩn tự do. 3.4. Nội dung 4: Tạo chế phẩm phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân và bước đầu thử nghiệm phân bón cho cây trồng 3.4.1. Mức độ tan trong nước theo thời gian của phân tan chậm tạo bởi các lớp màng bao Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng với phân bón tan chậm CRFs thì độ dày lớp vỏ là yếu tố quyết định tốc độ nhả chất dinh dưỡng của phân. Quá trình tan của phân càng chậm, khả năng duy trì hiệu lực của phân khi bón vào đất càng lâu khi lớp vỏ càng dày. Do vậy, việc điều chỉnh độ dày, số lớp của vỏ bọc có thể giúp kiểm soát tốc độ nhả chất dinh dưỡng phù hợp với nhu cầu dinh dưỡng của cây trồng (Azeem và ctv, 2014; Trần Quốc Toàn và ctv, 2018). Để chọn ra được thứ tự các lớp màng bao cho phân vô cơ tan chậm kết hợp vi khuẩn, lõi phân DAP được bọc bởi các lớp màng bao khác nhau và được kiểm tra mức độ tan theo thời gian trong nước trên thiết bị Tablet Disintegration tester - Model DT1000. Kết quả mức độ tan trong nước theo thời gian của các viên phân được trình bày trong Bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả khảo sát mức độ tan theo thời gian của phân DAP bọc bởi các vật liệu khác nhau Nghiệm thức Thời gian tan của màng bao (phút) DAP bọc Polyurethane > 2705,4a DAP bọc tạo bởi bentonite kết hợp vi hạt 446,4b calcium sodium alginate, PVA DAP bọc tạo bởi CMC - PVA - glycerol - urea 300,7c kết hợp vi hạt calcium sodium alginate DAP bọc bởi paraffin 173,4d CV% 0,4 Các giá trị trung bình của cùng một cột theo sau bởi chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p ≤ 0,05) Từ kết quả phân tích thời gian tan trong nước của các loại vật liệu tạo màng phân ở Bảng 3.1 thì phân tan chậm với vỏ bọc có bổ sung vi khuẩn phân giải lân được tạo ra với thứ tự lớp màng bao được thể hiện tóm tắt theo sơ đồ trong Hình 3.1.
Lõi phân (phân DAP chưa phủ) Bước 1 Phun polyurethane tạo vỏ bọc (lớp 1) Làm khô Bọc bentonite kết hợp với vi hạt calcium sodium alginate chứa vi khuẩn có bổ sung Bước 2 PVA làm chất kết dính (lớp 2) Làm khô Bước 3 Phun polymer tạo bởi CMC - PVA - urea - glycerol có bổ sung vi hạt calcium sodium alginate chứa vi khuẩn (lớp 3) Phun sáp paraffin Bước 4 Phân bón vô cơ tan chậm kết hợp vi khuẩn Đóng gói bảo quản Hình 3.1. Sơ đồ chế tạo phân vô cơ tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân 3.4.2. Khả năng tồn tại của vi khuẩn PSM57 trên màng bao phân vô cơ tan chậm theo thời gian Khả năng tồn tại của vi khuẩn trong màng bao phân bón theo thời gian được đánh giá thông qua mật số vi khuẩn trên môi trường PVK ở thời điểm 0 ngày, 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày, 28 ngày, 45 ngày, 60 ngày. Kết quả cho thấy mật số vi khuẩn phân giải lân PSM57 trên màng bao ở ngày đầu là 9,41 Log.CFU/g (2,6 x 109 CFU/g), còn ở ngày 7 mật số vi khuẩn bắt đầu
giảm với mật số 9,36 Log.CFU/g (2,3 x 109 CFU/g) khác biệt so với thời điểm ngày đầu có ý nghĩa về mặt thống kê. Sau đó mật số vi khuẩn giảm dần theo thời gian, ở thời điểm 14 ngày mật số vi khuẩn giảm xuống còn 4,38 Log.CFU/g (2,4 x 104 CFU/g). Mật số vi khuẩn trên màng bao phân ở thời điểm 14 ngày và chỉ còn đạt được 46,8% so với thời điểm ban đầu. Kể từ sau ngày thứ 21 mật số vi khuẩn bằng không. Hiện tượng khi đưa vi khuẩn lên màng bao phân vô cơ vi khuẩn có thể bị chết do không có khả năng chịu được nồng độ muối cao và bởi chính sự phóng thích chất dinh dưỡng từ lõi viên phân ra trong quá trình bảo quản và sử dụng phân vô cơ. Kết quả này cho thấy khi đưa vi khuẩn PSM57 lên màng bao phân vô cơ thời gian tồn tại của vi khuẩn này ngắn không đáp ứng được tiêu chí vi sinh vật phải sống và hoạt động tốt theo thời gian khi sử dụng làm phân bón trong thực tế. Bảng 3.2. Mật số vi khuẩn PSM57 trên màng bao phân tan chậm theo thời gian Thời gian (ngày) Mật số vi khuẩn (Log.CFU/g) 0 9,41a 7 9,36b 14 4,38c 21 - 28 - 45 - 60 - CV% 0,18 Các giá trị trung bình của cùng một cột theo sau bởi chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p ≤ 0,05) Như vậy, để chế tạo thành công phân vô cơ tan chậm kết hợp vi khuẩn thì việc cố định vi khuẩn lên màng bao mà vi khuẩn vẫn sống chỉ là yếu tố thứ nhất. Mặt khác, khi bọc vi khuẩn lên màng bao viên phân vô cơ, vi khuẩn không bị chết do chính sự phóng thích chất dinh dưỡng từ lõi viên phân theo thời gian trong quá trình bảo quản và sử dụng là yếu tố thứ hai giúp đạt được mục tiêu là chế tạo được phân vô cơ tan chậm với vỏ bọc tạo bởi polymer phân hủy sinh học có kết hợp vi khuẩn phân giải lân. Cho nên cần tìm kiếm và phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng chịu được nồng độ muối cao để thay thế chủng vi khuẩn PSM57. 3.4.3. Chọn lọc chủng vi khuẩn phân giải lân có khả năng chịu được nồng độ muối cao Trong 60 chủng vi khuẩn đã phân lập được, chủng vi khuẩn PSM57 có khả năng phân giải lân cao nhất, đường kính vòng phân giải là 13,6 mm ở thời điểm 240 giờ. Kết quả của nghiên cứu đã cho thấy phương pháp cố định vi khuẩn bằng phương pháp nhốt sử dụng calcium sodium alginate là phương pháp tối ưu vẫn đảm bảo vi khuẩn còn hoạt tính và có thể góp phần giúp bảo vệ vi khuẩn trước tác động của điều kiện bất lợi bên ngoài. Tuy nhiên, khi triển khai thực hiện Nội dung 4 thì khi đưa vi hạt calcium sodium alginate chứa vi khuẩn PSM57 lên màng bao viên phân vô cơ, thời gian tồn tại của vi khuẩn này ngắn. Mặt khác, nhiều nghiên cứu cho thấy trong thực tế có tồn tại các chủng vi khuẩn có khả năng chịu được nồng độ muối cao trong môi trường tự nhiên. Khả năng chịu được nồng độ muối cao là một trong các yếu tố thuận lợi giúp tăng khả năng sống của vi khuẩn trên màng bao phân. Do vậy, thí nghiệm này được thực hiện nhằm lựa chọn ra chủng vi khuẩn phân giải lân có khả năng
chịu được nồng độ muối cao cho mục đích tạo thành công phân vô cơ tan chậm kết hợp vi khuẩn. Trong 60 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân phân lập được, chọn các chủng vi khuẩn có đường kính vòng phân giải lân > 10 mm là PSM3, PSM5, PSM6, PSM10, PSM12, PSM15, PSM45, PSM48, PSM54, PSM55, PSM57 đem nuôi trên môi trường PVK bổ sung 2% NaCl, 3% NaCl và 4% NaCl. Chủng vi khuẩn có khả năng chịu được nồng độ muối cao được xác định dựa vào vòng phân giải lân bao quanh khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy. Ở thời điểm 240 giờ tiến hành xác định đường kính vòng phân giải lân của các chủng vi khuẩn. Kết quả cho thấy, chủng vi khuẩn PSM54 có khả năng chịu được nồng độ muối cao nhất, ở môi trường PVK có bổ sung 4% NaCl vẫn xuất hiện vòng phân giải lân, trong khi đó chủng vi khuẩn PSM57 lại không thể đo được đường kính vòng phân giải lân, ngay cả ở môi trường PVK thử nghiệm có nồng độ muối bổ sung 2% NaCl. Do vậy, chủng vi khuẩn PSM54 vừa có khả năng phân giải lân vừa có khả năng chịu được nồng độ muối cao được lựa chọn để thực hiện đưa lên màng bao phân vô cơ tan chậm cho các thí nghiệm tiếp theo. Kết quả định danh xác định được chủng vi khuẩn PSM54 là vi khuẩn Bacillus velezensis. Bảng 3.3. Đường kính vòng phân giải lân của các chủng vi khuẩn trên môi trường PVK có bổ sung 2% NaCl, 3% NaCl và 4% NaCl STT Chủng vi Đường kính vòng phân giải lân (mm) khuẩn 2% NaCl 3% NaCl 4% NaCl - - - 1 PSM3 - - - 2 PSM5 - - - 3 PSM6 - - - 4 PSM10 - - - 5 PSM12 - - - 6 PSM15 - - - 7 PSM45 - - 8 PSM48 9,7 9 PSM54 11,8 11,5 10,8 - - 10 PSM55 9,5 - - 11 PSM57 - Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến quá trình nhân sinh khối của chủng vi khuẩn PSM54 để khảo sát trong các thí nghiệm trên môi trường LB đã xác định được thời gian tối ưu để nhân sinh khối là 48 giờ. 3.4.4. Khả năng tồn tại của vi khuẩn PSM54 trên màng bao phân tan chậm theo thời gian Khả năng tồn tại của vi khuẩn trong màng bao phân bón theo thời gian được đánh giá thông qua mật số vi khuẩn trên môi trường PVK ở thời điểm 0 ngày, 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày, 28 ngày, 45 ngày và 60 ngày. Mật số vi khuẩn phân giải lân trong màng bao ổn định trong khoảng thời gian 14 ngày, mật số 9,43 Log.CFU/g không khác biệt so với thời điểm 0 ngày. Sau đó, mật số vi khuẩn giảm dần theo thời gian, ở thời điểm 21 ngày (9,35 Log.CFU/g), 28 ngày (8,43 Log.CFU/g),
45 ngày (8,36 Log.CFU/g) và ở 60 ngày mật số vi khuẩn giảm còn 8,33 Log.CFU/g, đạt 88,34% mật số vi khuẩn so với thời điểm ban đầu. Bảng 3.4. Mật số của chủng vi khuẩn PSM54 trên màng bao phân tan chậm theo thời gian Thời gian (ngày) Mật số vi khuẩn (Log.CFU/g) 0 9,43a 7 9,43a 14 9,43a 21 9,35b 28 8,43c 45 8,36d 60 8,33e CV% 0,07 Các giá trị trung bình của cùng một cột theo sau bởi chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p ≤ 0,05) Hình 3.2. Ảnh chụp SEM viên phân với lớp màng bao là polyurethane (a. Viên phân, b. Viên phân với lớp màng polyurethane) Hình 3.3. Ảnh chụp SEM viên phân với lớp bao là bentonite kết hợp vi hạt calcium sodium alginate chứa vi khuẩn PSM54 phân giải lân với chất kết dính là PVA (a.Viên phân, b. Viên phân với lớp màng bentonite kết hợp vi hạt calcium sodium alginate chứa vi khuẩn)
Hình 3.4. Phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân PSM54 (a. Sản phẩm phân, b. Hình chụp SEM viên phân, c. Hình chụp SEM viên phân với lớp màng bao phân chứa vi khuẩn phân giải lân, d. Bề mặt viên phân với vi khuẩn ). Như vậy, sau khoảng thời gian 60 ngày khi đưa vi khuẩn phân giải lân được cố định trên màng bao phân lân tan chậm thì vi khuẩn vẫn sống và mật số vi khuẩn đạt được 88,3% so với thời điểm ban đầu. 3.4.5. Khả năng phóng thích dinh dưỡng của phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân trong mô hình mô phỏng điều kiện tự nhiên Phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân được tạo ra có các lớp màng bao tạo bởi các vật liệu là polyurethane, bentonite, polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose, glycerol, urea và paraffin với thành phần được trình bày trong Bảng 3.5 được đem đi khảo sát sự phóng thích chất dinh dưỡng theo thời gian trong hệ thống hỗn hợp đất và cát ẩm mô phỏng theo điều kiện tự nhiên. Kết quả khảo sát cho thấy trong môi trường đất và cát ẩm mô phỏng điều kiện tự nhiên tốc độ giải phóng nitơ và phospho của phân trong vòng 14 ngày đầu tiên chậm lần lượt là 1,43% và 1,30%. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn trên màng bao phân có thời gian được giải phóng ra môi trường đất trong tự nhiên và ít bị tác động bởi nồng độ muối cao của chính phân bón khi phân bị hòa tan. Sau 21 ngày tốc độ giải phóng chất dinh dưỡng của phân bắt đầu tăng lên và sau 90 ngày hàm lượng nitơ trong phân được giải phóng đạt 83,18%, hàm lượng phospholà 81,33%.
Bảng 3.5. Thành phần của phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân PSM54 STT Thành phần 1 Lõi phân Phân DAP Đình Vũ (16 : 45). 2 Lớp màng bao Lớp 1: Polyurethane. Lớp 2: Bentonite và vi hạt calcium sodium alginate chứa vi khuẩn phân giải lân có bổ sung PVA làm chất kết dính. Lớp 3: CMC kết hợp PVA - urea - glycerol và vi hạt calcium sodium alginate chứa vi khuẩn phân giải lân. Lớp 4: Sáp paraffin 3 Mật số vi khuẩn phân giải Mật số vi khuẩn > 109 CFU/g lân trong màng bao phân tan chậm 4 Hàm lượng nitơ tổng của 12,58% phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân 5 Hàm lượng phospho tổng 33,37% của phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân Bảng 3.6. Hàm lượng chất dinh dưỡng được phóng thích của phân vô cơ tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân theo thời gian trong mô hình mô phỏng điều kiện tự nhiên Thời gian Hàm lượng nitơ phóng thích Hàm lượng lân phóng thích (ngày) (%) (%) k 1 0,48 0,51j 3 0,83j 0,83i 5 1,08i 1,02h 7 1,24h 1,16g 10 1,34g 1,23fg 14 1,43f 1,30f 21 12,98e 5,09e 28 30,17d 22,39d 45 47,53c 40,73c 60 64,44b 62,52b 90 83,18a 81,33a CV% 0,13 0,21 Các giá trị trung bình của cùng một cột theo sau bởi chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p ≤ 0,05)
3.4.6. Khả năng phân hủy sinh học của màng bao phân vô cơ tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân theo thời gian Khả năng phân hủy sinh học của màng bao phân vô cơ tan chậm được đánh giá qua độ giảm khối lượng và sự thay đổi hình thái cấu trúc bề mặt của lớp màng bao khi chôn trong đất. Kết quả độ giảm khối lượng của màng được trình bày trong Bảng 3.7. Bảng 3.7. Kết quả khảo sát khả năng phân hủy sinh học của màng bao phân tan chậm theo thời gian Thời gian Độ giảm khối lượng của màng bao phân (ngày) (%) 10 1,9g 20 4,1f 30 9,9e 45 15,6d 60 29,4c 75 44,0b 90 50,5a CV% 0,17 Các giá trị trung bình của cùng một cột theo sau bởi chữ cái khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p ≤ 0,05) Kết quả cho thấy trong 20 ngày đầu khối lượng của màng thay đổi không đáng kể chỉ giảm 4,1%, tới ngày thứ 30 độ giảm khối lượng của màng đạt 9,9% và tăng dần cho tới ngày 90 thì độ giảm khối lượng của màng đạt 50,5% và có sự khác biệt về mặt thống kê so với các thời điểm còn lại. Như vậy, màng bao phân tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân với màng bao tạo bởi các vật liệu chính là sodium alginate, CMC, PVA, bentonite, polyurethane có khả năng phân hủy sinh học. Kết quả này cũng phù hợp với một số nghiên cứu đã chỉ ra các vật liệu tạo màng bao có khả năng phân hủy sinh học như của Howard (2002), Malkaj và Dalas (2005), Yang và Huang (2008), Benchabane và Bekkour (2008), Lee và Mooney (2012), Trần Quốc Toàn (2016), Bahmanpour và ctv (2017), Rahman và ctv (2021), Wang và ctv (2021). 3.4.7. Ứng dụng thử nghiệm phân vô cơ tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân cho cây trồng trong nhà lưới 3.4.7.1. Ảnh hưởng của phân vô cơ tan chậm kết hợp vi khuẩn phân giải lân đến chiều cao thân chính của cây đậu phộng Chiều cao thân chính là một trong các chỉ tiêu đánh giá về sinh trưởng phát triển của cây đậu phộng trong những điều kiện sống nhất định. Chiều cao thân chính của cây là một trong các yếu tố tạo điều kiện cho sự ra hoa, tạo quả quyết định năng suất cây trồng. Vì chiều cao thân chính liên quan trực tiếp đến tổng số hoa có trên cây, số hoa hữu hiệu, khả năng đâm tia hình thành quả, khả năng tích lũy chất dinh dưỡng và khả năng chống chịu của cây. Chiều cao của cây do đặc điểm di truyền của giống quyết định còn phụ thuộc nhiều vào điều kiện ngoại cảnh, đặc biệt là chế độ chăm sóc và bón phân. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của phân bón được bón theo các công thức đối với sự phát triển chiều cao thân chính của cây đậu phộng được thể hiện qua Bảng 3.8, Hình 3.5 và Hình 3.6.