Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx K. Schum) và cây Cát sâm (Millettia speciosa Champ.) ở Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

6
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của luận án "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx K. Schum) và cây Cát sâm (Millettia speciosa Champ.) ở Việt Nam" là sử dụng các dung môi thích hợp để chiết chọn lọc, thu được hỗn hợp các hợp chất từ thân rễ, hạt cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx) và từ thân rễ cây Cát sâm (Millettia speciosa Champ.); Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất trong hạt, thân rễ cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx) và thân rễ cây Cát sâm (Millettia speciosa Champ.); Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx K. Schum) và cây Cát sâm (Millettia speciosa Champ.) ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN THỊ HƢỜNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY BON BO (Alpinia blepharocalyx K. Schum) VÀ CÂY CÁT SÂM (Millettia speciosa Champ.) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ Mã số: 9440114 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Vinh - 2022
Công trình đƣợc hoàn thành tại Trƣờng Đại học Vinh Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Trần Đình Thắng 2. PGS.TS. Ngô Xuân Lƣơng Phản biện 1: GS.TS. Phạm Quốc Long Phản biện 2: PGS.TS. Đỗ Quang Huy Phản biện 3: TS. Lê Mai Hoa Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng đánh giá luận án cấp Trƣờng họp tại Trƣờng Đại học Vinh vào hồi …..giờ … ngày … tháng… năm 2022 Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: 1. Thƣ viện Quốc gia, Hà Nội 2. Trung tâm Thông tin - Thƣ viện Nguyễn Thúc Hào, Trƣờng Đại học Vinh
MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Trong những năm gần đây, đã có nhiều cây thuốc quý y học cổ truyền là đối tượng nghiên cứu thực nghiệm và nghiên cứu lâm sàng để điều trị ung thư, qua đó hàng loạt dược chất mới được phát hiện, trong đó có rất nhiều chất có triển vọng lớn trở thành các chất dẫn đường. Ngoài ra, các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc tự nhiên có thể được sử dụng trực tiếp trong y học, nhiều hợp chất khác được sử dụng như con đường chất lượng hoặc đại phân tử trong quá trình tổng hợp và bán tổng hợp thuốc. Cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx K. Schum) thuộc chi Riềng (Alpinia - họ Gừng (Zingiberaceae), nó được sử dụng trong dân gian làm thuốc chữa các loại bệnh như thấp khớp, đau lưng, đau tức ngực, đau dạ dày. Từ các bộ phận khác nhau của chi riềng người ta đã thu được tinh dầu, và phân lập được nhiều hợp chất thuộc các lớp như flavonoid,tecpenoit, diarylheptanoid, … Cây Cát sâm (Millettia speciosa Champ.) còn có tên khác như Sâm nam, Sâm sắn,… thuộc chi Millettia, họ Đậu (Fabaceae). Cát sâm là loài cây thuốc quý, theo các nghiên cứu trong và ngoài nước, củ Cát sâm (Millettia speciosa Champ.) có tác dụng như bồi bổ, tăng cường sức khỏe, bảo vệ gan, điều trị thiếu máu, Giảm đau nhức xương khớp. Giảm ho, cảm sốt. Đặc biệt củ Cát sâm (millettia speciosa Champ.) có tác dụng chống mệt mỏi đáng kể, và là một nguyên liệu tiềm năng cho ngành thực phẩm chức năng. Millettia speciosa có chứa nhiều các hoạt chất như alkaloid, terpenoid, phenolic, saccharide và những hoạt chất này đã làm cho loài có nhiều hoạt tính như bảo vệ gan, ngăn ngừa ho, chống hen suyễn, tăng cường khả năng miễn dịch, ngoài ra còn thể hiện hoạt tính chống viêm, chống oxi hóa, chống huyết khối, kháng u. Vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx K. Schum) và cây Cát sâm (Millettia speciosa Champ.) ở Việt Nam có ý nghĩa lớn, góp phần quan trọng trong việc tìm hiểu nguồn tài nguyên thiên nhiên và bảo tồn phát triển cho nguồn dược liệu thiên nhiên nước ta. Đó là lý do mà tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx K. Schum) và cây Cát sâm (Millettia speciosa Champ.) ở Việt Nam”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án - Sử dụng các dung môi thích hợp để chiết chọn lọc, thu được hỗn hợp các hợp chất từ thân rễ, hạt cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx) và từ thân rễ cây Cát sâm (Millettia speciosa Champ.). - Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất trong hạt, thân rễ cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx) và thân rễ cây Cát sâm (Millettia speciosa Champ.). - Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập được. 1
3. Những đóng góp mới của luận án Kết quả nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của hạt, rễ cây Bon bo (A. blepharocalyx) và rễ cây Cát sâm (Millettia speciosa), cho một số đóng góp mới như sau: - Ursolic acid (MS3), uvaol (MS5), pterocarpine (MS6) và gypenoside XVII (MS12) là các chất lần đầu tiên phân lập được từ loài Cát sâm (Millettia speciosa Champ.). - Thử hoạt tính sinh học các hợp chất AR1 –AR6 phân lập từ rễ Bon bo cho thấy chúng đều có khả năng kháng viêm. Đây là lần đầu tiên thử khả năng kháng viêm của các hợp chất này ở loài Bon bo. - Lần đầu tiên nghiên cứu docking phân tử khả năng ức chế enzyme α- glucosidase đối với các hợp chất phân lập được từ loài Cát sâm. Kết quả nghiên cứu cho thấy MS3, MS5 và MS11 có khả năng docking tốt hơn MS7. 4. Cấu trúc của luận án Luận án bao gồm 126 trang với 38 bảng số liệu, 17 hình và 06 sơ đồ với 135 tài liệu tham khảo. Phần mở đầu 02 trang, kết luận 02 trang. Nội dung luận án được chia làm 3 chương: Chương 1: Tổng quan (24 trang); Chương 2: Phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm (25 trang); Chương 3: Kết quả và thảo luận (60 trang). Luận án có 01 trang danh mục công trình công bố, 12 trang tài liệu tham khảo. Ngoài ra còn có phần phụ lục gồm 208 phổ của một số hợp chất chọn lọc. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN Phần tổng quan đã trình bày những nội dung sau: 1.1. Cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx K. Schum) 1.1.1. Đặc điểm thực vật của Bon bo (Alpinia blepharocalyx) 1.1.2. Thành phần hoá học của Bon bo 1.1.3. Hoạt tính sinh học của Bon bo 1.2. Cây Cát sâm (Millettia speciosa Champ.) 1.2.1. Đặc điểm thực vật (Millettia speciosa) 1.2.2. Thành phần hóa học của Cát sâm 1.2.3. Hoạt tính sinh học của Cát sâm CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.2. Các phương pháp xử lý mẫu thực vật và phương pháp chiết 2.1.3. Phương pháp phân lập 2.1.4. Các phương pháp phổ xác định cấu trúc hợp chất 2.2. Thiết bị, dụng cụ và hoá chất 2.2.1. Dụng cụ, thiết bị 2
2.2.2. Hóa chất 2.3. Nghiên cứu các hợp chất từ hạt Bon bo (A. blepharocalyx ) 2.3.1. Chiết, phân lập các hợp chất từ hạt Bon bo Lấy 9,0 kg mẫu hạt Bon bo phơi khô, đem nghiền nhỏ, rồi ngâm chiết ba lần với dung môi methanol tinh khiết (20L x 3) bằng thiết bị chiết siêu âm thu được dịch chiết, sau đó thu hồi dung môi bằng thiết bị quay cất chân không thu được 950 g cao chiết methanol. Cao methanol được phân bố trong nước và chiết lần lượt với dung môi hexane, ethyl acetate, butanol. Cất quay chân không để thu hồi dung môi thu được 3 cao chiết tương ứng: cao hexane (ASH, 20 g); cao ethyl acetate (ASE, 345 g); cao butanol (ASB, 189 g) và dịch nước (ASW, 126 g). Cao ethyl acetate (ASE) được thực hiện sắc ký cột trong pha tĩnh là silica gel, hệ dung môi rửa giải hexane : ethyl acetate (100 : 1– 0 : 100; v/v) thu được 8 phân đoạn (ASE1 – ASE8). Phân đoạn ASE2 (43 g) được phân tích bằng sắc ký cột silica gel bằng hệ dung môi rửa giải hexane:ethyl acetate (15 : 1) thu được sáu phân đoạn nhỏ (ASE2.1-ASE2.6). Phân đoạn nhỏ ASE2.1 (0,5 g) được tinh chế bằng cách sử dụng cột pha đảo RP-18 rửa giải bằng methanol : nước (9: 1, v/v) thu được hợp chất AS1 (35 mg). Phân đoạn nhỏ ASE2.5 (0,3 g) được tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải hexan : acetone (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 4:1) thu được hợp chất AS3 (22 mg). Phân đoạn ASE5 (29 g) được phân tích bằng sắc ký cột được rửa giải bằng chloroform : methanol (20: 1 - 10: 1, v/v) theo thứ tự tăng dần, thu được năm phân đoạn nhỏ (ASE5.1 - ASE5.5). Việc tinh chế các phân đoạn nhỏ ASE5.2 (1.2g) được thực hiện bằng cách sử dụng cột pha đảo RP-18 rửa giải bằng methanol/nước (3:1, v:v) thu được hợp chất AS2 (7 mg). Phân đoạn nhỏ ASE5.5 (1,5g) được xử lý bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi chloroform methanol (7 : 1, v/v) thu được hợp chất AS4 (15 mg). Cao butanol (ASB) được thực hiện sắc ký cột silica gel với hệ dung môi chloroform : methanol (100 : 1 – 0 : 1, v/v) thu được bảy phân đoạn (ASB1 - ASB7). Phân đoạn ASB4 (1,7 g), rửa giải bằng methanol : nước (3 : 1, v/v), được tinh chế bằng sắc ký cột pha đảo RP-18column thu được các hợp chất AS5 (28 mg) và AS6 (11 mg). Phân đoạn ASB2 (0,5 g); rửa giải bằng methanol : nước (1 : 1, v/v) được tinh chế bằng sắc ký cột sephadex LH-20 thu được hợp chất AS7 (15 mg). Phân đoạn ASB1 (0,8 g), rửa giải bằng chloroform : methanol (9 : 1, v/v), được tinh chế bằng sắc ký cột pha đảo RP-18 thu được hợp chất AS8 (75 mg) và tinh chế bằng sắc ký cột LH-20 thu được hợp chất AS9 (153 mg). 3
Hạt A. blepharocalyx (9,0 kg) Ngâm chiết với M (3 x 20 l) Cao methanol (950 g) C, W Cao ethyl acetate- ASE (345 g) Cao butanol- ASB (189 g) Dịch nƣớc -ASW (126 g) CC, Silica gel CC, Silica gel Hexan:acetone (100:1-0:1, v/v) Chlorofom:methanol (100:1-0:1, v/v) ASE2 ASE5 ASB1 ASB2 ASB4 (43 g) (29 g) (0,8 g) (0,5 g) (1,7 g) CC, Silica gel Hexan:ethy lacetate CC, Silica gel CC, Silica CC, Silica (15:1, v/v) Chlorofom:methanol Methanol:w (3:1, v/v) Methanol:w (1:1, (20:1 10:1, v/v) RP-18 CC, Silica gel v/v) , LH-20 Chlorofom:methanol (9:1, v/v) ASE2.1 ASE2.5 LH-20 AS7 (0,5 g) (0,3 g) (15 mg) ASE5.2 ASE5.5 AS5 AS6 (1,2 g) (1,5 g) AS9 (28 mg) (11 mg) Hexane:acetone (153 mg) RP-18 (100:0-4:1) CC, Silica gel Methanol : w RP-18 CC, Silica gel Chlorofom:methanol (9:1, v/v Methanol : w Chlorofom:methanol (9:1, v/v) (3:1, v/v) (7:1, v/v) RP-18 AS1 AS3 (35 mg) (22 mg) AS2 AS4 AS8 (7mg) (15 mg) (75 mg) Sơ đồ 2.1: Phân lập các hợp chất từ hạt Bon bo (A. blepharocalyx ) 4
2.4. Nghiên cứu phân lập các hợp chất từ rễ cây Bon bo (A. blepharocalyx ) 2.4.1. Chiết, phân lập các hợp chất từ rễ cây Bon bo Rễ Bon bo (A. blepharocalyx ) được làm sạch, phơi khô ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Sau đó đem nguyên liệu này này (8,5 kg) đem nghiền nhỏ và thực hiện ngâm chiết ba lần với dung môi methanol (MeOH) tinh khiết (20L x 3) bằng thiết bị chiết siêu âm, ở nhiệt độ 40-500C. Dịch chiết sau đó được thu hồi dung môi bằng thiết bị quay cất chân không, đã thu được cao chiết methanol (820 g). Cao methanol được phân bố trong nước và chiết lần lượt với hexane, chloroform và butanol, cất quay chân không để thu hồi dung môi, thu được 3 cao chiết tương ứng: cao hexan (ARH, 20 g); cao chloroform (ARC, 245 g); cao butanol (ARB, 161 g) và dịch nước (ARW, 126 g). Cao chloroform (ARC) được tiến hành sắc ký cột với pha tĩnh là silica gel, hệ dung môi rửa giải là hỗn hợp hexane : acetone (100: 1 - 0: 100, v/v) để thu được tám phân đoạn (ARC1-ARC8). Phân đoạn ARC1 (9,2 g) được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel rửa giải với hệ dung môi rửa giải hexane : acetone (100 : 0 – 4 : 1) để tạo ra bảy phân đoạn nhỏ (ARC1.1 - ARC1.7). Phân đoạn ARC1.5 được sắc ký lại trên cột silica gel (chloroform : methanol, theo tỉ lệ 15 : 1 – 2 : 1; v/v) thu được hợp chất AR7 (11,2 mg). Phân đoạn ARC2 (8,8 g) được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel rửa giải với hệ dung môi rửa giải hexane : acetone (6 : 1; v/v) thu được hợp chất AR4 (35 mg). Phân đoạn ARC5 (11,8 g) được rửa giải bằng hệ dung môi chloroform : methanol (15 : 1; v/ v) thu được hợp chất AR2 (19 mg). Phân đoạn ARC8 (33 g) được đưa vào sắc ký cột silica gel rửa giải bằng hệ dung môi hexane và ethyl acetate (15 : 1) tạo ra sáu phân đoạn nhỏ (ARC8.1 - ARC8.6). Phân đoạn ARC8.3 (6,8 g) được sắc ký lại trên cột silica gel (chloroform-methanol, theo tỉ lệ 10 : 1 – 2 : 1) để thu được hợp chất AR3 (8,7 mg). Cao butanol (ARB) được tiến hành sắc ký cột với silica gel thông thường và hệ dung môi ethyl acetate : methanol (100 : 1 – 0 : 100; v/v) thu được bảy phân đoạn (ARB1 - ARB7). Phân đoạn ARB2 (2,1 g) được rửa giải bằng hệ dung môi chloroform : methanol (9:1; v/v); được tinh chế bằng sắc ký cột pha đảo RP-18 thu được hợp chất AR1 (55 mg). Phân đoạn ARB4 (3,6 g) được thực hiện sắc ký cột trên silica gel và hệ dung môi chloroform : methanol (12 : 1; v/v) để thu được năm phân đoạn ARB4.1 – ARB4.5. Phân đoạn ARB4.3 (1,7 g) được sắc ký nhiều lần trên silica gel rửa giải bằng ethyl acetate : methanol (18 : 1, 15 : 1; v/v) để thu được các hợp chất AR5 (9,5 mg) và AR6 (15,8 mg). 5
6
2.5. Nghiên cứu phân lập các hợp chất từ rễ cây Cát sâm 2.5.1. Chiết, phân lập các hợp chất từ rễ Cát sâm Rễ Cát sâm được sấy khô bằng thiết bị sấy (5,3 kg); sau đó đem nghiền nhỏ và ngâm chiết với ethanol (10 L × 3 lần) trong thiết bị chiết siêu âm có gia nhiệt ở 600C. Dịch tổng được cho vào máy cô quay chân không thu hồi dung môi dưới áp suất thấp, thu được 575 g cao tổng. Thêm nước vào cao tổng, khuấy đều, rồi lần lượt chiết bởi các dung môi hexane, ethyl acetate, butanol; sau đó cất kiệt dung môi thu được các cao chiết tương ứng: cao hexane (MSH - 61 g); cao ethyl acetate (MSE - 129 g); cao butanol (MSB - 143 g) và dịch nước (MSW - 121 g). Cao hexane (MSH- 61 g) được phân tách trên cột silica gel (CC) (150 g, 150 cm x 10 cm) dung môi giải hấp là hexane : acetone (100 : 0; 50 : 1; 39 : 1; 30 : 1; 20 : 1; 15 : 1; 9 : 1; 4 : 1) thu năm phân đoạn (MSH1 - MSH5). Phân đoạn MSH2 tiếp tục được phân tách lại bằng sắc kí cột (80 g, 80 x 1,5 cm) dung môi giải hấp là hexane : ethyl acetate (15 : 1; 9 : 1; v/v) thu được hợp chất friedelin - MS1 (16,5 mg). Phân đoạn MSH5 sắc ký cột silica gel và dùng hệ dung môi hexane : acetone (15 : 1) thu được hợp chất -sitosterol - MS2 (60,1 mg). Cao ethyl acetate (MSE- 129 g) được sắc ký cột (300 g, 150 cm × 10 cm) với pha tĩnh là silica gel 60 (0,063 – 0,200 mm); pha động là hỗn hợp CHCl3 : MeOH (100 : 0, 20 : 1, 10 : 1, 5 : 1, 2 : 1, 1 : 1) thu được 10 phân đoạn (MSE1- MSE10). Phân đoạn MSE2 (20,6 g) tiếp tục tách lại bằng sắc ký cột nhỏ (80g, 80 x 1,5 cm) và hệ dung môi rửa giải hexane : ethyl acetate (3 : 7; v/v) thu được hợp chất ursolic acid - MS3 (12,8 mg). Phân đoạn MSE3 (18,3 g) được tách trên sắc ký cột (300 g, 80 × 3 cm), rửa giải bằng hỗn hợp n-hexane : acetone (15 : 1; v/v) thu được 3 phân đoạn MSE3.1- MSE3.3. Phân đoạn MSE3.2 tiếp tục phân tách bằng sắc kí cột (140 g, 80 × 1,5 cm), rửa giải bằng hexane : ethyl acetate (10 : 1; 7 : 1; v/v) thu được hợp chất rotundic acid - MS4 (14,2mg). Phân đoạn MSE3.3 được tách trên sắc ký cột (50 g, 80 cm x 1,5 cm) hệ rửa giải hexane:ethyl acetate (15 : 1; 7 : 1; v/v), thu được uvaol – MS5 (14,5 mg). Phân đoạn MSE4 (16,2 g) được tách trên sắc ký cột, và hệ dung môi rửa giải hexane : ethyl acetate (15;1) thu được Pterocarpin – MS6 (21,5 mg). Phân đoạn MSE6 (21,3 g) được tách trên sắc ký cột (100 g, 80 x 1,5 cm), với hệ dung môi rửa giải n-hexane : ethyl acetate (15:1 - 1:1), thu được pedunculoside – MS7 (10,2 mg). Phân đoạn MSE7 (17,9 g) tiếp tục phân tách bằng cột pha thường, rửa giải bằng CH2Cl2 : MeOH : H2O (tỉ lệ 15 : 2 : 1; v/v) thu được hợp chất 3-acetyl morolic acid – MS8 (8,7 mg). Cao butanol (MSB- 143 g) được sắc ký cột (150 cm × 10 cm) pha tĩnh là silica gel 60 (0,063 - 0,200 mm); pha động là hỗn hợp CHCl3 : MeOH : H2O (20 : 1; 10 : 1; 7 : 1; 5 : 1; 2 : 1; v/v) thu được 8 phân đoạn (MSB1 - MSB8). Đem phân đoạn MSB2 (2,9 g) đi sắc ký cột trên silica gel (300 g, 60 × 3 cm) và rửa 7
giải bởi chloroform : methanol (15:1, 8:1) thu được sinapyl alcohol 4-yl O- glucopiranoside – MS9 (52,0 mg). Phân đoạn MSB3 (27 g) trước tiên được phân giải bằng cách sử dụng cột Sephadex LH-20 được rửa giải bằng CHCl3 : MeOH (1 : 1) và tiếp theo được tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với dung môi rửa giải bằng CHCl3 : MeOH (20 : 1 – 5 : 1) để thu được năm phần nhỏ (MSB3.1 - MSB3.5). Phân đoạn MSB3.4 được sắc ký cột trên silica gel, với hệ rửa giải là CHCl3 : MeOH (20 : 1) và sau đó dùng sắc kí lớp mỏng (CHCl3 : MeOH = 20 : 1), thu được chất bột màu vàng là daidzein-7-yl O-β- D-glucopyranoside – MS10 (23,0 mg). Phân đoạn MSB4 được dùng sắc kí lớp mỏng (20 cm x 20 cm, độ dày 2,5 mm SiO2), rửa giải bằng hỗn hợp chloroform và methanol (8 : 1, 6 : 1) thu được rutin – MS11 (57,0 mg). Tinh chế các phần nhỏ MSB8 (12,6 g) bằng cách sử dụng RP-18, rửa giải cột bằng MeOH : H2O (45 : 55; v/v) thu được tám phân đoạn nhỏ (MSB8.1 - MSB8.8) . Phân đoạn MSB8.2 (2,7g) được phân lập bằng sắc ký lỏng điều chế (HPLC) (ZORBAX SB-C18 (5 μm; 21,2 x 100 mm); MeOH : H2O; 55:45, 10 phút, 10 ml/phút) thu được hợp chất gypenoside XVII - MS12 (6,2 mg). Phân đoạn MSB5 (12,6 g) được tách trên cột pha đảo RP-18, rửa giải bằng hỗn hợp MeOH : H2O (40 : 60; v/v) thu được hợp chất Betulinic acid – MS13 ( 8,7 mg). Phân đoạn MSB7(4,2g) được tách bằng sắc kí cột và rửa giải bởi hệ dung môi rửa giải chloroform : methanol (9 : 1) thu được chất Daucosterol - MS14 (53,7 mg). 8
9
10
2.6. Phƣơng pháp thử hoạt tính sinh học 2.6.1. Thử hoạt tính ức chế sản sinh NO in vitro của các hợp chất phân lập được 2.6.2. Thử nghiệm sinh học in vitro ức chế enzyme α-glucosidase và ức chế enzyme acetylcholinesterase 2.6.3. Nghiên cứu docking phân tử để chống ức chế α-glucosidase 2.6.4. Phân tích thống kê CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Hạt cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx) 3.1.1. Phân lập hợp chất Quá trình phân lập các chất từ hạt cây Bon bo được trình bày ở sơ đồ 2.1. Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi nghiên cứu thành phần hoá học từ dịch chiết methanol của hạt cây Bon bo bằng cách kết hợp các phương pháp chiết, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột silica gel, sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích với các hệ dung môi rửa giải khác nhau phù hợp với từng phân đoạn. Kết quả của quá trình nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.1. Bảng 3.1: Các hợp chất được tách ra từ hạt Bon bo (Alpinia blepharocalyx) Ký hiệu Khối lƣợng Tên chất CTPT hợp chất (mg) AS1 Flavokawain A C18H18O5 35,0 AS2 2', 6'-dihydroxy-4'-methoxychalcone C16H14O4 7,0 AS3 Nevadensin C18H16O7 22,0 AS4 Apigenin C15H10O5 15,0 AS5 Apigetrin C21H19O10 28,0 AS6 Luteoloside C21H20O11 11,0 AS7 Rutin C27H30O16 15,0 AS8 Polydatin C20H22O8 75,0 AS9 Luteolin-4’-yl O-β-D-glucopyranoside C21H20O11 153,0 3.2. Thân rễ cây Bon bo (Alpinia blepharocalyx) 3.2.1. Các hợp chất đƣợc phân lập từ thân rễ Bon bo Quá trình phân lập các chất từ rễ cây Bon bo được trình bày ở sơ đồ 2.2. Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi nghiên cứu thành phần hoá học từ dịch chiết methanol của rễ cây Bon bo bằng cách kết hợp các phương pháp chiết, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột silica gel, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích với các hệ dung môi rửa giải khác nhau phù hợp với từng phân đoạn. Kết quả của quá trình nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.10 11
Bảng 3.10: Các hợp chất được tách ra từ thân rễ cây Bon bo Ký hiệu Tên chất CTPT Khối lƣợng hợp chất (mg) 4-hydroxy-2-methoxy-phenyl 1-O- β -D-{3''-O- AR1 [4'-hydroxy -3'-methoxybenzoyl)]- C21H24O11 55,0 glucopyranoside AR2 Desmethoxyyangonin C14H12O3 19,0 AR3 Resveratrol C14H12O3 8,7 AR4 Zerumbone C15H22O 35,0 AR5 Bisdemethoxycurcumin C19H16O4 9,5 AR6 Demethoxycurcumin C20H18O5 15,8 AR7 Quercetin C15H10O7 11,2 3.3. Nghiên cứu phân lập các hợp chất từ rễ cây Cát sâm 3.3.1. Phân lập các hợp chất từ rễ cây Cát sâm Quá trình phân lập các chất từ rễ cây Cát sâm được trình bày ở sơ đồ 2.1. Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi nghiên cứu thành phần hoá học từ dịch chiết ethanol của rễ cây Cát sâm bằng cách kết hợp các phương pháp chiết, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột silica gel, sắc ký lỏng hiệu năng cao phân tích với các hệ dung môi rửa giải khác nhau phù hợp với từng phân đoạn. Kết quả của quá trình nghiên cứu được thể hiện ở bảng 3.18 Bảng 3.18: Các hợp chất được tách ra từ thân rễ cây Cát sâm Ký hiệu hợp Khối lƣợng Tên chất CTPT chất (mg) MS1 Friedelin C30H50O 16,5 MS2 -Sitosterol C29H50O 60,1 MS3 Ursolic acid C30H48O3 12,8 MS4 Rotundic acid C30H48O5 14,2 MS5 Uvaol C30H50O2 14,5 MS6 Pterocarpine C17H15O5 21,5 MS7 Pedunculoside C36H58O10 10,2 MS8 3-acetyl morolic acid C32H50O4 8,7 MS9 Syringin C17H24O9 52,0 MS10 Daidzin C21H20O9 23,0 MS11 Rutin C27H30O16 57,0 MS12 Gypenoside XVII C48H82O18 6,2 MS13 Betulinic acid C30H48O3 14,2 MS14 Daucosterol C35H60O6 53,7 3.3.2. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất từ Rễ cây Cát sâm 3.3.2.3. MS3 - Ursolic acid (lần đầu tiên phân lập được từ Cát sâm) Hợp chất MS3 được phân lập dưới dạng chất rắn kết tinh màu trắng. Công thức phân tử được xác định là C30H48O3 dựa trên phổ HR-ESI-MS có peak ở m/z 455,35271 [M-H]- (calculated C30H47O3: 455,35252). Quan sát phổ 1 H-NMR thấy có các tín hiệu đặc trưng của một triterpenoid khung urs-12-ene: một tín hiệu triplet tại H 5,23 (1H, t, J=3,5; H-12) đặc trưng cho proton của liên kết 12
đôi tại CH-12; một tín hiệu doublet doublet tại H 3,16 (1H, dd, J=11,0/4,5; H-3) đặc trưng cho proton nhóm methine gắn với oxi tại CH-3. Trên phổ 13C-NMR và phổ DEPT có sự xuất hiện của 7 nhóm methyl (C 15,4, 16,8, 16,9, 17,0, 21,1, 23,3 và 28,3 ppm), 9 carbon methylen (C 18,0, 22,9, 23,9, 27,0, 27,6, 30,2, 32,7, 36,4, và 38,8 ppm), 5 carbon methine (δC 38,5, 38,6, 47,1, 52,4 và 54,8 ppm). Ngoài ra, các tín hiệu cộng hưởng của hai nguyên tử carbon ở δc 78,9 và 125,7 ppm được gán cho carbon methine liên kết với -OH (C-3) và carbon olefinic (C-12) tương ứng. Hơn nữa, tín hiệu trường yếu tại δc 180,5 chứng tỏ có nhóm cacboxylic (C-28). Phân tích phổ HMBC cho thấy các tương tác giữa giữa proton H-18 (δH 2,20), H-16 (δH 2,05) và H-22 (δH 1,65) với carbon C-28 (δC 180,5), chứng tỏ C-28 gắn với C-17. Các tương tác này thể hiện rõ trên phổ HMBC của MS3. So sánh với các tài liệu [89], MS3 được xác định là acid ursolic. Bảng 3.21: Dữ liệu phổ NMR của MS3 Vị C# C* [89] H# (ppm) H* (ppm) [89] trí (ppm) (ppm) (độ bội, J = Hz) (độ bội, J = Hz) 1 38,9 38,8 1,68 (1H, m); 1,63 (1H, m) 2 26,7 26,7 1,62 (1H, m); 1,58 (1H, m) 3 78,9 78,5 3,16 (1H, dd, J=11,0; 4,5) 3,15 (1H, dd, J=10,9; 5,1 ) 4 38,7 38,6 5 55,6 55,5 0,74 (1H, m) 6 18,3 18,3 1,54 (1H, m); 1,40 (1H, m) 7 33,2 33,1 1,54 (1H, m); 1,35 (1H, m) 8 39,6 39,6 9 47,5 47,1 1,55 (1H, m) 10 37,0 36,9 11 23,2 23,2 1,94 (1H, m); 1,89 (1H, m) 12 125,7 125,7 5,23 (1H, t, J=3,5 ) 5,22 (1H, t, J=3,7 ) 13 138,4 138,4 14 42,1 42,0 15 28,1 28,0 1,91 (1H, m); 1,12 (1H, m) 16 24,2 24,1 2,05 (1H, m);1,64 (1H, m) 17 48,5 47,1 18 53,1 53,2 2,20 (1H, d, J=11,5 ) 2,20 (1H, d, J=11,3 ) 19 39,2 39,2 1,37 (1H, m) 20 39,2 39,2 0,98 (1H, m) 21 30,6 30,6 1,51 (1H, m); 1,33 (1H, m) 22 36,9 36,9 1,72 (1H, m); 1,65 (1H, m) 23 27,7 27,6 0,98 (3H, s) 0,97 (3H, s) 24 15,0 14,8 0,96 (3H, s) 0,95 (3H, s) 25 15,3 15,2 0,78 (3H, s) 0,77 (3H, s) 26 16,6 16,5 0,85 (3H, s) 0,84 (3H, s) 27 23,1 22,9 1,12 (3H, s) 1,25 (3H, s) 28 180,5 180,5 29 16,7 16,6 0,88 (3H, d, J=6,5 ) 0,88 (3H, d, J=6,2 ) 30 20,6 20,4 0,97 (3H, d, J=5,5 ) 0,96 (3H, d, J=6,6 ) 13
H (500 MHz trong CD3OD) và H* (400 MHz trong CD3OD) C (125 MHz trong CD3OD) và C* (100 MHz trong CD3OD) 30 29 20 21 19 12 18 17 22 11 OH 25 26 13 1 H 28 9 14 2 16 O 10 8 15 3 H 5 27 4 7 HO H 6 23 24 Ursolic acid - (MS3) 3.4. Thử hoạt tính sinh học 3.4.1. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ rễ Alpinia blepharocalyx K. Schum. Ức chế sự sản sinh ra NO trong tế bào RAW 264,7 được kích thích bởi lipopolysaccharide (LPS) của các hợp chất AR1 – AR6 phân lập từ rễ Bon bo được đánh giá bằng thử nghiệm Griess với giá trị IC50 từ 7,66 – 14,06µg/mL. Bảng 3.33: Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập từ rễ loài A. blepharocalyx. RAW264.7 Ký hiệu Hợp chất [IC50 (µg/mL)] 4-hydroxy-2-methoxy-phenyl 1-O-β-D-[3''-O-(4'- AR1 7,66 ± 0,51 hydroxy-3'-methoxybenzoyl)]-glucopyranoside AR2 Desmethoxyyangonin 5,46 ± 0,23 AR3 Resveratrol 9,90 ± 1,28 AR4 Zerumbone 12,71 ± 0,71 AR5 Bisdemethoxycurcumin 14,06 ± 0,33 AR6 Demethoxycurcumin 13,44 ± 0,46 Kết quả thăm dò hoạt tính sinh học các hợp chất được tách ra từ thân rễ của A. blepharocalyx cho thấy các hợp chất này có khả năng kháng viêm. 3.4.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ Millettia speciosa Thử nghiệm sinh học in vitro về anti-glucosidase, anti-AchE và ức chế sự sản sinh NO của các chất phân lập từ rễ M. speciosa trồng ở Việt Nam là thử nghiệm đầu tiên được nghiên cứu. 3.4.2.1. Ức chế sản sinh ra NO Ức chế sự sản sinh ra NO trong tế bào RAW 264,7 được kích thích bởi lipopolysaccharide (LPS) của các hợp chất phân lập được đánh giá bằng thử 14
nghiệm Griess ở khoảng nồng độ 0,8 - 500 µg/mL. Theo kết quả của thử nghiệm này, sự sản sinh ra NO đối với các hợp chất được thử nghiệm thì MS3, MS4, MS5, MS7, MS12 ở mức trung bình, tiếp theo là các hợp chất MS6, MS9 và MS11. Ursolic acid (MS3) là chất ức chế sự sản sinh NO tốt nhất. Bảng 3.34: Hoạt tính ức chế sản sinh ra NO của hợp chất phân lập từ Millettia speciosa Kí hiệu chất IC50 (µg/mL) Kí hiệu chất IC50 (µg/mL) 1- MS1 >500 7- MS6 228,90±18,6 2- MS4 241,33±8,2 8- MS9 303,10±11,0 3- MS7 273,10±8,2 9- MS10 >500 4- MS5 246,49±18,7 10- MS11 449,53±5,2 5- MS3 43,92 ± 3,7 PC 8,58±0,9 6- MS12 93,91±5,4 3.4.2.2. Ức chế enzyme α-glucosidase Trong số 10 hợp chất được phân lập, có bốn hợp chất (MS3, MS5, MS7 và MS11) ức chế enzyme α-glucosidase ở khoảng nồng độ 1–256 µg/mL. Đặc biệt, các hợp chất MS3, MS5 và MS11 cho thấy sự ức chế enzyme α- glucosidase tốt nhất với giá trị IC50 lần lượt là 1,10; 1,96 và 2,2 µg/mL (Bảng 3.35.). Ở 256 µg/mL, các hợp chất MS3, MS5 và MS11 ức chế enzyme α- glucosidase với mức ức chế tương ứng là 99,0%; 92,5% và 85,0% (Bảng 3.36.). Hợp chất MS3 gây ra sự ức chế 91,5% đối với enzyme α-glucosidase ở 4 µg/mL (Bảng 3.36.). Kết quả so sánh với hợp chất đối chứng Acarbose (IC50 = 169,8 µg/mL) cho thấy các hợp chất MS3, MS5 và MS11 có sự ức chế enzyme α-glucosidase mạnh. Hợp chất MS7 gây ra sự ức chế 60,5% đối với enzyme α- glucosidase ở 256 µg/mL (Bảng 3.34.) và IC50 là 184,89 µg/mL (Bảng 3.35). Bảng 3.35: Kết quả đánh giá hoạt tính (IC50) ức chế enzyme α-glucosidase bởi các hợp chất phân lập từ Millettia speciosa Hợp chất IC50 (µg/mL)a Fold change 1-MS1 > 256 < 0,663 2-MS4 > 256 < 0,663 3-MS7 184,89±10,05 0,918 4-MS5 1,96±0,09 86,632 5-MS3 1,10±0,05 154,363 6-MS12 > 256 256 256 256
Các hợp chất còn lại MS1, MS4, MS6, MS9, MS10, MS12 cho thấy rất ít hoặc không có sự ức chế đối với enzyme α-glucosidase ở khoảng nồng độ thử nghiệm. Ở 256 µg/mL, sự ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất đó được xác định là 23% (MS1); 33% (MS4); 34% (MS12); 25% (MS6); 12% (MS9) và 22% (MS10) tương ứng. (Bảng 3.34). Bảng 3.36: Sự ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất phân lập từ Millettia speciosa % ức chế Nồng độ (µg/mL) 1-MS1 2-MS4 3-MS7 4-MS5 5-MS3 6-MS12 256 23 33 60,5 92,5 99 34 64 20 4 32 85 98 21 16 13 1 9,5 83 91,5 17 4 1 1 3 76,5 95 5 1 1 1 1 37,5 48,5 1 % ức chế Nồng độ (µg/mL) 7-MS6 8-MS9 9-MS10 10-MS11 Acarbosea 256 25 12 22 85 72 64 12 9 10 82,5 23 16 3 8 4 78 18 4 3 1 0 74 5 1 0 0 0 34,5 0 a Acarbose: đối chứng dương. 3.4.2.3. Ức chế enzyme acetylcholinesterase Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học về ức chế enzyme acetylcholinesterase (AChE), cho thấy rutin (MS11) có khả năng ức chế enzyme AChE với IC50 là 256,0 µg/mL và ursolic acid (MS3) có khả năng ức chế AChE mạnh nhất với IC50 là 8,0 µg/mL. Tuy nhiên khả năng ức chế enzyme AChE của MS3 và MS11 yếu hơn nhiều so với đối chứng dương - donepezil (IC50 = 0,025 µg / mL) (Bảng 3.37). Các hợp chất khác thể hiện sự ức chế enzyme AChE yếu trong khoảng nồng độ thử nghiệm. Bảng 3.37. Nồng độ ức chế nửa tối đa (IC50) đối với sự ức chế enzyme AchE bởi các hợp chất phân lập từ Millettia speciose Kí hiệu chất IC50 (µg/mL) Kí hiệu chất IC50 (µg/mL) 1- MS1 >256 7-MS6 >256 2-MS4 >256 8-MS9 >256 3-MS7 >256 9-MS10 >256 4-MS5 >256 10-MS11 256 ± 7.89 5-MS3 8.0 ± 0.75 PCa 0.025 ± 0.007 6-MS12 >256 a PC: đối chứng dương - donepezil 16
3.4.3. Nghiên cứu docking phân tử khả năng ức chế enzyme α-glucosidase Các nghiên cứu docking phân tử đã được thực hiện để kiểm tra tương tác giữa α-glucosidase và các hợp chất có hoạt tính (MS3, MS5, MS7 và MS11). Kết quả nghiên cứu docking phân tử cho thấy hợp chất ursolic acid (MS3) có năng lượng liên kết tự do (- 9,1 kcal/mol) thấp hơn các hợp chất rutin (MS11) (-8,7 kcal/mol), uvaol (MS5) (-8,9 kcal/mol) và pedunculoside (MS7) (-5,0 kcal/mol). Ba hợp chất MS3, MS5 và MS11 đều có năng lượng liên kết tự do thấp hơn acarbose (-7,9 kcal/mol). Giá trị năng lượng gắn kết càng âm thì liên kết tương ứng càng bền. Do đó, kết quả cho thấy rằng các hợp chất có hoạt tính liên kết dễ dàng với α-glucosidase hơn là acarbose (Hình 3.3). Nhóm hydroxyl (C3-OH) của MS3 nằm ở túi kỵ nước, được bao quanh bởi các gốc của Asp215 và Glu277 tạo thành các liên kết phân cực bền vững (Hình 3.4A). Do đó, vị trí hoạt động không bị chiếm bởi các phân tử nước. Trước khi liên kết với chất ức chế, các phân tử nước này xúc tác quá trình thủy phân của enzyme với sự có mặt của glucose. Các phân tử nước cũng có nhiệm vụ bắc cầu các nhóm carboxylate của dư lượng xúc tác Glu và Asp, và tham gia vào quá trình thủy phân. Các phân tử nước khác được cho là tạo thành một bể chứa nước và cung cấp nước cho quá trình thủy phân tiếp theo. Vì vậy, môi trường xung quanh chủ yếu là kỵ nước, giúp tăng khả năng di chuyển của chúng. Tương tự, nhóm hydroxyl của MS5 (C28-OH) và MS11 (C7-OH) hình thành liên kết bền vững với Asp352, giúp không bị thay thế bởi các phân tử nước (Hình 3.4B và Hình 3.4C). Tuy nhiên, trong cấu trúc của hợp chất MS7, các nhóm hydroxyl không thể tạo ra tương tác phân cực với các amino acid trong túi kỵ nước (Hình 3.4D), do đó cho thấy hợp chất này có thể ức chế chức năng của các enzyme đích ở nồng độ cao hơn đối chứng dương (acarbose), phù hợp với kết quả của thử nghiệm kháng α-glucosidase trong in vitro. Hình 3.3: Hợp chất MS3 (màu xanh lá cây - hoạt động mạnh nhất) và acarbose (màu xám - kiểm soát) trong vị trí hoạt động của α-glucosidase 17
Bảng 3.38: Tương tác của các hợp chất mô phỏng docking phân tử Hợp chất Dƣ lƣợng tƣơng tác liên kết Hydrogen 3 - MS7 Ser157, Tyr158 (Unfavorable bump), Asp242, His280, Asp307 (Unfavorable bump), Pro312, Phe314, Arg315, Glu411 (Unfavorable bump). 4 - MS5 Leu313 (Unfavorable bump), Arg315, Asp352, Gln353. 5 - MS3 Tyr158 (Pi-Alkyl), Asp215, Val216 (alkyl), Glu277, Phe303 (Pi-alkyl), Arg315, Glu411 (Unfavorable bump). 10 - MS11 Ser157, Ser240, Asp242, Phe303 (pi-pi stacked), Asp307 (pi-anion), Phe314, Ser311, Agr315, Asp352, Gln353, Glu411, Arg442. PC (Acarbose) Asp69, Asp215, Ser240, Asp242, His280, Phe303, Pro312, Arg315 (Unfavorable bump), Arg442 (Unfavorable bump). Hình 3.4: Các hợp chất được gắn vào túi liên kết của enzyme α-glucosidase Một tương tác liên kết hydro quan trọng khác đã được quan sát thấy giữa các hợp chất được nghiên cứu với Tyr158, His280, và vòng 310–315 nằm ở lối vào của túi vị trí hoạt động. Phân tích chi tiết cho thấy hợp chất pedunculoside (MS7) có liên kết hydrogen với Ser157, Tyr158, Asp242, His280, Asp307, Pro312, Phe314, Arg315 và Glu411. Dư lượng của Arg315, Gln353 là tương tác chính giữa uvaol (MS5) và α-glucosidase. Hợp chất ursolic acid (MS3) tạo ra hai tương tác pi-alkyl với Tyr158, Phe303 và một alkyl với Val216, khác với uvaol (MS5), cho thấy tương tác này có thể làm tăng cường khả năng ức chế của hợp chất này. Hợp chất rutin (MS11) tạo thành một chất xếp chồng pi-pi (Phe303), một pi-anion (Asp307) và một số liên kết hydrogen trong tương tác với Ser157, Ser240, Asp242, Phe314 Ser311, Agr315, Gln353, Glu411, Arg442 (Bảng 3.38, Hình3.4). Các hợp chất MS3, MS5 đã được nghiên cứu về sự ức chế của α-glucosidase trong ruột của con người. Kết quả docking phân tử cho 18