Tóm tắt luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của lá cây Giá (Excoecaria agallocha L.) và cây Đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour.)

Chia sẻ: Minh Tú | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu nhằm 2 mục tiêu: Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cây Giá (Excoecaria agallocha) và Đơn lá đỏ (E. cochinchinensis); đánh giá tác dụng gây độc tế bào, hoạt tính kháng viêm và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của cặn chiết tổng và các hợp chất phân lập được nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của lá cây Giá (Excoecaria agallocha L.) và cây Đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour.)

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------------------------ Lại Hợp Hiếu NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LÁ CÂY GIÁ (Excoecaria agallocha L.) VÀ CÂY ĐƠN LÁ ĐỎ (Excoecaria cochinchinensis Lour.) Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số: 9.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội – 2021
2 Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS. TS. Ngô Đại Quang Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Văn Thanh Phản biện 1: …………………………………………………… Phản biện 2: ……………………………………………………. Phản biện 3: ……………………………………………………. Luận án sẽ được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án Tiến sĩ cấp Học viện họp tại Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Vào hồi: giờ ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Thư viện Quốc gia
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Trải suốt lịch sử nhân loại, nguồn sinh vật biển và nguồn thực vật đã trở thành nguồn nguyên liệu tiềm năng cho nghiên cứu phát hiện các biệt dược phục vụ chăm sóc sức khỏe cộng đồng. Hơn 70% thuốc chống ung thư trên thị trường hiện nay có nguồn gốc thiên nhiên hoặc được tổng hợp theo mẫu hình cấu trúc của hợp chất thiên nhiên. Song song bệnh ung thư hiện đang là vấn đề đau đầu của các nhà khoa học, các căn bệnh liên quan đến kháng sinh trước đây được điều trị bằng cách dùng các thuốc kháng sinh như penicillin, cephalosporin... Tuy nhiên, hiện nay đã xuất hiện tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh không những ở Việt Nam và cả trên thế giới, ngoài các nguyên nhân thường gặp như ở các quốc gia khác, còn có nguyên nhân từ thói quen tự chữa trị và “bắt chước” đơn thuốc của người dân. Chính những nguyên nhân này làm xuất hiện hiện tượng gọi là kháng kháng sinh. Kháng kháng sinh là tình trạng các vi sinh vật như vi khuẩn, vi rút, nấm và ký sinh trùng thay đổi cách thức hoạt động, làm cho các thuốc trị bệnh do chúng gây ra trở nên vô hiệu. Vai trò quan trọng của các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học đã được khẳng định từ các nền y học cổ truyền cho đến y học hiện đại. Giá trị của chúng không chỉ có công dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh mà vì còn có thể dùng làm nguyên mẫu hoặc cấu trúc dẫn đường cho sự phát hiện và phát triển nhiều dược phẩm mới. Trong việc nỗ lực điều tra, nghiên cứu và tìm kiếm nguồn dược liệu phục vụ cho các chương trình chăm sóc sức khỏe cộng đồng, việc thực hiện các nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất có nguồn gốc từ thiên nhiên có hoạt tính gây độc tế bào, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, các nguồn kháng sinh thế hệ mới… để ứng dụng trong phòng ngừa, chữa trị các bệnh ung thư, kháng sinh, kháng lao… là một trong những nhiệm vụ đặc biệt quan trọng đã và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm. Bên cạnh các nguồn tài nguyên thực vật có mạch trên đất liền, nguồn tài nguyên sinh vật biển, nguồn tài nguyên thực vật rừng ngập mặn và thực vật tham gia ngập mặn đã và đang trở thành đối tượng thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học trong lĩnh vực y sinh-dược học. Nhiệm vụ điều tra, tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học trong các loài thực vật thuộc rừng ngập mặn đã và đang được triển khai, đang được nhiều cơ sở nghiên cứu quan tâm và theo đuổi nghiên cứu. Vì vậy đề tài “Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của lá cây Giá (Excoecaria agallocha L.) và cây Đơn lá đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour.)” được thực hiện nhằm mục tiêu phát hiện được các hoạt chất có tiềm năng từ cây Giá và Đơn lá đỏ góp phần làm
2 rõ hơn những công dụng chữa bệnh trong y học cổ truyền đồng thời làm tăng giá trị khoa học của các cây này ở Việt Nam. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án  Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ cây Giá (Excoecaria agallocha) và Đơn lá đỏ (E. cochinchinensis).  Đánh giá tác dụng gây độc tế bào, hoạt tính kháng viêm và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của cặn chiết tổng và các hợp chất phân lập được nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án  Phân lập các hợp chất từ cây Giá và cây Đơn lá đỏ bằng các phương pháp sắc ký kết hợp. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý, hóa học.  Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính kháng viêm và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất phân lập được nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo. CHƢƠNG I. TỔNG QUAN Những nghiên cứu trên thế giới và trong nước về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Giá (E. agallocha) và cây Đơn lá đỏ (E. cochinchinensis). CHƢƠNG II. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1. Đối tƣợng nghiên cứu Hình II.1. Tiêu bản cây Giá Hình II.2. Tiêu bản cây Đơn lá đỏ
3 Mẫu thực vật được TS. Nguyễn Thế Cường (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) xác định tên khoa học, tiêu bản lưu tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật và Viện Hóa sinh biển. II.2. Phƣơng pháp nghiên cứu II.2.1. Phương pháp ngâm chiết Mẫu thực vật được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm sau đó được xay nhỏ, chiết siêu âm/hoặc ngâm ở nhiệt độ phòng với methanol. Dịch chiết gom lại và cô cạn dưới áp suất giảm thu được cặn chiết methanol. Cặn chiết này được hoà với nước rồi chiết lỏng lỏng với chloroform thu được cặn chiết CHCl3 và phần dịch nước. II.2.2. Phương pháp phân lập và tinh chế các hợp chất Việc ngâm chiết, phân lập, tinh chế các phần dịch chiết của cây Giá và Đơn lá đỏ được thực hiện bằng các phương pháp: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC) silica gel với các cỡ hạt khác nhau, sắc ký cột pha đảo RP-18 và sephadex LH-20... II.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học Cấu trúc của hợp chất được xác định bằng sự kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại: điểm nóng chảy (Mp), độ quay cực ([α]D), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối phun mù điện tử (ESI- MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân: phổ một chiều (1H NMR, 13C NMR và DEPT) và phổ 2 chiều (COSY, HSQC, HMBC và NOESY/ROESY). II.2.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học  Hoạt tính gây độc trên ba dòng tế bào ung thư người: tế bào ung thư vú ở người (MCF-7), ung thư phổi người (LU-1) và ung thư biểu mô người (KB) sử dụng phương pháp MTT và SBR.  Hoạt tính tính ức chế sản sinh NO trên tế bào đại thực bào RAW264.7 kích thích bởi LPS.  Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ. Tám chủng vi sinh vật kiểm định thử nghiệm là: hai chủng vi khuẩn Gram (–) (Escherichia coli ATCC 25922 và Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853), hai chủng Gram (+) (Bacillus subtillis ATCC 11774 và Staphylococcus aureus ATCC 11632), hai chủng nấm sợi (Aspergillus niger 439 và Fusarium oxysporum M42) và hai chủng nấm men (Candida albicans ATCC 7754 và Saccharomyces cerevisiae SH 20).
4 Chƣơng III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ II.1. Phân lập các hợp chất II.1.1. Phân lập các hợp chất từ cây Giá Lá cây Giá (Excoecaria agallocha, A: Acetone 2,5 kg khô) CC: Cột sắc ký D: Dichloromethane Siêu âm lặp lại 3lần với MeOH M: Methanol trong 45 phút, nhiệt độ 50-60oC. H: n-Hexane Cặn MeOH W: Nước cất (A, 200 g) Bổ sung nước (1L) CHCl3/H2O 1:1 Bổ sung CHCl3 (1L×3lần) Cặn CHCl3 (94 g) Phần H2O n-Hexane/60% Aq. MeOH Bổ sung EtOAc (1L×3lần) Cặn n-Hexane Cặn MeOH Cặn EtOAc Lớp H2O (H, 80 g) (C, 14 g) (E, 7 g) (W) n-Hexane, n-Hexane-acetone tăng dần độ phân cực 100:1, 70:1,...0:100 C-1 C-2 C-3 (2.6 g) ( 1.1 g) CC, Silica gel (10.1 g) HA 3:1, DA 4:1 C-3A C-3B C-3C RP-18, CC, RP-18, CC, MW 1:1 MW 1:2 EA-5 EA-3 (5,8 mg) (8 mg) Hình III.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết CHCl3 cây Giá Cặn EtOAc (E, 7 g) RP-18, CC, H2O-MeOH (2:1) E-1 E-2 E-3 E-4 (0,45 g) (1,5 g) (2,7 g) (2,24 g) Sephadex LH-20, CC MeOH- H2O (1:2) E-2B Silica gel CC, E-2A MeOH-CH2Cl2 (1:2) EA-9 (8,2 mg) E-3A E-3C E-3B 1. Sephadex LH-20 CC, (285 mg) (78 mg) Methanol-H2O (1:1) 2. RP-18 CC, Methanol-H2O (1:2) Sephadex LH-20 CC, Methanol-H2O (1:1) EA-6 EA-7 EA-4 (12 mg) (7 mg) (10,2 mg) Hình III.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết EtOAc cây Giá
5 Phần nƣớc Diaion HP-20 MeOH-H2O (gradient 0:100, 25:75, 50:50, v/v) W-1 W-2 W-3 W-4 Silica gel CC, CHCl3-MeOH (30:1, 20:1, v/v) W-3C W-3A W-3B W-3D YMC RP-C18 CC YMC RP-C18 CC MeOH-H2O (3:3, v/v) Acetone-H2O (1:3,5, v/v) W-3A1 W-3A2 W-3B1 W-3B2 W-3B3 Silica gel CC, Sephadex LH-20 Sephadex LH-20 n-Hexane-acetone (5:2) (MeOH-H2O, 1:2) (MeOH-H2O, 1:2) EA-8 EA-1 EA-2 (4 mg) (3,5 mg) (5 mg) Hình III.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ dịch chiết nước cây Giá II.3.2. Phân lập các hợp chất từ cây Đơn lá đỏ Hình III.4. Sơ đồ phân bố các phân đoạn từ cặn MeOH cây Đơn lá đỏ
6 Phần nƣớc Diaion HP-20 MeOH-H2O (gradient 0:100, 25:75, 50:50, v/v) W-1 W-2 W-3 W-4 (85 g) Silica gel CC, Silica gel CC, CHCl3-MeOH (50:1, 25:1, v/v) CHCl3-MeOH (30:1, 20:1, v/v) W-2A W-2B W-3A W-3B W-3C W-3D YMC RP-C18 CC Acetone-H2O (1:3,5, v/v) W-3B1 W-3B2 W-3B3 Sephadex LH-20 (MeOH-H2O, 1:2) EC-2 EC-6 (8 mg) (3 mg) Silica gel CC, n-Hexane-acetone (5:2); Sephadex LH-20, MeOH-H2O (1:1) EC-11 EC-10 EC-9 EC-8 (2,7 mg) (6,6 mg) (3 mg) (3 mg) Silica gel CC, CH2Cl2-MeOH-H2O (5:1:0,1); YMC RP-C18, MeOH-H2O (1:1) EC-5 EC-4 EC-3 EC-1 (5,5 mg) (2 mg) (2 mg) (2,2 mg) Silica gel CC, CH2Cl2-MeOH-H2O (6:1:0,05); Sephadex LH-20, MeOH-H2O (1:1) EC-13 EC-12 EC-7 (20 mg) (21 mg) (3 mg) Hình III.5. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phần nước của cây Đơn lá đỏ III.1.3. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất Phần này trình bày thông số vật lý và các dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ cây Giá và cây Đơn lá đỏ. III.2. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất phân lập đƣợc III.2.1. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây Giá Bảng III.1. Kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào của cặn chiết MeOH cây Giá Dòng tế bào thử nghiệm KB LU-1 MCF7 Mẫu % ức IC50 % ức IC50 % ức IC50 chế (µg/mL) chế (µg/mL) chế (µg/mL) Cặn chiết MeOH 81,90 19,77 85,03 15,23 65,38 57,57 Đối chứng dương (Ellipticine 10 97,18 0,39 96,35 0,50 95,73 0,48 µg/mL)
7 Kết quả sàng lọc cặn chiết MeOH cho thấy cặn chiết MeOH của cây Giá có khả năng ức chế lớn hơn 50% sự phát triển tế bào sống trên cả ba dòng tế bào ung thủ thử nghiệm là KB, LU-1 và MCF7. Chất đối chứng dương ellipticine hoạt động ổn định trong thí nghiệm. Các kết quả trên là chính xác với r2 ≥ 0,99. III.2.2. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của cây Giá Kết quả sàng lọc cặn chiết MeOH của cây Giá cho thấy chỉ có hoạt tính kháng một VSVKĐ của vi khuẩn Gram dương B. subtillis (MIC = 200 µg/mL). Các hợp chất phân lập được đã được thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trên tám chủng vi khuẩn bao gồm hai chủng vi khuẩn Gram (–): E. coli, P. aeruginosa, hai chủng vi khuẩn Gram (+): B. subtillis, S. aureus, hai chủng vi khuẩn nấm mốc: A. niger, F. oxysporum, hai chủng vi khuẩn nấm men: S. cerevisiae và C. albicans. Hợp chất blumenol A (EA-6) thể hiện hoạt tính kháng VSVKĐ trên chủng F. oxysporum (MIC = 50 µg/mL). Bảng III.3. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất và cặn chiết từ cây Giá Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (g/mL) Ký hiệu mẫu Gram (-) Gram (+) Nấm mốc Nấm men Ec* Pa* Bc* Sa* An* Fo* Sc* Ca* Streptomycin - - 7.188 14.375 - - - - (57,5 g/mL) Nystatin - - - - 23.125 11.563 5.781 11.563 (92,5 g/mL) Tetracyclin 5.5 11 - - - - - - (44 g/mL) EA-1 >50 - - - - - - >50 EA-2 - - >50 - >50 - - - EA-3 - - - - >50 - - - EA-4 - - >50 - - - - - EA-5 - >50 - - - 50 - - EA-6 - - - - - - - - EA-7 - - - - - - - - EA-8 - - - - - - - - EA-9 >50 - - - >50 - >50 - Cặn chiết - - 200 - - - - - MeOH # Nồng độ mẫu đầu tương đương với 0,1 mM; Streptomycin, nystatin và tetracyclin được sử dụng như những kháng sinh chuẩn. *Ec (Escherichia coli), Pa (Pseudomonas aeruginosa), Bc (Bacillus subtillis), Sa (Staphylococcus aureus), An (Aspergillus niger), Fo (Fusarium oxysporum), Sc (Saccharomyces cerevisiae) và Ca (Candida albicans). (-) Không xác định.
8 III.2.3. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của cây Đơn lá đỏ Bảng III.4. Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế quá trình sản sinh nitric oxide (NO) trên đại tế bào RAW264.7 của các hợp chất Nồng độ Hợp chất Ức chế (%) Tế bào sống (%) (µM) EC-1 38,72 ± 0,56 76,12 ± 1,36 EC-2 46,78 ± 0,35 78,89 ±1,32 EC-3 75,83 ± 0,77 86,65 ±1,54 EC-4 31,09 ± 1,60 56,49 ±0,97 EC-5 42,02 ± 1,01 75,51 ±1,52 EC-6 68,18 ± 0,67 73,59 ±0,67 EC-7 100 39,22 ± 1,07 78,60 ±2,18 EC-8 94,96 ± 0,26 80,41 ±1,66 EC-9 82,91 ± 1,03 83,19 ±2,37 EC-10 27,87 ± 0,81 84,55 ±0,98 EC-11 30,47 ± 0,69 82,91 ±1,43 EC-12 38,38 ± 0,19 70,16 ±1,77 EC-13 35,01 ± 0,76 55,50 ±2,54 Đối chứng 0,3 33,89 ± 0,51 95,35 ±0,75 dương (Cardamonin) 3 88,80 ± 0,51 86,00 ±1,55 Cardamonin được sử dụng như chất chuẩn chứng. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Bảng II.5. Kết quả IC50 của các hợp chất thể hiện hoạt tính Hợp chất Giá trị IC50 (µM) EC-3 13,80 ± 1,23 EC-6 58,10 ± 2,04 EC-8 6,17 ± 0,25 EC-9 12,02 ± 0,73 Đối chứng dương 1,57 ± 0,24 (Cardamonin) Cardamonin được sử dụng làm chất chuẩn dương. Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
9 CHƢƠNG IV. THẢO LUẬN KẾT QUẢ IV.1. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Giá IV.1.1. Hợp chất excoecarin L (EA-1, Chất mới) Hình IV.1. Cấu trúc của EA-1, tương tác COSY, HMBC chính và chất tham khảo Intens. +MS, 1.5min #90 x105 355.1761 3.0 343.1897 2.5 2.0 1.5 1.0 373.1984 0.5 397.2241 311.1806 325.1961 339.2025 382.1945 388.3920 0.0 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 m/z Hình IV.2. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất EA-1 Hợp chất EA-1 phân lập từ phân đoạn chloroform, có dạng bột màu trắng. Phổ HR-ESI-MS cho pic ion giả phân tử [M + Na]+ tại m/z 343,1897 (tính toán theo lý thuyết C19H28NaO4+, 343,1880), phù hợp với công thức phân tử C19H28O4. Trên phổ 13C NMR và phổ HSQC cho tín hiệu cộng hưởng của 19 carbon, gồm bốn carbon không liên kết với hydro, sáu nhóm methine, tám nhóm methylene và một nhóm methyl. Trong đó, các tín hiệu của hai carbon methine olefin [δC 135,5 (C-15) và 135,2 (C-16)], hai nhóm oxymethylene [δC 68,6 (C-17) và 69,4 (C-20)], một nhóm oxymethine [δC 71,1 (C-6)] và một carbon hemiketal [δC 98,6 (C-3)] cũng được nhận dạng. Phổ 1H NMR xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng của một nhóm methyl bậc hai tại δH 1,12 (3H, d, J = 7,0 Hz, H- 18), một proton oxymethine tại δH 3,75 (1H, ddd, J = 4,0, 11,0, 11,5 Hz, H-6), hai nhóm oxymethylene tại δH 3,40 (1H, d, J = 11,0 Hz, H- 17a)/3,45 (1H, d, J = 11,0 Hz, H-17b) và δH 3,80 (1H, dd, J = 5,0, 9,5 Hz, H-20a)/3,89 (1H, dd, J = 3,5, 9,5 Hz, H-20b), hai proton olefin thuộc một liên kết đôi hai lần thế tại δH 5,73 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-15) và δH 5,66 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-16) (Bảng IV.1).
10 Hình IV.3. Phổ 1H NMR của hợp chất EA-1 Hình IV.4. Phổ 13C NMR của hợp chất EA-1 Hình IV.5. Phổ HSQC của hợp chất EA-1
11 Hình IV.6. Phổ HMBC của hợp chất EA-1 Hình IV.7. Phổ COSY của hợp chất EA-1 Phân tích chi tiết các tương tác trên phổ HSQC, HMBC và COSY cho thấy hợp chất EA-1 có cấu trúc phẳng tương tự như hợp chất agallochin I (trước đó cũng được phân lập từ cây này), ngoại trừ sự có mặt thêm tín hiệu của một nhóm hydroxy tại vị trí C-17. Các tương tác xa HMBC giữa δH 3,40/3,45 (H-17) với δC 28,0 (C-12), 51,1 (C-13), 56,6 (C-14) và 135,2 (C- 16) cho thấy nhóm OH liên kết với C-17, trong khi đó các tương tác hai chiều trên phổ COSY giữa proton H-18/H-4/H-5/H6/H-7 một lần nữa khẳng định nhóm methyl liên kết với C-4 và nhóm hydroxy liên kết với C-6. Ngoài ra, sự dịch chuyển hóa học về phía trường yếu của carbon hemiketal tại δC 98,69 (C-3) kết hợp với các tương tác HMBC giữa δH 3,80/3,89 (H- 20) với δC 32,7 (C-1), 98,6 (C-3), 57,9 (C-5) và 37,5 (C-10) cho phép khẳng định liên kết cầu eter giữa C-20 với C-3 và nhóm hydroxy còn lại trong phân tử liên kết tại C-3 (Hình IV.5-IV.6).
12 Bảng IV.1. Số liệu phổ NMR (δ ppm) của EA-1 và hợp chất tham khảo # Vị trí δCa,b [35] δCc,d δCc,e (dạng pic, J = Hz) HMBC NOESY 1 31,2 32,7 1,27 (1H, m) 5, 10 20a 2,09 (1H, ddd, 3,5, 12,5, 12,5) 2 26,9 28,2 1,71 (1H, m) 18, 20a 2,02 (1H, ddd, 3,5, 12,0, 13,5) 3 3 98,3 98,6 - 4 41,5 42,7 1,96 (1H, m) 2, 3, 5, 6, 6 18 5 56,9 57,9 1,03 (1H, dd, 5,0, 11,0) 1, 4, 6, 10, 7a, 9 18, 19 6 69,5 71,1 3,75 (1H, ddd, 4,0, 11,0, 11,5) 4, 7b, 15, 20b 7 44,7 46,2 1,43 (1H, dd, 11,5, 13,0) 5, 6, 9, 5, 6, 8, 9, 1,85 (1H, dd, 4,0, 13,0) 14a, 14, 15 14b 8 49,4 50,2 - 9 44,5 46,4 1,20 (1H, dd, 4,5, 12,5) 1, 5, 8, 10, 5, 7a 14, 15, 19 10 36,3 37,5 - 11 20,7 21,4 1,08 (1H, m)/1,72 (1H, m) 8, 9, 13 20a 12 31,9 28,0 1,28 (1H, m)/1,36 (1H, m) 9, 11, 13, 14, 16 13 43,7 51,1 - 14 60,4 56,6 1,09 (1H, m) 7, 8, 9, 12, 7a, 7b 1,67 (1H, dd, 2,5, 9,5) 13, 15, 16, 17 17 15 133,3 135,5 5,73 (1H, d, 6,0) 8, 13, 14, 6, 16, 16 20b 16 137,9 135,2 5,66 (1H, d, 6,0) 15, 14, 13, 15 8 17 24,4 68,6 3,40 (1H, d, 11,0) 12, 13, 14, 14b 3,45 (1H, d, 11,0) 16 18 19,3 19,6 1,12 (3H, d, 7,0) 3, 4, 5 2b 20 68,5 69,4 3,80 (1H, dd, 5,0, 9,5) 1b, 2a, 3,89 (1H, dd, 3,5, 9,5) 1, 3, 5, 10 6, 11a, 15 a Đo trong CDCl3, b75MHz; cđo trong CD3OD, d125MHz, e500MHz. #δC số liệu phổ của agallochin I tham khảo tài liệu sô [35]. Cấu hình tương đối của hợp chất EA-1 được xác định dựa vào giá trị hằng số tương tác (JH-H) và các tương tác trên phổ NOESY. Các vị trí H- 5, H-6, H-7a và H-9 được xác định là axial do giá trị JH-H lớn (J = 11,0 -
13 Hình IV.8. Các tương tác NOESY của hợp chất EA-1 Hình IV.9. Phổ NOESY của hợp chất EA-1 12,5 Hz). Thêm nữa, các tương tác NOESY giữa proton H-5/H-9, H-1a, H- 7a; H-7a/H-14a, H-9; H-20b/H-15; H-15/H-16 và H-20a/H-11a, H-1b, H-2a xác nhận cấu hình khung beyer-15-ene diterpenoid. Cuối cùng, các tương tác giữa H-6/H-20b, H-15, H-4 và giữa H3-18/H-2b cho phép khẳng định cấu hình β của H-6 và H-4 (Hình IV.8-IV.9). Từ các phân tích phổ nêu trên, hợp chất EA-1 được xác định là 3β,20-epoxy-3,6α,17-trihydroxy-19-nor-beyer- 15-ene, đây là một chất mới và cũng là hợp chất dạng 19-nor-beyerene diterpenoid đầu tiên phân lập được từ cây E. agallocha và được đặt tên là excoecarin L. Chi tiết xác định cấu trúc 8 hợp chất còn lại trong Luận án và được tóm tắt Hình IV.26 dưới đây:
14 Hình IV.26. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập từ cây Giá IV.2. Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc từ cây Đơn lá đỏ IV.2.1. Hợp chất 6α,7α-epoxy-4β,5β,9α,13α-tetrahydroxy-rhamnofola-1,15- dien-3-one 20-O-β-D-glucopyranoside (EC-1, Chất mới) Hợp chất EC-1 phân lập được có dạng bột, màu trắng. Phổ HR- ESI-MS cho pic ion giả phân tử [M - H]- tại m/z 541,2297 (tính toán theo lý thuyết C26H37O12-, 541,2291), 577,2063 [M + Cl]- (tính toán theo lý thuyết C26H38ClO12-, 577,2057) và 587,2346 [M + HCOO]- (tính toán theo lý thuyết C27H39O14-, 587,2345), phù hợp với công thức phân tử C26H38O12 (Hình IV.28). Hình IV.27. Cấu trúc của EC-1 và hợp chất tham khảo
15 Hình IV.28. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất EC-1 Hình IV.29. Phổ 1H NMR của hợp chất EC-1 Hình IV.30. Phổ 13C NMR của hợp chất EC-1 Phổ 13C NMR và phổ HSQC cho tín hiệu cộng hưởng của 26 carbon, bao gồm sáu carbon không liên kết với hydro, 13 nhóm methine, bốn nhóm methylene và ba nhóm methyl. Phân tích độ chuyển dịch hóa học của các tín hiệu cho phép nhận dạng một nhóm carbonyl [δC 209,9 (C-3)], bốn carbon olefin [δC 163,0 (C-1), 134,7 (C-2), 145,9 (C-15) và 117,2 (C-16)], sáu carbon thuộc một gốc đường glucose [δC 104,8 (carbon anome, H-1'), 75,2 (C-2'), 78,0 (C-3'), 71,6 (C-4'), 78,0 (C-5') và 62,8 (C-6')], ba carbon không
16 mang hydro liên kết với oxy [δC 74,7 (C-4), 64,6 (C-6) và 77,3 (C-9)], ba nhóm oxymethine [δC 68,1 (C-5) và 62,3 (C-7) và 71,4 (C-13)], cùng với một nhóm oxymethylen [δC 74,2 (C-20)]. Phổ 1H NMR cho tín hiệu của hai nhóm methyl [δH 1,70 (3H, s, H-17) và 1,76 (3H, d, J = 2,0 Hz, H-19)], một nhóm methyl bậc hai [δH 0,96 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-18)], một proton olefin thuộc một liên kết đôi ba vị trí thế [δH 7,66 (1H, br s, H-1)], hai proton olefin khác thuộc một liên kết đôi dạng >C=CH2 [δH 4,98 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-16a)/5,04 (1H, br s, H-16b), một proton anome của gốc đường glucose có cấu hình β [δH 4,33 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1') và các tín hiệu của các nhóm oxymethine/oxymethylene trong vùng dịch chuyển hóa học từ δH 3,20 – 4,20 ppm (Hình IV.28-IV.29). Hình IV.31. Các tương tác COSY, HMBC và NOESY chính của EC-1 Hình IV.31. Phổ HSQC của hợp chất EC-1 Hình IV.32. Phổ HMBC của hợp chất EC-1
17 Hình III.33. Phổ COSY của hợp chất EC-1 Hình III.34. Phổ NOESY của hợp chất EC-1 Phân tích chi tiết các phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều HSQC, COSY, HMBC cho thấy cấu trúc phần aglycon của EC-1 có nhiều vị trí tương đồng với hợp chất venenatin (EC-2) cũng được phân lập từ cây Đơn lá đỏ (E. cochinchinensis), ngoại trừ sự khác nhau ở các vị trí C-13 và C-14 (Bảng IV.9). Ở hợp chất EC-2, vị trí C-13 là carbon không liên kết với hydro có hai nhóm thế là hydroxy và isopropenyl, vị trí C-14 có một nhóm hydroxy, còn ở hợp chất EC-1 vị trí C-13 có 1 nhóm hydroxy và vị trí C-14 có một nhóm isopropenyl. Hơn nữa, các tương tác COSY giữa proton H-7/H-8/H- 14/H-13/H-12/H-11/H-8 và các tương tác HMBC giữa H-17 với C-14, C-15, C-16, giữa H-16 với C-14, C-15, C-17, giữa H-8 với C-9, C-11, C-13, C-14, C-15 đã khẳng định nhận định trên cũng như cấu trúc vòng C. Gốc đường glucose liên kết với aglycon ở vị trí C-20 nhờ các tương tác HMBC giữa H-1' với C-20 và H-20 với C-1'. Ngoài ra, các tương tác COSY và HMBC khác trong hình dưới đã khẳng định cấu trúc phẳng của vòng A và B trong phân tử EC-1. Với cấu hình phẳng xác định được như trên cho thấy EC-1 là một diterpenoid dạng khung rhamnofolane trong khi hợp chất EC-2 thuộc dạng khung daphnane. Trong thực tế cả ba dạng khung rhamnofolane, daphnane, tigliane đều có cấu trúc ba vòng A, B và C tương tự nhau dạng [5-7-6] tricyclic và chỉ khác nhau vị trí thế của nhóm isopropyl.
18 Bảng IV.9. Số liệu phổ NMR (δ ppm) của EC-1 và hợp chất tham khảo Vị Venenatin δHa,c (dạng pic, J = δCa,b HMBC COSY NOESY trí [106] Hz) 1 162,2 163,0 7,66 (1H, br s) 2, 3, 4, 10, 10 10, 18 19 2 135,5 134,7 - 3 209,9 209,9 - 4 74,6 74,7 - 5 70,5 68,1 4,30 (1H, br s) 3, 6, 7, 20 10 6 64,0 64,6 - 6, 8, 9, 14, 8, 17, 7 65,4 62,3 3,19 (1H, br s) 8 20 20a 8 39,1 40,0 3,10 (1H, br d, 12,5) 6, 7, 9, 11, 7, 14 7, 11, 13, 14, 15 13 17 9 79,8 77,3 - 10 51,0 51,5 4,15 (1H, dd, 2,5, 3,0) 9 1 1, 5 11 39,5 39,4 2,10 (1H, m) 18, 12 8, 12a 12 39,1 41,1 1,60 (1H, m) 9, 11, 13, 11, 13 11, 13 1,73 (1H, m) 14, 18 8, 12a, 13 75,4 71,4 3,52 (1H, m) 15 12, 14 17 2,80 (1H, dd, 10,0, 8, 13, 15, 14 79,4 54,2 8, 13 16a 12,5) 16, 17 15 147,2 145,9 - 16 114,7 117,2 4,98 (1H, d, 2,0) 15, 17 14, 17 5,04 (1H, br s) 7, 8, 13, 17 19,3 18,9 1,70 (3H, s) 14, 15, 16 16b 18 18,3 18,9 0,96 (3H, d, 7,0) 9, 11, 12 11 1 19 9,9 9,9 1,76 (3H, d, 2,0) 1, 2, 3 20 65,0 74,2 3,45 (1H, d, 11,0) 5, 6, 7, 1' 7 4,27 (1H, d, 11,0) 1' - 104,8 4,33 (1H, d, 7,5) 20 2' 2' - 75,2 3,20 (1H, *) 1' 1', 3' 3' - 78,0 3,36 (1H, *) 4' 2', 4' 4' - 71,7 3,27 (1H, *) 3' 3', 5' 5' - 78,0 3,26 (1H, m) 4', 6' 6' - 62,8 3,64 (1H, dd, 5,5, 5' 5' 12,0) 3,86 (1H, dd, 1,0, 12,0) a Đo trong CD3OD, b125 MHz, c500 MHz. *Tín hiệu chập pic. Tham khảo số liệu phổ 13C NMR của venenatin theo tài liệu số [106].