Tóm tắt Luận án tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

35
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích cơ bản của luận án này là bào chế được bột cao khô định chuẩn của cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối. Bào chế được viên nang cứng Kaviran từ bột cao khô định chuẩn cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối;...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN TRỌNG ĐIỆP NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA VIÊN NANG CỨNG KAVIRAN Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC Mã số: 62 72 04 02 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - NĂM 2017
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI HỌC VIỆN QUÂN Y Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Nguyễn Thanh Hải 2. PGS. TS. Nguyễn Tùng Linh Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án Tiến sĩ cấp Trường họp tại Học viện Quân y Vào hồi: giờ ngày tháng năm 20… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia; - Thư viện Học viện Quân y
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Suy giảm miễn dịch mắc phải là hậu quả của nhiều quá trình bệnh lý như: Suy dinh dưỡng, nhiễm khuẩn, ung thư, sau khi dùng các thuốc ức chế hoặc độc với các tế bào của hệ thống miễn dịch, do tia xạ hoặc hoá chất điều trị ung thư, trong nhiễm HIV/AIDS. Các trường hợp bệnh lý trên, ngoài điều trị tác nhân gây bệnh thì điều trị nhằm nâng đỡ cơ thể, tăng cường miễn dịch là cần thiết. Tuy nhiên, do chi phí điều trị cao, nhiều bệnh nhân không có cơ hội tiếp cận, thì việc tìm kiếm các thuốc điều trị bổ sung hoặc thay thế, với giá thành dễ chấp nhận là vấn đề cấp bách và có ý nghĩa thực tiễn cao. Quả nhàu và cúc hoa vàng (CHV) có tác dụng: tăng cường miễn dịch, chống oxy hoá, ức chế khối u, kháng khuẩn, chống nấm, chống viêm...Sâm Ngọc linh sinh khối (NLSK) có tác dụng: tăng lực, tăng quá trình nhận thức, chống oxy hóa, bảo vệ gan... Tuy nhiên, hiện nay chưa có chế phẩm thuốc nào bào chế phối hợp từ ba dược liệu này. Do vậy, để góp phần nghiên cứu phát triển một chế phẩm thuốc mới từ quả nhàu, CHV và sâm NLSK (Viên Kaviran) nhằm tăng cường miễn dịch và chống oxy hóa theo hướng hiện đại, an toàn, hiệu quả và ứng dụng được vào sản xuất, đề tài: “Nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran” được tiến hành nhằm các mục tiêu sau: 1. Bào chế được bột cao khô định chuẩn của cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối. 2. Bào chế được viên nang cứng Kaviran từ bột cao khô định chuẩn cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối. 3. Đánh giá được độc tính, tác dụng tăng cường miễn dịch, chống oxy hoá và bảo vệ gan của viên nang cứng Kaviran trên thực nghiệm.
2 * Đóng góp mới của luận án - Xây dựng được qui trình bào chế bột cao khô định chuẩn của Cúc hoa vàng, quả Nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối, bao gồm: Nâng cấp tiêu chuẩn cúc hoa vàng và quả nhàu dựa trên tiêu chuẩn của DĐVN IV. Xây dựng được qui trình chiết xuất các hoạt chất chính bằng phương pháp chiết siêu âm, qui trình bào chế bột cao khô bán thành phẩm bằng phương pháp phun sấy. Xây dựng và thẩm định được tiêu chuẩn cơ sở của bột cao khô bán thành phẩm. - Xây dựng được công thức bào chế viên nang cứng Kaviran từ bột cao khô định chuẩn quả nhàu, CHV và sâm NLSK trên cơ sở phối hợp giữa thành phần có tác dụng tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa… trong cùng công thức nhằm tăng cường tác dụng cho chế phẩm. Xây dựng được tiêu chuẩn chất lượng và đánh giá độ ổn định của chế phẩm. - Đánh giá được tính an toàn và một số tác dụng sinh học của chế phẩm: Chưa xác định được giá trị LD50 trên chuột và không thấy biểu hiện độc tính bán trường diễn trên thỏ; chế phẩm có tác dụng tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa và bảo vệ gan khi thử trên động vật thực nghiệm. Luận án có tính cấp thiết, ý nghĩa khoa học và tính thực tiễn cao. Kết quả của luận án có đóng góp mới cho nguyên ngành công nghệ dược phẩm và bào chế thuốc, là tài liệu tham khảo hữu ích trong lĩnh vực nghiên cứu bào chế các thuốc nguồn gốc dược liệu theo hướng hiện đại. * Nội dung và cấu trúc của luận án Luận án gồm 149 trang: Đặt vấn đề 2 trang, tổng quan 33 trang, đối tượng và phương pháp nghiên cứu 20 trang, kết quả nghiên cứu 56 trang, bàn luận 34 trang, kết luận 2 trang, kiến nghị 1 trang, danh mục bài báo 1 trang, có 158 tài liệu tham khảo (25 tài liệu tiếng Việt, 133 tài liệu tiếng Anh).
3 Chương 1. TỔNG QUAN Tổng quan về các dược liệu dùng trong nghiên cứu, gồm: quả nhàu, CHV và sâm NLSK. Mỗi dược liệu đề cập đến: Đặc điểm thực vật và phân bố, thành phần hóa học, tác dụng sinh học. Các thông tin về kỹ thuật chiết xuất dược liệu: Khái niệm và một số thuật ngữ, một số phương pháp chiết xuất hiện đại, mỗi phương pháp chiết xuất đề cập đến nguyên lý và cơ chế, thiết bị, một số ứng dụng và nghiên cứu điển hình. Các thông tin về kỹ thuật phun sấy: Khái niệm, thiết bị và các giai đoạn phun sấy, các thông số quan trọng của qui trình, ưu nhược điểm; ý nghĩa của phun sấy dịch chiết dược liệu, một số khó khăn gặp phải, một số nghiên cứu phun sấy dịch chiết dược liệu. Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu - Quả Nhàu, CHV đạt tiêu chuẩn DĐVN IV. Sâm NLSK đạt TCCS; Chất chuẩn: Apigenin, luteolin, ginsenosid (Rb1, Rg1) của hãng Sigma Aldrich. Scopoletin của hãng Shanghai Tauto Biotech; Các tá dược và hóa chất phân tích đều đạt tiêu chuẩn thí nghiệm. - Các thiết bị sử dụng đều đạt yêu cầu cho nghiên cứu chiết xuất, bào chế, kiểm nghiệm và đánh giá tác dụng dược lý. - Thỏ chủng Orytolgus cuniculus, khỏe mạnh, cân nặng 2,0 ± 0,2kg. Chuột nhắt trắng chủng Swiss, khỏe mạnh, cân nặng 20,0 ± 2,0g. Động vật được nuôi dưỡng ở điều kiện phóng thí nghiệm. 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Nghiên cứu bào chế bột cao khô tiêu chuẩn cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối 2.2.1.1. Phương pháp định lượng hoạt chất trong nguyên liệu, các phân đoạn dịch chiết và bột cao khô Định lượng flavonoid toàn phần bằng UV-Vis; Định lượng apigenin, luteolin trong CHV và scopoletin trong quả nhàu bằng
4 HPLC: Xây dựng và thẩm định phương pháp; Định lượng ginsenosid (Rg1, Rb1) trong sâm NLSK bằng HPLC: Theo phương pháp của Vũ Bình Dương và cộng sự (2008). 2.2.1.2. Nghiên cứu điều chế dịch chiết cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối - Điều chế cao CHV, cao quả nhàu: Khảo sát các thông số qui trình chiết siêu âm: Loại dung môi, tỷ lệ dung môi/ dược liệu, số lần chiết, thời gian và nhiệt độ chiết. Chỉ tiêu đánh giá: Hàm lượng flavonoid chiết được trong CHV và quả nhàu; hàm lượng ginsenosid (Rg1, Rb1) chiết được trong sâm NLSK; Nhóm hoạt chất bị kết tủa trong EtOH (Noni-ppt) chiết từ quả nhàu. Dịch chiết được cô đặc và loại tạp để thu được cao CHV (2:1) và cao quả nhàu (1:1). - Điều chế cao sâm NLSK: Chiết siêu âm với EtOH 70%, nhiệt độ chiết 600C, chiết hai lần với tỷ lệ DM/DL/lần là 10/1, thời gian chiết là 60 phút/lần. Sau khi chiết xuất, cô thu hồi dung môi đến tỷ lệ cao 1:1, loại bớt tạp rồi cô thu hồi dung môi để thu được cao 6:1. 2.2.1.3. Nghiên cứu bào chế bột cao khô cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối bằng phương pháp phun sấy Thông số khảo sát: Loại tá dược (Maltodextrin và aerosil); nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch; tỷ lệ tá dược/ chất rắn (TD/CR) trong cao; tỷ lệ chất rắn trong dịch phun (CR/DP); Thông số đánh giá: Theo chỉ tiêu chất lượng của bột cao khô (Mục 2.2.1.4). 2.2.1.4. Phương pháp đánh giá các chỉ tiêu chất lượng bột cao khô phun sấy Hình thức cảm quan: Quan sát bằng cảm quan và chụp hiển vi điện tử quyét; Khối lượng riêng và chỉ số nén CI: Theo USP 30; Mất khối lượng do làm khô: PL 9.6 - DĐVN IV; Tính hút ẩm: Thử ở 250C, độ ẩm tương đối 75,29%, thời gian: 7 ngày; Hàm lượng hoạt chất: Định lượng flavonoid toàn phần bằng UV-Vis, scopolein và
5 ginsenosid (Rg1, Rb1) bằng HPLC; Hiệu suất thu hồi hoạt chất và phun sấy: Là tỷ lệ % thực tế thu được so với lý thuyết. 2.2.1.5. Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa bột cao khô bán thành phẩm Tính chất: Thử bằng cảm quan; Mất khối lượng do làm khô, độ mịn, độ đồng nhất, tro toàn phần: Theo DĐVN IV; Định tính: bằng sắc ký lớp mỏng và HPLC; Định lượng bằng HPLC: apigenin, luteolin trong bột cao khô CHV, scopoletin trong bột cao khô quả nhàu, ginsenosid (Rg1, Rb1) trong bột cao khô sâm NLSK. 2.2.2. Nghiên cứu bào chế, tiêu chuẩn hóa và đánh giá độ ổn định của viên nang cứng Kaviran - Xây dựng công thức bào chế: Xác định tỷ lệ phối hợp các bột cao khô dựa trên đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro và tăng cường miễn dịch in vivo; Lựa chọn các tá dược: Aerosil, magnesi stearat, natri laurylsulphat, manitol. Khảo sát tỷ lệ Avicel và natri croscarmellose. Chỉ tiêu đánh giá: Khối lượng riêng, chỉ số nén CI của bột đóng nang và độ rã của viên nang. - Kiểm nghiệm về: Tính chất: Kiểm tra bằng cảm quan; Độ rã, độ đồng đều khối lượng, hàm ẩm: Theo DĐVN IV; Định tính: Bằng sắc ký lớp mỏng và HPLC; Định lượng: Apigenin, luteolin và ginsenosid (Rg1, Rg1) bằng HPLC. Từ kết quả kiểm nghiệm xây dựng tiêu chuẩn cơ sở (TCCS) cho chế phẩm. - Đánh giá độ ổn định: Theo hướng dẫn của ASIAN và WHO. 2.2.3. Nghiên cứu tính độc tính và tác dụng sinh học của viên nang cứng Kaviran trên động vật thực nghiệm 2.2.3.1. Đánh giá tính độc tính của viên nang cứng Kaviran - Xác định độc tính cấp trên chuột nhắt: Tiến hành theo hướng dẫn của Bộ Y tế, OECD và WHO. - Xác định độc tính bán trường diễn: Tiến hành theo quy định của WHO và Bộ Y tế: Thỏ gồm 3 lô, 12con/ lô: Lô chứng: Uống NaCl 0,9%, liều 2,5ml/kg; (2) Lô Kaviran liều 240 và 1200mg/kg;
6 Các chỉ tiêu đánh giá: Sinh lý - dược lý, huyết học, sinh hóa, mô bệnh học. Thời gian thử 6 tuần. 2.2.3.2. Đánh giá tác dụng sinh học của viên Kaviran a. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan bằng mô hình gây độc do paracetamol liều cao: Chuột nhắt trắng gồm 6 lô, mỗi lô ít nhất 10 con: Lô 1 (Đối chứng): Uống nước cất 0,2 ml/10g; Lô 2 (Mô hình): Uống nước cất 0,2ml/10g + paracetamol; Lô 3 (Chứng dương): Uống silymarin 140mg/kg + paracetamol; Lô 4: Uống Kaviran liều 0,72g/kg (D1) + paracetamol; Lô 5: Uống Kaviran liều 2,16g/kg (D2) + paracetamol; Lô 6: Uống Kaviran liều 4,32 g/kg (D3) + paracetamol. Đến ngày thứ 8, sau khi uống thuốc thử 3 giờ, cho chuột từ lô 2 đến lô 6 uống paracetamol liều 400mg/kg. Sau 48 giờ, lấy máu để đo hoạt độ enzym AST, ALT, xác định khối lượng gan và hàm lượng MDA. Quan sát đại thể và vi thể gan. b. Đánh giá tác dụng của Kaviran trên chuột thực nghiệm bị suy giảm miễn dịch do chiếu tia xạ: Chuột nhắt trắng gồm 5 lô, mỗi lô ít nhất 10 con: Lô 1: Không bị tác động gì; Lô 2: Chiếu xạ, uống NaCl 0,9%; Lô 3: Chiếu xạ, uống levamisol liều 50mg/kg; Lô 4: Chiếu xạ, uống Kaviran liều 0,72g/kg; Lô 5: Chiếu xạ, uống Kaviran liều 2,16g/kg. Chuột được chiếu xạ toàn thân liều 1Gy/ngày trong 6 ngày. Cho chuột được uống thuốc trong 6 ngày chiếu xạ và 7 ngày sau chiếu xạ. Ngày thứ 14, tiến hành các xét nghiệm. Các chỉ tiêu đánh giá: Khối lượng tuyến ức và lách tương đối; Số lượng bạch cầu và công thức bạch cầu; Vi thể lách, tuyến ức, hạch và đầu xương đùi. 2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu Sự khác biệt giá trị trung bình giữa các mẫu sử dụng Duncan’s Multiple Range Test bằng phần mềm SAS (α = 0,05), biểu diễn theo
7 ± SD. Giá trị trong cùng cột có cùng một trong các ký tự (biểu thị theo a, b, c, d...) là khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả bào chế bột cao khô tiêu chuẩn 3.1.1. Kết quả định tính, định lượng dược liệu - Định tính: Trên sắc ký đồ mẫu thử có các píc có thời gian lưu trùng với thời gian lưu dung dịch chuẩn của luteolin và apigenin (24,6 và 34,5 phút) trong CHV, scopoletin (6,9 phút) trong quả nhàu, ginsenosid (Rg1 12,8 phút và Rb1 34,5 phút) trong sâm NLSK. - Định lượng: CHV chứa 1,3986mg/g luteolin và 0,2274mg/g apigenin; Quả nhàu chứa 110,85µg/g scopoletin; sâm NLSK chứa 7,57mg/g ginsenosid (Rg1, Rb1). 3.1.2. Kết quả bào chế và tiêu chuẩn hóa bột cao khô cúc hoa vàng 3.1.2.1. Kết quả điều chế dịch chiết cúc hoa vàng - Ảnh hưởng của dung môi: Chiết siêu âm CHV hai lần ở 600C, tỷ lệ DM/DL là 10/1/lần, 60 phút/lần, nhưng với dung môi là: Nước và EtOH 40, 50, 60, 70 và 80%. Kết quả: EtOH 50% có hiệu suất chiết cao nhất (96,84%), sau đó giảm nhẹ khi chiết với EtOH 60 - 80%, nhưng cao hơn rõ rệt khi chiết với EtOH 40% và nước. Do vậy, lựa chọn EtOH 50% để khảo sát tiếp. - Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/DL và số lần chiết: Chiết siêu âm CHV với EtOH 50% ở 600C, 60 phút/lần. Chiết 1 lần với tỷ lệ DM/DL từ 10/1 - 50/1. Chiết 2 lần, tỷ lệ DM/DL lần 1 là 10/1, lần 2 lần lượt là 10/1, 7,5/1 và 5/1. Kết quả: Chiết 2 lần, tỷ lệ DM/DL 10/1/lần có hiệu suất chiết flavonoid (96,84%) tương đương chiết 1 lần với tỷ lệ DM/DL 30/1 - 50/1 và cao hơn 20/1. Do vậy, lựa chọn chiết 2 lần, tỷ lệ DM/DL 10/1/lần để khảo sát tiếp. - Ảnh hưởng của nhiệt độ: Chiết siêu âm CHV hai lần với EtOH 50%, tỷ lệ DM/DL 10/1/lần, 60 phút/lần, nhiệt độ 40-800C. Kết quả: Lượng flavonoid chiết được ở 60-800C là tương đương, nhưng cao
8 hơn rõ rệt ở 40-500C. Do vậy, nhiệt độ chiết thích hợp là 600C, vì khi tăng nhiệt độ không làm tăng hiệu suất, nhưng tốn năng lượng. - Ảnh hưởng của thời gian chiết: Chiết CHV hai lần với EtOH 50%, ở 600C, tỷ lệ DM/DL 10/1/lần, nhưng thời gian chiết từ 30 - 90 phút/ lần. Kết quả: Thời gian thích hợp để chiết flavonoid từ CHV là 60 phút/lần x 2 lần, khi tăng hoặc giảm thời gian chiết đều làm giảm lượng flavonoid chiết được. * Tóm tắt thông số và kết quả điều chế dịch chiết CHV Bảng 3.9. Thông số qui trình điều chế dịch chiết CHV STT Tên phương pháp/ thông số Thiết bị/ thông số 1 Chiết siêu âm Thiết bị SM30-CEP, công suất 400W 2 Cúc hoa vàng Kích thước nhỏ hơn 1mm 3 Dung môi chiết Ethanol 50% 4 Nhiệt độ chiết 600C 5 Số lần chiết 2 lần 6 Tỷ lệ DM/ DL 10/1/ lần x 2 lần 7 Thời gian chiết 60phút/ lần x 2 lần 3.1.2.3. Kết quả chiết xuất, cô cao, loại tạp dịch chiết cúc hoa vàng Bảng 3.11. Kết quả chiết xuất, cô đặc và loại tạp cao CHV 2:1 Bột CHV khô Cao CHV 2:1 Cao CHV 2:1 Nội dung thử Dịch chiết CHV kiệt trước loại tạp sau loại tạp Khối lượng, thể tích 9.740,3 g 200,0 lít 4.870,06g 4.870,14g Flavonoid, n=3 12,95±0,40mg/g 0,588±0,015mg/ml 23,28±1,23mg/g 20,79±0,85mg/g Hàm lượng chất rắn (%), n=3 70,24±0,95 38,90±0,63 Tỷ lệ chất rắn được loại ra (%) 44,62 Flavonoid mất khi loại tạp (%) 10,70 Hiệu suất chiết, cô cao (%) 89,88 - Hiệu suất chiết, cô cao và loại tạp (%) 80,27 Flavonoid (mg/g) tính theo cao khô tuyệt đối 33,14 53,45 Tỷ lệ làm giàu flavonoid sau loại tạp (lần) 1,61 Chiết 4 mẻ CHV, mỗi mẻ khoảng 3kg. Lấy 200 lít dịch chiết, cô thu hồi dung môi được 4870,06g cao CHV 2:1, hàm lượng flavonoid là 23,28 ± 1,23mg/g. Sau khi loại tạp thu được 4.870,14g cao CHV 2:1, hàm lượng flavonoid là 20,79 ± 0,85mg/g. 3.1.2.3. Bào chế bột cao khô cúc hoa vàng bằng phương pháp phun sấy - Ảnh hưởng của loại tá dược: Phun sấy cao CHV ở 160°C, tốc độ cấp dịch 45ml/phút, tỷ lệ tá dược/chất rắn (TD/CR) trong cao 1/1,
9 tỷ lệ chất rắn/dịch phun (CR/DP) 10%, nhưng với các tá dược là: maltodextrin (MD), aerosil (AE), MD/AE 8/2, MD/AE 6/4, MD/AE 4/6, MD/AE 2/8. Kết quả: Khi tăng dần tỷ lệ AE, giảm dần tỷ lệ MD làm tăng dần hàm ẩm, hiệu suất phun sấy, khả năng trơn chảy, nhưng giảm dần tính hút ẩm, hàm lượng và hiệu suất thu hồi flavonoid. Trong đó, MD/AE 4/6 có hàm ẩm và tính hút ẩm thấp, khối lượng riêng cao, khả năng trơn chảy tốt, hàm lượng và hiệu suất thu hồi flavonoid cao nên được lựa chọn để khảo sát tiếp. - Ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược: Phun sấy cao CHV với các điều kiện như ở khảo sát trên, nhưng tỷ lệ tá dược/chất rắn là 30, 40, 50, 75, 100%. Kết quả: Khi tăng tỷ lệ tá dược làm giảm hàm ẩm, tính hút ẩm, hàm lượng flavonoid, nhưng làm tăng khối lượng riêng, khả năng trơn chảy, hiệu suất phun sấy và thu hồi flavonoid. Trong đó, tỷ lệ tá dược 40% có hàm lượng hoạt chất cao và các chỉ số hóa lý phù hợp với múc đích nghiên cứu nên được lựa chọn để khảo sát tiếp. - Ảnh hưởng của nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch: Phun sấy cao CHV với các điều kiện như ở khảo sát trên, nhưng ở nhiệt độ và tốc độ cấp dịch là: 160ºC, 45ml/phút; 140ºC, 45ml/phút; 120ºC, 45ml/phút; 120ºC, 30ml/phút. Kết quả: Khi tăng nhiệt độ làm giảm hàm ẩm, hàm lượng flavonoid, nhưng tăng hiệu suất phun sấy. Khi giảm tốc độ cấp dịch làm giảm hàm ẩm, tăng tính hút ẩm, tăng hàm lượng flavonoid, tăng khối lượng riêng và khả năng trơn chảy. Trong đó, phun sấy ở 120ºC, 30ml/phút là phù hợp nhất. - Ảnh hưởng của tỷ lệ CR/DP: Phun sấy cao CHV với tỷ lệ CR/DP là 5, 10, 15, 20%. Kết quả: Tỷ lệ CR/DP 20% làm giảm hiệu suất phun sấy, tỷ lệ CR/DP 5% làm tăng hàm ẩm, tính hút ẩm và giảm khối lượng riêng. Như vậy, tỷ lệ CR/DP 15% là thích hợp nhất, vì ở tỷ lệ này làm giảm lượng dịch phun nên tiết kiệm được năng lượng và rút ngắn thời gian hơn khi phun sấy ở tỷ lệ CR/DP 10%. - Tóm tắt thông số qui trình bào chế bột cao khô CHV bằng phun sấy
10 Bảng 3.21. Thông số qui trình bào chế bột cao khô CHV bằng phun sấy STT Tên thông số Thông số 1 Dịch phun sấy Dịch chiết CHV, tỷ lệ chất rắn 20% 2 Tá dược phun sấy Maltodextrin/ Aerosil (40/60) 3 Tỷ lệ tá dược/ chất rắn 40% 4 Nhiệt độ đầu vào 120 ± 20C 5 Tốc độ cấp dịch 30 ml / phút 6 Tỷ lệ chất rắn của dịch phun 15% 7 Áp suất khí nén đầu phun 2 Bar 3.1.2.4. Kiểm nghiệm và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở bột cao khô cúc hoa vàng Bột cao khô CHV chứa luteolin và apigenin với hàm lượng lần lượt là 5,736 ± 0,280mg/g và 0,779 ± 0,044mg/g. Từ kết quả kiểm nghiệm đã xây dựng và thẩm định được TCCS bột cao khô CHV. 3.1.3. Kết quả bào chế và tiêu chuẩn hóa bột cao khô quả nhàu 3.1.3.1. Kết quả điều chế cao quả nhàu toàn phần a. Khảo sát thông số qui trình chiết xuất flavonoid từ quả nhàu - Ảnh hưởng của dung môi chiết: Chiết siêu âm quả nhàu 2 lần, tỷ lệ DM/DL 10/1/lần, ở 500C, 60 phút/lần, nhưng dung môi là: Nước và EtOH (40, 50, 60, 70, 80%). Kết quả: Khi tăng nồng độ EtOH làm tăng hiệu suất chiết flavonoid và đạt mức cao nhất tại EtOH 50%, khi tiếp tục tăng nồng độ EtOH lại làm giảm nhẹ hiệu suất chiết flavonoid. Do đó, lựa chọn EtOH 50% làm dung môi chiết. - Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/DL và số lần chiết: Chiết xuất quả nhàu với các điều kiện như khảo sát trên. Chiết 1 lần với tỷ lệ DM/DL là 20/1, 30/1. Chiết 2 lần với tỷ lệ DM/DL lần 1 là 10/1 và lần 2 lần lượt là 10/1, 7,5/1, 5/1. Kết quả: Chiết 2 lần, tỷ lệ DM/DL lần 1 và 2 lần lượt là 10/1 và 7,5/1 là thích hợp nhất, vì có hiệu suất chiết flavonoid cao (88,08%) và nếu tiếp tục tăng tỷ lệ DM/DL sẽ tốn dung môi, đồng thời sau giai đoạn chiết bằng EtOH, bã dược liệu sẽ được chiết tiếp bằng nước nên có thể chiết thêm cả flavonoid. - Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết: Chiết xuất quả nhàu với các điều kiện như khảo sát trên, nhưng ở nhiệt độ là: 40, 50, 60, 70,
11 800C. Kết quả: Nhiệt độ thích hợp nhất để chiết flavonoid từ quả nhàu là 700C, vì ở nhiệt độ này cho hàm lượng flavonoid tương đương khi chiết ở 800C và cao hơn ở 40 - 600C. - Ảnh hưởng của thời gian chiết: Thời gian chiết 60 phút/lần cho 2 lần có hiệu suất chiết flavonoid cao nhất. Khi giảm thời gian chiết ở lần 2 xuống 45 và 30 phút làm giảm hiệu suất chiết flavonoid, còn khi tăng lên 90 phút ở cả 2 lần chiết cũng làm giảm nhẹ hiệu suất chiết. Do vậy, thời gian chiết thích lợp là 60 phút/lần x 2 lần chiết. b. Khảo sát thông số qui trình chiết xuất Noni-ppt từ quả nhàu Chiết xuất Noni-ppt (giàu polysacharid) từ quả nhàu bằng phương pháp siêu âm. Kết quả: Điều kiện chiết thích hợp là 900C, tỷ lệ DM/DL 20/1, 2 giờ. Điều kiện chiết này được áp dụng để chiết xuất Noni-ppt trong bã quả nhàu sau khi đã chiết với EtOH 50%. c. Tóm tắt thông số qui trình chiết xuất cao quả nhàu 1:1 toàn phần Chiết siêu âm ở công suất 400W. Giai đoạn chiết với EtOH 50%: Chiết siêu âm ở 70ºC, chiết hai lần, tỷ lệ DM/DL lần 1 là 10/1 và lần 2 là 7,5/1, 60 phút/lần; Giai đoạn chiết với nước: Bã quả nhàu chiết tiếp với nước, tỷ lệ DM/DL 10/1, ở 90ºC, trong 2 giờ; Cô cao: Nhiệt độ 70ºC, áp suất giảm (60-70mmHg). d. Bào chế cao quả nhàu 1:1 toàn phần Bảng 3.25. Kết quả chiết xuất, cô cao, loại tạp của cao quả nhàu toàn phần Quả nhàu khô Cao EtOH 2:1, Cao EtOH 2:1, Cao QN 1:1 Nội dung thử kiệt chưa loại tạp đã loại tạp toàn phần Khối lượng (g) 13.684,58 6.844,71 6.843,47 13.686,73 Tỷ lệ chất rắn (%) 32,79 ± 0,80 23,81 ± 1,17 16,05 ± 0,25 Tỷ lệ (%) tạp loại ra từ dịch chiết 8,97 - - Flavonoid (mg/ 0,654 ± 0,032 1,104 ± 0,034 1,061 ± 0,047 0,560 ± 0,017 Hiệu suất chiết, cô cao, loại tạp tính theo fla (%) 81,10 85,72 Tỷ lệ (%) Noni-ppt 10,24 ± 0,45 - 39,23 ± 2,62 53,91 ± 1,55 Hiệu suất chiết Noni-ppt (%) từ quả nhàu 45,63 84,54 Bảng 3.25 cho thấy: Chiết xuất quả nhàu 5mẻ, mỗi mẻ 3kg. Dịch chiết EtOH 50% được cô đặc, loại bớt tạp chất thu được cao
12 EtOH 2:1. Bã quả nhàu được chiết tiếp với nước, cô đặc thu được cao nước 2:1. Gộp hai phần cao thu được cao quả nhàu 1:1. 3.1.3.2. Kết quả bào chế bột cao khô quả nhàu bằng phương pháp phun sấy a. Ảnh hưởng của loại tá dược đến phun sấy cao quả nhàu Phun sấy cao quả nhàu trong cùng điều kiện: Nhiệt độ 140ºC, tốc độ cấp dịch 30ml/phút, tỷ lệ TD/CR 50%, tỷ lệ CR/DP 15%, nhưng với các tá dược là: MD, AE, MD/AE(75/25), MD/AE(50/50), MD/AE(40/60), MD/AE(25/75). Kết quả: Khi tăng dần tỷ lệ AE và giảm dần tỷ lệ MD làm tăng dần hàm ẩm, khả năng trơn chảy, hiệu suất phun sấy, nhưng giảm dần tính hút ẩm, hàm lượng và hiệu suất thu hồi flavonoid, scopoletin. Trong đó, MD/AE 25/75 là phù hợp nhất để bào chế bột cao khô quả nhàu bằng phương pháp phun sấy. b. Ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược/ chất rắn Phun sấy cao quả nhàu trong cùng điều kiện, nhưng với các tỷ lệ TD/CR là 50, 40, 30, 20, 0%. Kết quả: Khi giảm dần tỷ lệ TD/CR làm tăng hàm ẩm, tính hút ẩm và hàm lượng hoạt chất, nhưng làm giảm dần khối lượng riêng, khả năng trơn chảy, hiệu suất thu hồi hoạt chất và phun sấy. Trong đó, tỷ lệ TD/CR 20% là phù hợp nhất để bào chế bột cao khô quả nhàu bằng phương pháp phun sấy c. Ảnh hưởng của nhiệt độ và tốc độ cấp dịch Phun sấy cao quả nhàu trong cùng điều kiện, chỉ khác về nhiệt độ phun sấy và tốc độ cấp dịch: 160ºC, 45ml/phút; 140ºC, 30ml/phút; 120ºC, 30ml/phút; 120ºC, 45ml/phút. Kết quả: Khi giảm nhiệt độ phun sấy làm tăng hàm lượng, hiệu suất thu hồi flavonoid, scopoletin. Tăng tốc độ cấp dịch làm tăng hàm ẩm, chỉ số CI, giảm hiệu suất phun sấy. Trong đó, phun sấy ở 1200C, 30ml/ phút là thích hợp nhất nên được lựa chọn để khảo sát tiếp.
13 d. Ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn trong dịch phun Phun sấy cao quả nhàu trong cùng điều kiện, chỉ khác nhau về tỷ lệ CR/DP: 5, 10, 15, 18%. Kết quả: Tỷ lệ CR/DP ít ảnh hưởng đến hàm ẩm, tính hút ẩm, hàm lượng và hiệu suất thu hồi hoạt chất, nhưng tăng tỷ lệ CR/DP làm tăng khối lượng riêng và khả năng trơn chảy. Trong đó, tỷ lệ CR/DP là 15% là thích hợp nhất để bào chế bột cao khô quả nhàu bằng phương pháp phun sấy. e. Tóm tắt thông số bào chế bột cao khô quả nhàu bằng phun sấy Bảng 3.35. Thông số qui trình bào chế bột cao khô quả nhàu bằng phun sấy STT Tên thông số Thông số 1 Dịch phun sấy Cao quả nhàu toàn phần 1:1 2 Tá dược phun sấy Maltodextrin/ Aerosil (25/75) 3 Tỷ lệ tá dược/ chất rắn 20% 4 Nhiệt độ đầu vào 120 ± 20C 5 Tốc độ cấp dịch 30 ml / phút 6 Tỷ lệ chất rắn của dịch phun 15% 7 Áp suất khí nén đầu phun 2 Bar 3.1.3.4. Kiểm nghiệm và tiêu chuẩn hóa bột cao khô quả nhàu Hàm lượng scopoletin trong bột cao khô quả nhàu là 383,78 ± 12,26 µg/g. Từ kết quả kiểm nghiệm đã xây dựng và thẩm định được TCCS bột cao khô quả nhàu. 3.1.4. Kết quả chiết xuất, bào chế và tiêu chuẩn hóa bột cao khô sâm Ngọc linh sinh khối 3.1.4.1. Kết quả điều chế dịch chiết sâm Ngọc linh sinh khối Bảng 3.36. Thành phần nguyên liệu và cao sâm NLSK Khối Hàm ẩm Hàm lượng ginsenosid (mg/g) Hiệu suất STT lượng (g) (%) Rg1 Rb1 Rg1+Rb1 chiết (%) Sâm NLSK 12.011,19 9,73±0,22 3,78±0,17 3,79±0,24 7,57±0,33 - Cao sâm 10.820,24 84,56±1,22 3,57±0,15 3,44±0,09 7,01±0,24 92,61 NLSK 1:1 Cao sâm 1.801,57 59,47±1,25 20,58±0,64 18,85±0,68 39,43±1,32 86,83 NLSK 6:1 Bảng 3.36 cho thấy cao sâm NLSK 6:1 có hàm lượng ginsenosid là 39,43mg/g, hàm ẩm là 59,47%. Cao sâm 6:1 được sử dụng trong nghiên cứu bào chế bột cao khô.
14 3.1.4.2. Kết quả bào chế bột cao khô sâm Ngọc linh sinh khối bằng phương pháp phun sấy a. Ảnh hưởng của tá dược hỗ trợ phun sấy Phun sấy cao sâm ở cùng điều kiện: Nhiệt độ 140ºC, tốc độ cấp dịch 30ml/phút, tỷ lệ TD/CR 50%, tỷ lệ CR/DP 10%, nhưng với các tá dược là: MD/AE(75:25), MD/AE(50:50), MD/AE(25:75). Kết quả: Khi giảm dần tỷ lệ MD và tăng dần tỷ lệ AE làm tăng hàm ẩm, hiệu suất phun sấy, khả năng trơn chảy, nhưng lại làm giảm tính hút ẩm, khối lượng riêng, hàm lượng và hiệu suất thu hồi ginsenosid. Trong đó, MD/AE 50/50 là phù hợp nhất nên được lựa chọn. b. Ảnh hưởng của nhiệt độ và tốc độ cấp dịch Phun sấy cao sâm trong cùng điều kiện, nhưng ở nhiệt độ đầu vào, tốc độ cấp dịch là: 160ºC, 45ml/phút, 140ºC, 30ml/phút, 120ºC, 30ml/phút. Kết quả: Nhiệt độ phun sấy từ 140 - 1600C cho sản phẩm có khối lượng riêng, hiệu suất phun sấy, hàm lượng, hiệu suất thu hồi ginsenosid cao hơn ở 1200C. Trong đó, phun sấy ở 1400C, 30ml/phút cho sản phẩm tốt hơn nên lựa chọn để khảo sát tiếp. c. Ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược Phun sấy cao sâm trong cùng điều kiện, nhưng ở tỷ lệ TD/CR là 50, 40, 30 và 20%. Kết quả: Khi tăng dần tỷ lệ TD/CR làm giảm dần hàm ẩm, tính hút ẩm, hàm lượng ginsenosid, nhưng khả năng trơn chảy, hiệu suất phun sấy và hiệu suất thu hồi hoạt chất. Trong đó, tỷ lệ TD/CR 30% là thích hợp nhất để bào chế bột cao khô sâm NLSK. d. Ảnh hưởng của tỷ lệ chất rắn trong dịch phun Phun sấy cao sâm NLSK ở cùng điều kiện, chỉ khác về tỷ lệ CR/DP (5, 10, 15, 20%). Kết quả: Khi tăng tỷ lệ CR/DP làm tăng khối lượng riêng, khả năng trơn chảy, hàm lượng và hiệu suất thu hồi ginsenosid, đồng thời giảm tính hút ẩm. Tuy nhiên, ở tỷ lệ CR/DP 20% thì chất lượng của bột không tăng, nhưng hiệu suất phun sấy lại giảm mạnh. Do vậy, tỷ lệ CR/DP 15% là phù hợp nhất.
15 e. Tóm tắt thông số bào chế bột cao khô sâm NLSK bằng phương pháp phun sấy Bảng 3.45. Thông số qui trình bào chế bột cao khô sâm NLSK bằng phun sấy STT Tên thông số Thông số 1 Nguyên liệu phun sấy Cao sâm NLSK (6:1) 2 Tá dược phun sấy Maltodextrin : Aerosil (50:50) 3 Tỷ lệ tá dược/ chất rắn 30% 4 Nhiệt độ đầu vào 140 ± 20C 5 Tốc độ cấp dịch 30 ml / phút 6 Tỷ lệ chất rắn của dịch phun sấy 15% 7 Áp suất khí nén đầu phun 2 Bar 3.1.4.3. Kiểm nghiệm và xây dựng tiêu chuẩn cơ sở bột cao khô sâm Ngọc linh sinh khối Bột cao khô sâm NLSK có hàm lượng ginsenosid (Rg1, Rb1) là 68,97 ± 1,93mg/g. Từ kết quả kiểm nghiệm đã xây dựng và thẩm định được TCCS của bột cao khô sâm NLSK. 3.2. Kết quả xây dựng công thức, tiêu chuẩn cơ sở và đánh giá độ ổn định của viên nang cứng Kaviran 3.2.1. Xây dựng công thức viên nang Kaviran - Xây dựng công thức dược chất: Trên cơ sở đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro và tác dụng tăng cường miễn dịch đã xác định được tỷ lệ phối hợp bột cao khô để xây dựng công thức dược chất của viên Kaviran là: bột cao khô sâm NLSK/ bột cao khô quả nhàu/ bột cao khô CHV với tỷ lệ 1/3/3. - Đã xây dựng được công thức viên nang Kaviran (Bảng 3.48). Bảng 3.48. Thành phần công thức cho một viên nang cứng Kaviran STT Thành phần Khối lượng 1 Bột cao khô sâm NLSK 60,0 mg 2 Bột cao khô CHV 180,0 mg 3 Bột cao Quả nhàu 180,0 mg 4 Aerosil 2,5 mg 5 Magnesi stearat 5,0 mg 6 Natri laurylsulphat 2,5 mg 7 Natri croscarmellose 20,0 mg 8 Manitol 24,58 mg
16 3.2.2. Kiểm nghiệm, xây dựng tiêu chuẩn cơ sở viên nang cứng Kaviran Viên nang Kaviran chứa luteolin là 0,846±0,030mg, apigenin là 0,121±0,006mg, ginsenosid Rg1 2,31±0,137g và ginsenosid Rb1 là 2,24 ± 0,167mg. Từ các kết quả kiểm nghiệm đã xây dựng và thẩm định được TCCS cho viên nang cứng Kaviran. 3.2.3. Kết quả đánh giá độ ổn định của viên nang cứng Kaviran Tất cả các tiêu chí đánh giá sau 6 tháng ở điều kiện lão hóa cấp tốc và 12 tháng ở điều kiện dài hạn đều đạt theo tiêu chuẩn cơ sở của chế phẩm. Như vậy, chế phẩm có độ ổn định ít nhất là 12 tháng. 3.3. Đánh giá độc tính và tác dụng tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa, bảo vệ gan của viên nang Kaviran 3.3.1. Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn - Độc tính cấp: Kaviran dùng đến mức liều cao nhất có thể cho chuột nhắt uống là 36g/kg/24h (gấp 50 lần liều dự kiến lâm sàng), nhưng không xác định được LD50. - Độc tính bán trường diễn: Kaviran liều 240 và 1200mg/kg không làm thay đổi về cân nặng cơ thể, điện tim thỏ. Chỉ số huyết học, hoạt độ enzym AST, ALT và hàm lượng creatinin, ure máu thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Hình ảnh đại thể và vi thể của gan, lách và thận ở lô dùng Kaviran không khác so với lô chứng. 3.3.2. Đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa và bảo vệ gan của viên nang cứng Kaviran 3.2.2.1. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan Khối lượng gan ương đối của chuột uống Kaviran ở liều 4,32g/kg giảm so với lô mô hình (p < 0,05). Kaviran cả 3 mức liều đều làm giảm hoạt độ AST, ALT, nhưng chỉ ở liều 2,16 và 4,32g/kg thì mới có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình (p < 0,05). So với lô mô hình, silymarin và Kaviran có tác dụng làm giảm hàm lượng MDA dịch đồng thể gan, nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống
17 kê (p > 0,05). Về đại thể, vi thể gan của chuột uống Kaviran hầu như đều bình thường hoặc mức độ tổn thương nhẹ hơn so với lô mô hình. 3.2.2.2. Đánh giá tác dụng của Kaviran trên chuột thực nghiệm bị suy giảm miễn dịch do chiếu tia xạ Lô chuột uống Levamisol và Kaviran (liều 0,72 và 2,16g/kg) đều làm tăng rõ rệt khối lượng ức và lách tương đối so với lô chứng chiếu xạ (p < 0,05). Bảng 3.59. Ảnh hưởng của Kaviran lên số lượng bạch cầu chuột nhắt trắng Lô Số lượng bạch cầu và các bạch cầu thành phần (109/ L) chuột Bạch cầu BC Lympho BC đơn nhân BC hạt Lô 1 4,107 ± 0,724 a 3,497 ± 0,628 a 0,249 ± 0,065 b 0,365 ± 0,053 a Lô 2 1,875 ± 0,354 c 1,470 ± 0,263 c 0,187 ± 0,054 b 0,189 ± 0,078 b bc bc a Lô 3 2,538 ± 0,652 1,982 ± 0,495 0,375 ± 0,170 0,210 ± 0,073 b Lô 4 2,900 ± 1,068 b 2,287 ± 0,917 b 0,278 ± 0,083 ab 0,196 ± 0,077 b Lô 5 2,588 ± 0,579 bc 2,113 ± 0,455 b 0,275 ± 0,086 ab 0,230 ± 0,050 b Giá trị trong cùng cột có cùng ký tự là khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p
18 cứu chiết xuất, bào chế bột cao khô CHV và quả nhàu vì liên quan đến tác dụng chống oxy hóa. Phần kết tủa trong EtOH (Noni-ppt) giàu polysaccharid trong quả nhàu đã được chứng minh có tác dụng tăng cường miễn dịch nên cũng được lựa chọn làm chỉ tiêu đánh giá khi xây dựng qui trình chiết xuất. 4.1.2. Điều chế cao cúc hoa vàng, quả nhàu và sâm Ngọc linh sinh khối 4.1.2.1. Ảnh hưởng của các thông số đến chiết xuất flavonoid từ cúc hoa vàng và quả nhàu - Ảnh hưởng của dung môi: Hàm lượng flavonoid chiết được tăng dần khi tăng nồng độ EtOH và cao nhất ở EtOH là 50%, sau đó giảm nhẹ khi tiếp tục tăng nồng độ EtOH. Vì flavonoid trong quả nhàu và CHV ở cả dạng glycosid và aglycol, nên EtOH nồng độ trung bình sẽ chiết flavonoid toàn phần tốt nhất. - Ảnh hưởng của tỷ lệ DM/DL: Khi tăng tỷ lệ DM/DL làm tăng hiệu suất chiết, nhưng nếu tỷ lệ này cao quá sẽ tốn dung môi, dịch chiết thu được loãng, nên khi cần cô đặc dịch chiết sẽ tốn thời gian và năng lượng hơn. Từ khảo sát đã lựa chọn được tỷ lệ DM/DL thích hợp: với CHV là 10/1 ở cả 2 lần chiết; với quả nhàu tỷ lệ DM/DL lần 1 và 2 lần lượt là 10/1 và 7,5/1. - Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết: Hàm lượng flavonoid chiết được tăng khi tăng nhiệt độ, nhưng nhiệt độ chiết trên 60ºC đối với CHV và 70ºC đối với quả nhàu thì không làm tăng đáng kể lượng flavonoid chiết được. Điều này có thể do nhiệt độ là vừa làm tăng khối lượng chiết, nhưng cũng tăng nguy cơ phân hủy flavonoid. - Ảnh hưởng thời gian chiết: Thời gian chiết flavonoid thích hợp là 60 phút/lần cho cả hai lần chiết. Khi tăng thời gian chiết không làm tăng lượng flavonoid chiết được (quả nhàu) hoặc giảm nhẹ (CHV). Vì sóng siêu âm có thể tác động làm phá vỡ khung cấu trúc của flavonoid, làm giảm lượng flavonoid. 4.1.2.2. Điều chế cao quả nhàu toàn phần