Tóm tắt luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài sao biển Culcita Novaeguineae Müller & Troschel, 1842 và Pentaceraster Gracilis (Lutken, 1871) Ở Việt Nam

Chia sẻ: Lê Thị Hồng Nhung | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

58
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án nhằm nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học chủ yếu của hai loài C.novaeguinea và P. gracilis ở vùng biển Đông bắc của Việt Nam. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được để tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài sao biển Culcita Novaeguineae Müller & Troschel, 1842 và Pentaceraster Gracilis (Lutken, 1871) Ở Việt Nam

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Bùi Thị Ngoan NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA LOÀI SAO BIỂN CULCITA NOVAEGUINEAE MÜLLER & TROSCHEL, 1842 VÀ PENTACERASTER GRACILIS (LUTKEN, 1871) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số: 62.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2018
2 Công trình được hoàn thành tại: Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: GS. VS. Châu Văn Minh Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Hoài Nam Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi giờ , ngày tháng năm 2018. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học Viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Hà Nội
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Sao biển là loài động động vật không xương sống, thuộc ngành Da gai (Echinodermata), lớp Asteroidea. Gọi tên sao biển là do cơ thể có 5 cánh xuất phát từ trung tâm của cơ thể sao biển, tương tự như hình ngôi sao. Theo phân loại của Blacke (1987), lớp Asteroidea được chia thành 7 bộ: Brisingida, Forcipulatida, Notomyotida, Paxillosida, Spinulosida, Valvatida và Velatida. Theo thống kê của tác giả Guang Dong và cộng sự trong giai đoạn từ năm 1997- 2007 đã có khoảng 98 loài sao biển trên toàn thế giới được nghiên cứu về thành phần hóa học. Những nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất thứ cấp có mặt trong sao biển bao gồm: các steroid, steroid glycoside (glycoside của polyhydroxysteroid, asterosaponin và cyclic steroid glycoside), các hợp chất thuộc nhóm glycosphingolipid (cerebroside và ganglioside). Ngoài ra còn một số các hợp chất khác như: anthraquinon, alkaloid, phospholipid, peptid và acid béo. Các thành phần hóa học này thể hiện rất nhiều các hoạt tính quý báu như: hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính làm tan máu, chống virut, kháng nấm, kháng vi sinh vật, kháng viêm… Theo đánh giá của các nhà khoa học trong nước, loài sao biển thuộc lớp động vật da gai (Echinodermata), lớp động vật da gai này có khoảng 350 loài thuộc 58 họ, 5 lớp (Huệ Biển, Hải Sâm, Sao Biển, Cầu Gai và Đuôi Rắn) sống ở biển Việt Nam. Cho đến thời điểm này, nghiên cứu về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học trên đối tượng sao biển ở Việt Nam đã thực hiện trên 09 loài, bao gồm: Sao biển Archaster typicus, Asterina batheri, Asteropsis carinifera, Astropecten polyacanthus, Astropecten monacanthus, Protoreaster nodosus, Acanthaster planci, Linckia laevigata và Anthenea aspera. Các hợp chất phân lập được từ sao biển ở Việt nam cũng thuộc các lớp chất steroid, steroid glycoside có hoạt tính gây độc tế bào và kháng viêm.
2 Chính vì vậy, nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học và hoạt tính sinh học các loài thuộc C. novaeguineae và loài sao biển P. gracilis ở Việt Nam tạo cơ sở khoa học trong việc nghiên cứu ứng dụng các loài sao biển này trong lĩnh vực y-dược học, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài sao biển Culcita novaeguineae Müller & Troschel, 1842 và Pentaceraster gracilis (Lutken, 1871) ở Việt Nam”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án  Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học chủ yếu của hai loài C.novaeguinea và P. gracilis ở vùng biển Đông bắc của Việt nam;  Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được để tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án:  Phân lập các hợp chất từ loài C. novaeguineae và P. gracilis ở Việt Nam bằng các phương pháp sắc ký;  Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý, hóa học;  Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN Phần tổng quan trình bày các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề: 1.1. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học trên đối tƣợng sao biển trên thế giới. Các lớp chất có được trong thành phần hóa học của các loài sao biển trên thế giới tập trung chủ yếu ở lớp steroid, glycoside (glycoside của polyhydroxysteroid, asterosaponin và cyclic steroid
3 glycoside...) với hoạt tính gây độc tế bào, kháng vi sinh vật kiểm định và kháng viêm. 1.2. Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của số loài sao biển ở Việt Nam. Cho đến nay, ở Việt nam đã nghiên cứu thành phần hóa học các loài Sao biển Archaster typicus, Asterina batheri, Asteropsis carinifera, Astropecten polyacanthus, Astropecten monacanthus, Protoreaster nodosus, Acanthaster planci, Linckia laevigata và Anthenea aspera. Các hợp chất thu được là các steroid, glycoside bao gồm cả glycoside của polyhydroxysteroid, asterosaponin... với hoạt tính gây độc tế bào, kháng viêm rất tốt. CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1. Loài sao biển Culcita novaeguineae Mẫu sao biển C. novaeguineae được thu vào tháng 10 năm 2013 tại Quảng Ninh. 2.1.2. Loài sao biển Pentaceraster gracilis. Mẫu sao biển P. gracilis được thu vào tháng 3 năm 2014 tại Cô Tô, Quảng Ninh. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất Phối hợp các phương pháp sắc ký bao gồm: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng điều chế và sắc ký cột (CC). 2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm: phổ khối (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR- ESI-MS), độ quay cực ([]D), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR). 2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học Hoạt tính gây độc tế bào của các hoạt chất được xác định theo phương pháp SRB.
4 2.3. Phân lập các hợp chất 2.3.1. Phân lập các hợp chất từ loài sao biển Culcita novaeguineae Phần này trình bày cách thức phân lập các hợp chất từ loài sao biển C. novaeguineae. CH2CL2 (15,2 g) MPLC SNAP-Sil DM 100:1 – 1:1 C1 C4 C7 C8 (2 g) C9 CC, YMC RP-18 MW 1:1 – 5:1 C8.1 C8.2 C8.3 C8.4 C8.5 C8.6 (500 mg) (387mg) (172 mg) (560 mg) (185 mg) Silica gel CC CC, Silicagel EMW 10/1/0,1 E/M/W 10/1/0,1 C8.5C C8.5D C8.5E C8.5F C8.5G C8.5A,B (46mg (18mg) (76mg) (150mg) (150mg) Silica gel CC YMC CC M/W 1,5/1 D/M/W 5/1/0,1 Sephadex LH-20 M/W 2/1 CN9 H8.5F1 H8.5F2 (5,4 mg) YMC CC CN3 CN4 CN5 A/W 1/1 (4,0mg) (7,5mg) (9,5mg) CN8 (3,5mg) CN6 CN7 (2,5mg) (5,0mg) Hình 2.4-6. Sơ đồ phân lập các chất từ cặn nước sao biển C. novaeguineae 2.3.2. Phân lập các hợp chất từ loài Pentaceraster gracilis Phần này trình bày cách thức phân lập các hợp chất từ loài P. gracilis W3 8.5 g YMC CC, MW: 1/1 W3 A W3B W3C W3D W3E 2.7 g 700 mg 720 mg 1.3 g 900 mg DMWa: DMWa: DMWa: DMW: 2.5/1/0.15/0.002 2.7/1/0.15/0.002 2.5/1/0.15/0.002 4/1/0.15 W3C1 W3D1 W3D2 W3E1 W3E2 W3E3 W3E4 W3E5 W3B1 W3B2 220 mg 210 mg 700 mg 80 mg 120 mg 60 mg 100 mg 65 mg 50 mg 80 mg Sephadex Sephadex Sephadex Sephadex EMW: DAW: MW: 1/1 MW: 1/1 MW: 1/1 MW: 1/1 5/1/0.1 1/3/0.1 EMW: W3D2a W3E1a W3E2a 3.5/1/0.1 PG2 240 mg 50 mg 80 mg W3E3a W3E3b PG5 12 mg EMW: 25 mg 10 mg 25 mg DAW: 1.8/1/0.2 1/2/0.1 Sephadex Sephadex W3E5a MW: 1/1 MW: 2/1 W3D2a1 W3D2a2 PG7 23 mg 60 mg 40 mg 18 mg PG4 PG6 MW: 2.5/1 MW: 1.5/1 10 mg 8 mg W3D2a2a PG3 25 mg 10 mg EMW: 2.5/1/0.15 PG1 9 mg Hình 2.7-9. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài Pentaceraster gracilis 2.4. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất 2.4.1. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ loài sao biển C. novaeguineae và P. gracilis Hợp chất CN1: Novaeguinoside E (chất mới)
5 Chất bột màu trắng, HR-ESI-MS: m/z 1273,5257 [M + Na]+, CTPT: C56H91NaO27S. 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) và 13C- NMR (DMSO-d6, 125 MHz) (Bảng IV.1.1). Hợp chất CN2: Natri 6α-[(O-β-D-fucopyranosyl-(l2)-O-β-D- galactopyranosyl-(l4)-O-[β-D-quinovopyranosyl-(l2)]-O-β-D- xylopyranosyl-(l3)-O-β-D-quinovopyranosyl)-oxy]-5α-pregn- 9(11)-ene-20-one-3β-yl-sulfate. Chất bột màu trắng. 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) và 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) (Bảng IV.1.2). Hợp chất CN3: Linckoside B Chất bột màu trắng, CTPT: C40H68O14. 1H-NMR (pyridine-d5, 500 MHz) và 13C-NMR (pyridine-d5, 125 MHz) (Bảng IV.1.3). Hợp chất CN4: Halityloside E 1 Chất bột màu trắng, CTPT: C39H68O13. H-NMR (pyridine-d5, 500 MHz) và 13C-NMR (pyridine-d5, 125 MHz) (Bảng IV.1.4). Hợp chất CN5: Halityloside D Chất bột màu trắng, điểm nóng chảy: 243-248 0C, CTPT: C39H68O14. 1H-NMR (pyridine-d5, 500 MHz) và 13C-NMR (pyridine- d5, 125 MHz) (Bảng IV.1.5). Hợp chất CN6: Culcitoside C5 Chất dạng bột không màu, CTPT: C38H66O14. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (Bảng IV.1.6). Hợp chất CN7:Halityloside B Chất dạng bột màu trắng, CTPT: C40H70O14. 1H-NMR (pyridine-d5, 500 MHz) và 13C-NMR (pyridine-d5, 125 MHz) (Bảng IV.1.7). Hợp chất CN8: Halityloside A. Chất dạng bột màu trắng, CTPT: C40H70O15. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (Bảng IV.1.8). Hợp chất CN9: 5α-cholestane-3β,6β,7α,8β,15α,16β,26-heptol Chất dạng bột màu trắng, CTPT: C27H48O7. 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) và 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) (Bảng IV.1.9).
6 III.3.10. Hợp chất PG2: Protoreasteroside Chất dạng bột màu trắng, CTPT: C56H92O27S. 1H-NMR (pyridine-d5, 500 MHz) và 13C-NMR (pyridine-d5, 125 MHz) (Bảng IV.2.1). Hợp chất PG1: Maculatoside Chất dạng bột màu trắng, CTPT: C56H92O27S. 1H-NMR (pyridine-d5, 500 MHz) và 13C-NMR (pyridine-d5, 125 MHz) (Bảng IV.2.2). Hợp chất PG3: Pentaceroside A (chất mới) Chất bột màu trắng, FT-ICR-MS: m/z 755,41935 [M + Na]+, CTPT: C37H64O14. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (Bảng IV.2.3). Hợp chất PG4: Pentaceroside B (chất mới) Chất bột màu trắng, FT-ICR-MS: m/z 623,3771 [M + Na]+, CTPT: C32H56O10. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (Bảng IV.2.4). Hợp chất PG5: Nodososide Chất dạng bột, CTPT: C38H66O14. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (Bảng IV.2.5). Hợp chất PG6: (5α,25S)-Cholestane-3β,6α,8,15β,16β,26-hexol 3-O- [(2-O-methyl)-β-D-xylopyranoside] Chất dạng bột, CTPT: C33H58O10. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (Bảng IV.2.6) Hợp chất PG7: 5α-cholestane-3β,6α,7α,8β,15α,16β,26-heptol Chất dạng bột màu trắng, CTPT: C27H48O7. 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) và 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) (Bảng IV.2.7). 2.5. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất được đánh giá trên 05 dòng tế bào ung thư người là: LNCaP (tuyến tiền liệt), MCF7 (vú), KB (ung thư biểu mô), HepG2 (gan) và SK-Mel-2 (sắc tố). Thực nghiệm được tiến hành tại Phòng thử nghiệm hoạt tính sinh học, Viện Công nghệ sinh học.
7 2.5.1. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc từ loài sao biển Culcita novaeguineae Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ loài sao biển C. novaeguineae cho thấy: Chỉ có các hợp chất CN5CN8 thể hiện hoạt tính, các hợp chất CN1CN4 và CN9 không có biểu hiện hoạt tính với giá trị IC50> 100 µM. Bảng 4.1. Giá trị IC50 của các chất từ sao biển C. novaeguineae trên 5 dòng tế bào ung thư IC50 trên dòng tế bào (µM) Chất sạch LNCaP MCF7 KB HepG2 SK-Mel2 CN1 >100 >100 >100 >100 >100 CN2 >100 >100 >100 >100 >100 CN3 >100 >100 >100 >100 >100 CN4 >100 >100 >100 >100 >100 CN5 31,801,59 33,961,57 32,661,47 75,014,11 32,993,05 CN6 57,081,81 62,952,96 92,042,84 >100 89,762,47 CN7 39,682,65 39,992,65 44,373,00 80,223,67 50,094,06 CN8 48,592,30 51,612,70 70,703,56 >100 73,993,10 CN9 >100 >100 >100 >100 >100 a Elipticine 1,990,16 1,950,12 2,070,12 1,710,16 2,150,24 chất chuẩn dương a Trong đó, hợp chất halityloside D (CN5) thể hiện hoạt tính khá tốt trên các dòng tế bào LNCaP (IC50 = 31,80  1,59 µM), MCF7 (IC50 = 33,96  1,57 µM), KB (IC50 = 32,66  1,47 µM) và SK-Mel2 (IC50 = 32,99  3,05 µM) và hoạt tính yếu trên dòng HepG2 (IC50 = 75,01  4,11 µM). Hợp chất halityloside B (CN7) thể hiện hoạt tính khá tốt trên các dòng tế bào LNCaP (IC50 = 39,68  2,65 µM), MCF7 (IC50 = 39,99  2,65 µM) và KB (IC50 = 44,37  3,00 µM); hoạt tính trung bình trên dòng tế bào SK-Mel2 (IC50 = 50,09  4,06 µM) và hoạt tính yếu trên dòng HepG2 (IC50 = 80,22  3,67 µM). Hai hợp
8 chất culcitoside C5 (CN6) và halityloside A (CN8) thể hiện hoạt tính trung bình hoặc yếu trên các dòng tế bào LNCaP, MCF7, KB, và SK- Mel2 với giá trị IC50 từ 48,59  2,30 đến 92,04  2,84µM, và không thể hiện hoạt tính (IC50> 100 µM) trên dòng Hep-G2. 2.5.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập đƣợc từ loài sao biển Pentaceraster gracilis Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ loài sao biển P. gracilis cho thấy: hợp chất maculatoside (PG1) thể hiện hoạt tính khá tốt trên các dòng tế bào LNCaP (IC50 = 39,75  3,34 µM), KB (IC50 = 36,53  0,78 µM), HepG2 (IC50 = 16,75  0,69 µM) và SK-Mel2 (IC50 = 19,44  1,45 µM) và hoạt tính trung bình trên dòng MCF7 (IC50 = 47,34  7,01 µM). Hợp chất PG7 thể hiện hoạt tính yếu trên các dòng tế bào LNCaP (IC50 = 86,57  2,19 µM), HepG2 (IC50 = 79,69  3,14 µM) và SK-Mel2 (IC50 = 96,77  4,07 µM) và không thể hiện hoạt tính (IC50> 100 µM) trên các dòng tế bào còn lại. Các hợp chất PG2PG6 không có biểu hiện hoạt tính trên tất cả năm dòng tế bào ung thư được thử nghiệm với giá trị IC50> 100 µM. Bảng 4.2. Giá trị IC50 của các chất từ sao biển Pentaceraster gracilis trên 5 dòng tế bào ung thư IC50 trên dòng tế bào (µM) Chất sạch LNCaP MCF7 KB Hep-G2 SK-Mel2 PG1 39,753,34 47,347,01 36,530,78 16,750,69 19,441,45 PG2 >100 >100 >100 >100 >100 PG3 >100 >100 >100 >100 >100 PG4 >100 >100 >100 >100 >100 PG5 >100 >100 >100 >100 >100 PG6 >100 >100 >100 >100 >100 PG7 86,572,19 >100 >100 79,693,14 96,774,07 Elipticinea 1,990,16 1,950,12 2,070,12 1,710,16 2,150,24 chất chuẩn dương a
9 CHƢƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 3.1. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ loài Culcita novaeguineae Phần này trình bày kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 09 hợp chất được phân lập từ loài C. novaeguineae. CN1: Novaeguinoside E CN2: natri 6α-[(O-β-D- fucopyranosyl-(l2)-O-β-D- galactopyranosyl-(l4)-O-[β-D- quinovopyranosyl-(l2)]-O-β-D- xylopyranosyl-(l3)-O-β-D- quinovopyranosyl)-oxy]-5α-pregn- 9(11)-ene-20-one-3β-yl-sulfate CN3: Linckoside B CN4: Halityloside E CN5: Halityloside D CN6: Culcitoside C5 CN7: Halityloside B CN8: Halityloside A CN9: 5α-cholestane- 3β, 6β,7α,8β,15α,16β,26-heptol
10 Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của một hợp chất mới. 3.1.1. Hợp chất CN1: Novaeguinoside E (chất mới) Hợp chất CN1 được phân lập từ loài sao biển Culcita novaeguineae dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử của nó được xác định là C56H91NaO27S bằng phổ HR-ESI-MS với sự xuất hiện pic ion phân tử tại m/z1273,5257 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C56H91Na2O27S+, 1273,5258). Các phổ NMR của nó đặc trưng cho một hợp chất asterosaponin, một lớp chất chính của các loài sao biển. Các số liệu phổ 1H và 13C-NMR (đo trong DMSO-d6) của CN1 tương tự như các số liệu của protoreasteroside, ngoại trừ có sự khác nhau ở các tín hiệu của chuỗi đường. Intens . x 104 +MS, 1.4min #83 413.2667 8 6 4 803.5400 1273.5257 274.2765 2 353.2659 155.0736 648.2584 566.2132 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z Hình 3.1. Phổ HR-ESI-MS của CN1 Hình 3.2a. Phổ 1H-NMR của CN1 trong DMSO-d6 Hình 3.2. Phổ 1H-NMR của CN1 trong pyridine-d5
11 Hình 3.3. Phổ 13C-NMR của CN1 Phân tích chi tiết các phổ 1D- và 2D-NMR của CN1 chứng minh sự có mặt của ba nhóm methyl [C 75,2 (C-3), 78,1 (C-6) và 76,2 (C-22)/H 3,83-3,87 (H-3), 3,45-3,47 (H-6) và 3,04-3,06 (H-22), mỗi tín hiệu 1H, m], một cacbon bậc bốn mang oxi [C 75,1 (C-20)], hai liên kết đôi bị thế ba vị trí [C 145,2 (s, C-9) vàC 115,7 (d, C- 11)/H 5,24 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-11); C 124,0 (d, C-24)/H 5,20 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-24) và C 130,4 (s, C-25)] và năm nhóm tert- metyl [C 13,0 (C-18), 19,0 (C-19), 19,9 (C-21), 17,8 (C-26) và 25,6 (C-27)/H 0,72 (H-18), 0,88 (H-19), 1,06 (H-21), 1,55 (H-26) và 1,65 (H-27), mỗi tín hiệu 3H, s]. Vị trí của cacbon bậc bốn mang oxi tại C-20, một nhóm oxymethin tại C-22 và một liên kết đôi tại C-24/C- 25 được xác định bằng các tương tác COSYH-22/H-23/H-24 kết hợp với các tương tác xa HMBC của H-21 (H 1,06) với C-17 (C 53,8)/C-20 (C 75,1)/C-22 (C 76,2) và của H-26 (C 1,55)/H-27 (H 1,65) với C-24 (C 124,0)/C-25 (C 130,4). Phân tích chi tiết các tương tác HMBC và COSY khác cho phép xác định chính xác cấu trúc phẳng phần aglycon của CN1. Hình 3.4. Phổ HSQC của CN1
12 Hình 3.5. Phổ COSY của CN1 Hình 3.6. Phổ HMBC của CN1 Trên phổ ROESY tương tác không gian của H-3 (H3.83- 3.87) với H-5 (H1.05-1.07) cho thấy cấu hình α của H-3. Tương tác NOE giữa H-6 (H3.45-3.47) và H-8 (H1.97-1.99)/H-19 (H 0.88) cũng như giữa H-8 (H1.97-1.99) và H-18 (H 0.72), chứng minh cho cấu hình β của H-6 (hình 4.9). Giá trị độ dịch chuyển hóa học 13C- NMR của C-21 tại C 19.9 (đo trong DMSO-d6) cho thấy cấu hình tương đôi R* tại C-20 [3]. Để xác định cấu hình tại C-22, phổ 1H- NMR của CN1 được đo lại trong pyridine-d5. Giá trị độ dịch chuyển hóa học 1H-NMR của H-21 tại H 1.64 (pyridine-d5) chứng minh cho cấu hình S* tại C-22. Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của CN1 Hc,e HMBC C a C C b Cc,d dạng pic (J = Hz) (H  C) Aglycon 1 35,9 35,15 1,26 m/1,62 m 2 29,2 28,35 1,36 m/2,12 m 3 78,3 75,18 3,85 m 4 30,6 29,49 1,04 m/2,35 m 5 49,2 48,43 1,06 m 6 80,0 78,11 3,46 m 7 41,2 40,63 0,83 m/2,27 m 8 35,4 34,67 1,98 m 9 145,6 145,18 - 10 38,2 37,70 - 11 116,6 115,67 5,24 d (5,0) 10, 13 12 42,6 41,99 1,96 m/2,18 m 13 41,6 40,51 - 14 54,0 53,36 1,15 m 15 22,6 24,55 1,10 m/1,63 m 16 25,3 21,15 1,62 m/1,75 m
13 17 55,1 53,80 1,83 m 18 13,4 13,00 0,72 s 12, 13, 14,17 19 19,2 19,04 0,88 s 1, 5, 9, 10 20 76,4 75,14 - 21 21,5 19,91 1,06 s 17, 20, 22 22 77,8 76,24 3,05 m 23 29,6 28,99 1,75 m/2,35 m 24 124,2 124,04 5,20 t (7,0) 25 131,8 130,40 - 26 17,4 17,85 1,55 s 24, 25, 27 27 25,6 25,64 1,65 s 24, 25, 26 Qui I 1 105,1 104,4 102,75 4,31 d (7,5) 6 2 74,1 74,1 73,00 3,18 f 3 90,5 89,8 87,90 3,28 f 4 74,5 74,3 72,96 2,91 t (9,0) 5 72,0 72,3 70,74 3,27 f 6 18,4 17,8 17,81 1,16 d (6,5) 4, 5 Xyl 1 104,5 104,0 102,49 4,53 d (7,5) 3 2 81,9 82,7 82,68 3,35 f 3 75,6 75,1 73,99 3,58 f 4 78,8 78,3 76,54 3,60 f 5 64,5 64,2 63,07 3,31/3,94 f Qui II 1 104,8 105,2 104,54 4,44 d (7,5) 2 2 76,2 75,6 74,84 3,06dd (7,5, 9,0) 3 76,8 77,0 75,58 3,12t (9,0) 4 75,5 76,0 74,63 2,86 t (9,0) 5 73,6 73,3 72,44 3,22dd (6,0, 9,0) 6 17,8 17,8 17,31 1,19 d (6,0) 4, 5 Fuc I Qui 1 102,0 101,2 100,08 4,42 d (7,5) 4 2 82,8 84,0 81,47 3,44 f 3 74,9 75,9 72,44 3,50 f 4 71,7 77,3 70,22 3,45 f 5 71,6 73,4 70,10 3,58 f 6 16,9 18,2 16,51 1,14 d (6,0) Fuc II 1 106,9 106,2 105,60 4,21 d (7,0) 2 2 73,8 71,8 72,05 3,32 f 3 75,0 74,7 73,23 3,51 f 4 72,5 72,8 70,99 3,38 br s 5 71,9 71,8 70,47 3,54 f 6 17,1 16,9 16,65 1,15 d (6,0) 4, 5 a C của novaeguinoside A [4], bC của protoreasteroside [3], cđo trong DMSO-d6, d125 MHz, e 500 MHz, etín hiệu bị chồng lấp.
14 Hình 3.8. Các tương tác COSY, Hình 3.7. Phổ ROESY của CN1 HMBC và ROESY chính của CN1 Ngoài ra, phổ 13C-NMR của CN1 xuất hiện 5 tín hiệu cacbon anome tại C 102,7 (C-1), 102,5 (C-1), 104,5 (C-1), 100,1 (C- 1) và 105,6 (C-1); có tương tác HSQC với các proton anome tương ứng (mỗi tín hiệu 1H, d, J = 7,5 Hz) tại H 4,31 (H-1), 4,53 (H-1), 4,44 (H-1), 4,42 (H-1) và 4,21 (H-1) chứng minh sự có mặt của 05 gốc đường. So sánh chi tiết số liệu phổ 1H và 13C- NMR phần chuỗi đường của CN1 với các số liệu tương ứng của protoreasteroside kết hợp với phân tích các phổ 1D TOCSY, COSY, HMBC, HSQC và ROESY và (hình 4.9), cho thấy sự khác nhau giữa hai hợp chất chỉ được ghi nhận ở các tín hiệu của đơn vị đường thứ 4. Số liệu phổ 13C-NMR của gốc đường này đo trong DMSO-d6 tại C 100,1 (C-1), 81,5 (C-2), 72,4 (C-3), 70,2 (C-4), 70,1 (C-5) và 16,5 (C-6) tương tự như các số liệu tương ứng của novaeguinoside A đo trong pyridine-d5 tại C 102,0 (C-1), 82,8 (C-2), 74,9 (C-3), 71,7 (C- 4), 71,6 (C-5) và 16,9 (C-6) và khác xa so với các số liệu của protoreasteroside đo trong pyridine-d5 tại C 101,2 (C-1), 84,0 (C-2), 75,9 (C-3), 77,3 (C-4), 73,4 (C-5) và 18,2 (C-6), chứng minh gốc đường thứ 4 là fucose. Điều này cũng phù hợp với cơ sở lý luận sinh tổng hợp lý thuyết với sự cùng có mặt trong loài sao biển C. novaeguineae của CN1 và hợp chất novaeguinoside A, có chứa cùng chuỗi năm đơn vị đường.
15 (A) (B) (C) (D) (E) Hình 3.9. Phổ 1D TOCSY của CN1 Trên phổ 1D TOCY của CN1, với sự kích thích chương trình xung vào các tín hiệu proton anome: H-1 tại H 4,53 (A), H-1 tại H 4,44 (B), H-1 tại H 4,42 (C), H-1 tại H 4,31 (D), and H-1 tại H 4,21 (E) sẽ giúp cho việc xác định chính xác proton của phân tử đường. Tương tác xa HMBC của proton anome H-1 (H 4.21) với C-2 (C 81.5), H-1 (H 4.42) với C-4 (C 76.5), H-1 (H 4.44) với C-2 (C 82.7) và của H-1 (H 4.53) với C-3 (C 87.9), chứng minh vị trí liên kết tương ứng của đường fucose II tại C-2, fucose I
16 tại C-4, quinovose II tại C-2 và xylose tại C-3. Ngoài ra, proton anome H-1 (H 4.31) của đường quinovose I có tương tác HMBC với C-6 (C 78,1) chứng minh vị trí liên kết thường gặp của chuỗi đường tại vị trí C-6 của phần algycon. Giá trị hằng số tương tác lớn (J = 7,5 Hz) của các proton anome cho thấy các liên kết đường đều có dạng β. Cấu hình của các đơn vị đường được xác định là D bởi sự tương đồng với hợp chất novaeguinoside A và tất cả các hợp chất asterosaponin đã được công bố. Như vậy, cấu trúc hóa học của CN1 được chứng minh là sodium (20R*,22S*)-6α-O-{-D-fucopyranosyl-(12)--D- fucopyranosyl-(14)-[-D-quinovopyranosyl-(12)]--D- xylopyranosyl-(13)--D-quinovopyranosyl}-3β,6α,20,22- tetrahydroxy-5α-cholesta-9(11),24-dien-3β-yl sulfate. Đây là một chất mới và được đặt tên là novaeguinoside E. 3.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập từ loài Pentaceraster gracilis Phần này trình bày kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 07 hợp chất được phân lập từ loài P. gracilis PG2: Protoreasteroside PG1: Maculatoside PG3: Pentaceroside A (chất mới) PG4: Pentaceroside B (chất mới)
17 PG6: (5α,25S)-cholestane- PG5: Nodososide 3β,6α,8,15β,16β,26- hexol 3-O-[(2-O- methyl)-β-D-xylopyranoside] PG7: 5α-cholestane-3β,6α,7α,8β,15α,16β,26-heptol Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của một hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào ung thư. 3.2.1. Hợp chất PG1: Maculatoside Hợp chất PG1 cũng được phân lập từ loài sao biển sao biển Pentaceraster gracilis dưới dạng chất bột màu trắng. Bảng 4.4. Phổ NMR của PG1 Hb,d HMBC C a C Cb,c Dạng pic (J = Hz) (H  C) Aglycon 1 35,9 35,97 1,38 m/1,65 m 2 29,2 29,46 1,89 m/2,76 m 3 78,3 77,64 4,86 m 4 30,6 30,74 1,69 m/3,45 m 5 49,2 49,37 1,46 m 6 80,0 80,33 3,79 m 7 41,2 41,67 1,26 m/2,70 m 8 35,4 35,39 2,12 m 9 145,6 145,55 - 10 38,2 38,29 - 11 116,6 116,84 5,24 d (5,5) 8, 10, 13
18 12 42,6 42,79 2,14 m/2,35 m 13 41,6 41,61 - 14 54,0 54,07 1,33 m 15 22,6 22,58 2,08 m/2,48 m 16 25,3 25,38 1,30 m/1,84 m 17 55,1 55,06 2,40 m 18 13,4 13,63 1,13 s 12, 13, 14,17 19 19,2 19,29 0,96 s 1, 5, 9, 10 20 76,4 76,34 - 21 21,5 21,38 1,66 s 17, 20, 22 22 77,8 78,24 3,88 m 23 29,6 30,62 2,45 m 2,92 br dd (6,5, 13,5) 24 124,2 124,67 5,66 t (6,5) 25 131,8 131,79 - 26 17,4 18,02 1,67 s 24, 25, 27 27 25,6 25,92 1,68 s 24, 25, 26 Qui I 1 104,4 105,01 4,80 d (7,5) 6 2 74,1 74,16 3,98* 3 89,8 89,98 3,85* 4 74,3 74,53 3,57 t (9,0) 5 72,3 71,99 3,67* 6 17,8 18,47 1,55 d (6,0) 4, 5 Xyl 1 104,0 104,35 5,07 d (7,5) 3 2 82,7 82,20 4,10* 3 75,1 75,55 4,23* 4 78,3 78,62 4,18* 5 64,2 64,41 3,81*/4,49 dd (5,0, 12,0) Qui II 1 105,2 105,12 5,28 d (7,5) 2 2 75,6 75,61 4,08* 3 77,0 77,47 4,14* 4 76,0 75,96 3,64* 5 73,3 73,71 3,70* 6 17,8 17,98 1,77 d (6,0) 4, 5 Qui III 1 101,2 101,51 4,92 d (7,5) 4