Tóm tắt Luận án tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án: Xây dựng qui trình thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis lựa chọn; Xây dựng qui trình thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men gellan của chủng S. paucimobilis lựa chọn; Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm gellan trong bảo quản, chế biến thực phẩm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HỒNG HÀ NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN TỪ Sphingomonas paucimobilis ĐỊNH HƢỚNG ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2018
Công trình đƣợc hoàn thành tại: Trƣờng Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm TS. Trần Thị Mai Phản biện 1: PGS. TS. Trần Đình Mấn Phản biện 2: PGS. TS. Nguyễn La Anh Phản biện 3: PGS. TS. Dương Văn Hợp Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi ….. giờ, ngày ….. tháng ….. năm ……… Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: 1.Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội 2.Thư viện Quốc gia Việt Nam
MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của luận án Gellan là một polysaccharit ngoại bào, được sinh tổng hợp bởi nhóm vi khuẩn hiếu khí Sphingomonas sp. Gellan đã được Mỹ và Châu Âu cho phép sử dụng trong thực phẩm, dược phẩm và các ngành công nghiệp khác như một chất tạo độ đặc, chất ổn định, chất làm dày và chất tạo gel. So với các polysaccharit khác, gellan có nhiều lợi thế như có thể duy trì độ bền ở nhiệt độ cao (trên 90oC), ổn định trong khoảng pH rộng (3 - 8) nên được ứng dụng nhiều trong sản xuất nước giải khát. Trong sản xuất bánh, kẹo dẻo, khi thêm gellan giúp tạo gel mềm, mọng nước và tăng được nhiệt độ nóng chảy, ngăn cản sự tan chảy và biến dạng sản phẩm. Gellan thường cho ra gel mềm, đàn hồi, trong và với tính chất tạo vi màng, có khả năng ngăn oxy nên cũng rất thích hợp cho sử dụng tạo màng bao bảo quản quả. Sản phẩm khử acyl của gellan là tác nhân làm đông vượt trội do gel có độ trong suốt cao, tạo gel giòn ở nồng độ thấp (dưới 0,4 %), có khả năng hồi phục nhiệt khi đun nóng và làm lạnh, được ứng dụng nhiều trong sản xuất thạch. Sở hữu những đặc tính quí báu trên, nên hiện nay gellan được ứng dụng rộng rãi trong chế biến và bảo quản thực phẩm, nhu cầu về thị trường ngày một tăng. Các công bố về quá trình sinh tổng hợp, thu nhận gellan trên thế giới cũng luôn được cập nhật, bổ sung nhằm nâng cao hiệu suất và chất lượng cho chế phẩm. Ở Việt Nam, hiện chưa có cơ sở nào sản xuất được gellan, gellan nhập ngoại đã được sử dụng để bổ sung vào nhiều sản phẩm thực phẩm khác nhau, nhưng giá nhập khẩu vẫn còn cao (khoảng 20-50 usd/kg, tùy loại). Trong giai đoạn 2013-2015, nhóm nghiên cứu của đề tài chúng tôi đã phân lập được một số chủng có khả năng sinh tổng hợp gellan khá cao (18-20 g/lít dịch nuôi) và bước đầu khảo sát được các điều kiện lên men, thu hồi gellan, tuy nhiên công nghệ chưa sẵn sàng, cần phải có các nghiên cứu cải tiến hơn nữa nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp. Do vậy, đề tài “Nghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm” đã được lựa chọn trong khuôn khổ của luận án này. Mục tiêu nghiên cứu của luận án: Xây dựng qui trình thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis lựa chọn; Xây dựng qui trình thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men gellan của chủng S. paucimobilis lựa chọn; Nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm gellan trong bảo quản, chế biến thực phẩm. Nội dung nghiên cứu 1. Lựa chọn chủng cho khả năng sinh tổng hợp gellan cao: Đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL4; So sánh khả năng sinh tổng hợp gellan của hai chủng S. paucimobilis GL4 và S. paucimobilis GL12. 2. Nghiên cứu thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis lựa chọn: Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình tam giác; Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít; Xác định điều kiện tách chiết và thu hồi chế phẩm gellan dưới dạng bột; Nghiên 1
cứu điều kiện bảo quản thích hợp cho chế phẩm; Đề xuất quy trình thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis lựa chọn. 3. Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men của chủng S. paucimobilis: Xác định điều kiện phản ứng chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl; Xác định điều kiện tách chiết và sấy kết tủa gellan khử acyl; Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan khử acyl; Đề xuất quy trình thu nhận gellan khử acyl. 4. Đánh giá chất lượng các chế phẩm: Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan từ S. paucimobilis; Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan khử acyl. 5. Thử nghiệm ứng dụng chế phẩm gellan và gellan khử acyl: Ứng dụng chế phẩm gellan trong tạo màng bao bảo quản chuối; Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl trong sản xuất thạch. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1. Về khoa học: Luận án là một nghiên cứu có hệ thống từ lựa chọn chủng giống, đến sinh tổng hợp, thu hồi và khai thác khả năng ứng dụng gellan, cũng như chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl. Các kết quả nghiên cứu của luận án có thể dùng làm tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu thu nhận và ứng dụng gellan hoặc các polisaccharit ngoại bào khác đi từ nguồn vi sinh vật. 2. Về thực tiễn: Xây dựng được qui trình công nghệ thu nhận gellan và gellan khử acyl góp phần chủ động tạo nguồn phụ gia thực phẩm sở hữu các đặc tính phù hợp cho ứng dụng trong bảo quản và chế biến thực phẩm. Kết quả mới - Đã xây dựng được quy trình thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis GL12 phân lập tại Việt Nam đạt 32,8 g/lít. Giải pháp sử dụng nguồn bột đậu tương giàu tryptophan thay thế nguồn trypton, kết hợp cải thiện phương thức cấp ôxi bằng việc bổ sung H2O2 theo bậc nhằm khắc phục độ nhớt của dịch lên men đã nâng cao được hiệu suất sinh tổng hợp gellan. - Đã xây dựng được quy trình chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl có độ deacyl đạt 86% đáp ứng yêu cầu cho việc tạo ra gel có độ giòn và độ trong cao. - Đã đánh giá được một số đặc tính của chế phẩm gellan và gellan khử acyl từ S. paucimobilis GL12 làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng trong chế biến, bảo quản thực phẩm. - Đã bước đầu thành công trong việc ứng dụng gellan trong tạo màng bao bán thấm có khả năng ngăn khí và giữ nước để kéo dài thời gian bảo quản chuối (18 ngày so với 9 ngày ở mẫu đối chứng). Gel tạo ra từ chế phẩm gellan khử acyl của đề tài khá bền và ổn định trong môi trường pH thấp (pH
trang với 29 bảng, 28 hình), kết luận (1 trang), kiến nghị (1 trang), danh mục các công trình đã công bố (1 trang) và tài liệu tham khảo (10 trang với 8 tài liệu tiếng Việt và 93 tài liệu tiếng Anh). CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Thông tin chung về gellan và gellan khử acyl bao gồm 04 tiểu mục: 1.1.1. Cấu tạo; 1.1.2. Tính chất; 1.1.3. Cơ chế tạo gel và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo gel và mục 1.1.4. Sphingomonas paucimobilis: giới thiệu chung về đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, cơ chế sinh tổng hợp gellan và động học quá trình sinh trưởng và tổng hợp gellan. 1.2. Tình hình nghiên cứu thu nhận gellan và gellan khử acyl bao gồm 03 tiểu mục: 1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp gellan, phần này đề cập đến các vấn đề về giống, tuổi giống, tỷ lệ giống, thành phần môi trường, nhiệt độ, pH và điều kiện cấp khí cho quá trình lên men; 1.2.2. Thu hồi và làm sạch gellan từ dịch lên men; 1.2.3. Chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl. 1.3. Tình hình nghiên cứu ứng dụng gellan và gellan khử acyl bao gồm 03 tiểu mục: 1.3.1. Ứng dụng trong tạo màng bảo quản trái cây; 1.3.2. Ứng dụng trong chế biến thực phẩm; 1.3.3. Ứng dụng trong các lĩnh vực khác. 1.4. Vấn đề cần nghiên cứu của luận án mục này điểm qua những kết quả nghiên cứu đã có trước để đưa ra những định hướng và nội dung nghiên cứu cụ thể cho luận án. CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu - Hai chủng S. paucimobilis GL4 và GL12 nhận được từ bộ sưu tập giống của Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học sau thu hoạch-Viện Cơ điện NN và Công nghệ STH. Chủng S. paucimobilis GL12 đã được kiểm nghiệm về độ an toàn chung và khả năng gây tan huyết đáp ứng đủ tiêu chuẩn cho ứng dụng trong chế biến thực phẩm. - Chuối tiêu được trồng tại Đông tảo, Khoái Châu, Hưng Yên vụ 2017. 2.2. Phƣơng pháp phân tích Xác định hàm lượng gellan và gellan khử acyl theo (Horace G., 1993). Phân tích cấu trúc gellan và gellan khử acyl theo phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân MNR (Fialho A. M., 1999). Xác định khối lượng phân tử của gellan theo Gong Y., (2009) và Masuelli A. M., (2014) thông qua việc xác định độ nhớt thực của dung dịch. Xác định mức độ deacyl hóa của gellan khử acyl qua phân tích phổ IR theo BaxterA., (1992). Xác định độ bền gel của gellan khử acyl bằng máy phân tích cấu trúc Texture Analyzer TA.XT2 (Anh) theo Mao R., (2000). Phân tích các chỉ tiêu chất lượng của gellan như khả năng tạo gel (Bajaj B.I., 2007), độ ẩm (AOAC 920.05), độ tro (AOAC 930.30), hàm lượng chì (AOAC 999.11), hàm lượng asen (AOAC 986.15), E. Coli (TCVN 7924-2:2008), Salmonella (TCVN 4829:2005), Coliform (TCVN 6848:2007), tổng số vi khuẩn hiếu khí (TCVN 4884:2005), tổng số bào tử nấm men, nấm mốc (TCVN 8275-2:2010). 3
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu - Lựa chọn chủng cho khả năng sinh tổng hợp gellan cao: chủng S. paucimobilis GL12 và GL4 được thử nghiệm với 150 ml dịch với glucose 3,2%; trypton 0,6 %; tỷ lệ tiếp giống 8 %; nhiệt độ lên men 30oC, pH 7, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Sau 72h dịch lên men được nâng nhiệt lên 95oC trong 15 phút, làm nguội và ly tâm ở 7000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi và đánh giá khả năng sinh tổng hợp gellan (Nguyễn Thị Hồng Hà, 2015). - Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng STH gellan từ S. paucimobilis GL12: tiến hành tương tự như trên, khảo sát với các nồng độ bột đậu tương, axit amin khác nhau và 6 chế độ cấp H2O2 theo bậc vào quá trình lên men (Guilan Z., 2014). - Tối ƣu hóa môi trƣờng sinh tổng hợp gellan từ S. paucimobilis GL12 trên bình tam giác bằng quy hoạch thực nghiệm bậc hai theo Box–Behnken. - Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít: các thí nghiệm được tiến hành lên men trên bình lên men sục khí 10 lít với các thông số về thành phần môi trường lên men theo điều kiện tối ưu tìm được khi lên men trên bình tam giác. Thiết bị lên men được cài đặt chế độ nhiệt độ 30oC, tốc độ thổi khí 1:1:1 v/v/ph, khảo sát với các tốc độ khuấy dao động từ 200 đến 300 vòng/phút. - Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men với các khảo sát về điều kiện tiền xử lý dịch lên men, lựa chọn dung môi kết tủa, tỷ lệ dịch lên men và dung môi theo Fialho A. M., (1999). - Xác định điều kiện sấy: kỹ thuật sấy đối lưu được sử dụng để khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của tác nhân sấy, thời gian sấy, độ dày lớp vật liệu sấy. Các thí nghiệm đều được thực hiện với tốc độ thổi khí 1 m/s, khi bề mặt khối sấy khô se, dùng que sắt nhọn kẻ thành các ô vuông có cạnh 1,5 cm,tiến hành đảo để khối ô vuông gellan rời ra, rồi dàn đều, sau đó cứ 2 giờ lặp lại 01 lần. Khi mẫu khô đem đi nghiền thành bột và bảo quản trong bao bì kín. - Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl: xác định điều kiện chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl theo Nampoothiri M. K., (2003); xác định tỷ lệ dịch/ethanol cho kết tủa gellan khử acyl; xác định điều kiện sấy và bảo quản chế phẩm gellan khử acyl. Mức độ deacyl hóa của mẫu được tính theo công thức sau: ĐĐA = 100 - xa Trong đó: h1720 và h3400 là chiều cao các đỉnh phổ tại bước sóng 1720 và 3400 cm-1 đặc trưng cho các nhóm carbonyl và nhóm - OH trong phân tử gellan và a là hệ số thực nghiệm. 4
- Nghiên cứu ứng dụng gellan tạo màng bao trong bảo quản chuối: xác định công thức dung dịch tạo màng gellan theo Rojas G. M. A., (2007); xác định một số đặc tính của dung dịch tạo màng gellan như xác định hàm lượng chất khô, thời gian khô của màng, thời hạn sử dụng dung dịch tạo màng, độ bám dính của màng, tính thẩm thấu hơi nước của màng, mức độ ngăn cản trao đổi khí được tiến hành theo Nguyễn Duy Lâm (2011). - Nghiên cứu ứng dụng gellan khử acyl trong chế biến thạch dứa: xác định hàm lượng gellan khử acyl thích hợp cho công thức thạch; đánh giá cảm quan và độ ổn định của sản phẩm). CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Lựa chọn chủng cho khả năng sinh tổng hợp gellan cao Từ kết quả ở bảng 3.1. rút ra, trong điều kiện khảo sát chủng S. paucimobilis GL12 có khả năng sinh tổng hợp gellan cao hơn chủng S. paucimobilis GL4. Hơn thế chủng S.paucimobilis GL12 đã được đánh giá là chủng an toàn, bước đầu đảm bảo cho các sản phẩm của chúng được ứng dụng trong chế biến thực phẩm (Nguyễn Thị Hồng Hà., 2015). Do vậy, chủng S. paucimobilis GL12 được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo của luận án. Bảng 3.1. So sánh khả năng STH gellan của hai chủng S. paucimobilis GL4 và S. paucimobilis GL12 Thí nghiệm Hàm lƣợng gellan (g/l) S. paucimobilis GL4 S. paucimobilis GL12 1 23,9 28,6 2 23,6 28,4 3 24,2 29,0 Trung bình 23,9 28,7 3.2. Nghiên cứu thu nhận gellan từ chủng S. paucimobilis GL12 3.2.1. Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp gellan 3.2.1.1. Ảnh hưởng của nitơ Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy khi bổ sung nguồn nitơ là trypton, hàm lượng gellan đạt cao nhất là 22,7 g/l. Tuy nhiên, với nguồn nitơ là bột đậu tương cũng cho sản lượng sinh tổng hợp gellan khá cao đạt 21,9 g/l. Điều này có thể do bột đậu tương có hàm lượng protein cao (khoảng 40%) và chứa nhiều tryptophan là một axit amin cũng được chứng minh như một tiền tố làm tăng khả năng sinh tổng hợp gellan (Hyuck J., 2003). Bajaj B. I., (2006) khi bổ sung tryptophan ở nồng độ 0,05% vào môi trường lên men đã tăng được sản lượng gellan lên tới 39,5 g/l. 5
Bảng 3.2. Ảnh hưởng các nguồn nit đến khả năng sinh tổng hợp gellan của S. paucimobilis GL12 Nguồn nitơ (%) Hàm lƣợng gellan (g/l) Pepton (0,6) 19,6b ± 0,61 Trypton (0,6) 22,7a± 0,40 Bột đậu tƣơng * (1,5) 21,9ab± 0,95 * Hàm lượng bột đậu tư ng được tính lấy để tư ng tư ng với 0,6% protein trong dịch lên men Kết quả ở hình 3.1. cho thấy khi bổ sung tăng dần bột đậu tương vào môi trường lên men, sản lượng gellan cũng tăng theo và tăng chậm lại khi bổ sung bột đậu tương 2%. Kết quả này cũng phù hợp với Hyuck J., (2003), tác giả cũng đã tìm ra dịch chiết đậu tương 2% bổ sung vào môi trường lên men sinh tổng hợp gellan từ chủng S. paucimobilis NK2000 đã cho khả năng sinh tổng hợp gellan tăng 44%. 30 24 24.2 Hàm lƣợng gellan (g/L) 25 22.7 21.5 20 15 10 5 0 1.50 1.75 2.00 2.25 Nồng độ bột đậu tƣơng (%) Hình 3.1. Ảnh hưởng nồng độ bột đậu tư ng đến khả năng sinh tổng hợp gellan của S. paucimobilis GL12 3.2.1.2. Ảnh hưởng của việc bổ sung các axit amin Các thí nghiệm được thử nghiệm với 4 loại axit amin với tỷ lệ bổ sung 0,05 %. Kết quả thử nghiệm đã xác định được L-threonine là axit amin thích hợp nhất cho sinh tổng hợp gellan (đạt 24,3 g/l với liều bổ sung 0,05%). Việc bổ sung L-threonine được cho là làm tăng sự biểu hiện của một số enzyme tham gia vào con đường sinh tổng hợp gellan do vậy dẫn đến làm tăng sản lượng gellan (Nampoothiri M. K., 2003). Nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ L-threonine đến khả năng sinh tổng hợp gellan thu được ở hình 3.2. đã khẳng định lại khả năng sinh tổng hợp gellan đạt cao nhất khi môi trường được bổ sung L-threonine 0,05%. 6
Axit amin Hàm lƣợng gellan 30 (g/l) 24.3 24.5 Hàm lƣợng gellan (g/l) 25 22.5 Đối chứng 20.8 20 (Không axit amin) 19,4 ± 0,36 15 Glycine 21,4 ± 0,39 10 L-valine 22,1 ± 0,89 5 L-glutamine 23,2 ± 0,47 0 0.01 0.03 0.05 0.07 L-threonine 24,3 ± 0,52 Tỷ lệ L- threonine (%) Bảng 3.3. Ảnh hưởng của các axit amin Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ L-threonine 3.2.1.3. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2 Động học phát triển của chủng S. paucimobilis GL12 cho thấy chủng sinh trưởng mạnh nhất từ giờ thứ 6 đến 24 giờ. Theo thời gian lên men, với việc tăng sinh khối, đồng thời lượng gellan được tích lũy quanh tế bào cũng tăng lên, kéo theo giảm hiệu quả cấp oxy cho tế bào. Để khắc phục hiệu ứng này, tiến hành các thử nghiệm bổ sung thêm H2O2 vào dịch lên men dựa trên sự chuyển hóa H2O2 thành O2. Tuy nhiên, nồng độ H2O2 quá mức lại là một trong những tác nhân gây tổn thương tế bào vi sinh vật, dẫn đến việc ức chế sự phát triển của tế bào cũng như sinh tổng hợp gellan. Do vậy, trong phần này tiến hành các thử nghiệm bổ sung dần H2O2 vào các mốc thời gian tương ứng 6, 12, 18, 24, 28 giờ với các liều lượng khác nhau theo từng chế độ thử nghiệm. Sau 72 giờ lên men, các mẫu được lấy đi đánh giá lượng sinh khối và gellan tạo thành Kết quả phân tích ở bảng 3.4 cho thấy, việc bổ sung H2O2 theo CĐ1 và CĐ2 hầu như không làm tăng được lượng sinh khối cũng như không cải thiện được khả năng sinh tổng hợp gellan cho chủng nghiên cứu. Điều này có thể lý giải do ở những giờ nuôi đầu (6, 12 giờ) lớp gellan bảo vệ bên ngoài vi khuẩn chưa nhiều nên việc sử dụng hàm lượng H2O2 ở những nồng độ 4 và 3 mM là không phù hợp sẽ gây sốc tế bào, ức chế quá trình tăng sinh. Đổi lại, với CĐ3 lượng H2O2 bổ sung ban đầu được duy trì ở mức thấp hơn (2 mM) sau mới tăng dần lên tới 3 và 4 mM ở những giờ cuối đã kích thích tăng sinh khối tế bào và kéo theo tăng hàm lượng gellan. Kết quả nhận được ở các CĐ4, CĐ5 và CĐ6 cho hàm lượng gellan thấp hơn hoặc tương tự với CĐ3. Thử nghiệm cũng cho thấy, kéo dài việc cung cấp H2O2 ở giờ thứ 28 (CĐ6) là không cần thiết bởi lẽ lúc đó vi khuẩn bắt đầu vào pha cân bằng, nhu cầu oxy đã giảm, khi đó chế độ sục khí hay lắc của hệ thống lên men cũng đủ để đảm bảo duy trì sự sống cho vi khuẩn. Guilan Z., (2014) cũng đã công bố sự sinh tổng hợp gellan đạt cao nhất khi bổ sung H2O2 trong những giờ đầu lên men. Như vậy, bổ sung H2O2 theo CĐ3 sẽ được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. 7
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của việc bổ sung H2O2 tới khả năng tích lũy sinh khối và gellan Lƣợng H2O2 bổ sung (mM) Lƣợng sinh khối Hàm lƣợng gellan Chế độ tƣơng ứng ở các mốc 6, 12, tế bào (g/l) (g/l) 18, 24, (28) giờ ĐC 0, 0, 0, 0 3,95 ± 0,36bc 20,1 ± 0,96b CĐ1 4, 3, 2, 2 3,97 ± 0,26c 20,1 ± 0,148b CĐ2 3, 4, 2, 2 4,12 ± 0,18ab 21,7 ± 0,84b CĐ3 2, 2, 3, 4 4,74 ± 0,36a 26,2 ± 0,88a CĐ4 2, 2, 4,3 4,38 ± 0,29ab 25,3 ± 0,47a CĐ5 2, 2, 3, 5 4,76 ± 0,18a 26,2 ± 1.19a CĐ6 2, 2, 3, 4 và (4) 4,74 ± 0,38a 26,2 ± 0,98a 3.2.1.4. Xác định thời gian lên men thích hợp cho thu nhận gellan Để xác định được thời gian lên men thích hợp cho hàm lượng gellan cao nhất, trong phần này các thí nghiệm được thiết kế theo các điều kiện lựa chọn ở trên (Bột đậu tương 2,0%, L-threonine 0,05 %, bổ sung H2O2 theo CĐ3, các điều kiện khác giữ nguyên). Kết quả trình bày ở hình 3.3. cho thấy, quá trình sinh tổng hợp gellan diễn ra sau 6 giờ nuôi cấy. Pha logarit của chủng kéo dài từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 30. Cùng với sự tăng sinh khối trong pha này, lượng gellan tích lũy trong dịch lên men cũng tăng theo từ 0,44 đến 10,20 g/l nhưng đạt giá trị cực đại (31,40 g/l) ở giờ thứ 66. Như vậy, hàm lượng gellan của chủng S. paucimobilis GL12 được sinh tổng hợp trong suốt pha logarit và cả ở pha cân bằng. Tác giả Nampoothiri M. K., (2003) cũng cho thấy chủng S. paucimobilis ATCC 31461 đạt hàm lượng gellan cao nhất tại 48 giờ. Trong khi đó, với chủng S. paucimobilis E2, Lobas D., (1992) lại tìm thấy từ 60-68 giờ là khoảng thời gian thích hợp cho thu nhận gellan. Như vậy, thời gian lên men tạo gellan phụ thuộc nhiều vào chủng sản xuất và điều kiện tiến hành. Dựa vào các kết quả thí nghiệm thu được, lựa chọn thời gian 66 giờ là thời điểm kết thúc quá trình lên men sinh tổng hợp gellan từ chủng S. paucimobilis GL12. Hàm lƣợng gellan (g/l) 35 4 2 30 3 1.8 1.6 25 2 1.4 OD 600 nm 20 1.2 1 15 1 0.8 10 0.6 0.4 5 0.2 0 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 Thời gian (giờ) Hàm lượng gellan (g/l) OD 600 nm Hình 3.3. Động học quá trình sinh trưởng và tích lũy gellan của chủng S. paucimobilis GL12 (Mũi tên chỉ các thời điểm bổ sung H2O2 tương ứng với nồng độ 2, 2, 3, 4 mM) 8
3.2.2. Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp gellan trên bình tam giác Dựa trên cơ sở đã khảo sát sự ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp gellan từ S. paucimobilis GL12, đã xác định được mức độ tác động đơn lẻ của các yếu tố tới sự sinh tổng hợp gellan từ S. paucimobilis GL12. Tuy nhiên, trong môi trường lên men các vi sinh vật sẽ phải chịu tác động đồng thời của các yếu tố đó, đặc biệt ba yếu tố có giá trị ảnh hưởng dương và lớn là glucose, bột đậu tương và L-threonine. Nhằm xác định được giá trị tối ưu của các yếu tố này, phương pháp quy hoạch thực nghiệm Box–Behnken đã được sử dụng và đưa ra được phương trình hồi qui biểu diễn ảnh hưởng của ba yếu tố trên tới khả năng sinh tổng hợp gellan của S. paucimobilis GL12 như sau: Hàm lượng gellan (Y) = + 32,2 + 2,02X1 + 0,71X2 + 1,18X3 + 1,5X1X2 – 0,89X1X3 + 1,39X2X3 – 3,05X12 – 3,05 X22 – 1,12X32 với X1, X2 và X3 là các yếu tố glucose, bột đậu tương và L-threonine tương ứng Sử dụng phương pháp hàm kỳ vọng để tối ưu khả năng sinh tổng hợp gellan từ chủng S. paucimobilis GL12. Kết quả tìm được giá trị hàm lượng gellan cao nhất theo lý thuyết đạt từ 31,0 đến 32,96 g/l khi tổ hợp 3 yếu tố là nồng độ glucose: 3,6 %; bột đậu tương: 2,1 %; L- threonine 0,06 %. Tiến hành lên men thực nghiệm với các điều kiện vừa tìm được ở trên, kết quả hàm lượng gellan thu được đạt (32,80 ± 0.85 g/l) nằm trong khoảng tin cậy trung bình 95% của khoảng giá trị dự đoán theo lý thuyết. Những kết quả này xác nhận, kết quả lý thuyết và thực nghiệm chênh trong giới hạn cho phép. Dưới điều kiện tối ưu, chủng S. paucimobilis ATCC 31.461 sinh tổng hợp gellan với hàm lượng 32,7 g/l sau 48 giờ lên men (Nampoothiri M. K., 2003). Cũng với chủng trên, Bajaj B. I., (2007) lại thu được 35,9 g/l, trong khi đó, Jun Zhang (2015) báo cáo chỉ tổng hợp được gellan từ S. paucimobilis QHZJUJW CGMCC2428 với hàm lượng 19.90 ± 0.68 g/l trên môi trường có 4% sucrose, 3% peptone, ở pH 7.0, 30oC sau 72 giờ lên men. 3.2.3. Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít * Xác định tốc độ khuấy: Trong phần này 5 tốc độ khuấy 200; 225, 250, 275 và 300 vòng/phút được thử nghiệm. Kết quả hình 3.10 cho thấy, ở tốc độ khuấy 200 vòng/phút, khả năng tạo gellan thu được khá thấp chỉ đạt 28,3 g/l sau 66 giờ lên men. Sản lượng gellan đạt tối đa là 32,5 g/l ở tốc độ khuấy 275 vòng/phút. Tuy nhiên, khi tăng tốc độ khuấy lên 300 vòng/phút sản lượng gellan giảm nhẹ. Kết quả nghiên cứu ở trên cho thấy, tốc độ khuấy trộn ảnh hưởng nhiều tới khả năng sinh tổng hợp gellan của chủng S. paucimobilis GL12. Trong nuôi cấy vi sinh vật ở quy mô lớn thì độ nhớt của môi trường cao và nhu cầu oxy lớn do vậy nếu tốc độ khuấy thấp sẽ không thích hợp. Nhưng tốc độ khuấy quá lớn sẽ tạo ra lực cắt làm ảnh hưởng đến cấu trúc cũng như sự phát triển của tế bào, điều đó đồng nghĩa với việc các sản phẩm thứ cấp tạo thành cũng bị ảnh hưởng (Banik R. M., 2006). Do vậy, tốc độ khấy 275 vòng/phút được chọn cho nghiên cứu tiếp theo. 9
35 30.7 32.3 31.8 35 2 28.3 29.1 Hàm lƣợng gellan (g/L) 30 30 4 Hàm lƣợng gellan (g/l) 25 25 23 1.5 OD 600nm 20 1 20 1 15 15 10 0.5 10 5 5 0 0 0 0 12 24 36 48 52 56 58 60 62 64 66 200 225 250 275 300 Hàm lượng gellan pH Tốc độ khuấy(vòng/phút) Thời gian (giờ) Hình 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy Hình 3.5. Động học quá trình sinh tổng hợp gellan trên bình lên men 10 lít (khấy 275 v/ph) * Xác định thời gian thu hồi gellan: Đồ thị biểu thị sự sinh trưởng, phát triển và tổng hợp gellan của chủng vi khuẩn S. paucimobilis GL12 trong quá trình sinh tổng hợp gellan trên bình lên men sục khí 10 lít với tốc độ thổi khí 1:1:1 v/v/ph và tốc độ khuấy 275 vòng/phút được thể hiện ở hình 3.5. Kết quả phân tích cho thấy, đường cong sinh trường của chủng nghiên cứu ở qui mô này cũng tương tự như ở qui mô bình tam giác, lượng sinh khối đạt cực đại sau khoảng 30 giờ lên men. Gellan cũng được tích lũy ngay từ pha logarit, tăng dần theo thời gian và đạt cực đại ở pha cân bằng (33,1 g/l ở 58 giờ). Mặc dù hàm lượng gellan thu nhận ở quy mô bình sục khí không khác nhiều so với quy mô phòng thí nghiệm (32,8 g/l ở 66 giờ), nhưng thời gian thu nhận gellan đã rút ngắn được tới 8 giờ. Điều này có thể là do ở hệ thống bình lên men việc kiểm soát tốc độ cấp khí tốt hơn cho quá trình tăng trưởng và duy trì của vi khuẩn. Hơn nữa, lượng H2O2 bổ sung theo bậc vào môi trường lúc này có thế lại đóng vai trò như một tác nhân gây sốc nhẹ để cảm ứng cho vi khuẩn tăng tiết nhanh gellan ra bên ngoài bề mặt để bảo vệ chúng. 3.2.4. Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men 3.2.4.1. Tiền xử lý dịch lên men và ly tâm loại sinh khối Do đặc tính của chủng S. paucimobilis khi sinh trưởng phát triển sẽ tiết ra gellan bám xung quanh tế bào để bảo vệ chúng khỏi các tác động bên ngoài. Do vậy, để tách gellan khỏi sinh khối, dịch lên men cần được xử lý trước khi ly tâm. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý dịch lên men đến hiệu quả tách gellan khỏi tế bào vi khuẩn Nhiệt độ dịch lên men Hàm lƣợng gellan Hàm lƣợng sinh khối tế bào (oC) (g/l) (g/l) Không xử lý nhiệt (ĐC) --- --- 75 -- -- 85 - 3,51 90 31,9 4,62 95 32,8 4,74 100 32,6 4,75 Chú thích: --- : Không tách pha, không thu hồi được gellan; -- : Có dấu hiệu tách pha, khi ly tâm không phân tách được sinh khối tế bào và gellan; - : Có tách pha, khi ly tâm dịch nổi chứa gellan còn lẫn sinh khối tế bào; 10
Kết quả của bảng 3.5. cho thấy, khi xử lý dịch lên men ở nhiệt độ dưới 85oC không thể tách hết gellan ra khỏi sinh khối. Tuy nhiên ở các mốc nhiệt xử lý 90, 95, 100 oC trong 15 phút, làm nguội và ly tâm ở 7000 vòng/phút trong 15 phút cho hiệu quả tách vi khuẩn khỏi dịch lên men là như nhau. Hiện tượng này có thể do khi nâng nhiệt tế bào vi khuẩn ở nhiệt độ cao sẽ biến tính co cụm lại và nhả khối dịch gellan bám xung quanh tế bào. Bên cạnh đó ở khoảng nhiệt độ này cao hơn nhiệt độ tan chảy của gel, gellan ở dạng sợi đơn, độ nhớt giảm kéo theo giảm độ kết dính với bề mặt vi khuẩn. Do vậy, khi tiến hành ly tâm sẽ dễ dàng tách được gellan khỏi tế bào vi khuẩn. 3.2.4.2. Nghiên cứu kết tủa gellan bằng dung môi hữu cơ * Lựa chọn dung môi thích hợp: Dịch lên men thu được qua bước tiền xử lý ở trên được cho thử nghiệm kết tủa gellan với các dung môi ethanol, acetone và isopropyl alcohol theo tỉ lệ dịch:dung môi là 1:3 (v/v). Kết quả ở hình 3.6A. cho thấy, hiệu suất thu hồi gellan từ các dung môi thử nghiệm là khá cao (trên 91%) và khác nhau không đáng kể, có lẽ vì gellan là một polyme anion nên chúng kết tủa tốt với các dung môi phân cực. Tuy nhiên xét về hiệu quả kinh tế và tính an toàn, ethanol sẽ là dung môi được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp của luận án. West T. P., (2003) cũng đã chọn ethanol là dung môi để thu hồi gellan và nhận thấy khi sử dụng ethanol hiệu suất thu hồi gellan đạt cao hơn so với khi sử dụng dung môi isopropyl alcohol và methanol. 100 93.6 94.2 35 30.9 30.6 Hiệu suất thu hồi gellan (%) Hiệu suất thu hồi gellan (%) 100 30 90 30 30 Hàm lƣợng gellan (g/l) 80 76.2 Hàm lƣợng gellan (g/l) 80 25 70 62.5 25 94.2 60 30.7 30.9 20 60 91.5 93.3 20 50 25 40 20.5 15 15 40 30 10 10 20 5 20 5 10 0 0 0 0 2/1 1/1 1/2 1/3 Aceton Ethanol Isopropyl Hàm lượng gellan (g/l) Tỷ lệ dịch lên men/ethanol Hiệu suất thu hồi gellan alcohol Hiệu suất thu hồi gellan (%) Hàm lượng Gellan (g/l) Dung môi A. Ảnh hưởng của các loại dung môi B. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men/ethanol Hình 3.6. Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất thu hồi gellan * Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men/ethanol đến hiệu suất thu hồi gellan: Để hiệu suất thu hồi gellan cao nhất và tiết kiệm chi phí sản xuất, nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men gellan/ethanol đến khả năng thu hồi gellan được tiến hành khảo sát với 4 tỷ lệ khác nhau: 2/1, 1/1, 1/2 và 1/3. Kết quả nghiên cứu ở hình 3.6B cho thấy, hiệu suất thu hồi gellan cao nhất ở tỷ lệ dịch lên men/ethanol là 1/3 cho hiệu suất thu hồi đạt 94,2%. Ở tỷ lệ 1/2, hiệu suất thu hồi gellan có thấp hơn nhưng không nhiều so với tỉ lệ 1/3 (hiệu suất đạt 93,6%). Khi giảm lượng cồn xuống (ở các tỷ lệ 1/1 và 2/2) hiệu suất thu hồi gellan cũng bị giảm xuống nhiều (tương đương 76,2% và 62,5%). 11
Từ các nhận xét trên, tỷ lệ dịch lên men/ethanol là 1/2 sẽ được lựa chọn nhằm giúp tiết kiệm đáng kể lượng ethanol tiêu hao mà vẫn đảm bảo được hiệu suất thu hồi gellan khá cao. 3.2.4.3. Loại màu khỏi kết tủa gellan Do đặc tính của các chủng Sphingomonas sp trong quá trình sinh trưởng và phát triển cũng thường tiết ra môi trường các sắc tố carotenoid màu vàng nên kéo theo các kết tủa gellan cũng bị sậm màu nếu các sắc tố này không được loại ra trước đó (Xuechang W., 2011). Dựa trên khả năng hòa tan của các carotenoid vào các dung môi hữu cơ, lặp lại các lần kết tủa gellan với các dung môi này sẽ làm tăng được độ sáng màu cho kết tủa. Trong phần này, tiến hành thí nghiệm với 500 ml dịch lên men sau khi đã tách sinh khối. Ethanol 95o được sử dụng làm dung môi để kết tủa gellan với 4 lần kết tủa lặp lại. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi gellan và khả năng loại màu qua các lần kết tủa được cho ở bảng 3.6. Từ kết quả phân tích này và quan sát sự cải thiện độ trắng của kết tủa gellan (hình 3.7), kết tủa lặp lại 3 lần sẽ được lựa chọn. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của số lần kết tủa lặp lại đến hiệu suất thu hồi gellan và khả năng loại màu Số lần kết tủa Lƣợng gellan Hiệu suất thu Lƣợng carotenoid Khả năng loại tổng (g) hồi gellan (%) tổng bị loại ra (g) carotenoid (%) Dịch gellan thô 16,40 - 0,0930 - 1 15,35 93,6 0,0776 83,4 2 15,04 91,7 0,0846 91,0 3 14,70 89,6 0,0867 93,2 4 14,61 89,1 0,0868 93,3 Dịch gellan sau lên men Kết tủa lần 1 Kết tủa lần 2 Kết tủa lần 3 Hình 3.7. Sự cải thiện màu sắc của kết tủa gellan qua các lần kết tủa lặp lại 3.2.5. Sấy kết tủa gellan tạo chế phẩm dạng bột Để sản phẩm gellan dễ sử dụng, dễ bảo quản thì cần tạo chế phẩm gellan dạng bột. Dịch gellan đậm đặc có đặc tính là một khối keo nhớt nên không dễ dàng để tiến hành sấy phun, sấy đông khô… nếu không bổ sung chất trợ sấy. Tuy nhiên, khi bổ sung chất trợ sấy có thể sẽ ảnh hưởng đến cấu trúc tạo gel của chế phẩm. Phương pháp sấy đối lưu đã khắc phục được các nhược điểm trên và được sử dụng để thử nghiệm cho nội dung nghiên cứu này. 12
Qua khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ của tác nhân sấy, thời gian sấy, độ dày vật liệu sấy đã tìm được thông số sấy thích hợp với độ dày khối sấy 5cm, nhiệt độ của tác nhân sấy là 80oC và thời gian sấy là 24 giờ, hiệu suất thu hồi sản phẩm đạt 85,9 % với độ ẩm sản phẩm là 6,50 %. Tóm tắt các bước trên tính được hiệu suất tổng của quá trình thu hồi chế phẩm gellan từ dịch nổi lên men chủng S. paucimobilis GL12 là 76,9 % (bảng 3.7) Bảng 3.7. Đánh giá hiệu suất thu hồi gellan từ dịch nổi lên men chủng S. paucimobilis GL12 Các công đoạn Hiệu suất (%) Dịch nổi 100 Kết tủa gellan + loại màu 89,6 Sấy 85,9 Toàn bộ quá trình 76,9 3.2.5. Nghiên cứu xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan Trong quá trình sản xuất và phân phối hàng hóa, bao bì có chức năng bảo vệ sản phẩm trong môi trường kín, ngăn cản độ ẩm không khí, tránh ánh sáng, tránh tác động của các lực bên ngoài, giữ cho tính chất của sản phẩm được ổn định trong một thời gian nhất định. Vì chế phẩm gellan có đặc tính hòa tan được trong nước, dễ bị hút ẩm nên việc lựa chọn loại bao bì thích hợp để bảo quản chế phẩm là rất cần thiết. Sau khi khảo sát đặc tính của một số loại bao bì 1 lớp và nhiều lớp (màng kép), độ ẩm của gellan bảo quản trong các loại màng này hầu như không thay đổi so với khi mới đóng gói. Ở loại màng ghép thì màng có lá nhôm tránh ẩm tốt nhất, điều đó đã chứng minh vai trò của lớp lá nhôm mỏng trong vật liệu tạo màng, có được kết quả này là do ngoài các tính chất về độ bền hóa học, bền nhiệt độ, bền cơ học, màng nhôm còn có một số tính chất mà các vật liệu khác không có được là tính chống khí, độ ẩm và ánh sáng rất tốt. Xét về mặt kinh tế thì các loại màng ghép càng nhiều lớp giá càng đắt. Do vậy, để phù hợp cho việc đóng gói sản phẩm được an toàn, đồng thời có hiệu quả kinh tế, màng Al/PE được lựa chọn cho bảo quản sản phẩm gellan. Sau 06 tháng bảo quản gellan đựng trong màng này vẫn có độ ẩm 6,51%. 13
3.2.7. Đề xuất quy trình thu nhận S. paucimobilis GL12 Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu, quy trình công nghệ sản xuất bột gellan được đề xuất: Chủng vi khuẩn S.paucimobilis GL12 Nhân giống (30oC ± 2; pH 7 ± 0,2; 20 giờ; 200 vòng/phút) Lên men sinh tổng hợp gellan (giống 8%; 30oC, pH 7; H2O2 ở 6, 12, 18 và 24 h bổ sung 2, 2, 3 và 4 mM; 275 vòng/ phút; tốc độ thổi khí 1 lít/lít/phút; 58 giờ) Tiền xử lý dịch lên men tách vi khuẩn (95 – 100 oC/ 15 phút) Ly tâm thu dịch nổi chứa gellan (7000v/ph trong 15 phút) Ethanol 95o Kết tủa gellan (dịch nổi/Ethanol: 1/2; kết tủa 10 giờ) Ly tâm thu tủa (ly tâm 4500 v/ph, trong 15 phút) Sấy tủa (Độ dày lớp sấy 5cm; 80 - 85 oC; thổi khí: 1m/s; sấy 24 giờ) Nghiền và bao gói Chế phẩm gellan Hình 3.8. Qui trình công nghệ thu nhận gellan từ S. paucimobilis GL12 trên hệ thống bình lên men 10 lít 3.3. Chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl 3.3.1. Xác định điều kiện chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl 3.3.1.1. Ảnh hưởng của pH đến mức độ deacyl từ gellan Để khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến mức độ deacyl của gellan, các thí nghiệm được tiến hành trong môi trường kiềm ở một số giá trị pH khác nhau 8, 9, 10, và 11 với thời gian xử lý 8 14
phút. Các mẫu gellan khử acyl sẽ được đưa đi phân tích đánh giá mức độ deacyl bằng phương pháp phổ hồng ngoại IR. Trên các phổ hồng ngoại nhận được ở hình 3.9 đều xuất hiện các pic ở vùng 3400 và 1726 cm-1. Trong đó, pic ở khoảng 3400 cm-1 là dao động hóa trị đặc trưng cho các nhóm chức OH- của chuỗi polysaccharide. Và pic xuất hiện ở khoảng 1726 cm-1 là dao động hóa trị đặc trưng của các nhóm chức acyl, cường độ của các pic phụ thuộc vào số lượng nhiều hay ít của các nhóm này. Với các mẫu gellan chuẩn và gellan thu được từ S. paucimobilis GL12, phổ IR của chúng xuất hiện đầy đủ hai pic hấp thụ ở 3400 và 1726 cm-1 với cường độ khá mạnh (hình 3.9a và 3.9b). Với phổ IR của các mẫu gellan khử acyl, cũng xuất hiện pic ở hai băng sóng này, tuy nhiên cường độ pic ở khoảng 1726 cm-1 đều bị giảm và có sự khác nhau theo mỗi điều kiện khử acyl (hình 3.9c và 3.9d). Khi tăng độ kiềm của phản ứng đồng nghĩa với việc tăng mức độ deacyl, do đó khi xử lý ở pH 10 nhận thấy độ lớn của pic ở vùng 1726 cm-1 có giá trị nhỏ hơn so với khi xử lý ở pH 9. 100 98 96 94 814.29 607.48cm-1 92 895.57 90 %T 1229.75 88 2934.45cm-1 86 1291.52cm-1 84 1725.63cm-1 1415.02cm-1 1616.93cm-1 82 3421.13cm-1 1027.02cm-1 80 79 4000 3500 3000 2500 2000 1750 1500 1250 1000 750 500450 cm-1 A. Phổ IR của gellan (chuẩn) B. Phổ IR của gellan từ S. paucimobilis GL12 100 98 96 94 894.71 611.64cm-1 92 812.75 1725.18cm-1 90 %T 1293.19cm-1 88 1412.87cm-1 2932.13cm-1 86 1611.42cm-1 1231.53 84 82 3399.48cm-1 1032.28cm-1 80 79 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500450 cm-1 C. Phổ IR của gellan khử acyl thu được ở điều kiện D. Phổ IR của gellan khử acyl thu được ở điều kiện phản phản ứng pH = 9 trong 8 phút (tư ng ứng độ ứng pH = 10 trong 8 phút (tư ng ứng độ deacyl 82%) deacyl 65%) Hình 3.9. Phổ IR của các gellan 15
Từ kết quả xác định chiều cao các đỉnh phổ thu được và dựa vào công thức tính mức độ deacyl của các mẫu thử nghiệm ở các pH khác nhau được cho ở bảng 3.8. Bảng 3.8. Ảnh hưởng của pH xử lý tới mức độ deacyl của gellan pH Mức độ deacyl-ĐĐA (%) Đặc tính gel 8 KXĐ Gel mềm 9 65 Gel mềm, yếu 10 82 Gel chắc, giòn 11 84 Gel chắc, giòn Thực nghiệm cho thấy, khả năng deacyl phụ thuộc nhiều vào pH xử lý. Khi xử lý ở pH 8 (nhiệt độ 80°C, trong 8 phút), mức độ deacyl gần như không đáng kể, sản phẩm thu được từ phản ứng này cho gel có các tính chất gần với gellan (gel mềm, đàn hồi). Khi tăng mức độ kiềm lên đạt pH 9, thu được sản phẩm có độ deacyl ở khoảng 65%, tạo gel nhão, yếu. Xử lý ở pH 10, sản phẩm nhận được có độ deacyl 82%, cho gel chắc, giòn. Khi tăng đến pH 11 mức độ deacyl cải thiện không đáng kể (đạt 84%). Như vậy, việc thay đổi pH có thể nhận được các sản phẩm có độ deacyl khác nhau và với mỗi sản phẩm nhận được có thể sử dụng để tạo gel có tính chất khác nhau từ mềm, đàn hồi tới cứng và giòn. Đặc tính khác nhau của gel nhận được từ các sản phẩm gellan khử acyl có thể được giải thích do sự thay thế nhóm acyl đã làm giảm liên kết hydro nội phân tử, làm giảm cấu trúc xoắn cuộn của gellan dẫn đến khả năng hút ẩm giảm, tăng độ cứng và độ giòn cho gel. 3.3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến mức độ deacyl Nhằm tìm ra thời gian thích hợp cho phản ứng deacyl, tiến hành khảo sát thời gian deacyl ở điều kiện môi trường kiềm có pH 10, ở nhiệt độ 80 oC, độ deacyl hóa của sản phẩm được xác định sau các mốc 4, 6, 8, 10 và 12 phút phản ứng (hình 3.10). Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian deacyl hóa cho thấy, tốc độ deacyl xảy ra khá nhanh trong 8 phút và mạnh mẽ nhất ở khoảng 4 phút đầu của phản ứng (độ deacyl đạt 60%). Thời điểm 8 và 10 phút sau phản ứng, tốc độ deacyl xảy ra chậm dần (độ deacyl tăng từ 82% - 86%). Sau 10 phút, độ deacyl của gellan ít bị thay đổi. Điều này có thể được giải thích do giai đoạn đầu quá trình deacyl xảy ra đối với các nhóm acyl trên bề mặt của gellan, chúng tiếp xúc trực tiếp với các ion OH- nên tốc độ deacyl xảy ra khá nhanh. Sau đó, phản ứng deacyl xảy ra đối với các nhóm acyl bên trong khó tiếp xúc hơn, đòi hỏi thời gian khuếch tán lâu hơn của ion OH- vào lớp bên trong. Vì vậy, tốc độ phản ứng deacyl hóa diễn ra chậm dần. Ngoài ra, do gellan có mạch polyme dài, đan xen, cuộn xoắn che lấp các nhóm chức nên rất khó loại bỏ hoàn toàn nhóm acyl. Điều này cũng nhận được tương tự khi tiến hành deacetyl hóa chitin để được sản phẩm chitosan. Theo tác giả Đặng Xuân Dự (2015) sử 16
dụng nồng độ NaOH 50%, đun nóng ở 80°C sau khoảng 3 giờ phản ứng đã thu được chitosan có độ đề acyl khoảng 83%. 100 100 82 86 86 98 72 96 Độ deacyl-ĐĐA (%) 80 816.43 60 94 897.53 611.80cm-1 60 92 1723.50 90 1297.00 %T 40 88 2926.72cm-1 1414.72cm-1 1236.93 86 20 1612.22cm-1 1155.83 84 0 82 3388.20cm-1 1038.89cm-1 4 6 8 10 12 80 79 Thời gian phản ứng (phút) 4000 3500 3000 2500 2000 1750 1500 1250 1000 750 500450 cm-1 Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian deacyl đến độ Hình 3.11. Phổ IR của gellan khử acyl thu được ở deacyl của gellan điều ki1n phản ứng pH = 10 trong 10 phút (tư ng ứng độ deacyl 86%) Từ các kết quả trên, lựa chọn được các điều kiện thích hợp cho thu nhận gellan khử acyl từ dịch nổi chứa gellan của chủng S. paucimobilis GL12 như sau: điều chỉnh dịch tới pH 10, giữ ở 80°C trong 10 phút, hạ nhiệt dịch khử, trung hòa về pH 7 bằng HCl. Phổ IR của sản phẩm ở điều kiện xử lý này được cho trên hình 3.11 tương ứng với mức độ deacetyl 86%. 3.3.2. Kết tủa gellan khử acyl bằng ethanol Ethanol được lựa chọn để kết tủa gellan khử acyl trong dịch lên men. Nhằm thu hồi hiệu suất gellan khử acyl cao nhất và tiết kiệm chi phí sản xuất, nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men gellan khử acyl/ethanol đến khả năng thu hồi gellan khử acyl. Sau khi kết thúc quá trình khử acyl và trung hòa về pH 7, ethanol 95o được bổ sung vào khối dịch theo các tỷ lệ dịch/ethanol: 2/1, 1/1, 1/2 và 1/3 để kết tủa trong 10 giờ, sau đó đánh giá lượng gellan khử acyl thu được cho mỗi thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hiệu suất thu hồi gellan khử acyl tăng dần khi tăng lượng ethanol trong dịch và đạt ổn định khi tỷ lệ dịch khử acyl/ethanol là ½ , hiệu suất thu hồi đạt 89,3% (hình 3.12). 100 35 Hàm lƣợng gellan khử acyl (g/l) Hiệu suất thu hồi gellan khử acyl 90 89.3 89.9 30 80 71.9 70 25 58.2 60 20 29.3 29.48 50 (%) 23.58 15 40 19.09 30 10 20 5 10 0 0 2/1 1/1 1/2 1/3 Tỷ lệ dịch gellan khử acyl/ethanol Hàm lượng gellan khử acyl (g/l) Hiệu suất thu hồi gellan khử acyl (%) Hình 3.12. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch gellan khử acyl/ethanol Hình 3.13. Kết tủa gellan khử acyl sau 1 lần đến hiệu suất thu hồi kết tủa cồn 17
Một điều khác cũng được nhận thấy khi bổ sung kiềm vào để thực hiện phản ứng deacyl, màu vàng của khối dịch lên men sẽ bị nhạt dần và dịch có màu trắng khi ở pH 10. Do đó, trong trường hợp này chỉ cần tiến hành kết tủa 1 lần thay vì 3 lần như trong trường hợp của gellan trên đây. Sự đối màu này có thể là do song song với trong quá trình khử acyl đã xảy ra phản ứng oxy hóa làm khối dịch chuyển từ màu vàng sang màu trắng. 3.3.3. Sấy thu hồi chế phẩm gellan khử acyl Kế thừa các kết quả nghiên cứu về phương pháp sấy đối lưu cho gellan ở phần trên, trong phần này, kết tủa gellan khử acyl cũng được sấy theo phương pháp này với chế độ sấy như sau: sấy ở nhiệt độ 80oC, tốc độ thổi khí 1 m/s, độ dày khối sấy là 5cm. Sau 24 giờ thu được sản phẩm đem đi nghiền thành bột, đóng gói kín. Kết quả phân tích ở bảng 3.9. cho thấy, hiệu suất thu hồi của quá trình sấy đạt 85,6 % cho sản phẩm có độ ẩm 6,45%, chế phẩm phẩm có dạng bột mịn, màu trắng sáng, mùi thơm nhẹ. Từ những kết quả trên, có thể tóm tắt hiệu suất quá trình thu hồi chế phẩm gellan khử acyl dạng bột từ dịch nổi lên men chủng S. paucimobilis GL12, khi đó hiệu suất tổng đạt 76%, chế phẩm có độ ẩm đạt 6,5%, độ deacyl 86% (Bảng 3.10). Bảng 3.9. Xác định hiệu xuất sấy thu hồi gellan khử acyl Lần sấy Lƣợng gellan Hiệu suất Độ ẩm khử acyl (g) thu hồi (%) (%) Ban đầu 200,0 - - Lần 1 171,4 85,7 6,48 Lần 2 171,2 85,6 6,45 Lần 3 171,2 85,6 6,42 Trung bình 171,2 85,6 6,45 Bảng 3.10. Đánh giá hiệu suất thu hồi gellan khử acyl từ dịch nổi lên men chủng S. paucimobilis GL12 Các công đoạn Hiệu suất (%) Dịch nổi 100 Khử acyl + kết tủa 89,3 Sấy 85,6 Toàn bộ quá trình 76,0 Từ những kết quả thu được ở này, qui trình khử acyl được đề xuất theo hình 3.14: 18