Tóm tắt luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Xáo tam phân (Paramignya trimea (Oliv.) Guill.) và cây Nhó đông (Morinda longissima Y. Z. Ruan)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:21

Thêm vào BST

Báo xấu

32
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Muc tiêu của đề tài là phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất từ thân và rễ loài Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.) và Nhó đông (Morinda longissima Y. Z. Ruan), nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan và kháng virus viêm gan B của cao chiết và các hợp chất sạch.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Xáo tam phân (Paramignya trimea (Oliv.) Guill.) và cây Nhó đông (Morinda longissima Y. Z. Ruan)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ -------------------------------- TRẦN THU HƯỜNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY XÁO TAM PHÂN (PARAMIGNYA TRIMERA (OILV.) GUILL.) VÀ CÂY NHÓ ĐÔNG (MORINDA LONGISSIMA Y. Z. RUAN) Chuyên ngành: Hóa học các hợp chất thiên nhiên Mã số chuyên ngành: 9.44.01.17 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội, 2020 1
Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: PGS. TS. Nguyễn Mạnh Cường Người hướng dẫn khoa học 2: PGS. TS. Đỗ Thị Thảo Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: …. Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ ..’, ngày … tháng … năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam 2
MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Ở Việt Nam, hiện bẩy loài Paramignya phân bố chủ yếu ở miền nam. Loài Paramignya trimera (Oliv.) Guill.) có tên địa phương là thần dược và Xáo tam phân Cây là cây đặc hữu ở Việt Nam. Thân và rễ của cây được được dùng để điều trị các bệnh về gan, đặc biệt là xơ gan Morinda longissima Y. Z. Ruan (Rubiaceae) là loài cây nhỏ phân bố chủ yếu ở khu vực phía bắc Việt Nam. Đồng bào Thái tỉnh Sơn La và Lai Châu sử dụng thân rễ và rễ cây để chữa các bệnh về gan, viêm và phù nề. Do đó, nhiệm vụ nghiên cứu và thành phần hóa học của thân và rễ loài Xáo tam phân và Nhó đông ở nước ta là quan trọng và cần thiết. Từ đó, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Xáo tam phân (Paramignya trimea (Oliv.) Guill.) và cây Nhó đông (Morinda longissima Y. Z. Ruan)”. 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án - Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một số hợp chất từ thân và rễ loài Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guill.) và Nhó đông (Morinda longissima Y. Z. Ruan). - Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan và kháng virus viêm gan B của cao chiết và các hợp chất sạch. 3. Những nội dung nghiên cứu chính của luận án - Đánh giá tác dụng bảo vệ gan và tác dụng kháng virus viêm gan B của các cao chiết tổng. - Phân lập các hợp chất từ thân và rễ loài Xáo tam phân và Nhó đông - Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập. - Đánh giá tác dụng bảo vệ gan và kháng virus viêm gan B của một số hợp chất sạch Bố cục của Luận án: Luận án bao gồm 139 trang với 45 bảng, 21 hình, 4 sơ đồ phân lập và 137 tài liệu tham khảo. Luận án bao gồm 4 chương: Giới thiệu (2 trang), Chương 1: Tổng quan (28 trang); Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (02 trang); Chương 3: Kết quả (10 trang), Chương 4: Thảo luận (83 trang); Kết luận (2 trang); Kiến nghị (1 trang); Các bài báo liên quan đến luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (15 trang); Phụ lục (31 trang). 3
CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN Phần tổng quan này đã đề cập đến những vấn đề sau: - Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Paramignya. - Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Morinda. - Tổng quan về kỹ thuật đánh giá tác dụng bảo vệ gan và kháng virus viêm gan B. CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Thân và rễ cây Xáo tam phân (Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum) (C-499) được thu hái vào tháng 2/2013 tại xã Ninh Vân, huyện Ninh Hòa, tỉnh Khánh Hòa. Thân và rễ cây Nhó đông (Morinda longissima Y. Z. Ruan) (C-547) được thu hái vào tháng 4/2013 tại xã Chiềng An, tỉnh Sơn La. Tên khoa học của hai loài cây trên được xác định bởi TS. Nguyễn Quốc Bình, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, Viện KH&CN Việt Nam. Mẫu tiêu bản của hai cây được lưu trữ tại phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, kí hiệu mẫu là C-499 và C-547. 2.2. Phương pháp Phương pháp hóa học Phương pháp sắc ký bản mỏng TLC, phương pháp phân lập bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường, pha đảo, Diaion HP-20, Sephadex LH-20. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập ra được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp vật lý và hóa học, sử dụng các phương pháp phổ bao gồm phổ ESI-MS, HR-ESI-MS, 1D và 2D-NMR. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học Các cặn chiết và các hợp chất sạch được đánh giá bằng các phương pháp sau: - Tác dụng kháng virus viêm gan B (HBV) trên in vitro trên dòng HepG2.2.15 nhiễm HBV dựa trên giá trị ức chế mức độ biểu hiện HBsAg (IC50) - Đánh giá tác dụng bảo vệ gan in vivo trên chuột BALB/c trên mô hình gây độc gan bằng paracetamol. 4
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Đánh giá tác dụng sinh học của các cao chiết và phân đoạn 3.2. Phân lập các hợp chất từ loài Xáo tam phân Từ thân rễ cây Xáo tam phân đã phân lập và xác định cấu trúc của 10 hợp chất, gồm 5 coumarin, ostruthin (PT-1), ninhvanin (PT-2, mới), 6-(6-hydroxy-3,7-dimethylocta-2,7-dienyl)-7- hydroxycoumarin (PT-6), ninhvanin B (PT-7, mới), hai hợp chất biscoumarin monoterpen glycosides, paratrimerin A (PT-8, mới) và paratrimerin B (PT-9, mới), 01 cromen, 6-(2-hydroxyethyl)-2,2- dimethyl-2H-1-benzopyran (PT-3),01 alcaloid, citrusinine-I (PT- 4),01 ancol, paramitrimerol (PT-5, mới) và 01 hợp chất limonoid glucoside mới, parabacunoic acid (PT-10, mới). Các đặc điểm, tính chất và các thông số phổ của 10 hợp chất phân lập được được trình bày ở phần này. 3.3. Phân lập các hợp chất từ loài Nhó đông Từ thân rễ loài Nhó đông đã phân lập và xác định cấu trúc của 22 hợp chất gồm: 12 hợp chất anthranoid, damnacanthal (ML-1), lucidin-ω-methyl ether (ML-2), soranjidiol (ML-3), morindone -5- methyl ether (ML-4), rubiadin (ML-5), rubiadin-3-methyl ether (ML-6), damnacanthol (ML-7), morindone (ML-8), 1-hydroxy-2- methyl-6-methoxy anthraquinone (ML-9), morindone-6-methyl ether (ML-10), morindone-6-O-β-gentiobioside (ML-11), lucidin-3-O-β- primeveroside (ML-12), 02 naphtalen glycosid mới, morinlongoside A (ML-13, mới), morinlongoside B (ML-14, mới), 02 iridoid glycosid, morinlongoside C (ML-15, mới), geniposidic acid (ML- 16), 05 hợp chất glycosid, 3-O-[β-D-xylopyranosyl-(1-6)-β-D- lucopyranosyl]-(3R)-l-octen-3-ol (ML-17), acteoside (ML-18), cistanoside E (ML-19), ethyl-β-D-galatopyranoside (ML-20), isoacteoside (ML-21) và một flavonoid quercetin (ML-22). Đặc điểm, tính chất và các thông số phổ của 22 hợp chất phân lập được trình bày tại phần này. 3.4. Đánh giá tác dụng sinh học của các hợp chất sạch 5
CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ Chương này trình bày về thảo luận về các kết quả về đánh giá tác dụng sinh học các cao chiết và phân đoạn, về phân lập và xác định cấu trúc của các hợp chất và hoạt tính sinh học của các hợp chất sạch. 4.1. Đánh giá tác dụng sinh học của các cao chiết và phân đoạn 4.1.1. Đánh giá tác dụng kháng viêm gan virus B Bảng 4. 1. Ảnh hưởng của các cao chiết đến khả năng sống của tế bào HepG2.2.15 stt Loài Mẫu Ký hiệu Giá trị OD % sống sót 1 　Mẫu trắng 0,049 　 2 　DMSO 0,805 100 3 P.trimera cao chiết MeOH PT 0,920 114,23 4 PR P. trimera cao nước 0,799 99,27 5 P. trimera phân đoạn dianion của PR1 cao nước 0,811 100,70 6 P. trimera phân đoạn dianion của PR2 cao nước 0,832 103,31 7 P. trimera phân đoạn dianion của PR3 cao nước 0,895 111,13 8 P. trimera phân đoạn dianion của PR4 cao nước 0,805 100,02 9 P.trimera phân đoạn dianion của PR5 cao nước 0,192 23,84 10 ML M. longissima EtOH extract 0,86 102,25 11 W M. longissima cao chiết nước 0,82 107,28 - Có 8 cao chiết cho tỷ lệ sống của tế bào HepG2.2.15 trên 80%, các cao này được đánh giá tiếp khả năng ức chế mức độ biểu hiện kháng nguyên bề mặt HBsAg. Bảng 4. 2. Khả năng ức chế biểu hiện HBsAg trên tế bào HepG2.2.15 của các cao chiết STT Phân đoạn Giá trị OD Mức độ biểu Ký hiệu Nồng độ SE (450nm) hiện HBsAg ( %) 1 Mẫu trắng 　 0,190 0,140 0 2 DMSO 0 µM 1,228 0,016 100 3 Lamivudine 50 µM 0,635 0,022 42,86 4 PT cao chiết MeOH 60 µg/ml 1,351 0,026 111,88 6
5 PR cao nước 60 µg/ml 1,647 0,066 140,37 6 phân đoạn PR1 dianion của cao 60 µg/ml 1,393 0,011 115,89 nước 7 phân đoạn PR2 dianion của cao 60 µg/ml 1,406 0,016 117,19 nước 8 phân đoạn PR3 dianion của cao 60 µg/ml 1,310 0,035 107,93 nước 9 phân đoạn PR4 dianion của cao 60 µg/ml 1,269 0,014 103,98 nước 10 ML EtOH extract 60 µg/ml 0,91 0,028 69,37 11 W cao chiết nước 60 µg/ml 1,051 0,06 85,04 Kết quả cao etanol và cao nước của loài Nhó đông có tác dụng làm giảm mức độ biểu hiện của HBsAg của tế bào HepG2.2.15. Bảng 4. 3. Nồng độ ức chế biểu hiện HBsAg trên tế bào HepG2.2.15 của các cao chiết Nồng độ Abs 450 SE Ức chế (%) IC50 (μg/ml) Trắng 　 0,071 0,007 0 DMSO 0 µM 1,911 0,018 100 Lamivudine 50 µM 0,905 0,040 45,30 19,92±0,18 　ML 15 µg/ml 1,856 0,001 97,02 30 µg/ml 1,754 0,081 91,48 146,90±30,17 60 µg/ml 1,567 0,129 81,31 　 7,5 µg/ml 1,966 0,000 102,98 　W 7,5 µg/ml 1,917 0,008 100,34 15 µg/ml 1,894 0,038 99,09 297,76±58,14 　 30 µg/ml 1,843 0,028 96,29 　 60 µg/ml 1,841 0,107 90,77 　 Cao tổng etanol (ML) và cao nước (W) của thân và rễ loài Morinda longissima có tác dụng kháng HBV trên in vitro. 4.1.2. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên in vivo - Cao metanol và cao nước rễ Xáo tam phân có tác dụng bảo vệ gan trên mô hình chuột BALB/c bị nhiễm độc paracetamol. Bảng 4. 4. Ảnh hưởng của cao metanol và cao nước lên nồng độ aminotransferase huyết thanh Lô Thuốc và liều lượng AST (UI/L) ALT (UI/L) 1 Đối chứng sinh lý 87,80 ± 1,48 28,70 ± 2,59 715,75 ± 253,94 558,25 ± 296,54 2 Đối chứng bệnh lý p
116,50 ± 34,65 81,25 ± 8,59 3 cao metanol 10g/kg p0,05 so với (5) 266,00 ± 170,92 113,25 ± 27,41 4 cao nước liều 10g/kg p
PT-6 6-(6-hydroxy-3,7-dimethylocta-2,7-dienyl)- PT-7 (ninhvanin B) mới, C19H22O4, 314 7-hydroxycoumarin, C19H22O4, 314 PT-9 (paratrimerin B) mới, C40H44O16, 780 PT-10 (axit parabacunoic) mới, C32H44O13, 636 PT-8 (paratrimerin A) mới, C45H52O20, 912 Hợp chất PT-8 được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng, tan trong các dung môi hữu cơ như axeton, clorofom, [α]D25 - 25,0o(c 0,02, MeOH). Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI- MS với hai peak ion giả phân tử ở m/z 781,2691 [M+H]+ và 803,2548 [M+Na]+ cho biết công thức phân tử của PT-8 là C40H44O16. Ion mảnh ở m/z 457,1637 [M-C12H20O10 +H]+ cho thấy hợp chất PT-8 là một mono-coumarin glucoside. Phổ IR với các tần số dao động hóa trị νmax 3379 và 1646 cm- 1 chứng minh sự có mặt của các nhóm chức OH và Cacbonyl CO lacton. Phổ UV-Vis cho thấy sự có mặt của hệ liên hợp chromophore (coumarin) ở νmax 204, 256, 292, 330 nm. Trên phổ 13C-NMR/DEPT của PT-8 xuất hiện tín hiệu 40 cacbon, gồm 12 nguyên tử cacbon bậc bốn, 22 nhóm metin (có 8 cacbon trong khoảng 74-79 ppm), 4 nhóm metilen (có hai cacbon trong khoảng 62,4-62,8 ppm), và 2 nhóm metyl. Phổ 1H-NMR của PT-8 có xuất hiện các tín hiệu proton của hai vòng coumarin thế ở vị trí C-6,7 với hai cặp proton thơm dạng duplet-ortho H-3 (δH 6,28, d, 9,5 Hz)/H-4 (δH 7,95, d, 9,5 Hz); và H- 3' (δH 6,22, d, 9,5 Hz)/H-4' (δH 7,88, d, 9,5 Hz), bốn proton thơm dạng singlet H-5 (δH 7,47, s) và H-8 (δH 7,03, s), H-5' (δH 7,39, s) và H-8' (δH 7,09, s). Hình 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất PT-8 9
Cấu trúc gồm hai coumarin thế ở vị trí C-6,7 của PT-8 được khẳng định một lần nữa qua các tương tác trên phổ COSY, HMBC, NOESY (Hình 4,12). Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR của PT-8 có xuất hiện các tín hiệu của hai đơn vị đường β-D-glucose, cụ thể là hai proton anomer δH 4,99 (H-1''), 4,93 (H-1'''), hai cacbon anomer 102,49 (C-1'''), 101,62 (C-1''), 8 nhóm metin gắn với oxi ở δC 62,48-78,42 ppm và các tín hiệu proton ở δH 3,21-3,90 ppm. Ngoài ra, vị trí liên kết giữa hai đường glucose và hai nhân coumarin được xác định bằng dữ kiện phổ HMBC của PT-8 thông qua tương tác giữa proton anomer H-1'' (δH 4,99, d, 8 Hz) và cacbon C-7 (δC 158,35), giữa H-1''' (δH 4,93, d, 7,5 Hz) và C-7' (δC 160,03) cho phép xác định. Hơn nữa, trên phổ NOESY xuất hiện tương tác giữa giữa proton anome H-1 và H-1 với hai proton thơm H-8 và H-8 khẳng định vị trí liên kết của hai đường glucose với hai nhân coumarin. Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR hợp chất PT-8 còn xuất hiện thêm một cầu nối monoterpen (C 10) được xác định là 1,4-dimethyl-4- vinylcyclohexene tương tự như hợp chất bisparasin [111]. Phổ 1H- NMR xuất hiện tín hiệu đặc trưng của cầu nối này bởi tín hiệu của một liên kết đôi có cấu hình trans [δH 6,41 (1H, d, 16,5 Hz, H-9) và δH 6,35 (1H, d, 16,5 Hz, H-10)], một olefin proton singlet H-10' (δH 5,35, s); 4 proton không tương đương dạng peak multilet thuộc về hai nhóm metilen-vicinal H-12 (δH1,65 &1,88, m) và H-12' (δH 2,16 & 2,29, m), hai nhóm metyl thế CH 3-11' (δH 1,85, br s) và CH3-11 (δH 1,31, s). Cấu trúc cầu nối 1,4-dimethyl-4-vinylcyclohexene với hai vòng coumarin được khẳng định bằng phổ HMBC, thông qua tương 10
tác giữa nhóm metyl CH3-11' (δH 1,85) và C-10' (δC124,55), C-11' (δC135,60) và C-12' (δC28,56), tương tác nhóm metyl CH3-11 (δH 1,31) với C-10 (δC 140,92), C-11 (δC 40,22) và C-12 (δC 31,95). Liên kết giữa vòng monotecpen và hai vòng courmarin của hợp chất PT-8 được chứng minh qua tương tác HMBC qua ba liên kết ( 3J) giữa proton trans-olefin H-9 (δH 6,41) và C-5 (δC 126,6), trans-olefin H- 10 (δH 6,37) và C-6 (δC 127,66), giữa H5' (δH 7,39) và C-9'(δC 44,34). Liên kết giữa vòng monotecpen và hai vòng courmarin được khẳng định thêm một lần nữa trên phổ NOESY, xuất hiện tương tác giữa hai proton thơm H-5 và H-5' của vòng coumarin với proton vinyl H-9 và H-9'. Như vây, qua các tương tác HMBC và NOESY trên cho phép xác định vị trí liên kết giữa vòng monotecpen và hai vòng courmarin là tại C-6/C-9 và C-6'/C-9', Hơn nữa, từ phổ NOESY cho thấy có tương tác giữa nhóm 11-CH3 (δH 1,31, s) và proton H-9' (δ H 4,13, s) chứng minh tính chất cấu hình dạng cis giữa hai nhóm này, cũng như cấu hình dạng cis giữa hai nhân coumarin. Cấu hình dạng ghế của cầu nối 1,4-dimethyl-4-vinylcyclohexene được khẳng định bằng tương tác NOESY của proton metylen H-12 (δ H 1,87, m) với H-12 (δH 2,16, m) và đồng thời cho phép xác định vị trí nhóm 11-CH 3 và proton H-9 là axial- và pseudo-axial trên cầu nối này. Trên phổ NOESY xuất hiện tương tác giữa hai proton thơm H-5 (δH 7,47) với proton H-4 (δH 7,88) của hai nhân coumarin và đặc điểm cản quay do hai vòng coumarin glucozit cồng kềnh và cấu hình dạng cis của hai nhóm thế coumarin trên, cho phép xác định cấu hình tại hai cacbon bất đối C-9' và C-11 có thể xuất hiện ở dạng 9'S,11S hoặc 9'R,11R. Hình 4.11. Phổ 1H-NMR của hợp chất PT-8 11
Hình 4.12. Tương tác COSY, NOESY và HMBC của hợp chất 8 Bảng 4.14. Bảng số liệu phổ hợp chất PT-8 13 C C-NMR 1 HMBC HMBC COSY NOESY H-NMR ( MeOD, 13 (MeOD, C 1H 1 H 13C 1 H -> 1 H -> 500 MHz) 1 1 125 MHz) H H 2 163,28 (s) - 3, 4 - 3 114,31 (d) 6,28, d, 9,5 Hz - 2, 4a 4 4 4 146,00 (d) 7,95, d, 9,5 Hz 5 2, 8a, 5 3 3 4a 115,19 (s) - 3, 8 - - 5 126,60 (d) 7,47, s 4 4, 7, 8a - 9 6 127,66 (s) - 8, 10 - - 7 158,35 (s) - 5, 8, 1'' 6, 7 - 8 103,99 (d) 7,03, s - 4a, 6, 7, - 1'' 8a 8a 155,22 (s) - 4, 5, 8 - - 9 121,23 (d) 6,41, d, 16,5 Hz 5 5, 10 10 5, 11- CH3 10 140,92 (d) 6,37, d, 16,5 Hz 9, 11-CH3 9, 11, 11- 9 11-CH3 CH3 11 40,22 (s) - 9, 12, 11- - 9, 10, 9' 12
13 C C-NMR 1 HMBC HMBC COSY NOESY H-NMR ( MeOD, 13 (MeOD, C 1H 1 H 13C 1 H -> 1 H -> 500 MHz) 1 1 125 MHz) H H CH3 12 31,95 (t) 1,65-1,88, 2H, m 11-CH3 10, 11, 12' 12' 11- 25,82 (q) 1,31, s 12 10, 11, 9', - CH3 12' 2' 163,49 (s) - 2', 3' - - 3' 114,08 (d) 6,22, d, 9,5 Hz - 2', 4'a 4' 3' 4' 145,89 (d) 7,88, d, 9,5 Hz 5' 2', 5', 8'a 3' 4' 4'a 114,40 (s) - 3', 8' - - 5' 130,95 (d) 7,39, s 4' 4', 7', 8'a - 6' 131,62 (s) - 8' - - 7' 160,03 (s) - 5', 8', 1''' - - 8' 103,63 (d) 7,09, s - 4'a, 6', 7', - 1''' 8'a 8'a 155,03 (s) - 4', 5', 8' - 9' 44,34 (d) 4,13, s 12, 5', 11'- 12, 11- - CH3 CH3, 5' 10' 124,60 (d) 5,35, s 11'-CH3 11' 135,60 (s) - 12, 11'-CH3 12' 28,56 (t) 2,29, m 12, 11'-CH3 12 8 2,16, m 11'- 23,66 (q) 1,85, s - - CH3 1'' 101,62 (d) 4,99, d, 8 Hz 7 2'' 8 2'' 74,77 (d) 3,35-3,4, m 1'' 3'' 78,19 (d) 3,42 -3,53, m 4'' 71,71 (d) 3,23, 1H, t, 9 Hz 5'' 78,42 (d) 3,42 -3,53, m 6'' 62,72 (t) 3,85, dd, 12, 2 Hz 4'' 3,35-3,39, m 1''' 102,49 (d) 4,93, d, 7,5 Hz 7' 2''' 8' 2''' 75,01 (d) 3,58, dd, 8,0, 8,0 Hz 1''' 74,77 (d) 3''' 78,34 (d) 3,42 -3,53, m 4''' 71,21 (d) 3,33-3,39, m 5''' 78,38 (d) 3,42 -3,53, m 6''' 62,48 (t) 3,88, dd, 12, 2 Hz 3,70, dd, 12, 6,5 Hz Dựa vào dữ kiện phổ trên, hợp chất PT- 8 được xác định là một biscoumarin glucoside mới lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên và đặt tên là paratrimerin A. 4.3. Xác định các hợp chất từ thân rễ cây Nhó đông 13
Bằng cách kết hợp các dữ liệu phổ NMR một chiều và 2 chiều, IR, MS, UV, 22 hợp chất được phân lập từ thân và rễ loài Nhó đông đã được xác định cấu trúc như sau: Damnacanthal (ML-1) Lucidin-ω-methyl ether Sorandidiol (ML-3) C16H10O5, 282 (ML-2) C15H10O4, 254 C16H12O5, 284 Rubiadin-3-methyl Morindone-5-methyl ether Rubiadin (ML-5) ether(ML-6), (ML-4), C16H12O5, 284 C15H10O4, 254 C16H12O4,268 Morindone (ML-8) 1-hydroxy-2-methyl-6- Damnacanthol (ML-7) C15H10O5, 270 methoxy anthraquinone C16H12O5, 284 (ML-9) C16H12O4, 268 Morindone-6-methyl ether Morindone-6-O-β- Lucidin-3-O-β- (ML-10) Gentiobioside(ML-11) primeveroside (ML-12) C16H12O5, 284 C27H30O15, 594 C26H28O14, 564,5 14
morinlongoside C (ML- morinlongoside A (ML-13) morinlongoside B (ML-14) 15) C29H38O15, 626 C27H36O13, 568 C22H32O15, 536 3-O-[β-D-Xylopyranosyl-(1-6)-β- Geniposidic acid (ML-16) D-glucopyranosyl] Cistanoside-E (ML-18) C16H22O10, 374 (3R)-l-octen-3-ol (ML-17) C21H32O12, 476,47 C19H33O10, 421 Ethyl-β-D- Isoacteoside (ML-20) galatopyranoside (ML-19) C29H36O15, 624 C8H16O6, 208,09 Acteoside (ML-21) Quercetin (ML-22) C29H36O15, 624 C15H10O7, 302 4.4. Đánh giá tác dụng sinh học của các hợp chất sạch 4.4.1. Đánh giá tác dụng kháng viêm gan virus B Đánh giá ảnh hưởng tới khả năng sống tế bào HepG2.2.15 của 09 hợp chất sạch đã được đánh giá bằng MTS sau 48 giờ ủ. Bảng 4. 3. Ảnh hưởng tới khả năng sống tế bào HepG2.2.15 của các hợp chất sạch stt 　Nồng Hợp chất độ Ký hiệu Giá trị OD % Sống sót 1 　　Mẫu trắng 0,049 　 15
2 　　DMSO - D6 0,805 100 3 10 µM VHKC 1099 ostruthin (PT-1) 0,165 20,55 4 10 µM VHKC 1111 ninhvanin (PT-2) 0,625 77,60 5 6-(2-Hydroxyethyl)- 10 µM VHKC 1114 2,2-dimethyl-2H-1- benzopyran (PT-3) 0,905 112,37 6 10 µM VHKC 1131 paratrimerin A (PT-8) 0,900 111,81 7 10 µM VHKC 1132 paratrimerin B (PT-9) 0,713 88,59 8 parabacunoic acid (PT- 10 µM VHKC 1133 10) 0,53 65,81 9 10 µM VHKC 1100 morindone (ML-8) 1,011 125,60 10 10 µM VHKC 1138 damnacanthal (ML-1) 0,800 99,39 11 10 µM VHKC 1139 rubiadin (ML-5) 1,014 125,97 Kết quả cho thấy 05 hợp chất sạch cho tỷ lệ sống của tế bào HepG2.2.15 trên 80%, các hợp chất này được đánh giá tiếp khả năng làm giảm mức độ biểu hiện HBsAg. Bảng 4. 4. Khả năng ức chế biểu hiện HBsAg trong tế bào Hep2.2.15 của các hợp chất sạch Phân đoạn Giá trị OD Mức độ biểu Ký hiệu Nồng độ SE (450nm) hiện HBsAg % Mẫu trắng 　 0,190 0,140 0 DMSO 0 µM 1,228 0,016 100 Lamivudine 50 µM 0,635 0,022 42,86 6-(2-Hydroxyethyl)- VHKC 1114 2,2-dimethyl-2H-1- 20 µM 1,276 0,044 104,61 benzopyran (PT-3) VHKC 1131 paratrimerin A (PT-8) 20 µM 1,300 0,061 106,92 VHKC 1100 morindone (ML-8) 20 µM 0,992 0,067 77,28 damnacanthal (ML- VHKC 1138 20 µM 1,077 0,094 85,42 1) VHKC 1139 rubiadin (ML-5) 20 µM 1,058 0,077 83,64 Morindone (ML-8), rubiadin (ML-5) và damnacanthal (ML-1) có khả năng ức chế tốt biểu hiện HBsAg. Bảng 4. 5. Giá trị IC50 của 03 mẫu chất sạch Nồng độ Abs 450 SE Ức chế % IC50(µM) Mẫu trắng 　 0,071 0,007 0 　 DMSO 0 µM 1,911 0,018 100 　 16
Lamivudine 50 µM 0,905 0,040 45,30 19,92±0,18 　 2,5 µM 1,829 0,026 95,53 　 VHKC 1100 5 µM 1,577 0,015 81,85 32,06±3,21 　morindone (ML-8) 10 µM 1,465 0,056 75,74 　　 20 µM 1,315 0,089 67,61 　　 2,5 µM 1,813 0,009 94,66 　 VHKC 1138 5 µM 1,711 0,067 89,11 32,54±3,05 　damnacanthal 10 µM 1,471 0,107 76,06 　 (ML-1) 　 20 µM 1,275 0,003 65,41 　　 2,5 µM 1,858 0,081 97,13 　 VHKC 1139 5 µM 1,809 0,019 94,44 45,82±10,79 　rubiadin (ML-5) 10 µM 1,657 0,042 86,20 　　 20 µM 1,409 0,053 72,72 　 Hợp chất morindone (ML-8), rubiadin (ML-5) và damnacanthal (ML-1) có hoạt tính ức chế HBV in vitro thông qua khả năng làm giảm mức độ biểu hiện HBsAg trên dòng tế bào HepG2.2.15. 4.4. Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của một số hoạt chất từ loài Xáo tam phân Ninhvanin (PT-2, hợp chất mới), ở mức 50 mg/kg/ngày làm giảm nồng độ ALT huyết thanh cũng như hạn chế một phần tổn thương gan do paracetamol gây ra (400 mg/kg). Ostruthin (PT-1) ở mức 50 mg/kg/ngày làm giảm nồng độ ALT và AST huyết thanh và hạn chế tổn thương gan do paracetamol gây ra. Ostruthin có tác dụng bảo vệ gan tốt tương đương với sylimarin với cùng liều 50 mg/kg/ngày Bảng 4. 6. Ảnh hưởng của hợp chất ostruthin và ninhvanin lên nồng độ aminotransferase huyết thanh Lô Thuốc và liều lượng AST (UI/L) ALT (UI/L) Đối chứng sinh lý 84,20 ± 3,90 29,20 ± 2,59 1 Đối chứng bệnh lý 324,00 ± 50,54 495,67 ± 61,50 2 p< so với (1) p< so với (1) ostruthin 50 mg/kg 97,00 ± 15,72 62,00 ± 23,30 p> so với (1) p< so với (1) 3 p< so với (2) pso với (5) p> so với (5) ninhvanin 50 mg/kg 162,67 ± 72,51 283,00 ± 11,13 p< so với (2) 4 p>so với (2) p< so với (5) p< so với (5) 17
Đối chứng tham khảo 56,00 ± 12,53 90,32 ± 19,06 (silymarin 50 mg/kg) p< so với (1) 5 p> so với (1) p< so với (2) p
Từ thân rễ loài Nhó đông đã phân lập và xác định cấu trúc của 22 hợp chất gồm: 12 hợp chất anthraquinone, damnacanthal (ML-1), lucidin-ω-methyl ether (ML-2), soranjidiol (ML-3), morindone -5-methyl ether (ML-4), rubiadin (ML-5), rubiadin-3- methyl ether (ML-6), damnacanthol (ML-7), morindone (ML-8), 1- hydroxy-2-methyl-6-methoxy anthraquinone (ML-9), morindone-6- methyl ether (ML-10), morindone-6-O-β-gentiobioside (ML-11), lucidin-3-O-β-primeveroside (ML-12), 02 naphtalen glycosid mới, morinlongoside A (ML-13, mới), morinlongoside B (ML-14, mới), 02 iridoid glycosid, morinlongoside C (ML-15, mới), geniposidic acid (ML-16),05 hợp chất glycosid, 3-O-[β-D-xylopyranosyl-(1-6)- β-D-lucopyranosyl]-(3R)-l-octen-3-ol (ML-17), acteoside (ML-18), cistanoside E (ML-19), ethyl-β-D-galatopyranoside (ML-20), isoacteoside (ML-21) và một flavonoid quercetin (ML-22). Về đánh giá tác dụng sinh học của một số hợp chất sạch Ba hợp chất anthraquinone, morindone (ML-8), damnacanthal (ML-1), rubiadin (ML-5) có tác dụng kháng HBV in vitro thông qua làm giảm mức độ biểu hiệu HBsAg trên tế bào HepG2.2.15 nhiễm HBV với giá trị IC50 tương ứng là 32,06 ± 3,21 μM, 32,54 ± 3,05 μM, 45,82 ± 10,79 μM. Hợp chất ninhvanin ở liều 50 mg/kg/ngày chỉ có tác dụng làm giảm chỉ số ALT và hạn chế một phần tổn thương gan gây ra bởi paracetamol liều 400 mg/kg trên chuột. Trong khi đó, hợp chất ostruthin ở liều 50 mg/kg/ngày không những có tác dụng làm giảm chỉ số AST, ALT, hạn chế tổn thương gan gây ra bởi paracetamol và có tác dụng bảo vệ gan tương đương với silymarin ở mức liều 50 mg/kg/ngày. KIẾN NGHỊ Các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Paramignya trimera và Morinda longissima cho thấy: - Cần nghiên cứu sâu hơn về hiệu quả, độ an toàn và cơ chế hoạt động trong điều trị các bệnh về gan của ostruthin (PT-1). - Ba hợp chất anthranoid, morindone (ML-8), damnacanthal (ML-1), rubiadin (ML-5) là những hợp chất tiềm năng để nghiên cứu và phát 19
triển các loại thuốc để điều trị HBV. Do đó, cần nghiên cứu sâu hơn về tác dụng chống HBV của các hợp chất này trên in vivo. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Lần đầu tiên, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của Xáo tam phân và Nhó đông được nghiên cứu trên thế giới. - Từ thân và rễ của loài Xáo tam phân, 06 hợp chất mới (ninhvanin (PT-2), ninhvanin B (PT-7), paratrimerin A (PT-8), paratrimerin B (PT-9), paramitrimerol (PT- 5), axit parabacunoidc (PT-10) được phân lập và làm sáng tỏ cấu trúc hóa học. Đặc biệt, hợp chất PT-8 và PT-9 là các glycoside biscourmarin liên kết monoterpen đầu tiên được phân lập từ tự nhiên. - Từ thân và rễ của loài Nhó đông đã phân lập hai hợp chất naphthalene glycoside mới, morinlongoside A (ML-13), morinlongoside B (ML-14), một glycoside iridoid, morinlongoside C (ML-15). - Cao metanol và ostruthin từ thân và rễ của loài Xáo tam phân cho thấy các hoạt động bảo vệ gan tốt, hạn chế tổn thương gan gây ra bởi paracetamol ở chuột BALB/c. - Lần đầu tiên phát hiện, chiết xuất ethanol và nước và morindone (ML-8), damnacanthal (ML-1), rubiadin (ML-5) từ thân và rễ của loài Nhó đông có hoạt tính chống HBV trên in vitro thông qua sự ức chế HBsAg ở tế bào HepG2.2.15. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Tên giải pháp hữu ích: Quy trình phân lập và tinh chế hợp chất coumarin ostruthin có tác dụng bảo vệ gan từ thân và rễ cây Xáo tam phân (Paramignya trimera), Theo quyết định chấp nhận đơn hợp lệ số 29620/QĐ-SHTT, ngày 21 tháng 5 năm 2015. 2. Tên giải pháp hữu ích: Quy trình phân lập hợp chất biscoumarin monoterpen glycosid từ cây Xáo tam phân (Paramignya trimera) và hợp chất biscoumarin monoterpen glycosid thu được, Số 1803, Theo quyết định số 53659/QĐ-SHTT, 30/07/2018. 3. Nguyen Manh Cuong, Tran Thu Huong, Ninh The Son, To Dao Cuong, Doan Thi Van, Pham Ngoc Khanh, Vu Thi Ha, Nguyen Cong Thuy Tram, Pham Quốc Long, Young Ho Kim, Morinlongosides A- 20