Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu: Nghiên cứu chế tạo, đặc trưng và khảo sát tiềm năng ứng dụng của hệ dẫn thuốc nano đa chức năng nền copolyme PLA-PEG có và không có hạt từ (Fe3O4)

Chia sẻ: Lê Thị Hồng Nhung | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

60
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu của luận án: Tổng hợp được copolyme PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau trong vùng 3:1-1:3. Chế tạo hệ nano copolyme PLA-PEG mang Curcumin có và không gắn yếu tố hướng đích Folat. Nghiên cứu khả năng mang Curcumin của các hệ nano copolyme PLAPEG, nghiên cứu khả năng phóng thích Curcumin đối với các hệ nano copolyme không và có gắn Folat. Nghiên cứu độc tính tế bào in vitro của hệ nano copolyme PLA-PEG mang Curcumin không và có gắn Folat trên dòng tế bào ung thư gan người HepG2. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu: Nghiên cứu chế tạo, đặc trưng và khảo sát tiềm năng ứng dụng của hệ dẫn thuốc nano đa chức năng nền copolyme PLA-PEG có và không có hạt từ (Fe3O4)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ  Phan Quốc Thông NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO, ĐẶC TRƯNG VÀ KHẢO SÁT TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA HỆ DẪN THUỐC NANO ĐA CHỨC NĂNG NỀN COPOLYME PLA-PEG CÓ VÀ KHÔNG CÓ HẠT TỪ (Fe3O4) Chuyên ngành: Vật liệu điện tử Mã số: 9.44.01.23 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHOA HỌC VẬT LIỆU Hà Nội – 2019
Luận án được hoàn thành tại: Phòng Vật liệu nano y sinh, Viện Khoa học vật liệu, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học: GS. TSKH. Nguyễn Xuân Phúc TS. Hà Phương Thư Phản biện 1: ............................................... Phản biện 2: ............................................... Phản biện 3: ............................................... Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Học viện tại Học Viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi ... giờ ... ngày ... tháng ... năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: Thư viện Quốc gia Hà Nội, Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ, Thư viện Viện Khoa học vật liệu, Thư viện Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
1 Mở đầu Trong vài thập niên trở lại đây, các hệ vật liệu kích thước nano phân phối thuốc đã được quan tâm phát triển mạnh. Trong tất cả các hệ vật liệu phân phối thuốc kích thước nanomet, hệ polyme, hệ hạt vàng, hệ hạt từ được quan tâm hơn cả. Đặc biệt, hệ phân phối thuốc nanomet trên nền hạt nano sắt từ (Fe3O4) được quan tâm phát triển mạnh trong những năm gần đây với nhiều ưu điểm vượt trội như dễ dàng phát triển thành hệ nano phân phối thuốc đa chức năng ứng dụng cho cả mục đích chẩn đoán và điều trị bệnh. Polyme phân hủy sinh học được sử dụng để thiết kế các hệ phân phối thuốc kích thước nano với những đặc tính ưu việt hơn so với các hệ phân phối thuốc truyền thống như: kiểm soát phóng thích thuốc, tự phân hủy và không gây độc sau khi sử dụng, giảm liều dùng và sự phụ thuộc của bệnh nhân vào thuốc được cải thiện. Trong số các polyme phân hủy sinh học phải kể đến polylactic axit (PLA), poly(lactic-co-glycolic) (PLGA), … đã được cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (FDA) cho phép ứng dụng trong dược phẩm và lưu hành trên thị trường. Việc chức năng hóa bề mặt polyme phân hủy sinh học như PLA bởi PEG (polyethylene glycol) để cải thiện những hạn chế của polyme phân hủy sinh học là rất quan trọng. PEG là một polyme ưu nước, độc tính thấp, không kích thích miễn dịch và đã được FDA cho phép lưu hành. Copolyme PLA-PEG sau khi tổng hợp được sử dụng như một hệ dẫn thuốc ứng dụng cho mục đích chẩn đoán và điều trị bệnh. Trong nội dung của luận án, copolyme PLA-PEG được sử dụng để mang Curcumin (một dược chất có tính chất chống ôxy hóa và tiêu diệt được nhiều loại tế bào ung thư) và gắn yếu tố hướng đích Folat tạo thành hệ dẫn thuốc hướng đích Cur/PLA-PEG-Fol kích thước nano được sử dụng để tiêu diệt tế bào ung thư Hep-G2 (dòng tế bào ung thư gan ở người). Hơn nữa, copolyme PLA-PEG còn được sử dụng để bọc hạt nano sắt từ Fe3O4 tạo thành hệ dẫn thuốc Fe3O4@PLA-PEG kích thước nano với phần lõi là hạt nano sắt từ Fe3O4 và bọc cùng lúc hạt nano sắt từ Fe3O4 và Curcumin tạo thành hệ dẫn thuốc đa chức năng Cur/Fe3O4@PLA-PEG. Hệ thuốc
2 nano này được sử dụng cho mục đích chẩn đoán hình ảnh cộng hưởng từ MRI, cũng như cho khả năng tăng nhiệt tại chỗ khi chiếu từ trường ngoài, có thể ứng dụng trong nhiệt trị ung thư và phóng thích thuốc Curcumin. Với ý nghĩa đó, trong đề tài nghiên cứu của tôi dưới sự dẫn dắt của tập thể thầy hướng dẫn đã chọn tên luận án: “Nghiên cứu chế tạo, đặc trưng và khảo sát tiềm năng ứng dụng của hệ dẫn thuốc nano đa chức năng nền copolyme PLA-PEG có và không có hạt từ (Fe3O4)”. Mục tiêu của luận án: 1) Tổng hợp được copolyme PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau trong vùng 3:1-1:3. Chế tạo hệ nano copolyme PLA-PEG mang Curcumin có và không gắn yếu tố hướng đích Folat. Nghiên cứu khả năng mang Curcumin của các hệ nano copolyme PLA- PEG, nghiên cứu khả năng phóng thích Curcumin đối với các hệ nano copolyme không và có gắn Folat. Nghiên cứu độc tính tế bào in vitro của hệ nano copolyme PLA-PEG mang Curcumin không và có gắn Folat trên dòng tế bào ung thư gan người HepG2. 2) Tổng hợp hạt nano Fe3O4 và chế tạo được chất lỏng từ có độ bền cao trên nền hạt Fe3O4 bọc copolyme PLA-PEG tạo thành hệ nano Fe3O4@PLA-PEG. Chế tạo được hệ chất lỏng từ đa chức năng Fe3O4@PLA-PEG/Cur trên nền hạt nano Fe3O4 bọc copolyme PLA-PEG mang Curcumin. 3) Nghiên cứu khả năng gây độc trên tế bào ung thư của các hệ nano Fe3O4 bọc copolyme mang thuốc (Cur). Nghiên cứu khả năng ứng dụng làm tác nhân tăng tương phản ảnh cộng hưởng từ hạt nhân, nghiên cứu hiệu ứng đốt nóng cảm ứng từ và khả năng phóng thích thuốc (Curcumin). Thử nghiệm độc tính, và khả năng nhiệt từ trị tiêu diệt tế bào ung thư, tiêu diệt khối u trên chuột thử nghiệm dựa trên hiệu ứng đốt nóng cảm ứng từ ứng dụng trong nhiệt trị ung thư (hyperthermia). Nội dung luận án: Chương 1 trình bày tổng quan giới thiệu về một số hệ dẫn thuốc, các polyme phân hủy sinh học được sử dụng cho mục đích tổng hợp các
3 hệ dẫn thuốc kích thước nano, lợi thế của các hệ dẫn thuốc khi được chức năng hóa bề mặt, vai trò của các chất chức năng hóa bề mặt như poly(ethylene glycol), tinh bột, polysaccarit, … lợi thế của hệ dẫn thuốc kích thước nano, hệ nano copolyme mang thuốc hướng đích. Tiềm năng và tính ưu việt của hệ nano copolyme PLA-PEG mang thuốc và gắn yếu tố hướng đích. Hệ chất lỏng từ trên nền hạt nano Fe3O4 chức năng hóa bề mặt bởi copolyme PLA-PEG có và không mang Curcumin cũng được trình bày tổng quát. Trong chương 2, quy trình tổng hợp copolyme PLA- PEG và các quy trình chế tạo các hệ mẫu, quy trình thử nghiệm sinh học trên các dòng tế bào ung thư và trên chuột mang khối u, và nguyên lý của các phép đo nhằm phân tích và biện luận các kết quả trong luận án được trình bày chi tiết. Chương 3, chương 4 và chương 5 trình bày các kết quả nghiên cứu thu nhận được của luận án và các thảo luận liên quan. Chương 3 trình bày kết quả nghiên cứu tổng hợp copolyme PLA- PEG, chế tạo hệ nano dẫn thuốc PLA-PEG mang Curcumin có và không gắn yếu tố hướng đích Folat với các đặc trưng về kích thước, hình dạng, cấu trúc, khả năng phân tán và độ bền phân tán được trình bày, phân tích và biện luận chi tiết, thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư gan G-Hep2. Các kết quả nghiên cứu trong chương 4 liên quan đến vật liệu nano Fe3O4 được tổng hợp bằng phương pháp đồng kết tủa, bọc copolyme PLA-PEG có mang và không mang Curcumin tạo thành hệ chất lỏng từ kích thước nano đa chức năng. Các đặc trưng về hình dạng, kích thước, cấu trúc, tính chất từ, hiệu ứng tăng cường độ tương phản cộng hưởng từ và hiệu ứng đốt nóng từ định hướng ứng dụng trong y sinh được trình bày, phân tích và biện luận chi tiết. Chương 5 trình bày các kết quả thử nghiệm sinh học của hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG trên tế bào ung thư và chuột mang khối u, thử độc tính tế bào, độc tính cấp, chụp ảnh cộng hưởng từ trên tế bào và khối u chuột. Ý nghĩa nghiên cứu của luận án Hạt nano copolyme PLA-PEG được tổng hợp với tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau sẽ ảnh hưởng đến khả năng mang thuốc (Curcumin, hạt nano sắt từ Fe3O4), khả năng thâm nhập tế bào ung thư
4 (Hep-G2) cũng như khả năng phóng thích thuốc. Hạt nano copolyme PLA-PEG mang thuốc hướng đích và hệ nano mang thuốc đa chức năng với những ưu điểm vượt trội so với các hệ phân phối thuốc truyền thống và các hệ phân phối thuốc polyme. Cụ thể: Tăng cường khả năng lưu thông máu, tránh sự đào thải do các thực bào và các tế bào của hệ lưới nội mô, giảm đáng kể các protein lắng đọng bề mặt. Hạt nano copolyme PLA-PEG được sử dụng để mang Curcumin và gắn yếu tố hướng đích Folat tạo thành hệ dẫn thuốc nano mang thuốc hướng đích, bọc hạt nano từ Fe3O4 tạo thành các hệ dẫn thuốc nano và mang Curcumin tạo thành hệ dẫn thuốc đa chức năng ứng dụng trong chẩn đoán hình ảnh cộng hưởng từ MRI, khả năng tăng nhiệt tại chỗ dưới tác dụng của từ trường ngoài sử dụng cho mục đích nhiệt trị tại chỗ tiêu diệt tế bào ung thư, nhiệt từ trị (hyperthermia) tiêu diệt khối u trên chuột thử nghiệm, tăng cường phóng thích Curcumin. Đóng góp mới của luận án Đã tổng hợp được copolyme PLA-PEG bằng phương pháp trùng ngưng với các tỷ lệ thành phần PLA-PEG khác nhau. Đã chế tạo được hạt nano copolyme PLA-PEG bằng phương pháp bay hơi dung môi dạng mixen với cấu trúc lõi-vỏ, mang Cucurmin tạo thành hệ nano mang thuốc Cur/PLA-PEG và gắn yếu tố hướng đích Folat tạo thành hệ nano mang thuốc hướng đích Cur/PLA-PEG-Fol. Đã tổng hợp thành công hạt nano sắt từ Fe3O4 bằng phương pháp đồng kết tủa với từ độ đạt khoảng 65 emu/g, bọc copolyme PLA-PEG có và không có mang Curcumin tạo thành hệ chất lỏng nano từ đa chức năng cấu trúc lõi-vỏ Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur với giá trị độ phục hồi r 2 cao hơn các chất thương phẩm Resovist và Ferumoxytol ứng dụng trong chẩn đoán hình ảnh MRI. Đốt nóng cảm ứng từ hệ chất lỏng nano từ Fe3O4@PLA-PEG/Cur làm tăng nhiệt tại chỗ và tăng hiệu quả giải phóng thuốc (Curcumin).
5 Sử dụng hệ chất lỏng nano từ đa chức năng Fe3O4@PLA-PEG trong ứng dụng nhiệt trị giúp tiêu diệt hiệu quả tế bào và khối u trên chuột. Bố cục của luận án: Luận án gồm 132 trang, bao gồm: phần mở đầu, 5 chương nội dung, kết luận và cuối cùng là danh sách tài liệu tham khảo. Các kết quả chính của luận án đã được công bố trong 5 bài báo trên các tạp chí trong nước và quốc tế và 5 bài báo khác có liên quan. Chương 1 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ HỆ DẪN THUỐC 1.1. Hệ dẫn thuốc 1.1.1. Hệ dẫn thuốc kích thước thông thường - Các thiết bị phân phối thuốc La cá thiết bị dùng để đặt thuốc vào trong và phân phối, cấy thuốc vào mô bên trong cơ thể. Một số thiết bị được sử dụng để phân phối thuốc như: Cảm biến sinh học phân phối thuốc; Thiết bị phân phối thuốc dựa trên nền các vi dòng; Vi chip kiểm soát phóng thích thuốc; Các bơm và ống dẫn phân phối thuốc. - Các hệ phân phối thuốc hướng đích Đối với hệ phân phối thuốc hướng đích và được kiểm soát, một loạt các hệ chất mang được phát triển như: Các chất nền liên kết, kháng thể đơn dòng, các vi hạt hình cầu và liposome. Ngoài ra, có nhiều hệ thống tinh vi dựa trên cơ chế phân tử, công nghệ nano, và liệu pháp phân phối gen cũng được phát triển. - Các hệ phân phối thuốc chuyên biệt Là các hệ thống phân phối thuốc đến các vị trí trong cơ thể đã được chọn lọc (gan, lá lách, xương, lympho). Do kích thước nhỏ, chúng có thể được tiêm trực tiếp vào cơ thể, các hệ thống phân phối thuốc chuyên biệt có thể bao gồm thuốc và vật liệu lõi hoặc thuốc có thể được phân tán như chất nhũ tương bên trong vật liệu mang hoặc thuốc có thể được gói gọn bởi vật liệu mang.
6 1.1.2. Hệ dẫn thuốc kích thước nano (HDTNN) - Tính ưu việt và tiềm năng của HDTNN + Tính ưu việt của HDTNN DHTNN có những đặc tính ưu việt sau: i) kéo dài sự lưu thông trong máu; ii) đóng gói và bảo vệ của một loạt các tác nhân điều trị với tải trọng cao; iii) tối ưu hóa tổ hợp các tính chất vật lý của chất mang để tận dụng cả hai cơ chế nhắm đích chủ động và thụ động; iv) đáp ứng với các kích thích tại chỗ cho phóng thích thuốc kiểm soát; v) khả năng chịu đựng nhiều các gốc thuốc tương phản/chụp ảnh/quan sát bằng phương tiện của một loạt các kỹ thuật hình ảnh đa phương thức. + Tiềm năng của HDTNN Các hệ thống phân phối có thể được thiết kế để cung cấp, phóng thích có kiểm soát hoặc phóng thích kích hoạt các phân tử điều trị, tăng thời gian lưu trú trong máu, giảm phân phối không đặc hiệu, nhắm đích các mô hoặc các kháng nguyên bề mặt tế bào đích với một yếu tố gắn kết nhắm đích, qua đó tăng khả năng và hiệu quả điều trị của thuốc. Hình 1.3. Sơ đồ hệ dẫn thuốc nano đa chức năng. - Các vật liệu bảo đảm các chức năng hệ dẫn thuốc nano + Vật liệu cho chức năng thích ứng môi trường sinh hóa Hệ dẫn thuốc nano cấu trúc lõi-vỏ, với phần lõi là các polyme phân hủy sinh học được chức năng hóa bởi polyme ưa nước polyethylene glycol (PEG) có thể được ghép, tạo phức, hoặc hấp thụ lên bề mặt của các hạt nano để tạo nên sự ổn định về không gian và hình
7 thành nên các thuộc tính "tàng hình" giúp tăng thời gian lưu thông máu và tương thích sinh học. + Vật liệu cho chức năng hóa trị liệu Một số phân tử thuốc kháng ung thư bao gồm doxorubicin, dopamine và Curcumin đã được sử dụng trong điều trị hoặc hỗ trợ điều trị ung thư. Trong các loại thuốc nêu trên, Curcumin được xem như một dược chất kháng ung thư tiềm năng có nguồn gốc thiên nhiên. + Vật liệu cho chức năng lý trị liệu Hệ dẫn thuốc nano ngoài chức năng mang, giúp phân tán và lưu thông các dược chất (thuốc) trong môi trường sinh lý tốt hơn, chúng còn mang (bọc) các tác nhân lý trị liệu khác nhau như hạt nano vàng, hạt nano từ. + Vật liệu cho chức năng chẩn đoán hình ảnh Các hạt nano tăng độ tương phản hình ảnh như hạt nano vàng, hạt nano từ đã được sử dụng như những tác nhân chẩn đoán hình ảnh. + Vật liệu cho chức năng bám đích Hoạt động hướng đích của các hạt nano liên quan đến việc tạo phức của các phối tử nhắm đích với các hạt nano, hoặc sử dụng từ trường ngoài để điều khiển các hạt nano, đặc biệt là các hạt nano từ tính định vị tại các vị trí đích, hoặc dựa vào đặc tính cấu tạo màng tế bào có thể thực hiện các hoạt động nhắm đích. 1.1.3. Các loại polyme nghiên cứu ứng dụng - Liposome: đã được sử dụng như các hạt mang thuốc tiềm năng với những lợi thế riêng của chúng như khả năng bảo vệ thuốc tránh bị đào thải sớm, nhắm đích đến các vị trí cụ thể và làm giảm độc tính hoặc tác dụng phụ. - Polyme phân hủy sinh học: so với liposome, polyme phân hủy sinh học (polyme tự nhiên, polyme dendrit, copolyme) lợi thế hơn liposome, giúp tăng độ ổn định của thuốc/protein và những thuộc tính phóng thích được kiểm soát hữu ích.
8 1.1.4. Copolyme phân hủy sinh học PLA-PEG - Polyme PLA: Polylactic axit (PLA) là polyme phân hủy sinh học có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng để thiết kế các hệ phân phối thuốc kích thước nano với những đặc tính ưu việt hơn so với các hệ phân phối thuốc truyền thống và không gây độc cho cơ thể. - Polyme PEG: PEG là một oligome ưa nước có thể được hấp thụ hoặc gắn liền với bề mặt của các hạt nano. PEG làm giảm đáng kể sự tương tác không đặc hiệu với protein, tránh sự đào thải của các thực bào, các tế bào của hệ lưới nội mô, đồng thời tăng khả năng phân tán trong nước, qua đó tăng đáng kể khả năng lưu thông trong máu. - Tổng hợp copolyme PLA-PEG Copolyme PLA-PEG được tổng hợp bằng phản ứng mở vòng trùng ngưng axit lactic với polyethylenee glycol tạo thành block copolyme PLA-PEG với sự có mặt của muối thiết II (Sn(Oct)2) đóng vai trò như xúc tác. Copolyme PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần về trọng lượng giữa PLA và PEG khác nhau được tiến hành tổng hợp nhằm đánh giá ảnh hưởng của các hợp phần PLA và PEG đến kích thước, khả năng mang thuốc cũng như khả năng tương thích sinh học của hệ nano copolyme PLA-PEG mang thuốc hướng đích. Hình 1.6. Sơ đồ tổng hợp copolyme PLA-PEG bằng phương pháp trùng ngưng mở vòng polyme 1.2. Hệ dẫn thuốc nano từ tính 1.2.1. Hạt nano từ - Cấu trúc: Fe3O4 là hợp chất ôxít phổ biến của nguyên tố sắt, vật liệu này thuộc họ ferrite spinel có hai phân mạng từ không tương đương và tương tác giữa các phân mạng là phản sắt từ. Vật liệu Fe3O4 có cấu trúc spinel đảo. Công thức phân tử: FeO. Fe2O3 = Fe. Fe2O4, Mô hình ion: [Fe3+]A[ Fe3+Fe2+]B O42-.
9 - Các tính chất khả dụng y sinh: Trong các loại vật liệu nano y sinh, các hạt nano từ tính (Magnetic Nanoparticles – MNPs) có một số tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong y sinh như: (i) Tách chiết các tế bào và các thực thể sinh học, (ii) Dẫn truyền thuốc, gen và các nuclide phóng xạ tới những vùng bệnh nằm sâu trong cơ thể, (iii) Tăng cường độ tương phản trong chẩn đoán cộng hưởng từ hạt nhân, và (iv) Nhiệt trị điều trị ung thư. - Chức năng chẩn đoán hình ảnh: Khi được định vị trong môi trường sinh học, các hạt nano từ có thể tạo sự nhiễu loạn từ trường cục bộ do đó ảnh hưởng đến tốc độ hồi phục từ trong các mô chứa nước. Vì vậy, chúng được nghiên cứu kỹ và được sử dụng như một tác nhân tăng độ tương phản ảnh cộng hưởng từ hạt nhân MRI trong chẩn đoán lâm sàng. Cơ sở của việc chụp ảnh cộng hưởng từ là dựa trên tín hiệu hồi phục spin của các proton trong các phân tử nước có trong các mô sinh học khi bị kích thích bởi các chuỗi xung tần số vô tuyến điện dưới tác dụng của từ trường ngoài cố định (B0). - Hiệu ứng đốt nóng cảm ứng từ và nhiệt từ trị Đốt nóng cảm ứng từ (Magnetic Inductive Heating – MIH) dựa trên khả năng hấp thụ năng lượng từ từ trường xoay chiều tạo nên nguồn đốt nóng dựa trên sự tổn hao hồi phục Neel và Brown. Khi được đưa vào trong các khối u các hạt nano từ có thể đóng vai trò tiêu diệt tế bào ung thư do khả năng nhạy nhiệt của các tế bào ung thư. Đây là lý do tại sao chúng được nghiên cứu kỹ để sử dụng như tác nhân nhiệt trị ung thư dùng chất lỏng từ (Magnetic Fluid Hyperthermia – MFH). Trong tất cả những vật liệu từ, Fe3O4 là đối tượng được nghiên cứu kỹ, bởi vì chúng dễ tổng hợp, có đặc tính siêu thuận từ tốt cũng như rất an toàn cho ứng dụng y sinh. 1.2.2. Các phương pháp chế tạo hạt nano từ Phương pháp đồng kết tủa Với phương pháp này hạt thường được tổng hợp trong dung môi là nước dưới điều kiện kiềm (thu được bằng cách thêm hydrôxit (NaOH)
1 0 hoặc amoni hydrôxit (NH4OH)). Quá trình này thường được dùng để tổng hợp các hạt nano ôxit và ferit. Phương pháp khử Phương pháp vi nhũ tương Phương pháp sol-gel Phương pháp thủy nhiệt Phương pháp phân hủy nhiệt Trong luận án này, chúng tôi sử dụng phương pháp đồng kết tủa để tổng hợp hạt nano sắt từ Fe3O4 do dễ tổng hợp, giá thành thấp, kích thước hạt phân bố khá hẹp, các hạt nano sau khi tổng hợp có độ thuần khiết vì được phân tán trong môi trường nước nên dễ chức năng hóa bề mặt bằng các vật liệu khác nhau. 1.2.3. Bọc bảo vệ và chức năng hệ nano từ tính Trong nghiên cứu của chúng tôi, hạt nano sắt từ Fe3O4 sau khi tổng hợp được chức năng hóa bằng copolyme PLA-PEG tạo thành hệ dẫn thuốc nano cấu trúc lõi-vỏ và mang Curcumin tạo thành hệ dẫn thuốc nano đa chức năng cấu trúc lõi-vỏ ứng dụng trong chẩn đoán hình ảnh cộng hưởng từ MRI, nhiệt trị ung thư dựa vào khả năng tăng nhiệt tại chỗ nhờ từ trường ngoài và khả năng tăng nhiệt phóng thích Curcumin. Chương 2 CÁC KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM Copolyme PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG là 3:1, 2:1, 1:1, 1:2 và 1:3 được tổng hợp thông qua phản ứng mở vòng trùng ngưng giữa monome của axit lactic và polyethylene glycol (PEG) với sự có mặt của xúc tác thiếc (II) 2-ethylhexanoat. Copolyme PLA:PEG sau khi tổng hợp được chế tạo thành hạt nano PLA:PEG, mang curcumin tạo thành hệ nano Cur/PLA-PEG và gắn yếu tố hướng đích Folat tạo thành hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol. Hạt nano sắt từ Fe3O4 được tổng hợp bằng phương pháp đồng kết tủa, sau đó được bọc chức năng bởi PLA-PEG tạo thành hạt nano Fe3O4@PLA-PEG
11 và mang curcumin tạo thành hạt nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur. Các hạt nano PLA-PEG, Cur/PLA-PEG, Cur/PLA-PEG-Fol, Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur được đặc trưng hình thái, kích thước hạt bằng phương pháp hiển vị điện tử FE-SEM, phổ tán xạ laze động (DLS – Dynamic Light Scattering), trong khi đó độ bền phân tán của các hệ nano được đặc trưng bởi thế Zeta. Cấu trúc của các hạt nano được đặc trưng bởi phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) và phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS (Ultraviolet-Visible), khả năng mang curcumin của copolyme PLA-PEG và hạt nano Fe3O4@PLA-PEG được xác định bằng phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS thông qua việc xây dựng phưng trình đường chuẩn. Nghiên cứu khả năng giải phóng chậm curcumin từ hệ dẫn thuốc nano được thực hiện bằng cả hai phương pháp ủ nhiệt (giải phóng chậm thụ động) và phương pháp đốt nóng cảm ứng từ (giải phóng chậm chủ động dựa vào nhiệt) Thử nghiệm độc tính tế bào của hệ nano Cur/PLA-PEG, Cur/PLA-PEG-Fol được thực hiện trên dòng tế bào Hep-G2 (dòng tế bào ung thư gan người) sử dụng phương pháp của Skehan và cộng sự 1990 và phương pháp của Likhiwitayawuid và cộng sự năm 1993. Cấu trúc của hạt nano sắt từ Fe3O4 được xác định bằng phương pháp nhiễu xạ tia X, trong khi đó tỷ lệ khối lượng lớp vỏ bọc PLA-PEG và lượng curcumin mang vào được xác định bằng phương pháp phân tích nhiệt vi lượng (TGA - Thermal Gravimetric Analysis). Từ độ bảo hòa của các hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur được xác định bằng phép đo từ kế mẫu rung (VSM – Vibrating Sample Magnetometer), khả năng tăng nhiệt của các hạt nano được thực hiện bằng phương pháp đốt nóng cảm ứng từ MIH – Magnetic Inductive Heating). Các phép đo đánh giá tốc độ hồi phục cộng hưởng từ hạt nhân và chụp ảnh MRI trên các mẫu chất lỏng từ Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur được thực hiện trên thiết bị cộng hưởng từ Bruker Biospec, tần số từ trường xoay chiều 300 MHz, từ trường tĩnh 7
12 tesla tại Trung tâm chụp ảnh động vật, thuộc Trường Đại học Đông Bắc, Thành phố Boston, Hoa Kỳ. Thử nghiệm sinh học gồm thử độc tính tế bào, độc tính cấp, phương pháp nhiệt từ trị tiêu diệt tế bào, nhiệt từ trị tiêu diệt khối u rắn được thực hiện tại Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội cho kết quả rất khả quan, mở ra hướng mới ứng dụng hạt nano sắt từ trong lĩnh vực y sinh. Chương 3 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐẶC TÍNH CỦA HỆ NANO COPOLYME PLA-PEG ĐA CHỨC NĂNG 3.1. Chế tạo hệ nano copolyme PLA-PEG, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol Hình 3.1. Mô tả quy trình chế tạo hệ dẫn thuốc nano Cur/PLA-PEG, Cur/PLA- PEG-Fol 3.2. Cấu trúc, hình thái học và đặc trưng tính chất của các hạt nano PLA-PEG, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol Hạt nano PLA-PEG, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol được đặc trưng bằng ảnh FE-SEM cho thấy có dạng hình cầu và đơn phân tán, kích thước trung bình dưới 100 nm. Tuy nhiên, hạt nano PLA-PEG với các tỷ lệ thành phần PLA:PEG khác nhau có kích thước khác nhau. Kích
13 thước hạt nano PLA-PEG chủ yếu do thành phần kỵ nước PLA quyết định là chủ yếu. So với kết quả ảnh SEM, kết quả đo phân bố kích thước hạt bằng phương pháp tán xạ ánh sáng động (DLS) cho thấy kích thước (thủy động) của hạt có xu hướng tăng lên. Khả năng mang thuốc của các hạt nano PLA-PEG Khi tăng thành phần PLA trong copolyme PLA-PEG phần lõi PLA sẽ tăng lên, chính vì vậy khi mang Curcumin vào sẽ tăng các mối liên kết kỵ nước giữa phần lõi PLA với Curcumin, qua đó làm tăng lượng Curcumin được mang vào và tăng hiệu quả mang thuốc. Bảng 3.4. Kích thước hạt, lượng Curcumin và hiệu quả mang Curcumin của các hệ copolyme PLA-PEG, Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol Kích thước các hệ nano (nm) Lượng Cur Hiệu quả Tỷ lệ mang vào mang thuốc PLA/PEG PLA-PEG Cur/PLA-PEG Cur/PLA-PEG-Fol (mg/mL) (%) 3:1 59 69 86 0,73 91,3 2:1 55 65 82 0,63 78,8 1:1 50 61 80 0,43 53,8 1:2 49 60 80 0,40 50 1:3 49 60 80 0,39 48,8 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại FT-IR Các phổ đo được cho thấy, sau khi được mang vào copolyme PLA-PEG đỉnh hấp thụ của Curcumin dịch chuyển từ 431 nm tới 426 nm, tương tự trường hợp của axit folic đỉnh hấp thụ dịch chuyển từ 283 nm tới 276 nm sau khi được gắn vào copolyme PLA-PEG, qua đó cho thấy đã có gắn kết axit folic vào copolyme PLA-PEG và Curcumin đã được mang vào copolyme PLA-PEG. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại FT-IR Các phổ hồng ngoại (FT-IR) của PEG và copolyme PLA-PEG cho thấy dao động của nhóm C-O-C trên PEG xuất hiện ở vị trí 1097 cm- 1 đã dịch chuyển tới vị trí 1114 cm-1 trên các copolyme PLA-PEG, mặt khác dao động của nhóm –CO-O- (nhóm cacboxyl) trên PLA xuất hiện ở vị trí 1554 cm-1 đã dịch chuyển tới vị trí 1539 cm-1 trên các copolyme PLA-PEG và liên kết C-H ở vị trí 2924 cm-1 của PLA đã dịch chuyển tới
14 vị trí 2978 cm-1 của PLA-PEG. Vị trí 1539 cm-1 là dao động đặc trưng được hình thành trong phản ứng trùng ngưng. Qua đó, có thể nói rằng copolyme PLA-PEG đã được tạo thành thông qua phản ứng trùng ngưng mở vòng polyme hóa giữa PEG và mono axit lactic. Các kết quả phân tích FT-IR đối với các mẫu Curcumin Cur/PLA-PEG, axit folic, PLA-PEG-Fol đã cho thấy Curcumin đã được mang vào copolyme PLA-PEG và Fol đã gắn thành công lên hệ mi-xen PLA-PEG. 3.3. Nghiên cứu giải phóng chậm curcumin Kết quả nghiên cứu thuộc tính giải phóng chậm in vitro của Curcumin từ hệ nano Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol ở bảng 3.5, 3.6 và Hình 3.21A, 3.21B cho thấy, lượng Curcumin giải phóng chậm sau 48 giờ có xu hướng bão hòa trên cả hai hệ nano Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol, trong đó đối với hệ nano Cur/PLA-PEG tỷ lệ nhả chậm Curcumin đạt cao nhất 91,1% với Cur/PLA-PEG có tỷ lệ thành phần PLA:PEG 3:1 và thấp nhất 83,2% với Cur/PLA-PEG có tỷ lệ thành phần PLA:PEG 1:3, kết quả tương ứng trên hệ nano Cur/PLA-PEG-Fol là 89,1% và 72,3%. Hình 3.21. Tỷ lệ % giải chậm Cur từ hệ Cur/PLA-PEG (A) và Cur/PLA-PEG- Fol (B) tại 37oC 3.4. Nghiên cứu khả năng gây độc trên tế bào ung thư của các hệ nano Cur/PLA-PEG và Cur/PLA-PEG-Fol Đã tiến hành nghiên cứu khả năng gây độc tế bào in vitro với mục tiêu đánh giá khả năng ức chế tế bào ung thư (Hep-G2, dòng tế bào ung
15 thư gan người) của hệ nano Cur/PLA-PEG, Cur/PLA-PEG-Fol so với Curcumin tự do copolyme PLA-PEG, qua đó đánh giá vai trò của các hệ nano phân phối thuốc trong việc ức chế và tiêu diệt tế bào ung thư. Hình 3.24. Sự thay đổi hình dạng tế bào Hep-G2 dưới tác dụng của Cur/PLA- PEG và Cur/PLA-PEG-Fol Bảng 3.7. Giá trị IC50 của hệ nano Cur/PLA-PEG, Cur/PLA-PEG-Fol và Cur/H2O Tỷ lệ Cur/PLA-PEG Cur/PLA-PEG-Fol Cur/H2O PLA:PEG IC50 (μg/mL) IC50 (μg/mL) IC50 (μg/mL) 3:1 114,8±5,7 19,0±0,9 2:1 106,9±5,3 14,2±0,7 1:1 97,5±4,9 12,8±0,6 820,6±41,0 1:2 98,8±4,9 12,1±0,6 1:3 94,4±4,7 12,7±0,6 Chương 4 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO VÀ ĐẶC TÍNH CỦA HỆ CHẤT LỎNG NANO TỪ ĐA CHỨC NĂNG LÕI HẠT Fe3O4 4.1. Chế tạo hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur Hạt nano sắt từ được chế tạo bằng phương pháp đồng kết tủa. Hạt nano Fe3O4 sau khi tổng hợp được phân tán vào trong nước, chức năng
16 hóa bởi PLA-PEG tạo thành hạt nano Fe3O4@PLA-PEG và mang curcumin tạo thành hạt nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur. Hình 4.2. Mô tả quy trình chế tạo hệ dẫn thuốc nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur 4.2. Cấu trúc, hình thái học và đặc trưng tính chất các mẫu hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur Phân tích XRD và FT-IR Kết quả phân tích nhiễu xạ tia X và phân tích phổ hồng ngoại cho thấy hạt nano sắt từ đã được liên kết và bọc bởi PLA-PEG, trong khi cấu trúc tinh thể của lõi hạt nano từ Fe3O4 không bị thay đổi. Hình dạng, kích thước và sự phân bố kích thước các hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur Phân tích ảnh TEM cho thấy hạt nano Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur có kích thước gần tương đương nhau, đạt khoảng 20 nm và lớn hơn khoảng 5 nm so với hạt nano Fe3O4 (kích thước khoảng 15 nm), các hạt nano Fe3O4@PLA-PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur có cấu trúc lõi-vỏ với phần lõi là hạt nano Fe3O4 được tin là tiếp giáp với hợp phần PLA, còn phần vỏ bọc là hợp phần PEG.Kết quả đo DLS cả 3 mẫu hạt nano có sự phân bố kích thước hẹp cho thấy các mẫu đã được chuẩn bị tốt và phân tán ổn định.
17 Hình 4.5. Ảnh SEM, TEM và phân bố kích thước của các hạt nano Fe 3O4, Fe3O4@PLA- PEG, Fe3O4@PLA-PEG/Cur tương ứng hình 1A, 1B, 1C; 2A, 2B, 2C Đặc trưng đóng góp khối lượng và từ tính của các mẫu Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur Để xác định hàm lượng chất bọc phi từ PLA-PEG và Curcumin được dùng vào trong hệ nano Fe3O4@PLA-PEG/Cur, các mẫu hạt nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur được phân tích nhiệt vi trọng (TGA) để tính phần trăm khối lượng các hợp phần Fe 3O4, PLA PEG/Curcumin trong mẫu. Kết quả cho thấy từ độ riêng của hạt lõi Fe3O4 sau khi được chức năng hóa thể hiện sự tăng lên đáng kể, đối với mẫu hạt nano Fe3O4@PLA-PEG tăng 13,6% (từ 64,4 lên 73,2 emu/g), còn với Fe3O4@PLA-PEG/Cur tăng 8,9% (từ 64,4 lên 70,4 emu/g). Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với công bố của tác giả Y. Piñeiro- Redondo và cộng sự. Bảng 4.3. Từ độ bão hòa: đo trực tiếp cho mẫu lõi-vỏ (Mcs); hiệu đính bởi khối lượng vỏ danh định (Mccal) và bởi khối lượng vỏ thí nghiệm TGA (M cex) của các mẫu hạt nano Fe3O4, Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur Mcs mscal Mccal msTGA Mcex Mẫu (emu/g) (%) (emu/g) (%) (emu/g) Fe3O4 64,4 0 64,4 0 64,4 Fe3O4@PLA-PEG 64,5 9,1 70,4 13,5 73,2 Fe3O4@PLA-PEG/Cur 52,9 25 70,5 24,9 70,4
18 Ảnh cộng hưởng từ hạt nhân hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur Ảnh cộng hưởng từ hạt nhân chụp trên thiết bị Bruker 7 Tesla theo chế độ trọng T 2 của mẫu Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA- PEG/Cur được giới thiệu trên Hình 4.10. Mẫu nước ở giữa có ảnh mầu trắng là mẫu có nồng độ CLT C (S1) = 0 µg/mL. Hình 4.10. So sánh độ tương phản ảnh cộng hưởng từ hạt nhân theo chế độ trọng T1 và T2 của các hạt nano Fe3O4@PLA-PEG (A) và Fe3O4@PLA-PEG/Cur (B) Kết quả cho thấy hệ nano CLT chứng tỏ là một hệ đa chức năng (tương phản MRI, mang nhả thuốc và cả điều trị nhiệt từ - trình bày ở mục sau) ứng dụng cho chẩn đoán và điều trị trong y sinh. Kết quả đốt nóng cảm ứng từ của hệ nano Fe3O4@PLA-PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur Hiệu ứng đốt nóng cảm ứng từ của các hạt nano Fe3O4@PLA- PEG và Fe3O4@PLA-PEG/Cur sau khi được phân tán trong nước được nghiên cứu bằng phương pháp đo lường nhiệt trên hệ đốt từ dùng từ trường xoay chiều cường độ từ 0 – 800 Oe, ở tần số 310 kHz tại Trường ĐH Nam Florida. Với những kết quả như đã trình bày, hiệu ứng đốt nóng của các hạt nano được bọc rất đáng được quan tâm và chúng có thể được sử dụng hiệu quả trong điều trị bằng nhiệt từ trị.