Tóm tắt luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu, thu nhận protein từ sinh khối rong nước lợ (Chaetomorpha sp.) để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:28

Thêm vào BST

Báo xấu

20
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu quá trình thu nhận protein concentrate từ sinh khối rong Chaetomorpha sp. Khảo sát các tính chất sinh học, tính chất chức năng và giá trị dinh dưỡng của protein concentrate từ rong để có thể ứng dụng vào thực phẩm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu, thu nhận protein từ sinh khối rong nước lợ (Chaetomorpha sp.) để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Bạch Ngọc Minh NGHIÊN CỨU, THU NHẬN PROTEIN TỪ SINH KHỐI RONG NƯỚC LỢ (Chaetomorpha sp.) ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã sỗ: 9 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Tp. Hồ Chí Minh – 2020
1 Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Hoàng Kim Anh Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TSKH Ngô Kế Sương Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: …. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 201…. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay một số loài rong (như Chaetomorpha sp.,) đang mọc tự nhiên trong khắp các ao hồ nuôi tôm nước lợ vùng đồng bằng sông Cửu Long. Sau khi thu hoạch tôm, rong bị vớt ra khỏi ao và để thành đống, vừa lãng phí vừa gây ô nhiễm môi trường. Nhiều nghiên cứu cho thấy, các thành phần trong rong có giá trị cao về mặt dinh dưỡng. Việc nghiên cứu và thu nhận các sản phẩm có giá trị từ rong sẽ tận dụng nguyên liệu sẵn có để tạo ra các giá trị gia tăng đồng thời giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường tại địa phương. Đặc biệt, protein trong rong có thành phần acid amin cân đối và hàm lượng các acid amin thiết yếu khá cao. Các loại protein thực vật cũng có nhiều tính chất chức năng tốt khiến chúng được sử dụng rộng rãi trong các sản phẩm thực phẩm chế biến. Ngoài ra, một số loại protein từ rong cũng thể hiện các tính chất sinh học như khả năng kháng khuẩn, kháng oxy hóa. Nghiên cứu thu nhận protein từ rong mở ra cơ hội sử dụng nguồn đạm thực vật để thay thế nguồn đạm từ động vật trong thực phẩm. 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài Nghiên cứu quá trình thu nhận protein concentrate từ sinh khối rong Chaetomorpha sp. Khảo sát các tính chất sinh học, tính chất chức năng và giá trị dinh dưỡng của protein concentrate từ rong để có thể ứng dụng vào thực phẩm. 3. Tính mới và ý nghĩa của đề tài Đề tài tập trung nghiên cứu thu nhận chế phẩm protein concentrate từ rong Chaetomorpha sp., nguồn nguyên liệu mới chưa được khai thác trong nước và trên thế giới. Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật siêu âm kết hợp với một loại cellulase mới để thủy phân thành tế bào rong nhằm tăng cường khả năng trích ly protein. Khác với các loại cellulase thông thường (có pH tối ưu trong vùng acid), enzyme cellulase mới hoạt động tốt trong vùng pH từ 6,5-7,5 nên thích
2 hợp sử dụng để hỗ trợ trích ly protein từ sinh khối rong là nhóm protein tan tốt trong môi trường trung tính hoặc kiềm nhẹ. Ngoài ra, đề tài có ý nghĩa khoa học khi cung cấp những thông tin hoàn toàn mới và có hệ thống về các nhóm protein trong rong Chaetomorpha sp. như thành phần acid amin, các phân đoạn protein và kích thước phân tử của nhóm protein tan trong nước và tan trong kiềm; các đặc điểm về hình thái, cũng như khả năng kháng khuẩn, kháng oxy hóa, tính chất chức năng, khả năng tiêu hóa trong điều kiện in vitro và in vivo của các chế chế phẩm protein concentrate từ rong Chaetomorpha sp. 4. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án - Khảo sát quá trình trích ly và tinh sạch protein để thu 2 chế phẩm protein tan trong nước và tan trong kiềm từ rong Chaetomorpha sp. - Xác định thành phần acid amin, hình thái và cấu trúc, các tính chất chức năng, hoạt tính sinh học và giá trị dinh dưỡng của protein concentrate từ rong. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Rong lục Chaetomorpha sp. Rong lục thuộc chi Chaetomorpha là các cơ thể đa bào được tạo thành bởi các tế bào hình trụ, được đặc trưng bởi các sợi không phân nhánh. Ngành : Chlorophyta Lớp : Ulvophyceae Bộ : Cladophorales Họ : Cladophoraceae Chi : Chaetomorpha Có khoảng 50 loài Chaetomorpha hiện được công nhận dựa trên một số đặc điểm hình thái, chẳng hạn như hình thức tăng trưởng, kích
3 thước tế bào và hình dạng của các tế bào đính kèm (Leliaert, Frederik và cộng sự 2011). 1.2. Protein từ rong Hàm lượng protein trong rong có sự khác nhau tùy theo loài. Kết quả khảo sát của Kumar (2010) trên 18 loài rong biển khác nhau thuộc 3 ngành Chlorophyta, Phaeophyta, Rhodophyta tại Ấn Độ cho thấy hàm lượng protein thay đổi từ 10 – 35%. Hàm lượng protein trong rong còn bị ảnh hưởng bởi chu kỳ mùa trong năm. Theo Fleurence (1999), hàm lượng protein của rong P. palmate dao động từ 9 – 25% theo mùa với lượng protein cao nhất thu được trong các tháng mùa xuân và mùa đông. Đối với rong lục Ulva lactuca, tháng thu nhận protein cao nhất là tháng tám với 32,7% protein trên trọng lượng khô (Fattah và Sarry,1987). Protein từ rong có đầy đủ các thành phần acid amin thiết yếu với tỷ lệ cân đối hơn nhiều so với các loại protein từ thực vật trên cạn. Protein từ rong cũng rất giàu acid aspartic và acid glutamic. Đáng chú ý là lysine được biết đến với nồng độ tương đối thấp trong các nguồn protein thực vật nhưng lại rất dồi dào trong trong rong. Chính vì thế, protein từ rong có thể được sử dụng như một nguồn dinh dưỡng có giá trị trong chế độ ăn uống của con người. Các loại protein có giá trị thu nhận từ rong bao gồm lectin và phycobiliprotein. Bên cạnh đó, chế phẩm protein concentrate và protein isolate từ rong cũng có triển vọng sử dụng trong thực phẩm để thay thế cho protein động vật do có khả năng làm giảm nguy cơ bệnh tim mạch (Lammi và cộng sự, 2019). 1.3. Thu nhận protein từ rong Tác nhân chủ yếu được sử dụng để trích ly protein từ rong là dung môi kiềm. Tuy nhiên, việc trích ly protein bị hạn chế bởi các polysaccharides trong thành tế bào. Phương án thường được lựa chọn là sử dụng hệ enzyme thủy phân thành tế bào. Fleurence và cộng sự (1995) đã nghiên cứu sử dụng các enzyme khác nhau trên các loài rong
4 đỏ, kết quả là hoạt động của các carrageenase và cellulase đã giúp hiệu quả thu nhận protein tăng 10 lần. Ngoài ra sử dụng sóng siêu âm để trích ly các thành phần protein, carbohydrate… từ rong cũng được nghiên cứu nhiều. Trong số các phương pháp trích ly mới hiện nay, có thể kể đến phương pháp SFE sử dụng CO2 siêu tới hạn và phương pháp PLE sử dụng dung môi lỏng ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao để tách các chất có khả năng kháng khuẩn, kháng ung thư và kháng oxi hóa từ rong S.pallidum và H.elongate (Fitzgeral 2011). Sau khi nhận được dịch chiết protein thô, nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để tinh sạch protein. Trong nhóm các phương pháp truyền thống có phương pháp kết tủa bằng các tác nhân như dung môi hữu cơ, muối trung tính, kết tủa tại điểm đẳng điện... Protein sau đó được tiếp tục tinh sạch bằng các phương pháp hiện đại như thẩm tích, lọc màng, sắc kí lọc gel, sắc kí trao đổi ion, sắc kí ái lực… để thu được sản phẩm có độ tinh sạch cao hơn. 1.4. Các tính chất của chế phẩm protein concentrate Chế phẩm protein concentrate được đánh giá thông qua các chỉ tiêu: thành phần và hàm lượng acid amin, hình thái và cấu trúc, tính chất chức năng và giá trị dinh dưỡng để có thể sử dụng trong công nghiệp thực phẩm. Bên cạnh đó, một số tính chất sinh học đặc biệt của chế phẩm protein cũng được xác định nhằm đánh giá triển vọng ứng dụng của nguồn protein mới trong các lĩnh vực khác.
5 CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nghiên cứu Rong Chaetomorpha sp. được thu nhận sau 15 – 20 ngày phát triển, được thu tại các ao nuôi tôm quảng canh tại huyện Giá Rai, Bạc Liêu. Rong được vận chuyển trong thùng xốp trong ngày đến phòng thí nghiệm. Rong được rửa để loại tạp chất, sau đó phơi khô, xay nhỏ và sấy tới độ ẩm 5%, bảo quản trong bình hút ẩm ở nhiệt độ phòng. Enzyme Cellulase của hãng Genecor (Mỹ), tên thương mại là Crestone Conc. có khả năng hoạt động tốt trong vùng pH trung tính từ 6,0 – 7,5, nhiệt độ từ 450C – 550C; có hoạt tính 1.100 UI/ml. 2.2. Sơ đồ nghiên cứu Sơ đồ nghiên cứu thể hiện ở hình 2.2 2.3. Bố trí thí nghiệm 2.3.1. Xác định các nhóm protein trong rong Phương pháp của Hu và Esen (1981) được sử dụng để xác định các nhóm protein trong rong dựa vào khả năng hòa tan của chúng trong các dung môi khác nhau. 2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lý nguyên liệu đến hiệu suất trích ly protein Các yếu tố được nghiên cứu trong quá trình xử lý nguyên liệu gồm ảnh hưởng của nhiệt độ sấy rong (40-1050C) và kích thước xay rong (0,25-1mm).
6 Rong nguyên liệu Khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu Sấy, xay nhỏ Khảo sát và tối ưu Enzyme hóa quá trình trích ly nhóm protein tan trong nước Trích ly 1 Dịch trích protein Bã Khảo sát và tối ưu rong hóa quá trình trích Dung môi ly nhóm protein tan kiềm trong kiềm Trích ly 2 Dịch trích protein Khảo sát điều kiện kết tủa protein Tủa protein Thẩm tích loại muối Hình thái, cấu trúc Sấy đông khô Tính chất chức năng Tính chất sinh học Giá trị dinh dưỡng PC tan trong nước và tan trong kiềm Hình 2.2. Sơ đồ quy trình thu nhận protein concentrate từ rong Chaetomorpha sp.
7 2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình tríc-h ly nhóm protein tan trong nước có sự hỗ trợ của enzyme Các yếu tố khảo sát là loại dung dịch đệm (sử dụng làm dung môi trích ly), pH (5,0-8,0), tỷ lệ nguyên liệu và dung môi (1:5 đến 1:30), nồng độ enzyme (50-150 UI/g), thời gian (1-8 giờ) và nhiệt độ trích ly (300C đến 700C). Hàm mục tiêu là hiệu suất trích ly protein và Phycocyanin. Tối ưu hóa quá trình trích ly: sử dụng mô hình quy hoạch thực nghiệm bậc 2 với sự hỗ trợ của phần mềm Modde 5.0. 2.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm Các yếu tố được khảo sát gồm tỷ lệ dung môi và nguyên liệu (1:10 đến 1:30), nồng độ dung môi (0,5-1,5%), nhiệt độ (300C-700C) và thời gian trích ly (30-90 phút). Hàm mục tiêu là hiệu suất trích ly nhóm protein tan trong kiềm. Quá trình trích ly protein tan trong kiềm được tối ưu hóa sử dụng mô hình quy hoạch thực nghiệm bậc 2 với sự hỗ trợ của phần mềm Modde 5.0. 2.3.5. Nghiên cứu quá trình tinh sạch protein Khảo sát quá trình kết tủa protein bằng các phương pháp khác nhau: kết tủa đẳng điện bằng HCl, kết tủa bằng dung môi ethanol, kết tủa bằng muối amoni sulphate và nâng cao độ tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích. Hàm mục tiêu là hiệu suất thu sản phẩm và hàm lượng protein trong chế phẩm protein. 2.3.6. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và cấu trúc của chế phẩm protein từ rong Protein được tách phân đoạn bằng sắc ký lọc gel, sử dụng cột 50x1,5 cm và hạt Biogel P100 có kích thước 100 – 200 mesh (10 – 40µm). Các phân đoạn protein thu được sau quá trình sắc ký được xác định kích thước phân tử. Chế phẩm protein concentrate cũng được sử
8 dụng để xác định thành phần acid amin và quan sát hình thái trên kính hiển vi điện tử. 2.3.7. Xác định tính chất sinh học của chế phẩm protein concentrate Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên 3 chủng vi khuẩn gây bệnh cho người là: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa. Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hoá dựa trên các cơ chế: bắt gốc tự do DPPH, bắt gốc tự do ABTS•+, tương tác với ion Fe2+ và ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào. 2.3.8. Xác định tính chất chức năng của chế phẩm protein Xác định các tính chất chức năng của chế phẩm protein concentrate từ rong bao gồm: khả năng tạo bọt và độ ổn định của bọt; khả năng tạo gel; khả năng hòa tan; khả năng hấp thu nước; khả năng tạo nhũ. So sánh với chế phẩm protein concentrate từ đậu nành. 2.3.9. Đánh giá giá trị dinh dưỡng trong điều kiện in vitro Xác định các chỉ tiêu sau của chế phẩm protein concentrate: - Khả năng tiêu hóa (IVPD) - Chỉ số điểm acid amin (AAS) - Chỉ số tiêu hoá protein dựa theo acid amin (PDCAAS) 2.3.10. Đánh giá giá trị dinh dưỡng trong điều kiện in vivo Mô hình in vivo được thực hiện trên đối tượng chuột bạch, với 4 nhóm có các chế độ ăn riêng biệt. - Nhóm 1: Chế độ ăn không chứa protein - Nhóm 2: Chế độ ăn thường (thức ăn Viện Pasteur cung cấp) - Nhóm 3: Chế độ ăn AIN 93 có chứa protein APC - Nhóm 4: Chế độ ăn AIN 93 có chứa protein từ đậu nành Các chỉ tiêu đánh giá: Hệ số tăng trọng (PER), Tỷ lệ hấp thu protein tịnh (NPR) và giá trị sinh học của protein (BV) 2.4. Phương pháp phân tích
9 - Các thành phần hóa sinh của rong được xác định theo phương pháp LAPS (Standard compositional laboratory analytical procedure) được mô tả bởi Dien và cộng sự, 2010. - Hàm lượng protein hòa tan thu được sau quá trình trích ly được xác định bằng phương pháp Lowry và Bradford. - Hàm lượng Phycocyanin được xác định bằng cách sử dụng thiết bị đo quang phổ UV-Vis (Bennett và Bogorad, 1973). - Cấu trúc của rong nguyên liệu và chế phẩm protein được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM). - Thành phần acid amin của chế phẩm protein được xác định bằng HPLC, sử dụng cột Aminex của Biorad và đầu dò RI. - Kích thước phân tử của các phân đoạn protein được xác định bằng điện di và LC-MS/MS 2.5. Phương pháp xử lý số liệu Tất cả các thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại. Kết quả được xử lý thống kê bằng phần mềm Statghraphics, đánh giá sự khác biệt giữa các kết quả thu được ở mức ý nghĩa α=0,05. Số liệu tối ưu hóa quá trình trích ly bằng quy hoạch thực nghiệm bậc 2 được xử lý bằng phần mềm Moodle 5.0. CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thành phần protein trong rong 3.1.1. Xác định thành phần sinh hóa của rong Hàm lượng carbohydrate và protein trong sinh khối rong Chaetomorpha lần lượt là 47,19% và 12,68%. Hàm lượng protein trong rong Chaetomorpha sp. không cao (12,68%-20%) khi so sánh với hàm lượng protein trong đậu nành là nguồn nguyên liệu thực vật thường được sử dụng để thu nhận các chế phẩm protein concentrate và isolate. Tuy nhiên việc tách chiết protein từ rong, theo sau đó là sử dụng bã rong
10 sau khi tách protein để sản xuất ethanol sinh học và phân bón vi sinh sẽ tạo ra chuỗi giá trị khép kín của nguyên liệu với nhiều sản phẩm đa dạng, tạo công ăn việc làm cho người nông dân, mở ra hướng phát triển bền vững cho nguồn nguyên liệu hiện đang bị bỏ phí này. 3.1.2. Xác định các nhóm protein trong rong Rong sẽ được xử lý lần lượt bằng nước cất; NaCl 0,5M; ethanol 70% và NaOH 0,1M để xác định các nhóm protein. Kết quả cho thấy trong rong Chaetomorpha sp., nhóm protein tan trong kiềm chiếm tỷ lệ cao nhất 55,27%, nhóm protein tan trong nước chiếm 34,33% so với tổng lượng protein. Hai nhóm protein tan trong muối và cồn có tỷ lệ thấp tương ứng là 6,07% và 4,32%. Kết quả phân tích các nhóm protein trong rong là cơ sở cho việc lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình trích ly protein. Từ kết quả trên, chúng tôi quyết định lựa chọn khảo sát quá trình trích ly của hai nhóm protein có hàm lượng cao trong rong là nhóm tan trong nước và nhóm tan trong kiềm. 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lý nguyên liệu đến hiệu suất trích ly protein Sinh khối rong sau khi thu hoạch cần được phơi sấy để có thể bảo quản trong thời gian dài. Tuy nhiên, nhiệt độ sấy quá cao có thể làm biến tính protein và ảnh hưởng đến thành phần acid amin. Kích thước rong sau khi xay cũng ảnh hưởng đến diện tích tiếp xúc bề mặt giữa nguyên liệu và dung môi, do đó ảnh hưởng đến hiệu quả trích ly. Kết quả cho thấy nhiệt độ sấy ở 600C và kích thước nguyên liệu nhỏ hơn 0,1mm là tốt nhất cho quá trình trích ly protein. 3.3. Khảo sát quá trình trích ly nhóm protein tan trong nước với sự hỗ trợ của cellulase Ở các tế bào thực vật thành tế bào cấu tạo từ cellulose rất chắc chắn, do đó để việc phá vỡ tế bào có hiệu quả, ngoài sự hỗ trợ của các tác
11 động vật lý như sóng siêu âm, enzyme cellulase cũng được sử dụng để cắt đứt các liên kết của thành tế bào và giải phóng protein. Kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng đệm phosphate 0,1M pH 7 với tỷ lệ nguyên liệu:dung dịch đệm 1:20 là thích hợp cho hoạt động của enzyme. Nồng độ cellulase sử dụng là 100UI/g, thời gian và nhiệt độ trích ly tối ưu lần lượt là 60 phút và 500C. Các điều kiện này cũng là điều kiện thích hợp để thu nhận Phycocyanin. Hàm lượng Phycocyanin thu được cao nhất là 0,39 mg/g rong khô, chiếm khoảng 1% so với tổng hàm lượng của nhóm protein tan trong nước thu được trong dịch trích (38,36 mg/g rong khô). Tối ưu hoá quá trình trích ly protein tan trong nước Thủy phân sinh khối rong bằng enzyme là một phản ứng trong hệ dị thể, vì vậy khả năng tiếp xúc của enzyme với cơ chất là vấn đề quan trọng. Tỷ lệ nguyên liệu/cơ chất:dung dịch đệm cao sẽ làm tăng độ nhớt môi trường, hạn chế khả năng truyền khối. Ngược lại, sử dụng nồng độ cơ chất thấp sẽ làm loãng dịch trích và gây khó khăn trong quá trình trích ly tiếp theo bằng dung môi kiềm. Trong thí nghiệm này pH 7 và tỷ lệ nguyên liệu/cơ chất:dung môi 1:20 được giữ cố định ở mức tối ưu. Quá trình tối ưu hóa được thiết lập với 3 thông số biến đổi là nồng độ enzyme (X1), nhiệt độ (X2) và thời gian trích ly (X3), sử dụng mô hình tối ưu hóa ba yếu tố trực giao cấp 2 có tâm xoay với 3 thí nghiệm ở tâm. Phương trình hồi quy mô tả hàm lượng protein hòa tan thu được trong dịch trích như sau: Y1 = 37,024 + 3,452 X1 + 2,322 X3 – 3,137 X12 – 1,417 X32 Nồng độ enzyme và thời gian trích ly ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất trích ly protein, tuy nhiên sự tương tác của các yếu tố này lại không có ảnh hưởng đến hàm lượng protein thu được trong dịch trích (p>0.05). Các điều kiện tối ưu của quá trình trích ly là nồng độ enzyme là 121 UI/g cơ chất, nhiệt độ và thời gian trích ly tương ứng là 400C là
12 90 phút. Hàm lượng protein hòa tan dự đoán theo phương trình hồi quy và thu được trong thực nghiệm là 38,921 và 37,651 mg/g rong khô, khác biệt 3,27%. 3.4. Khảo sát quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm bằng dung môi NaOH Các kết quả khảo sát đơn yếu tố cho thấy, các thông số kỹ thuật phù hợp đối với quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm bao gồm tỷ lệ cơ chất và dung môi (1:20), nồng độ NaOH 1%, thời gian và nhiệt độ trích ly tương ứng là 60 phút và 500C. Trên cơ sở các kết quả này, quá trình tối ưu hóa được thực hiện theo mô hình trực giao cấp 2 có tâm xoáy với 3 thí nghiệm tại tâm. Các yếu tố có ảnh hưởng lớn tới quá trình trích ly được lựa chọn làm thông số biến đổi là thời gian trích ly (X4) và nồng độ NaOH (X5). Phương trình hồi quy mô tả hàm lượng protein hòa tan thu được trong dịch trích như sau: Y2 = 65,180 + 6,321 X4 + 10,224 X5 – 5,509 X4 X5 – 8,259 X52 Kết quả cho thấy nồng độ NaOH và thời gian trích ly thể hiện ảnh hưởng tương hỗ của đến hàm lượng protein. Khi sử dụng nồng độ NaOH thấp sẽ cần nhiều thời gian để quá trình trích ly đạt hiệu suất tối ưu. Ngược lại khi sử dụng NaOH ở nồng độ cao, quá trình trích ly sẽ nhanh chóng đạt tới trạng thái cân bằng và việc kéo dài thời gian sẽ không làm tăng đáng kể hiệu suất trích ly. Hàm lượng protein hoà tan dự đoán đạt cao nhất 68,651 mg/g rong khô tại nồng độ NaOH là 1,2% và thời gian trích ly là 72 phút, khác biệt 0,8% so với kết quả thực nghiệm. Đánh giá hiệu quả trích ly protein bằng các phương pháp
13 Trong thí nghiệm này, bể siêu âm Elma có tần số sóng 35kHz được sử dụng kết hợp với cellulase để tăng hiệu quả thủy phân thành tế bào. Cấu trúc tinh thể phức tạp của cellulose khiến nó bền Hình 3.5. Hiệu quả trích ly 2 nhóm protein tan trong nước và tan trong kiềm bằng các phương với các tác động thủy phân. pháp khác nhau Khi sử dụng kết hợp với cellulase, sóng siêu âm giúp phá vỡ cấu trúc tinh thể của cellulose, tạo điều kiện để enzyme có thể tiếp cận tốt hơn với cơ chất để thủy phân thành tế bào rong một cách hiệu quả. Chính vì vậy, sử dụng kết hợp cả siêu âm và enzyme giúp tăng hiệu suất trích ly protein từ sinh khối rong một cách rõ rệt so với đối chứng (67,9 so với 43,34 mg/g rong khô). Hình thái cấu trúc của rong nguyên liệu và bã rong sau trích ly được nghiên cứu bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM). a b Hình 3.7. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét (độ phóng đại 250x, thang đo 50µm) của bã rong Chaetomorpha sp. sau khi trích ly protein (a) Không sử dụng siêu âm và enzyme (b) Có sử dụng siêu âm và enzyme Khi không có các biện pháp hỗ trợ, thành tế bào rong bị phá vỡ không hiệu quả, nên nhiều tế bào còn nguyên các thành phần nội bào chưa được trích ly (Hình 3.7a). Ngược lại, với sự hỗ trợ của siêu âm
14 và enzyme, hầu như tất cả các tế bào rong đều teo lại do đã giải phóng triệt để các thành phần nội bào (Hình 3.7b). 3.5. Nghiên cứu quá trình tinh sạch protein Quá trình kết tủa đẳng điện và kết tủa bằng dung môi ethanol cho hiệu suất thu protein không cao, độ tinh sạch của kết tủa protein < 50%. Khi sử dụng muối (NH4)2SO4 bão hòa 70%, hiệu suất tủa và độ tinh sạch của nhóm protein tan trong nước đạt tương ứng 62,86% và 58,77%, của nhóm protein tan trong kiềm đạt tương ứng 65,29% và 62,29%. Mẫu được đem thẩm tích bằng màng bán thấm cellophane có kích thước lỗ 14kDa để loại bỏ muối, hiệu suất thu hồi nhóm protein tan trong nước và tan trong kiềm tương ứng là 70,81%, 71,08%; độ tinh sạch tương ứng là 72,80% và 75,50%. 3.6. Xác định tính chất của chế phẩm protein concentrate 3.6.1. Thành phần sinh hoá của chế phẩm protein concentrate Để thu nhận chế phẩm protein concentrate, chúng tôi tiến hành trích ly hai phân đoạn protein tan trong nước và tan trong kiềm, sau đó kết tủa bằng muối ammonium và thẩm tích loại muối theo các điều kiện tối ưu. Chế phẩm protein sau khi sấy đông khô đến độ ẩm dưới 10% w/w. Hàm lượng protein trong hai chế phẩm APC-N và APC-K lần lượt là 72,8% và 76,3%. 3.6.2. Thành phần acid amin trong protein của rong Bảng 3.17. Thành phần acid amin trong chế phẩm protein Hàm lượng acid amin trong chế phẩm Acid amin protein (g/100g protein) Chế phẩm APC-N Chế phẩm APC-K Aspatic acid 11,7 ± 0,2 11,5 ± 0,15 Glutamic acid 16,1 ± 0,09 15,7 ± 0,14 Serine 5,3 ± 0,03 5,1 ± 0,1 Histidine 1,4 ± 0,07 1,7 ± 0,25
15 Arginine 5,3 ± 0,15 6,2 ± 0,1 Glycine 4,9 ± 0,18 4,9 ± 0,12 Threonine 4,1 ± 0,16 5,1 ± 0,23 Alanine 7,3 ± 0,11 7,8 ± 0,09 Tyrosine 4,5 ± 0,09 4,1 ± 0,06 Methionine 3,6 ± 0,15 3,5 ± 0,15 Valine 5,4 ± 0,18 6,5 ± 0,09 Phenylanine 5,9 ± 0,34 5,9 ± 0,18 Isoleucine 3,5 ± 0,15 4,6 ± 0,01 Leucine 8,3 ± 0,14 8,6 ± 0,09 Lysine 5,1 ± 0,18 5,6 ± 0,07 Cystine 3,0 ± 0,05 1,8 ± 0,09 Proline 4,6 ± 0,09 1,4 ± 0,05 Hàm lượng các acid amin thiết yếu trong protein của Chaetomorpha sp. chiếm tỷ lệ cao, tổng hàm lượng của 8 acid amin không thay thế trong chế phẩm protein APC-N và APC-K chiếm tương ứng 37,3% và 41,5% so với tổng lượng protein. Hàm lượng các acid amin như methionine, lysine và threonine trong chế phẩm protein từ rong cao hơn so với các protein có nguồn gốc thực vật. 3.6.3. Hình thái cấu trúc của chế phẩm protein concentrate Hình 3.9 cho thấy cấu trúc của chế phẩm protein concentrate có dạng tấm. Chế phẩm protein tan trong nước APC-N có cấu trúc tấm phẳng và lớn, trong khi chế phẩm protein tan trong kiềm APC-K có cấu trúc dạng tấm nhỏ hơn, bề mặt gồ ghề và xốp. Thông thường các tấm có cấu trúc nhỏ và xốp sẽ có độ hoà tan cao hơn. Cấu trúc vi mô của hai loại protein concentrate có thể được dùng để giải thích khả năng hoà tan của chúng (Hu và cộng sự, 2013).
16 a b c d Hình 3.9. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét của protein concentrate ở độ phóng đại 500x, thang đo 50µm và ở độ phóng đại 1000x, thang đo 10µm. (a), (b) chế phẩm APC.N; (c), (d) chế phẩm APC.K 3.6.4. Xác định kích thước và khối lượng phân tử của các phân đoạn protein Chế phẩm protein concentrate từ rong sẽ được phân đoạn bằng sắc ký lọc gel và xác định kích thước phân tử bằng điện di SDS-PAGE. Các phân tử protein có cấu trúc rất phức tạp. Cấu trúc không gian của protein cũng như khả năng bị biến tính trong môi trường chứa SDS có thể ảnh hưởng đến khả năng di động của protein. Bên cạnh đó, protein còn có thể liên kết với các thành phần phi protein khác và rất khó để có thể tách riêng protein ra khỏi các thành phần này trong các điều kiện chạy điện di SDS-PAGE thông thường. Sự ảnh hưởng của hình dạng và kích thước của các thành phần liên kết phi protein đến tính di động của protein là rất khó dự đoán. Theo nhiều nghiên cứu, các protein trong rong thường có bản chất là các glycoprotein. Glycoprotein là các protein có chứa các oligosaccharide/ polysaccharide liên kết cộng hóa trị với các acid amin thích hợp. Các glycoprotein có độ linh động điện di thấp và trọng lượng phân tử cao, do đó tạo ra hiện tượng kéo thành dải trong gel điện di. Hai mẫu protein tan trong nước và tan trong kiềm được gửi đến phòng thí nghiệm Sinh hoá, trường ĐH Khoa học Tự Nhiên, ĐH Quốc
17 gia Tp.HCM để xác định kích thước phân tử bằng phương pháp LC- MS/MS, sử dụng kĩ thuật ion hoá mẫu bằng tia lửa điện (ESI) và xác định khối lượng phân tử bằng QTOF. Sắc ký đồ của hai mẫu protein khi phân tích LC/MS/MS thể hiện ở hình 3.15 và hình 3.16. Kết quả phân tích khối phổ của các peak này như sau. - Mẫu protein tan trong nước chứa các mảnh protein có kích thước lần lượt là 11,4 kDa, 13,6 kDa, 15,4 kDa, 27,2 kDa và 38,6 kDa (Hình 3.15) - Mẫu protein tan trong kiềm chứa các mảnh protein có kích thước lần lượt là 11,4 kDa, 21,1 kDa, 27,2 kDa, 34,1 kDa 40,5 kDa và 63,8 kDa (Hình 3.16). Hình 3.15. Kết quả phân tích Hình 3.16. Kết quả phân tích MS mẫu APC-N MS mẫu APC-K 3.7. Xác định tính chất sinh học của protein 3.7.1. Thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật Những chủng vi khuẩn kiểm định gây bệnh ở người do ATCC cung cấp: S.aureus, E.coli, P.aeruginosa. Khi so sánh với đối chứng là kháng sinh Kanamycin với nồng độ khuyến nghị là 10µg/ml, hiệu quả kháng khuẩn của protein concentrate từ rong là khá tốt đối với vi khuẩn S. aureus và P. aeruginosa (Đường kính vòng kháng khuẩn đối với 2 vi khuẩn này tương ứng là 6 mm và 6,33 mm). Kháng sinh có hiệu quả kháng vi khuẩn E. coli cao hơn gấp đôi so với khi sử dụng protein concentrate từ rong. Tuy nhiên, giá trị
18 MIC (nồng độ thấp nhất tại đó chế phẩm thể hiện hoạt tính kháng khuẩn) của chế phẩm protein từ rong cao hơn nhiều so với đối chứng là kháng sinh Kanamycin. Điều đó cũng cho thấy, hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm protein từ rong còn khá thấp, chưa đủ để có thể đưa vào ứng dụng thực tế. 3.7.2. Thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hoá Khả năng chống oxi hoá của hai chế phẩm Chaetomorpha protein concentrate được thử nghiệm theo các cơ chế khác nhau. Ở cùng một nồng độ, chế phẩm APC.N có hoạt tính bắt gốc tự do DPPH cao hơn hẳn chế phẩm APC.K. Ở cùng nồng độ thử nghiệm là 78,125 µg/ml thì tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của hai mẫu chế phẩm APC.N và APC.K lần lượt là 73,97% và 22,22%. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm APC-K ở nồng độ thử nghiệm 312,55 µg/ml là 55,18%. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm APC.N cao hơn có thể là do trong nhóm protein tan trong nước có chứa Phycocyanin là nhóm protein có hoạt tính kháng oxi hoá. Ngoài ra, phân tử protein thu nhận từ rong cũng có thể chứa các thành phần acid amin có khả năng kháng oxy hóa như cysteine (chứa nhóm thiol), các acid amin chứa nhóm phenolic như tyrosin. Với mục tiêu đánh giá khả năng ứng dụng chế phẩm APC-N trong thực phẩm chức năng giàu chất chống oxi hóa, APC-N tiếp tục được sử dụng để nghiên cứu sâu hơn về khả năng chống oxi hoá bằng các cơ chế khác nhau. Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh hoá Trung tâm Sâm và Dược liệu, ĐH Y Dược, Tp HCM. Tóm lại các thí nghiệm đánh giá khả năng kháng oxy hóa của chế phẩm protein tan trong nước từ rong Chaetomorpha sp. cho thấy, APC-N có khả năng kháng oxy hóa bằng nhiều cơ chế khác nhau. Chế phẩm APC-N là protein concentrate với hàm lượng protein 72,8% w/w. Ngoài protein tan trong nước và phycocyanin, chế phẩm APC-N