Tóm tắt luận án Tiến sĩ Công nghệ thực phẩm: Ứng dụng các kỹ thuật lên men, xử lý nhiệt và nano trong chế biến và nâng cao giá trị các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi

Chia sẻ: Nhiên Hà | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:41

Thêm vào BST

Báo xấu

45
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án với mục tiêu nâng cao và cải thiện sinh khả dụng của các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi thông qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi (tỏi đen và tỏi len men lactic) và công nghệ nano.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Công nghệ thực phẩm: Ứng dụng các kỹ thuật lên men, xử lý nhiệt và nano trong chế biến và nâng cao giá trị các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ Thực phẩm Mã ngành: 62540101 NGUYỄN ÁI THẠCH ỨNG DỤNG CÁC KỸ THUẬT LÊN MEN, XỬ LÝ NHIỆT VÀ NANO TRONG CHẾ BIẾN VÀ NÂNG CAO GIÁ TRỊ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TỎI Cần Thơ, 2020
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Nguyễn Minh Thủy Người hướng dẫn phụ: TS. Hà Phương Thư Luận án được bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp cơ sở Họp tại: ………………………………., Trường Đại học Cần Thơ. Vào lúc ….. giờ ….. ngày ….. tháng ….. năm ….. Phản biện 1: Phản biện 2: Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ. Thư viện Quốc gia Việt Nam.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Nguyễn Ái Thạch, Nguyễn Minh Thủy, Nguyễn Thị Mỹ Tuyền và Võ Thị Diệu. 2016. Thay đổi đặc tính lý hóa của củ tỏi trong quá trình thuần thục và tồn trữ. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 45b: 16-24. ISSN 1859-2333. 2. Nguyễn Ái Thạch, Lê Thái Anh Thư và Nguyễn Minh Thủy. 2016. Ảnh hưởng của quá trình chần, mật độ Lactobacillus platarum và nồng độ muối đến các hoạt chất sinh học trong sản phẩm tỏi lên men muối chua. Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn. Chuyên đề: Nông nghiệp xanh: 161-166. ISSN 1859–4581. 3. Nguyễn Ái Thạch, Nguyễn Minh Thủy. 2017. Ảnh hưởng của nhiệt độ lão hóa đến các đặc tính lý hóa của sản phẩm tỏi đen. Tạp chí Hóa học. 55(4E23): 130-134. ISSN: 0866-7144. 4. Nguyễn Ái Thạch, Nguyễn Minh Thủy. 2017. Ảnh hưởng của nhiệt độ lão hóa đến hàm lượng các hợp chất sinh học trong tỏi đen. Tạp chí Hóa học. 55(4E23): 135-139. ISSN: 0866- 7144. 5. Nguyen Ai Thach and Nguyen Minh Thuy. 2017. Effect of extraction conditions on polyphenols, flavonoids, S-Allyl cysteine content and antioxidant activity of black garlic extract. Vietnam Journal of Science and Technology, 55(5A), 18-25. ISSN: 0866-708X. 6. Nguyễn Ái Thạch và Nguyễn Minh Thủy. 2018. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian sấy đến các hợp chất có hoạt tính sinh học và khả năng chống oxy hóa của sản phẩm tỏi đen. Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, 1(86): 59-63. ISSN: 1859-1558.
7. Nguyen Ai Thach and Nguyen Minh Thuy. 2019. Study of synthesis and characteristics of total polyphenols, total flavonoids and S-allyl cysteine-loaded alginate nanoparticles with various black garlic extracts and alginate ratios. International Journal of Engineering Sciences and Reasearch Technology, 8(6): 261-272. ISSN: 2277-9655. 8. Nguyen Ai Thach, Ha Phuong Thu and Nguyen Minh Thuy. 2019. In-vitro evaluation of cytotoxicity, antimicrobial, and enzyme inhibition activity of black garlic and its nanoparticles. International Journal of Engineering Sciences and Reasearch Technology, 8(10): 59-63. ISSN: 2277-9655.
Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của luận án Ở Việt Nam, tỏi được trồng nhiều tại các vùng Hải Dương, Hà Nội, Bắc Giang, Phan Rang, Lý Sơn, Đà Lạt,… Tỏi Phan Rang có đặc điểm củ nhỏ, vỏ lụa trắng, tinh dầu rất thơm. Nhiều nông hộ áp dụng quy trình VIETGAP vào sản xuất, cung cấp cho người tiêu dùng sản phẩm tỏi bảo đảm chất lượng an toàn. Bảo quản tỏi rất quan trọng để cung cấp sản phẩm cho thị trường rau củ tươi và cho quá trình chế biến. Tỏi có thể được lưu trữ khoảng 1-2 tháng trong điều kiện tốt ở nhiệt độ môi trường xung quanh với RH thấp (< 75%). Tuy nhiên, trong những điều kiện này, củ tỏi sẽ dần dần trở nên mềm, xốp và nhăn nheo do mất nước. Khảo sát độ thuần thục và phương pháp tồn trữ giúp duy trì ổn định nguồn nguyên liệu cho quá trình chế biến và mua bán. Việc tiêu thụ tỏi tươi chưa qua chế biến bị hạn chế do có mùi hăng, vị cay đặc trưng và có xu hướng gây khó chịu cho dạ dày. Trong những năm gần đây, các phương pháp chế biến khác nhau như xử lý nhiệt, lão hóa (aging) và lên men đã được sử dụng để loại bỏ mùi khó chịu và cải thiện vị của tỏi (Bae et al., 2014). Tỏi đen có vị ngọt dịu và độc đáo, cấu trúc mềm dẻo như trái cây sấy, không gây mùi vị khó chịu như tỏi tươi (Wang et al., 2010). Hơn nữa, quá trình chế biến tỏi đen còn liên quan đến sự hình thành các hợp chất phenolic, S-allyl-L-cysteine (SAC) và các hợp chất hoà tan trong nước có tác dụng chống oxy hoá mạnh (Corzo- Martinez et al., 2007; Imai et al., 1994). Vì vậy đây là thực phẩm lý tưởng trong phòng ngừa và điều trị bệnh tim, Alzheimer, viêm khớp và các bệnh mãn tính như bệnh tiểu đường, đặc biệt là bệnh ung thư. Ngoài ra, quá trình lên men, ngoài việc là một phương pháp để bảo quản nguyên liệu tươi trong thời gian ngắn trước khi tiếp tục chế biến, nó có thể 1
mang lại một vài thuận lợi (cải thiện mùi, làm giàu các chất chuyển hóa mong muốn được tạo ra bởi các vi sinh vật và tăng độ an toàn) như đã được báo cáo trong các sản phẩm len men thực vật khác (Buckenhuskes et al., 1990). Hiện nay, các nghiên cứu chuyên sâu về quy trình chế biến và các biến đổi chất lượng sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic đã bắt đầu được quan tâm tại Việt Nam. Tuy nhiên, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở việc tạo ra sản phẩm mới (tỏi đen), chưa quan tâm nhiều đến hoạt chất sinh học trong sản phẩm. Do đó, việc nghiên cứu, thiết lập và kiểm soát các thông số kỹ thuật trong chế biến là điều cần thiết và cấp bách nhằm tạo ra sản phẩm có giá trị sinh học và khả năng phòng ngừa bệnh cao tại Việt Nam. Khả năng hấp thu các dược chất quý trong tỏi vào cơ thể đến nay công bố vẫn còn hạn chế, tuy nhiên có thể khẳng định rằng khi nano hóa các hoạt chất trên thì khả năng hấp thu sẽ tăng lên gấp hàng chục lần (Shaikh et al., 2009). Quy trình chế tạo hạt nano tỏi đen khá phức tạp bởi chúng chỉ được hình thành khi đáp ứng các tiêu chí về tính chất vật lý và hóa học đặc trưng. Hạt nano tỏi đen cũng chưa được chế tạo và công bố ở các nghiên cứu trong nước và quốc tế. Vì vậy, nghiên cứu chế biến các sản phẩm từ tỏi với hàm lượng cao các hoạt chất sinh học, đồng thời cùng với việc trích ly hiệu quả các hoạt chất này và ứng dụng công nghệ nano để tăng cường hoạt tính của chúng là cấp thiết. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Nâng cao và cải thiện sinh khả dụng của các chất có hoạt tính sinh học trong tỏi thông qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi (tỏi đen và tỏi len men lactic) và công nghệ nano. 1.3 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Khảo sát sự thay đổi đặc tính lý học và hợp chất có hoạt tính sinh học của củ tỏi (Allium sativum L.) trong quá trình thuần thục và tồn trữ. 2
Nội dung 2: Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học trong củ tỏi thông qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic. Nội dung 3: Ứng dụng công nghệ nano nhằm cải thiện sinh khả dụng của các hợp chất sinh học từ sản phẩm tỏi đen. 1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Nguyên liệu tỏi tươi cổ mềm, giống địa phương được thu hoạch và chọn lựa vào thời điểm mùa vụ năm 2014, 2015, 2016 và 2017 tại phường Văn Hải, thành phố Phan Rang - Tháp Chàm, tỉnh Ninh Thuận. Sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic được chế biến và nghiên cứu tại Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ. Hạt nano tỏi đen được chế tạo bằng cách sử dụng polymer alginate mạch ngắn và thử nghiệm hoạt tính kháng sinh, gây độc tế bào ung thư, ức chế enzyme -glucosidase và AChE, khả năng hạ đường huyết trên chuột nhắt trắng bị tiểu đường tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 1.5 Ý nghĩa của luận án 1.5.1 Ý nghĩa khoa học Luận án đã cung cấp nhiều kết quả nghiên cứu về độ thuần thục, thời gian thu hoạch và điều kiện bảo quản tỏi tươi. Ngoài ra, cơ chế hình thành tỏi đen và tỏi lên men lactic trong suốt quá trình chế biến cũng được làm rõ. Các mô hình đề xuất và các thiết lập liên quan đến các giá trị tham số động học được đánh giá nhằm có các hiểu hiết chính xác về sự thay đổi của các hợp chất có hoạt tính sinh học trong sản phẩm thực phẩm trong quá trình chế biến. Hạt nano tỏi đen được chế tạo và thử nghiệm thành công ở kỹ thuật in-vitro và in-vivo góp phần làm đa dạng cơ sở dữ liệu thuốc phục vụ hỗ trợ và điều trị bệnh. 1.5.2 Ý nghĩa thực tế 3
Thông qua quy trình chế biến tỏi đen và tỏi lên men lactic sẽ làm tăng lượng tiêu thụ tỏi cho người nông dân. Nghiên cứu đồng thời quy trình sản xuất hai dạng sản phẩm này cũng nhằm tạo ra nguồn thực phẩm mới có giá trị sinh học cao và là công việc có ý nghĩa khoa học và thực tiễn. Tỏi đen và tỏi lên men lactic trải qua quá trình chế biến có hàm lượng các chất có hoạt tính sinh học (S-allyl cysteine, polyphenol, flavonoid,…) và hoạt động chống oxy hóa cao hơn so với tỏi tươi. Đặc biệt, các hợp chất này có khả năng ứng dụng cao trong việc bảo vệ sức khỏe và là một liệu pháp phòng ngừa bệnh ung thư cho người tiêu thụ chúng. Tỏi đen và tỏi lên men lactic cũng góp phần làm đa dạng hơn các sản phẩm từ tỏi ngoài thị trường và cung cấp nguồn thực phẩm giàu “giá trị dược liệu” trong bữa ăn hàng ngày. Công nghệ nano được áp dụng đồng thời sẽ tăng giá trị sinh học của sản phẩm và mở hướng mới cho việc sử dụng các sản phẩm của tỏi Việt Nam ở mức độ cao và hiệu quả hơn. Ngoài ra, sự ra đời của hệ nano tỏi đen sẽ là niềm hy vọng mới cho các bệnh nhân ung thư, tiểu đường và một số loại bệnh khác. 1.6 Những điểm mới của luận án Luận án cung cấp thông tin thời điểm thuần thục và điều kiện bảo quản tỏi tươi liên quan đến đặc tính lý học và các hợp chất có hoạt tính sinh học trong suốt quá trình tồn trữ. Xây dựng được quy trình chế biến tỏi đen và tỏi lên men lactic nhằm tạo ra sản phẩm tỏi có chất lượng cao vượt trội so với tỏi tươi (tăng cường hàm lượng các hoạt chất sinh học và khả năng chống oxy hóa trong tỏi đen). Xây dựng quy trình trích ly các hợp chất sinh học từ tỏi đen và ứng dụng công nghệ nano chế tạo thành công hạt nano tỏi đen mang các chất có hoạt tính sinh học với kích 4
thước 100 nm, hình dạng gần với hình cầu và độ ổn định cao. Hiệu quả thu nhận được từ thử nghiệm hoạt tính của hệ nano tỏi đen ở kỹ thuật in-vitro và in-vivo cũng được xác định. 1.7 Kết cấu của luận án Luận án gồm 5 chương: Chương 1-Giới thiệu (trang 1-5); Chương 2-Tổng quan tài liệu (trang 6-30); Chương 3- Phương tiện và phương pháp (trang 31-47); Chương 4-Kết quả và thảo luận (trang 48-135); Chương 5-Kết luận và đề nghị (trang 136-137). Trong nội dung chính có 36 bảng và 84 hình. Trong bài viết sử dụng 282 tài liệu tham khảo (263 tài liệu tiếng Anh và 19 tài liệu tiếng Việt). Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quát về tỏi Tỏi (Allium sativum L.), một trong những loại thực vật lâu đời nhất được sử dụng trong y học, đã trở thành một phần quan trọng trong của sống của con người qua nhiều thế kỷ. Tỏi được sử dụng như gia vị thực phẩm, tăng cường sức khỏe cho người lính trong chiến tranh, chữa cảm lạnh, nhiễm trùng và điều trị nhiều loại bệnh khác nhau, từ bệnh tim mạch đến ung thư và thậm chí cả bệnh dịch hạch (Amagase, 2006). Thành phần của tỏi rất phức tạp, với hơn 200 hợp chất khác nhau góp phần vào hiệu quả có lợi của tỏi. Những tính năng quan trọng và độc đáo nhất của tỏi là hàm lượng hợp chất lưu huỳnh hữu cơ cao. Tỏi có chứa nhiều lưu huỳnh hơn (ít nhất gấp 4 lần) so với nhiều loại rau chứa lưu huỳnh cao khác: hành tây, bông cải xanh và súp lơ. Tỏi cũng chứa nhiều carbohydrate chứa fructose, protein, xơ, saponin, phospho, kali, kẽm, lượng selen vừa phải và vitamin C, steroid glycoside, lectin, prostaglandin, tinh dầu, adenosine, vitamins B1, B2, B6, và E, biotin, acid nicotinic, acid béo, glycolipid, phospholipid, anthocyanin, flavonoid, phenol, và 5
acid amin thiết yếu (Borek, 2001; Imai et al., 1994; Amagase et al., 2001; Ide et al., 1999; Borek, 2006; Rahman, 2003). 2.2 Các nghiên cứu liên quan đến điều kiện thu hoạch và tồn trữ củ tỏi sau thu hoạch Tại Thổ Nhĩ Kỳ, tỏi có thể được bảo quản tại 0-5oC, 60-70% RH trong ít nhất 3-4 tuần trong kho. Đến năm 2012, chưa có phương pháp xử lý nào được thực hiện ở trước và sau thu hoạch tỏi bảo quản tại Thổ Nhĩ Kỳ. Bảo quản tỏi trong điều kiện kiểm soát khí quyển và điều chỉnh khí quyển được sử dụng phổ biến với phương pháp chiếu xạ, hóa chất và gia nhiệt khác nhau ở nước ngoài (Selen and Nilgün, 2012). Geraldine et al. (2008) đánh giá tính chất vật lý của agar-agar (1%) dựa trên lớp màng phủ kết hợp với 0,2% chitosan và 0,2% acid acetic, cũng như ảnh hưởng của chúng đến lớp màng phủ của tỏi chế biến. Tổn thất ẩm trung bình của tỏi phủ màng thấp hơn 3 lần so với mẫu đối chứng (không phủ màng). Có sự gia tăng đáng kể sự khác biệt về màu sắc (DE*) của mẫu đối chứng so với cách xử lý khác. Tỏi bao màng có cường độ hô hấp (30 mg CO2/kg.giờ) giảm một nửa so với tỏi đối chứng. Hiện nay, ở Việt Nam, củ tỏi sau khi thu hoạch từ ruộng tỏi sẽ được nông dân xử lý, phơi nắng nhiều ngày và lưu kho. Quy trình đơn giản này sẽ làm tỏi dễ bị thối hỏng, mất nước và dẫn đến giảm giá trị kinh tế. Ngoài ra, các nghiên cứu sau thu hoạch củ tỏi vẫn chưa được công bố nhiều ở nước ta. 2.3 Các nghiên cứu nâng cao hoạt chất sinh học trong tỏi liên quan đến chế biến tỏi đen và tỏi lên men lactic Ở Việt Nam trước đó, tỏi đen chỉ được nghiên cứu tại Học viện Quân y ở quy mô cấp Nhà nước mã số KC10.TN05/11-15. Theo chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu lên men tỏi đen từ tỏi Lý Sơn và đánh giá tác động sinh học của 6
sản phẩm tạo ra” cho biết quá trình lên men, các hoạt tính sinh học của tỏi Lý Sơn tăng đáng kể, trong đó hàm lượng đường tổng tăng khoảng 13 lần, fructose tăng khoảng 52 lần và SAC tăng gấp 6 lần. Tỏi đen được chế biến từ tỏi tươi thu hoạch ở xã Quảng Hòa, huyện Quảng Trạch, tỉnh Quảng Bình để ủ và lên men tỏi đen sau 35-55 ngày.Nồi ủ sử dụng có phần nắp trong là viền cao su giữ kín nhiệt, lỗ thông hơi gắn với một nhiệt kế 100oC để theo dõi nhiệt độ trong nồi (Nguyễn Đức Vượng và ctv., 2015). Ngoài ra, Nguyễn Đức Vượng và ctv. (2017) cũng đã sử dụng quy trình lên men tự nhiên bằng nhiệt để chuyển tỏi trắng thành tỏi đen. Tiến hành lên men trong điều kiện 70oC và thời gian lên men từ 35-45 ngày. Hàm lượng S-allyl cysteine (SAC) tăng lên cũng là một thay đổi quan trọng trong tiến trình chế biến tỏi đen. Tỏi tươi chứa 20-30 g/g SAC (Kodera et al., 2002) và lượng SAC trong tỏi đen cao gấp 5-6 lần so với tỏi tươi (Bae et al., 2012; Wang et al., 2010). SAC được hình thành bởi quá trình thủy phân của -glutamyl-S-allyl cysteine (GSAC) bởi - glutamyl transpeptidase (-GTP, EC 2.3.2.2) (Kodera et al., 2002). SAC là một trong những hợp chất amino acid chứa lưu huỳnh chính và là chất có nhiều lợi ích nhất của tỏi, như chống oxy hóa, chống ung thư, chống các bệnh lý về gan và thần kinh (Kodera et al., 2002). Tỏi muối chua từ năm công ty ở Tây Ban Nha được phân tích về các đặc tính hóa lý, thành phần gần đúng, acid ascorbic, thiamin, riboflavin, -tocopherol, và hàm lượng acid amin. Acid chuẩn độ dao động trong khoảng 0,70 đến 2,66%, trong khi hàm lượng muối trong khoảng 2,39 đến 7,40%. Một sự khác biệt đáng kể trong hàm lượng vitamin, cũng như các đặc điểm hóa lý. Mức độ vitamin phân tích là thiamine (0-0,055 mg/kg), riboflavin (0,013-0,032 mg/kg), 7
-tocopherol (0,36-2,53 mg/kg), và acid ascorbic (0-47,9 mg/100 g) (Casado et al., 2004). Tỏi được bóc vỏ, xử lý (chần và không chần) và tiến hành lên men trong nước muối với sự tham gia của giống vi khuẩn L. plantarum. Quá trình lên men diễn ra trong 7 ngày ở nơi duy trì nhiệt độ 30oC. Theo dõi các tính chất hóa học và vật lý của tỏi sau lên men và sau quá trình bảo quản 3 tháng. Sự phát triển của nấm men hoặc nấm mốc không được phát hiện trong tỏi chần hoặc không chần trong 7 ngày của quá trình lên men. Đối với tỏi chần, pH của nước muối giảm dần, đạt giá trị 3,77 ở 7 ngày. Đối với tỏi không chần có một sự khởi đầu giảm pH của môi trường (4,00), nhưng do sự phát triển của L. Plantarum đã không diễn ra, pH tăng lên (5,65), có lẽ do sự khuếch tán sự hình thành acid vào tỏi trong nước muối (de Castro et al., 1998). Tỏi tươi (đã bóc vỏ) ngâm ngập trong dung dịch acid acetic 2% và NaCl được bảo quản ở 20oC trong 60 ngày. pH của tỏi muối chua giảm còn khoảng 4 ở ngày thứ 20 của quá trình tồn trữ. Số lượng allicin (thành phần vị cay nồng chính yếu) của tỏi muối chua bởi phân tích HPLC giảm 5,9% vào ngày thứ 40 của quá trình tồn trữ so với allicin trong tỏi tươi (Kim et al., 1993). Các nghiên cứu trong nước về tỏi cũng còn hạn chế. Đặc biệt các nghiên cứu chuyên sâu về tác động trong quá trình chế biến, tồn trữ và khả năng hấp thu của các hoạt chất có giá trị sinh học trong các sản phẩm từ tỏi vẫn còn rất hạn chế, chưa thấy công bố trên các tài liệu khoa học trong nước và trên thế giới. 2.4 Các nghiên cứu tạo hạt nano mang chất có hoạt tính sinh học từ tỏi hoặc sản phẩm tỏi Theo Lu et al. (2014) allicin, thành phần hoạt động chính bắt nguồn từ một tác nhân mùi truyền thống trong tỏi, tạo nên hàng loạt các tác dụng sinh học. Nhưng đáng tiếc, 8
tiềm năng lớn của tỏi trong quá trình chế biến bị hạn chế bởi sự nhạy cảm của tỏi đối với các điều kiện nhiệt và kiềm kèm theo mùi hăng của tỏi. Trong nghiên cứu này, nanoliposome allicin đã được điều chế bằng cách sử dụng phương pháp bốc hơi ngược pha nhằm khắc phục các hạn chế đã nêu. Vũ Bình Dương và Hồ Anh Sơn (2015) đã đánh giá được tác dụng ức chế dòng tế bào ung thư phổi không tế bào nhỏ người A549 của cao khô tỏi đen bằng thử nghiệm trypan blue và MTT. Kết quả cho thấy tại các thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau khi ủ với tỏi đen nồng độ 2,5-10 mg/mL, tỏi đen ức chế mạnh sự tăng sinh tế bào A549 với nồng độ gây IC50 ở 24 giờ là 10,57 mg/mL. Đến nay, vẫn chưa có nghiên cứu nào ở trong và ngoài nước chế tạo thành công hạt nano nhỏ hơn 100 nm mang hoạt chất từ tỏi đen đi kèm với các thử nghiệm in-vitro và in- vivo. Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Phương tiện nghiên cứu 3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Các thí nghiệm được tiến hành thông qua việc lấy mẫu, thực nghiệm, phân tích và xử lý dữ liệu tại: Ruộng tỏi vào thời điểm mùa vụ năm 2014, 2015, 2016 và 2017 tại phường Văn Hải, thành phố Phan Rang - Tháp Chàm, tỉnh Ninh Thuận. Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp; Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học; Phòng Thí nghiệm Chuyên sâu - Trường Đại học Cần Thơ. Phòng Vật liệu Nano Y sinh, Viện Khoa học Vật liệu; Phòng Hóa sinh Ứng dụng, Phòng Hoạt chất Sinh học, Phòng Nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên, Viện Hóa học; Phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học; Phòng Thiết bị dùng chung, Viện Kỹ thuật Nhiệt đới; 9
Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Thời gian thực hiện từ tháng 06/2014 đến tháng 03/2018. 3.1.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 3.1.2.1 Thiết bị và dụng cụ Một số thiết bị và dụng cụ cơ bản được sử dụng trong các thí nghiệm như sau: - Cân phân tích Ohaus, model - Tủ đông Sanyo, model SF- PX224/E (Mỹ) CR27K (Nhật Bản) - Máy đo cấu trúc Rheotex, - Tủ sấy Amerex, model model SD700 (Nhật Bản) CV250 (Mỹ) - Máy đo quang phổ, model - Hệ thống HPLC-UVD 722N (Trung Quốc) (Shimadzu, Shimadzu Corporation, Nhật Bản) - Tủ mát Alaska, model SL-8C - Cột sắc ký LiChroCART (Trung Quốc) (Merck, Đức) - Tủ làm tỏi đen (80cm x - Kính hiển vi điện tử quét 71cm x 110cm, 50-100oC, RH Hitachi, model S-4800 tối đa ở các nhiệt độ tương (Singapore) ứng) (Việt Nam) - Máy tán xạ ánh sáng động - Cân sấy ẩm hồng ngoại, (DLS) Zetasizer Nano, model model MX50 (Godex, Mỹ) 7.03 (Anh) - Máy quang phổ hồng ngoại - Máy Elisa reader (Biotek, chuyển đổi Fourier Perkin ELx800, USA) Elmer (Waltham, Massachusetts, USA) - Máy cô quay chân không - Máy Tecan Genios Ika, model RV10 digital V Fluorescence Luminescence (Đức) Microplate Reader, model A-5082 (Thụy Sĩ) - Máy đo đường huyết Omron, - Máy khuấy từ gia nhiệt 10
model HGM-111 (Nhật Bản) IKA, model C-MAGHS7 (Đức) - Bể siêu âm, model Elma - Máy Elisa reader, model P300H (Đức) ELx800 (Biotek, Mỹ) 3.1.2.2 Hóa chất Một số hóa chất cơ bản được sử dụng trong các thí nghiệm như sau: - Thuốc thử Folin-Ciocalteu - Chất chuẩn S-allyl-L- (độ tinh khiết  99%) (Merck, cysteine ( 98%, Sigma, Đức) Mỹ) - 1,1-diphenyl-2-picryl- - Acetonitrile (độ tinh khiết hydrazil (độ tinh khiết  99%) 99,8%) (Merck, Đức) (Merck, Đức) - Chất chuẩn quercetin (độ - Enzyme -glucosidase tinh khiết  98% Sigma, Mỹ) (CAS No 9001-42-7, Sigma, Mỹ) - Dimethyl sulfoxide (CAS - Alloxan monohydrate No 67-68-5, Sigma, Mỹ) (Sigma, Mỹ) - Acetylcholinesterase (CAS - -Nitrophenyl--D- No 9002-53-8, Sigma, Mỹ) glucopyranoside (CAS No 3767-28-0, Sigma, Mỹ) - 4-Notrophenol (CAS No - Thuốc thử Ellman's 100-02-7, Sigma, Mỹ) (DTNB) (Sigma, Mỹ) - Môi trường MRS broth - Natri alginate (Sigma, Mỹ) (Hemidia, Ấn Độ) Các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn để sử dụng trong phân tích. 3.1.3 Nguyên liệu Nguyên liệu tỏi cổ mềm, giống địa phương được thu hoạch vào buổi sáng sớm, thời tiết nắng ráo. Hình dạng bên ngoài cho thấy cổ cây tỏi đã ngã sang một bên, đầu lá vàng úa và trong khoảng thời gian 130 đến 140 ngày (sau khi gieo) tại phường Văn Hải, thành phố Phan Rang - Tháp Chàm, tỉnh Ninh Thuận. Chọn lựa củ tỏi không bị sâu, thối hoặc nhiễm 11
nấm. Củ tỏi được cho vào thùng carton và vận chuyển bằng ô tô đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ. 3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát sự thay đổi đặc tính lý học và hợp chất có hoạt tính sinh học của củ tỏi (Allium sativum L.) trong quá trình thuần thục và tồn trữ 3.2.1.1 Mục tiêu Xác định ảnh hưởng của thời điểm thuần thục và điều kiện bảo quản đến đặc tính lý học và các hợp chất có hoạt tính sinh học trong quá trình tồn trữ. Chọn được thời điểm thu hoạch tỏi có chất lượng tốt nhất và điều kiện tồn trữ thích hợp để áp dụng trong chế biến các sản phẩm tỏi. 3.2.1.2 Bố trí thí nghiệm a Chất lượng củ tỏi ở các thời điểm thu hoạch Các củ tỏi được thu hoạch tại nhiều ruộng tỏi ở địa bàn phường Văn Hải, thành phố Phan Rang – Tháp Chàm, tỉnh Ninh Thuận. Ở mỗi độ tuổi thu hoạch 5 kg củ tỏi. Các củ tỏi được tồn trữ trong túi vải dạng lưới (kích thước lỗ khoảng 0,9 mm). Củ tỏi được phân tích tại phòng thí nghiệm có nhiệt độ phòng 28 – 30oC và RH 68 – 71%. Thí nghiệm được bố trí một nhân tố. Nhân tố A: độ thuần thục (ngày sau khi gieo): 120, 125, 130, 135 và 140 Số nghiệm thức: 5. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. b Ảnh hưởng của nhiệt độ tồn trữ đến chất lượng củ tỏi Củ tỏi sau khi thu hoạch được xử lý sơ bộ và tách một lớp vỏ ngoài của củ tỏi nhằm loại bỏ đất cát. Sau đó, các củ tỏi được chứa trong túi vải lưới và tồn trữ ở các nhiệt độ khác nhau. Thí nghiệm được bố trí một nhân tố. Nhân tố B: nhiệt độ tồn trữ (oC): 0, 5, 20 và nhiệt độ phòng (28-30) Số nghiệm thức: 4. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. 12
c Ảnh hưởng của loại bao bì sử dụng đến sự hao hụt khối lượng Chọn củ tỏi ở độ tuổi và nhiệt độ bảo quản thích hợp từ các thí nghiệm trước. Khối lượng tỏi trong bao bì là 500-550 g. Các loại bao bì được sử dụng trong thí nghiệm: PE (24 x 34 cm và dày 38 m), thùng carton (30 x 22,5 x 12,5 cm) với tỷ lệ đục lỗ là 0,5% (đường kính lỗ 5 mm, 20 lỗ trên hai mặt của bao bì với khoảng cách đều nhau) và vải lưới (24 x 34 cm và dày 0,21 mm, kích thước lỗ lưới khoảng 0,9 mm). Các mẫu được tồn trữ ở nhiệt độ thích hợp đã chọn. Thí nghiệm được bố trí một nhân tố. Nhân tố C: loại bao bì: PE, thùng carton và vải lưới Số nghiệm thức: 3. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hao hụt khối lượng (%), hàm lượng polyphenol tổng số (TPC) (mg acid gallic tương đương (GAE)/g d.w), hàm lượng flavonoid tổng số (TFC) (mg quercetin tương đương (QE/g d.w), hàm lượng thiosulfinate tổng số (mol/g d.w), hoạt động chống oxy hóa (%), chỉ số nảy mầm bên trong, màu sắc, độ ẩm (%), cường độ hô hấp. 3.2.2 Nội dung 2: Nâng cao các chất có hoạt tính sinh học trong củ tỏi thông qua quy trình chế biến sản phẩm tỏi đen và tỏi lên men lactic 3.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý nhiệt đến quy trình sản xuất sản phẩm tỏi đen. a Mục tiêu: xác định các thông số tối ưu cho quá trình sản xuất tỏi đen nhằm tạo ra sản phẩm tỏi đen có chất lượng cao (tăng cường hàm lượng các hoạt chất sinh học và khả năng chống oxy hóa của tỏi đen). b Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp xử lý nhiệt nguyên liệu đến chất lượng củ tỏi tươi 13
Chọn các củ tỏi còn nguyên vỏ lụa có đường kính trong khoảng 3,60,2 cm để tiến hành thí nghiệm - Phương pháp 1: Chần bằng hơi nước (100oC) trong khoảng thời gian 4, 6, 8 và 10 phút. Số nghiệm thức: 4. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. - Phương pháp 2: Lạnh đông ở nhiệt độ -18oC trong khoảng thời gian 12, 24, 36 và 48 giờ. Số nghiệm thức: 4. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Mẫu đối chứng: không xử lý nhiệt. Các chỉ tiêu cần theo dõi: TPC (mg GAE/g d.w), TFC (mg QE/g d.w), hàm lượng thiosulfinate (mol/g d.w), khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH (%) và đánh giá cảm quan theo phương pháp Phân tích mô tả định lượng (QDA). Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian lăo hóa đến chất lượng sản phẩm tỏi đen Củ tỏi tươi sau khi được xử lý nhiệt sẽ tiếp tục được lão hóa để thành tỏi đen. Chất lượng của tỏi đen được theo dõi sau mỗi 5 hoặc 7 ngày lão hóa cho đến khi kết thúc quá trình chế biến 45 ngày. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với hai nhân tố. Nhân tố D: nhiệt độ lão hóa (oC): 60, 70, 80 và 90 Số nghiệm thức: 4. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các chỉ tiêu cần theo dõi: độ ẩm (%), pH, oBrix, hàm lượng đường khử (% d.w), hàm lượng polyphenol tổng số (TPC), hàm lượng flavonoid tổng số (TFC), hàm lượng thiosulfinate tổng số (mol/g d.w), hoạt động chống oxy hóa (%), hàm lượng SAC (mg/kg d.w) bằng phương pháp HPLC. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian sấy đến chất lượng sản phẩm tỏi đen Củ tỏi sau khi lão hóa được tiến hành sấy khô lớp vỏ bên ngoài. Nghiên cứu được bố trí theo mô hình Box- Behnken với 2 nhân tố: Nhân tố F: nhiệt độ sấy (oC): 50, 60 và 70 14
Nhân tố G: thời gian (giờ): 8, 12 và 16 Số nghiệm thức: 3 x 3 = 9. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các chỉ tiêu cần theo dõi: hàm lượng polyphenol tổng số (TPC), hàm lượng flavonoid tổng số (TFC) và hoạt động chống oxy hóa (%). Đánh giá cảm quan: theo phương pháp hồi quy logistic. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của quá trình tồn trữ đến khả năng duy trì các hoạt chất sinh học trong sản phẩm tỏi đen Tỏi sau khi kết thúc quá trình sấy, được đem bảo quản ở nhiệt độ môi trường (282oC) và nhiệt độ mát (5oC) với hai loại bao bì bảo quản là PA và bao bì phức hợp (tráng nhôm). Mỗi bao bì chứa 300 gram tỏi đen. Tiến hành theo dõi hàm lượng các hợp chất sinh học, khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH của tỏi đen theo thời gian bảo quản (2 tuần/lần). Mục đích của thí nghiệm là xác định nhiệt độ và loại bao bì bảo quản thích hợp nhằm duy trì giá trị của sản phẩm tỏi đen với chất lượng tốt nhất. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Nhiệt độ tồn trữ (oC): nhiệt độ môi trường (282) và nhiệt độ mát (5) Loại bao bì chứa: polyamide (PA) và bao bì phức hợp (nhôm) Tổng số nghiệm thức: 2 x 2 = 4. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g d.w), hàm lượng flavonoid tổng số (mg QE/g d.w), khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH (%). 3.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố (pH, nồng độ muối, mật số vi khuẩn acid lactic) đến quy trình sản xuất sản phẩm tỏi lên men lactic. 15
a Mục tiêu: xác định các thông số tối ưu cho quá trình sản xuất lên men nhằm tạo ra sản phẩm tỏi muối chua có chất lượng cao (tăng cường hàm lượng các hoạt chất sinh học và khả năng chống oxy hóa trong sản phẩm). b Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp chần nguyên liệu tỏi đến chất lượng sản phẩm Chọn các tép tỏi đã bóc vỏ có chiều dài giữa 20–30 mm, chiều rộng giữa 5–10 mm, có chiều dày giữa 5–10 mm. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên. Các củ tỏi được bóc vỏ và đặt tép tỏi vào trong túi chần với hai lít nước đã được đun nóng trước tới nhiệt độ, thời gian bố trí. Sau khi chần, mẫu tỏi được nhanh chóng làm lạnh trong bồn nước đá 3 phút. Tỏi được để ráo nước ở nơi thoáng mát và đặt vào các túi PA bảo quản ở nhiệt độ 5oC cho đến khi phân tích các hoạt chất sinh học. Nhân tố H: nhiệt độ chần (oC): 70, 80 và 90 Nhân tố I: thời gian chần (giây): 60, 90, 120, 150 và 180 - Đối chứng HoIo: không chần Số nghiệm thức: 3 x 5 = 15. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Các chỉ tiêu cần theo dõi: Hàm lượng thiosulfinate (µmol/g d.w), flavonoid tổng số (mg QE/g d.w), polyphenol tổng số (mg GAE/g d.w), khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH (%), độ cứng (g lực), màu sắc. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch nước muối và mật số vi khuẩn thuần chủng (Lactobacillus plantarum) đến khả năng lên men lactic tỏi Vi khuẩn Lactobacillus plantarum thuần chủng được sử dụng có nguồn gốc từ bộ sưu tập giống vi sinh vật của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Chủng Lactobacillus plantarum sử dụng bao gồm dòng XK 1.4 được phân lập từ dưa leo muối chua (theo 16