Tóm tắt Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu bệnh đốm đen (Phaeoisariopsis personata) hại lạc tại Nghệ An

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

31
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài đã xác định được các đặc điểm sinh học, dịch tễ đặc trưng của nấm, đánh giá được thiệt hại năng suất do bệnh đốm đen gây ra đối với cây lạc và nghiên cứu biện pháp phòng trừ bệnh một cách hệ thống. Kết quả nghiên cứu của đề tài đã khẳng định được tầm quan trọng của bệnh đồng thời giải thích được sự gây bệnh của nấm P. personata hại lạc trên đồng ruộng, tìm ra thời điểm xử lý bệnh hiệu quả, từ đó làm cơ sở cho việc đề xuất và áp dụng các biện pháp phòng trừ nhằm giảm thiểu thiệt hại của bệnh một cách hiệu quả, góp phần nâng cao năng suất và phẩm chất lạc.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu bệnh đốm đen (Phaeoisariopsis personata) hại lạc tại Nghệ An

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGÔ THỊ MAI VI NGHIÊN CỨU BỆNH ĐỐM ĐEN (Phaeoisariopsis personata) HẠI LẠC TẠI NGHỆ AN CHUYÊN NGÀNH : BẢO VỆ THỰC VẬT MÃ SỐ : 62 62 01 12 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI, 2017
Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn: PGS.TS. NGUYỄN VĂN VIÊN Phản biện 1: PGS.TS. Ngô Bích Hảo Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 2: PGS.TS. Nguyễn Kim Vân Hội Khoa học kỹ thuật Bảo vệ thực vật Việt Nam Phản biện 3: TS. Hà Minh Thanh Viện Bảo vệ thực vật Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bệnh đốm đen do nấm Phaeoisariopsis personata (giai đoạn vô tính) hay Mycosphaerella berkeleyi (giai đoạn hữu tính) là một trong các bệnh hại lá nguy hiểm nhất đối với cây lạc trên toàn thế giới. Thiệt hại năng suất do bệnh đốm đen trên toàn cầu ước tính gần 3 triệu USD (CABI, 2006). Mức độ thiệt hại năng suất của bệnh đốm đen hại lạc thay đổi từ 10 – 80%, tùy theo khu vực và vụ trồng (CABI, 2006; Zhang, 2001; Dwivedi, 2003; Pensuk, 2003; Khedikar, 2010). Trên đồng ruộng, nấm tạo cả 2 giai đoạn sinh sản vô tính và hữu tính nhưng bào tử phân sinh hình thành từ tàn dư tồn tại trong đất là nguồn bệnh quan trọng nhất. Nhìn chung, nấm gây bệnh đốm đen không truyền qua hạt nhưng được xem là tác nhân truyền qua đất. Khi bắt đầu vụ trồng, bào từ phân sinh nấm từ tàn dư trong đất sẽ nhiễm các lá phía dưới và nhanh chóng phát tán lên các lá phía trên và có thể gây tàn lụi bộ lá nếu điều kiện ngoại cảnh thuận lợi (McDonald et al., 1985). Tác nhân gây bệnh đốm đen là một loài nấm túi thuộc nhóm sinh dưỡng “biotrophe” và quan hệ của nấm với cây lạc tuân theo quan hệ gen đối gen điển hình. Hiện nay đã có một số nghiên cứu trên thế giới về tính kháng của cây lạc đối với nấm gây bệnh đốm đen ((Dwivedi et al., 2002; Mace et al., 2006; Mondal and Badigannavar 2009; Mondal et al., 2009; Mallikarjuna et al., 2012). Các chủng nấm khác nhau về nền di truyền có thể có phản ứng mẫn cảm khác nhau đối với thuốc hóa học cũng như khác nhau về tính gây bệnh trên các giống cây (Adiver et al., 2009). Vì vậy, mức độ đa dạng về các đặc điểm sinh học cũng như di truyền của nấm gây bệnh đốm đen nói riêng và tác nhân gây bệnh nói chung cần phải được nghiên cứu để áp dụng hiệu quả các biện pháp phòng chống nhưng có rất ít nghiên cứu về mức độ đa dạng của nấm gây bệnh được thực hiện. Cho tới nay, mới chỉ có 2 nghiên cứu về mức độ đa dạng phân tử của nấm gây bệnh đốm đen hại lạc tại Ấn Độ dựa trên phân tích RAPD (Adiver et al., 2009) và phân tích phổ isozyme (Adiver et al., 2008). Tương tự cũng chỉ có 2 nghiên cứu về mức độ biến động về tính gây bệnh của nấm gây bệnh đốm đen (Hossain, 1997; Hossain and Ilag, 2000). Tại Nghê ̣ An nói riêng và Việt Nam nói chung, bệnh đốm đen hại lạc xuất hiện và gây hại phổ biến trên đồng ruộng. Tuy nhiên, cho tới nay, chưa có một công trình nào nghiên cứu sâu và thực hiện một cách hệ thống về bệnh này ở Việt Nam. Bên ca ̣nh đó, do bệnh hiếm khi làm chết cây nên người dân cũng như các cơ quan chuyên môn chưa thâ ̣t sự ý thức đươ ̣c tác ha ̣i của nhóm bê ̣nh ha ̣i lá đế n năng suấ t và phẩ m chấ t la ̣c. Chı́nh vı̀ vậy, công tác chı̉ đa ̣o trong phòng trừ bê ̣nh chưa phù hơ ̣p dẫn đế n sự giảm sút nghiêm tro ̣ng về năng suất cũng như phẩ m chấ t la ̣c của vùng. Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên, việc nghiên cứu về bệnh đốm đen hại lạc là cần thiết ở Việt Nam. Nghiên cứu này tập trung vào đánh giá thiệt hại, mức độ đa dạng của nấm cũng như đánh giá một số biện pháp phòng trừ bệnh trong điều kiện tỉnh Nghệ An. 1
Các kết quả nghiên cứu của luận án sẽ là cơ sở để nghiên cứu và ứng dụng các biện pháp trừ bệnh đốm đen nhằm phòng chống hiệu quả sự phát triển, lây lan của bệnh trên đồng ruộng, góp phần làm tăng năng suất và phẩm chất lạc. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Đánh giá được thiệt hại, mức độ đa dạng và biện pháp phòng trừ nấm P. personata gây bệnh đốm đen hại lạc tại Nghệ An. 1.3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu Bệnh đốm đen hại lạc do nấm P. personata gây ra. 1.3.2. Phạm vi nghiên cứu Đề tài tập trung nghiên cứu về đa dạng phân tử, đặc tính sinh học, tính gây bệnh và một số biên pháp phòng chống nấm P. personata. 1.3.3. Địa điểm, thời gian nghiên cứu Điều tra, đánh giá tác hại và nghiên cứu về bệnh đốm đen hại lạc tại Nghệ An. Mẫu bệnh đốm đen được thu thập tại Nghệ An và một số tỉnh khác như Lào Cai, Thanh Hóa, Hà Tĩnh và Đồng Nai. Đề tài được thực hiện từ năm 2012 đến năm 2015. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đề tài đã đánh giá được thiệt hại năng suất do bệnh đốm đen gây ra đối với cây lạc ngoài đồng ruộng tại Nghệ An. Trên giống lạc L14, bệnh đốm đen có thể làm giảm năng suất tới 30,24% trong vụ xuân và tới 49,90% trong vụ thu. Bổ sung thông tin về phân loại nấm đốm đen hại lạc tại Nghệ An. Trình tự vùng gen ITS của 11 mẫu nấm thu thập đã cho thấy chúng thuộc loài Phaeoisariopsis personata (giai đoạn vô tính) hay Mycosphaerella berkeleyi (giai đoạn hữu tính). Dựa trên phân tích Rep - PCR cũng đã chứng tỏ quần thể nấm ở Nghệ An có mức độ đa dạng thấp và không có mối quan hệ giữa các nhóm phả hệ với đặc điểm hình thái, nguồn gốc của câc mẫu nấm thu thập. Xác định được các đặc điểm sinh học và dịch tễ đặc trưng của nấm P. personata tại Nghệ An. Trong đó, khám phá khoa học quan trọng nhất là xác định được dạng sinh sản hữu tính của nấm chưa phát hiện thấy trong điều kiện tự nhiên tại Nghệ An. Kết quả nghiên cứu của luận án đã chứng tỏ thuốc hoạt chất Carbendazime, dịch chiết thực vật từ cây cà độc được (Datura metel) và cây trầu không (Piper betel) có khả năng phòng chống hiệu quả nấm P. personata trong điều kiện phòng thí nghiệm, trong nhà lưới cũng như ngoài đồng ruộng. Ở ngoài đồng ruộng, có hai thời điểm xử lý bệnh đốm đen hiệu quả nhất, bao gồm phun khi cây mọc 5 tuần, 6 tuần hoặc khi cây mọc 8 tuần và 9 tuần. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài đã bổ sung, đóng góp mới những dữ liệu khoa học về định danh nấm đốm đen bằng giải trình tự vùng ITS. Đặc biệt, dựa trên phân tích Rep - PCR đã chứng tỏ quần thể nấm ở Nghệ An có mức độ đa dạng thấp và 2
không có mối quan hệ giữa các nhóm phả hệ với đặc điểm hình thái, nguồn gốc của câc mẫu nấm thu thập. Kết quả nghiên cứu này gợi ý đối với nấm gây bệnh đốm đen hại lạc ở Nghệ An, các biện pháp quản lý bệnh có thể được áp dụng đồng loạt trên toàn tỉnh và tạo hiệu quả phòng chống giống nhau. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài đã xác định được các đặc điểm sinh học, dịch tễ đặc trưng của nấm, đánh giá được thiệt hại năng suất do bệnh đốm đen gây ra đối với cây lạc và nghiên cứu biện pháp phòng trừ bệnh một cách hệ thống. Kết quả nghiên cứu của đề tài đã khẳng định được tầm quan trọng của bệnh đồng thời giải thích được sự gây bệnh của nấm P. personata hại lạc trên đồng ruộng, tìm ra thời điểm xử lý bệnh hiệu quả, từ đó làm cơ sở cho việc đề xuất và áp dụng các biện pháp phòng trừ nhằm giảm thiểu thiệt hại của bệnh một cách hiệu quả, góp phần nâng cao năng suất và phẩm chất lạc. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TÌNH HÌNH SẢN XUẤT LẠC TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM Cây lạc đứng hàng thứ hai sau cây đậu tương trong số các cây trồng ngắn ngày lấy dầu thực vật (cả về diện tích và sản lượng) và được trồng rộng rãi ở hơn 100 quốc gia trên thế giới. Theo số liệu của Tổ chức Nông Lương Thế giới (2013), từ năm 2000 đến 2012, cùng với sự gia tăng về năng suất, sản lượng lạc thế giới cũng tăng lên, đạt cao nhất là 38,4 triệu tấn (năm 2008), sau đó giảm xuống cùng với sự tụt giảm diện tích trồng, do đó sản lượng lạc năm 2010 chỉ đạt 35,9 triệu tấn (FAO, 2013). Các nước có sản lượng lạc lớn nhất trong niên vụ 2011/2012 là Trung Quốc, Ấn Độ, Nigeria và Mỹ. Trung Quốc là nước đứng đầu với 16,8 triệu tấn, tiếp theo là Ấn Độ với 5,78 triệu tấn và Việt Nam là nước đứng thứ 12 với sản lượng 0,47 triệu tấn (FAO, 2013). Sản xuất lạc tại Việt Nam được phân bố ở hầu hết các vùng sinh thái nông nghiệp với diện tích trồng lạc chiếm khoảng 28% tổng diện tích cây công nghiệp hàng năm, tập trung chủ yếu ở các vùng như Duyên hải Nam Trung Bộ, Đồng bằng sông Hồng, Trung du và miền núi phía Bắc và Bắc Trung Bộ. Theo số liệu của Tổng cục Thống kê Việt Nam (2013), trong vòng 10 năm từ 2002-2012, mặc dù diện tích giảm từ 246,7 nghìn ha (năm 2002) xuống còn 220,5 nghìn ha (năm 2012) nhưng sản xuất lạc ở Việt Nam đã có những bước chuyển biến tích cực về năng suất, tăng từ 1,62 tấn/ha (năm 2002) lên 2,13 tấn/ha (năm 2012). Sản lượng tăng từ 400,4 nghìn tấn (năm 2002) lên 470,6 nghìn tấn (năm 2012). Năm 2012, năng suất lạc bình quân cả nước đạt cao nhất là 2,13 tấn/ha. Sản lượng lạc của cả nước đạt cao nhất vào năm 2008 với 530,2 nghìn tấn (bảng 2.2). 2.2. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH ĐỐM ĐEN HẠI LẠC Năm 1985, Ellis và Everhad khi kiểm tra mẫu bệnh ở Alabama và Nam Carolina đã có kết luận rằng nấm bệnh thuộc loại Cercospora sp. và đặt tên là Cercospora personatum. Hiện nay, tên nấm này được đổi thành Phaeoisariopsis personata (giai đoạn vô tính) hay Mycosphaerella berkeleyi (giai đoạn hữu tính). 3
Theo số liệu của Trung tâm Sinh học Nông nghiệp Quốc tế (CABI, 2006), tính trên toàn thế giới, bệnh đốm nâu và đốm đen có thể làm giảm năng suất lạc từ 10 - 80%, con số này thay đổi tùy theo từng khu vực và mùa vụ khác nhau. Theo Khedikar et al. (2010), khi cây lạc vừa bị ảnh hưởng của bệnh rỉ sắt và bệnh đốm đen thì năng suất có thể giảm 50 - 70%. Ở Pakistan, khi tỷ lệ cây nhiễm bệnh đốm đen lên đến 87,2% thì thiệt hại năng suất lên đến 70% (Ijaz et al., 2011). Ở Bangladesh, bệnh đốm lá lạc do nấm C. arachidicola và C. personatum làm giảm năng suất lạc từ 30 - 48% (Hasan et al., 2016). Ở Việt Nam, theo Mehan and Hong (1994), bệnh rỉ sắt Puccinia arachidis và bệnh đốm đen hại lạc Phaeoisariopsis personata là hại bệnh hại lá chính trên lạc, phân bố ở khắp các vùng trồng trong cả nước. Hai bệnh này kết hợp với nhau làm giảm 30 - 70% năng suất lạc Bệnh đốm đen có thể gây hại ở tất cả các bộ phận trên mặt đất của cây lạc như thân, cành nhưng lá là bộ phận bị hại nặng nhất. Nấm sản sinh ra độc tố Cercosporin kìm hãm sự hoạt động của lá gây hiện tượng rụng lá sớm. Bệnh có thể phát sinh gây hại ở ngưỡng nhiệt độ 18 - 35oC và nhiệt độ tối thích là 18 - 23oC (Pande et al., 2004). Trên đồng ruộng, nấm tạo cả 2 giai đoạn sinh sản vô tính và hữu tính nhưng bào tử phân sinh hình thành từ tàn dư tồn tại trong đất là nguồn bệnh quan trọng nhất (CABI, 2006). Các cây ký chủ của bệnh đốm đen mới được ghi nhận ở các loài thực vật thuộc chi Arachis mà chưa ghi nhận ở các loài thực vật nào khác ngoài chi Arachis này (Arsule and Pande, 2012). Theo Abdou and Cooper (1974) và Butler et al. (1994), nấm C. personatum sinh trưởng và sinh bào tử tốt nhất trên môi trường WA + PLX và OMA + PLX ở ngưỡng nhiệt độ 25°C. Kết quả nghiên cứu của Abdou and Cooper (1974) cũng cho thấy, nấm C. personatum sinh bào tử tốt nhất khi nuôi cấy ở điều kiện chiếu sáng hoàn toàn nhưng khi nuôi cấy ở điều kiện tối hoàn toàn thì nấm không sinh bào tử.. Tác giả Zhang et al. (2001) đã tiến hành thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo nấm gây bệnh đốm đen hại lạc C. personatum lên giống lạc Florunner trong nhà lưới, ở điều kiện nhiệt độ 25 - 28oC, cường độ chiếu sáng 14h/ngày, sau đó đánh giá mức độ bệnh ở 3, 4, 5, 6, 7 và 8 tuần tuổi. Kết quả cho thấy, chỉ số bệnh trên cây 5 tuần tuổi đạt cao nhất. Khi lây nhiễm với nồng độ 1,6 × 105 bào tử/ml thì chỉ số bệnh cao hơn so với công thức lây nhiễm với mật độ độ 1,6 × 103 bào tử/ml và 1,6 × 104 bào tử/ml. 2.3. NHỮNG NGHIEN CỨU VỀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ BỆNH ĐỐM ĐEN * Biện pháp canh tác Biện pháp canh tác như vệ sinh đồng ruộng, thu dọn tàn dư cây bệnh và nhổ bỏ cỏ dại có tác dụng phòng chống hiệu quả bệnh đốm đen (CABI, 2006; Gaddamwad et al., 2014). * Sử dụng giống kháng Sử dụng giống kháng bệnh được coi là ưu tiên hàng đầu trong phòng chống bệnh đốm đen hại lạc. Nhiều tác giả trên thế giới đã chỉ ra rằng, sử dụng giống kháng bệnh có hiệu quả nhất. Nhiều dòng/giống lạc kháng bệnh đã được nghiên cứu và đưa vào trong sản xuất như LGN123, LGN184, LGN117, GPBD4, VG9816, RHRGS 06083, RHRGS 06092, ICG 5286, ICG 2273, ICG 111426 và ICG 6022 (Kukanur et al., 2014; Kahate et al., 2015). 4
Ở Việt Nam, Lưu Minh Cúc (2009) đã nghiên cứu chỉ thị vi vệ tinh trong lập bản đồ gen kháng bệnh đốm đen ở cây lạc. Phân tích đa dạng di truyền 32 giống lạc cho kết quả 46/104 chỉ thị cho đa hình giữa các giống. Sử dụng phương pháp chọn giống truyền thống kết hợp chỉ thị phân tử rút ngắn được thời gian chọn giống và chọn ra 17 dòng mang gen kháng bệnh. * Sử dụng nấm đối kháng Trong số các nấm đối kháng có khả năng ứng dụng trong phòng chống bệnh cây, nấm Chaetomium có tiềm năng lớn. Nấm Chaetomium là một trong những loại nấm túi hoại sinh lớn nhất với trên 300 loài đã được mô tả (von Arx, Guarro et al. 1986). Một số loài Chaetomium, chủ yếu là các chủng thuộc 2 loài C. Globosum và C. cupreum đã được chứng tỏ có hoạt tính ức chế nhiều loài nấm gây bệnh cây truyền qua đất như Phytophthora spp., Pythium ultimum, Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici và một số nấm hại phần trên mặt đất như Venturia inequalis, Pyricularia oryzae, Botritis cinera, Phomopsis, Colletotrichum (Soytong et al., 2001; Aggarwall et al., 2004). Tuy nhiên, chưa có bất cứ nghiên cứu nào về sử dụng nấm Chaetomium trong phòng chống bệnh đốm đen hại lạc do nấm P. personata gây ra đã được công bố. * Sử dụng dịch chiết thực vật Theo Singburaudom (2015), hoạt chất hydroxychavicol trong dịch chiết thô từ lá trầu không là thành phần có hoạt tính chống nấm gây bệnh thực vật. Tác giả đã đánh giá tính kháng của dịch chiết đối với một số loại nấm như Colletotrichum gloeosporioides, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Sphaceloma ampelinum, v.v... Kết quả cho thấy, dịch chiết xuất thô từ lá trầu không ức chế sự hình thành sợi nấm và sự nảy mầm của bào tử. Ở nồng độ 1% và 10%, dịch chiết lá trầu không có khả năng ức chế 100% các loại nấm thử nghiệm trong điều kiện in vitro. Theo Kishore et al. (2001), dịch chiết từ lá cà độc dược (Datura metel L.) có tác dụng tốt trong việc ức chế khả năng nảy mầm của nấm gây bệnh đốm đen hại lạc. Khi thử nghiệm với các nồng độ từ 0,01 - 10%, sau 24h, khả năng ức chế sự nảy mầm của nấm gây bệnh đốm đen đều đạt kết quả tốt, từ 93,9 - 100%. Nồng độ dịch chiết 2% có khả năng ức chế hơn 60% sự hình bào tử của nấm P. personata gây bệnh đốm đen hại lạc trong điều kiện nhà lưới. Ở ngoài đồng ruộng, sử dụng dịch chiết từ lá cà độc dược (D. metel L.) có khả năng ức chế tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh đối với nấm P. personata gây bệnh đốm đen hại lạc đến khi thu hoạch (115 ngày sau trồng). Theo Kishore and Pande (2005), ở ngoài đồng ruộng, sử dụng dịch chiết cà độc dược (D. metel L.) phun lên cây lạc ở các thời điểm 45, 60, 75 và 90 ngày sau trồng đều có hiệu quả phòng trừ bệnh đốm đen do nấm P. personata đến 95 ngày sau trồng. * Phòng chống bằng chất kích kháng Theo Zhang et al. (2001), lây nhiễm nấm gây bệnh đốm đen hại lạc C. personatum trong điều kiện nhà lưới, sau đó xử lý bằng các chất kích kháng như salicylic acid, sodium salicylate, isonicotinic acid, or benzo [1,2,3]thiadiazole-7- carbothioc acid S-methyl ester (Actigard) khi cây được 4 tuần tuổi. Các chất kích 5
kháng SA, NaSA, BABA và INA được xử lý với nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0 mg/ml; trong khi đó Actigard được xử lý với nồng độ 0,05; 0,10; 0,15 và 0,20 mg/ml. Kết quả thí nghiệm cho thấy, mức giảm chỉ số bệnh đốm đen hại lạc không có sự sai khác rõ ràng giữa các công thức thí nghiệm. Khi xử lý các chất kích kháng đối với bệnh đốm đen hại lạc C. personatum thì cây lạc không tạo cảm ứng hệ thống giống như một số loại cây trồng khác. * Phòng chống bằng thuốc hoá học Thuốc hóa học có hiệu quả cao trong phòng chống bệnh đốm đen và được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới. Theo Johnson and Subrahmanyam (2003), sử dụng hexaconazole (nồng độ 0,2%) phun vào thời điểm cây được 60 ngày và 75 ngày tuổi, chỉ số bệnh đốm lá lạc là 18,8% và năng suất tăng lên 43%. Theo Pappachan et al. (2015), phun thuốc BVTV thuộc nhóm carbendazim (0,1%), carbendazim + mancozeb (0,2%), difenconazole (0,1%) và tebuconazole (0,1%) có hiệu quả cao trong phòng trừ bệnh đốm đen hại lạc, trong đó phun thuốc carbendazime (0,1%) có năng suất lạc cao nhất và có hiệu quả kinh tế cao nhất. PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.1.1. Vật liệu, thiết bị và hóa chất nghiên cứu - Vật liệu nghiên cứu: Giống lạc trồng phổ biến tại Nghệ An (giống L14 và giống Sen Lai) và 33 mẫu lá lạc bị bệnh đốm đen được thu thập tại Nghệ An và một số tỉnh khác như Lào Cai, Thanh Hóa, Hà Tĩnh và Đồng Nai. - Thiết bị nghiên cứu: Máy PCR, tủ lạnh bảo quản mẫu, nồi hấp khử trùng môi trường, buồng nuôi cấy nấm, kính hiển vi, bể ổn nhiệt, v.v... - Hoá chất dùng trong kỹ thuật PCR và các hóa chất khác như thuốc bảo vệ thực vật (Topsin M 70WP, Anvil 5SC, Daconil 75WP, Carbenvil 50SC), chất kích kháng: Salicylic acid, Bion 50WG, Oligochitosan, Aliette 800WG (Aliette 800WG là thuốc trừ bệnh nhưng cơ chế tác động của thuốc có khả năng kích kháng nên trong nội dung nghiên cứu của luận án đã sử dụng Aliette 800WP như chất kích kháng). - Chế phẩm sinh học: Chế phẩm Ketomium và chế phẩm EMINA - Dịch chiết thực vật: Dịch chiết lá cà độc được (Datura metel L.) và lá trầu không (Piper betle L.). - Môi trường nuôi cấy: WA, PDA, OMA, v.v... 3.1.2. Địa điểm nghiên cứu + Điều tra đồng ruộng, đánh giá thiệt hại của bệnh và các thí nghiệm phòng trừ ngoài đồng ruộng được thực hiện tại tỉnh Nghệ An. + Các nghiên cứu liên quan đặc điểm sinh học, tính gây bệnh và mức độ đa dạng phân tử được thực hiện tại: - Bộ môn bệnh cây, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. - Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. - Trung tâm Thực hành thí nghiệm và Trại thực nghiệm Nông học, Khoa Nông Lâm Ngư, Trường Đại học Vinh. 6
3.1.3. Thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện tử năm 2012 đến năm 2015. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Đánh giá mức đô ̣ phổ biế n và tác ha ̣i của bệnh đốm đen hại lạc tại Nghệ An - Xác đinh ̣ loài nấ m gây bê ̣nh đố m đen và đánh giá mức độ đa dạng phân tử của các mẫu nấm thu thập được - Nghiên cứ u mô ̣t số đặc điểm sinh học của nấ m gây bê ̣nh đố m đen ha ̣i la ̣c - Nghiên cứu biện pháp phòng trừ bê ̣nh đố m đen hại lạc do nấm P. personata gây ra 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Phương pháp điều tra theo QCVN 01- 38: 2010/BNNPTNT. - Phương pháp đánh giá thiệt hại của bệnh đốm đen hại lạc đến sinh trưởng và năng suất lạc được thực hiện theo Das and Roy (1995). - Phương pháp phân lập đơn bào tử được thực hiện theo Urashima et al. (1993). - Các mẫu nấm thuần được chiết DNA tổng số theo phương pháp của Doyle and Doyle (1987). - Hai mồi ITS4 và ITS5 (White et al., 1990) đã được sử dụng để nhân toàn bộ vùng ITS của các mẫu nấm. - Tìm kiếm trên cơ sở dữ liệu Genbank bằng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Mức độ đa dạng di truyền của nấm gây bệnh đốm đen lạc được đánh giá bằng kỹ thuật Rep-PCR theo Versalovic et al. (1991, 1994). + Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng và môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng và sinh bào tử của nấm P.personata được thực hiện theo Stenglein et al. (2006). + Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ bào tử và tuổi lá đến khả năng gây bệnh của nấm P. personata bằng phương pháp lá tách được thực hiện theo Mallikarjuna (2012). - Đánh giá tính gây bệnh trong điều kiện chậu vại/ô nhỏ được thực hiện theo Aquino et al. (1995). - Phương pháp đánh giá khả năng phòng chống bệnh đốm đen hại lạc bằng thuốc hóa học được thực hiện theo Labrinos and Nutter (1993). - Phương pháp đánh giá khả năng phòng chống bệnh đốm đen hại lạc bằng chất kích kháng được thực hiện theo Zhang et al. (2001). - Phương pháp đánh giá khả năng phòng chống bệnh bằng dịch chiết thực vật được thực hiện theo Kishore et al (2001). - Phương pháp đánh giá khả năng phòng chống bệnh bằng phẩm sinh học được thực hiện theo Zhang et al. (2001). - Tính hiệu lực của thuốc, chát kích kháng, dịch chiết thực vật, chế phẩm sinh học theo công thức Abbott (1925). - Số liệu phân tích đa dạng di truyền của nấm được xử lý bằng phần mềm MEGA 7
6.0 và NTSys 2.0. Hệ số tương đồng cho từng cặp mẫu được tính toán theo công thức: S = (a+d)/(a+b+c+d). Trong đó. S là hệ số tương đồng, a là số băng giống nhau của 2 mẫu, b là số băng chỉ xuất hiện ở mẫu thứ i, c là số băng chỉ xuất hiện ở mẫu thứ j, d là số băng không xuất hiện ở cả 2 mẫu (nhưng xuất hiện ở các mẫu khác). - Số liệu điều tra được xử lý trong Microsoft Office Excel. Số liệu thí nghiệm được tính toán, xử lý thống kê theo phương pháp phân tích phương sai bằng chương trình IRRISTAT 4.0. PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. MỨC ĐỘ PHỔ BIẾN VÀ TÁC HẠI CỦA BỆNH ĐỐM ĐEN HẠI LẠC TẠI NGHỆ AN 4.1.1 Mức độ phổ biến của bệnh đốm đen hại lạc tại Nghệ An Bệnh đốm đen xuất hiện và gây hại phổ biến hàng năm trên các ruộng lạc tại Nghệ An trong cả vụ thu và vụ xuân. Trong vụ xuân và vụ thu từ năm 2012 đến năm 2014, từ vùng đồng bằng, đồng bằng ven biển đến vùng trung du và miền núi của tỉnh Nghệ An, Mức độ phổ biến của bệnh tại các điểm điều tra đều đạt mức tối đa là 100%, tất cả các ruộng điều tra đều bị nấm gây bệnh đốm đen P. personata gây hại. 4.1.2. Diễn biến bệnh đốm đen hại lạc tại Nghệ An Qua quá trình điều tra trong 3 vụ liên tiếp (vụ xuân 2013, vụ thu 2013, vụ xuân 2014) cho thấy, sự xuất hiện của bệnh phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng của cây. Bệnh bắt đầu xâm nhập khi cây bắt đàu ra hoa, đến khi cây bắt đầu đầm tia thì triệu chứng bệnh bắt đầu biều hiện. Bệnh phát triển ổn định và bắt đầu tăng nhanh khi quả lạc vào chắc và tiếp tục gây hại đến khi quả chín. Tuy nhiên, sự phát triển của bệnh phụ thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết, đặc biệt là độ ẩm và lượng mưa. Chính vì vậy, các huyện thuộc vùng đồng bằng ven biển như Diễn Châu, Nghi Lộc do lượng mưa nhiều và ảnh hưởng của gió biển nên bệnh phát triển mạnh và lây lan nhanh. Ở Nam Đàn, lượng mưa hàng năm ít hơn nên bệnh có xu hướng gây hại nhẹ hơn. Ở cả 3 huyện điều tra, điều kiện thời tiết mưa gió nhiều trong vụ thu thuận lợi cho bệnh phát triển nên mức độ gây hại của bệnh cao hơn và cây tàn lụi sớm hơn so với vụ xuân. 4.1.3. Ảnh hưởng của bệnh đốm đen đến sinh trưởng và các yếu tố cấu thành năng suất của cây lạc Mức độ thiệt hại của bệnh đến sinh trưởng và năng suất được đánh giá trong 2 vụ liên tiếp gồm vụ xuân vụ thu năm 2014. Kết quả cho thấy, bệnh đốm đen ảnh hưởng nghiêm trọng đên năng suất lạc, khi mức độ gây hại của bệnh càng cao thì năng suất càng giảm. Trong vụ xuân 2014, khi cây không bị bệnh (cấp 0) thì năng suất khi thu hoạch đạt 58,41 tạ/ha. Khi mức độ gây hại trung bình trên ruộng ở mức cấp 1 thì năng suất giảm 5,02% so với cấp 0. Khi mức độ gây hại trung bình trên ruộng ở mức cấp 3 thì năng suất giảm 17,0%. Khi mức độ gây hại trung bình trên ruộng ở mức cấp 5 thì năng suất giảm 30,24%. Khi mức độ gây hại trung bình trên ruộng ở mức cấp 7 thì năng suất giảm 43,28%. Thực tế điều tra cho thấy, cấp bệnh trung bình trên ruộng trong vụ lạc 8
xuân thường dao động từ cấp 3 đến cấp 5, do đó năng suất khi thu hoạch giảm tương ứng tử 17% đến 30,24%. Tương tự, trong vụ thu 2014, khi cây không bị bệnh (cấp 0) thì năng suất thu được là 35,09 tạ/ha. Khi mức độ gây hại trung bình trên ruộng ở mức cấp 1 năng suất giảm 7,24%. Khi mức độ gây hại trung bình trên ruộng ở mức cấp 3 thì năng suất giảm 18,02%. Khi mức độ gây hại trung bình trên ruộng ở mức cấp 5 thì năng suất giảm 34,23%. Khi mức độ gây hại trung bình trên ruộng ở mức cấp 7 thì năng suất giảm 49,90%. Khi mức độ gây hại trung bình trên ruộng ở mức cấp 9 thì năng suất giảm 64,38%. Thực tế điều tra cho thấy, cấp bệnh trung bình trên ruộng trong vụ lạc thu thường dao động từ cấp 5 đến cấp 7, do đó năng suất khi thu hoạch giảm tương ứng tử 34,23% đến 49,90%. Các số liệu trên cung cấp thông tin ban đầu về thiệt hại năng suất do bệnh đốm đen gây ra trên cây lạc tại Việt Nam. 4.2. XÁC ĐỊNH LOÀI NẤM GÂY BỆNH ĐỐM ĐEN VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG PHÂN TỬ CỦA CÁC MẪU NẤM THU THẬP ĐƯỢC 4.2.1. Xác định các mẫu nấm gây bệnh đốm đen hại lạc thu tại Nghệ An bằng giải trình tự vùng ITS Trong nghiên cứu này, 8 mẫu nấm gây bệnh đốm đen lạc phân lập từ bốn vùng sinh thái của tỉnh Nghệ An (Đồng bằng ven biển, Đồng bằng, Trung du và miền núi) cũng như 3 mẫu nấm gây bệnh đốm đen hại lạc thu tại Lào Cai, Hà Tĩnh và Đồng Nai đã được giải trình tự trình tự trực tiếp vùng ITS từ sản phẩm PCR. Sau khi lắp ráp và loại bỏ các đoạn nhiễu ở 2 đầu, các mẫu nấm đều có kích thước đoạn đọc được từ 441 – 496 bp. Trình tự các đoạn đọc được bao phủ vùng ITS1, 5.8S và ITS2 của chuỗi ITS, cho phép xác định chính xác nấm gây bệnh đốm đen tới mức loài (Goodwin et al., 2001). Đầu tiên, trình tự đọc được của 11 mẫu được sử dụng để tìm kiếm các chuỗi gần gũi trên GenBank. Kết quả tìm kiếm (BLAST SERCH) cho thấy tất cả 11 mẫu đều trùng khớp với 2 mẫu M. berkeleyi duy nhất trên GenBank (mã GenBank AB435066 và AY266147). Đáng chú ý, kết quả tìm kiếm cũng cho thấy hiện nay mới chỉ có 2 trình tự vùng ITS của nấm gây bệnh đốm đen hại lạc trên GenBank. Tiếp theo, trình tự vùng ITS của 11 mẫu nấm được so sánh với nhau và với 30 trình tự vùng ITS của các mẫu nấm Mycosphaerella đại diện sẵn có trên GenBank, kể cả 2 mẫu M. berkeikeyi (AY266147 và AB435066). Các mẫu nấm trên Genbank này là các mẫu chuẩn đã được công bố (Goodwin et al., 2001) (Bảng 4.1). Kết quả so sánh trình tự cho thấy trình tự vùng ITS của 11 mẫu nấm đều đồng nhất 100% với nhau chứng tỏ chúng đều là thành viên của cùng 1 loài. Khi so sánh trình tự của 11 mẫu nấm trong nghiên cứu này với trình tự của 30 mẫu nấm GenBank thấy chúng có mức đồng nhất rất cao, 99,7% và 100%, tương ứng với 2 mẫu nấm M. berkeleyi, AY266147 và AB435066, sẵn có trên GenBank. Tất cả 11 mẫu nấm trong nghiên cứu này đều có mức đồng nhất trình tự thấp hơn nhiều, từ 69,2% đến 94,2% đối với 28 mẫu nấm GenBank còn lại (Bảng 4.1). Phân tích phả hệ dựa trên trình tự vùng ITS cũng cho thấy 11 mẫu nấm trong nghiên cứu và 2 mẫu nấm M. berkeleyi sẵn có trên GenBank ở trên hình thành một 9
cụm loài rõ rệt, với giá trị thống kê boostrap 100% và tách biệt hẳn các nấm Mycosphaerrella khác (Hình 4.1). Bảng 4.1. So sánh trình tự vùng ITS của 11 mẫu nấm gây bệnh đốm đen hại lạc với các nấm Mycosphaerella Mức đồng Mã STT Tên giai đoạn vô tính Tên giai đoạn hữu tính nhất trình tự GenBank (%) 1 Phaeoisariopsis personata Mycosphaerella berkeleyi AB435066 100.0 2 Phaeoisariopsis personata Mycosphaerella berkeleyi AY266147 99.7 3 Dothistroma septospora Mycosphaerella pini AF013227 94.2 4 Cercospora arachidicola Mycosphaerella arachidis AF297224 93.5 5 Chưa xác định Mycosphaerella africana AF173314 93.3 6 Chưa xác định Mycosphaerella keniensis AF173300 93.3 Cercospora sorghi var. 7 Chưa xác định AF297233 83.4 maydis 8 Cercospora nicotianae Chưa xác định AF297230 83.3 9 Cercospora zeae-maydis Chưa xác định AF291709 83.1 10 Cercospora asparagi Chưa xác định AF297229 83.1 11 Cercospora beticola Chưa xác định AF297222 82.9 12 Cercospora kikuchii Chưa xác định AF291708 82.9 13 Cercospora sorghif Chưa xác định AF291707 82.9 14 Paracercospora fijiensis Mycosphaerella fijiensis AF181705 82.6 Mycovellosiella 15 Mycosphaerella tasmaniensis AF173307 82.6 tasmaniensis 16 Asteromella brassicae Mycosphaerella brassicicola AF297227 82.5 17 Cercospora kalmiae Chưa xác định AF297226 82.2 18 Pseudocercospora musae Mycosphaerella musicola AF181706 82.1 19 Ramularia brunnea Mycosphaerella fragariae AF173312 81.0 20 Ramularia brunnea Mycosphaerella fragariae AF297235 79.9 21 Uwebraunia ellipsoidea Mycosphaerella ellipsoidea AF173302 78.4 22 Chưa xác định Mycosphaerella marksii AF173316 77.7 23 Paracercospora fijiensis Mycosphaerella fijiensis AF297234 77.4 Colletogloeopsis 24 Mycosphaerella molleriana AF173301 75.2 molleriana 25 Septoria tritici Mycosphaerella graminicola AF181694 74.8 26 Lecanosticta acicola Mycosphaerella dearnessii AF260818 74.5 27 Uwebraunia juvenis Mycosphaerella juvenis AF173299 74.4 28 Cladosporium iridis Mycosphaerella macrospora AF297231 70.0 29 Cladosporium allii-cepae Mycosphaerella allii-cepae AB026160 69.6 30 Cladosporium herbarum Mycosphaerella tassiana AJ238469 69.2 10
Hình 4.1. Phân tích phả hệ dựa trên trình tự toàn bộ vùng ITS của 11 mẫu nấm gây bệnh hại đốm đen lạc thu tại Việt Nam (đánh dấu bằng chấm đen) và các mẫu nấm sẵn có trên GenBank. Cây được xây dựng bằng phương pháp NJ. Thanh bar trình bày khoảng cách di truyền. Giá trị ở các nốt là giá trị thống kê boostrap dưới dạng % (1000 lần lặp) và chỉ trình bày các giá trị >50% (Ngưỡng tin cậy nhìn chung là 75% có nghĩa trong 1000 lần lặp thì 750 lần các taxa phân nhóm với nhau). Kết quả so sánh trình tự và phân tích phả hệ vùng ITS đã chứng tỏ tất cả 11 mẫu nấm gây bệnh đốm đen hại lạc thu thập tại Nghệ An, Hà Tĩnh, Lào Cai và Đồng Nai là thành viên của loài M. berkeleyi. Nghiên cứu này cũng chứng minh trình tự vùng ITS rất bảo thủ trong loài M. berkeleyi và do đó không thể sử dụng trong phân tích đa dạng nhưng lại là chỉ thị phân tử rất tốt để định danh nấm gây bệnh đốm đen hại lạc M. berkeleyi. 11
4.2.2. Phân tích đa dạng di truyền của nấm gây bệnh đốm đen hại lạc dựa trên phân tích Rep - PCR 4.2.2.1. Phân tích Rep - PCR các mẫu nấm gây bệnh đốm đen hại lạc thu thập tại Việt Nam Kết quả phân tích Rep-PCR của 33 mẫu nấm gây bệnh đốm đen thu thập trên 4 giống gồm L14, L26, Sen Lai và Sen Nghệ An (Sen NA), trồng vụ xuân 2013 tại 4 tỉnh gồm Đồng Nai (2 mẫu), Nghệ An (29 mẫu), Thanh Hóa (1 mẫu), Lào Cai (1 mẫu) cho thấy, số băng sản phẩm của phản ứng PCR với bộ mồi BOX là 17 với kích thước từ ~ 0,15 kb tới ~ 2 kb (Bảng 4.2, Hình 4.2). Bộ mồi ERIC và REP không tạo các băng sản phẩm. Kiểm tra các băng sản phẩm trên gel agarose cho thấy bộ mồi BOX tạo tới 7 băng đa hình nằm gữa vị trí 0,3 kb và 2 kb (Hình 4.2). Bảng 4.2. Sản phẩm của phân tích Rep-PCR đối với 33 mẫu nấm gây bệnh đốm đen hại lạc Rep-PCR Số băng hình thành Số băng đa hình Kích thước băng tối đa (kb) ERIC-PCR 0 0 0 BOX-PCR 17 7 2.0 REP-PCR 0 0 0 17 7 Hình 4.2. Box-PCR trên 33 mẫu nấm dốm đen hại lạc M. berkeleyi thu thập ở 4 tỉnh năm 2013. Số thứ tự mẫu tương ứng với số thứ tự trong Bảng 4.8. M1 và M2 lần lượt là thang DNA 1 kb và 100 bp (GeneRuler 1 kb, GenRuler 100 bp, Thermo Scientific) với các băng tham khảo 250 bp và 1500 bp (M1), 100 bp và 500 bp (M2) được chỉ rõ bằng mũi tên. 4.2.2.2. Phân tích cụm sản phẩm Rep - PCR Các băng sản phẩm PCR của bộ mồi BOX đã được chuyển sang số liệu nhị phân để tạo dữ liệu đầu vào cho phân tích cụm dùng phần mềm NTSYS nhằm tìm hiểu mức độ đa dạng và quan hệ của các mẫu nấm gây bệnh đốm đen. Kết quả phân tích cụm cho bộ mồi BOX đã tạo ra 3 cụm mẫu nấm (ký hiệu là I, II, III) với ngưỡng phân chia dựa trên hệ số tương đồng là 83 %. Cụm III gồm 03 mẫu là NA 3.4, NA9.5, NA20.3, cụm II gồm 5 mẫu TH1, LC2, NA12.1, NA14.1, NA24.1, cụm I gồm 25 mẫu còn lại (Hình 4.3). Mặc dù chia thành 3 cụm nhưng do (i) PCR không tạo ra các sản phẩm khi dùng mồi Rep cũng như ERIC (chứng tỏ bộ gen của chúng giống nhau và không chứa các vị trí để gắn mồi) và (ii) mức tương đồng di truyền khá cao (83-99%) trong phân 12
tích dùng mồi BOX nên phân tích Rep - PCR đã chứng tỏ quần thể nấm gây bệnh đốm đen tại Nghệ An khá đồng nhất. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của chúng tôi là trong điều kiện thí nghiệm tại Nghệ An, qua 2 năm điều tra từ 2013 đến 2014, chưa phát hiện thấy hình thức sinh sản hữu tính của nấm đốm đen. Quan sát này cũng phù hợp với công bố của McDonald et al. (1985) rằng nấm đốm đen hại lạc khó hình thành giai đoạn sinh sản hữu tính ngoài tự nhiên. Hình 4.3. Phân tích cụm dựa trên số liệu BOX-PCR của các mẫu nấm gây bệnh đốm đen thu thập tại Việt Nam. Hệ số tương đồng được tính theo công thức tính hệ số phù hợp đơn giản (Simple Matching Coeficient). Các cây được vẽ theo phương pháp ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung bình số học ngang bằng (UPGMA) Phân tích χ2 đã được thực hiện nhằm tìm hiểu liệu có mối quan hệ giữa các cụm phả hệ với các nguồn gốc cũng như đặc điểm hình thái mẫu nấm. Phân tích χ2 đã cho thấy không có mối quan hệ giữa các nhóm nấm được phân biệt dựa trên phân tích Box-PCR với nguồn gốc của chúng (4 vùng sinh thái, 4 giống lạc), đặc điểm hình thái trên môi trường nuôi cấy nhân tạo (4 màu tản nấm, 4 nhóm kích thước tản nấm). Bảng 4.3. Quan hệ của các nhóm phả hệ với nguồn gốc địa lý, giống, đặc điểm hình thái Quan hê giữa nhóm phả hệ Độ tự χ2 p Kết luận* (I, II, III) với do df Giống (L14, L26, Sen Lai, Sen NA) 6 1,63 0,951 Không quan hệ Vùng sinh thái (Đồng bằng ven biển, 6 10,7 0,148 Không quan hệ Đồng bằng, Trung du, Miền núi) Màu tản nấm (Xám nhạt, Xám đậm, Xám 6 3,02 0,807 Không quan hệ hồng, Đen) Kích thước tản nấm (mm) (0-3,4; >3,4- 6 6,1 0,412 Không quan hệ 6,8; >6,8-10,1; >10,1) * Kết luận được dựa trên ngưỡng tin cậy chung là α = 0.05 13
Kết quả nghiên cứu trên gợi ý đối với nấm gây bệnh đốm đen ở Nghệ An, các biện pháp quản lý bệnh (giống kháng, thuốc hóa học, chế phẩm sinh học) có thể được áp dụng đồng loạt trên toàn tỉnh và tạo hiệu quả phòng chống giống nhau. 4.3. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA NẤM P. PERSONATA GÂY BỆNH ĐỐM ĐEN HẠI LẠC 4.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy và điều kiện ánh sáng đến sinh trưởng và sinh bào tử của nấm P. personata Nấm được nuôi cấy trên các môi trưởng khác nhau và được đặt ở ngưỡng nhiệt 0 độ 25 C, ủ trong bóng tối liên tục (24h tối) hoặc 12 giờ chiếu sáng xen kẽ 12 giờ ủ trong bóng tối (12h sáng 12h tối). Kết quả cho thấy, nấm sinh trưởng và sinh bào tử thuận lợi khi nuôi cấy ở điều kiện 12 giờ sáng xen kẽ 12 giờ tối. Trong 10 loại môi trường sử dụng trong thí nghiệm, môi trường PDA bổ sung dịch chiết lá lạc thuận lợi nhất cho sự sinh trưởng của nấm, đường kính tản nấm đo được sau 10 tuần có giá trị lớn nhất là 6,65 mm. Trên tất cả các môi trường nuôi cấy đều có sự hình thành bào tử. Trong đó, môi trường OMA và môi trường WA + dịch chiết lá lạc có lượng bào tử hình thành trên tản nấm nhiều nhất, lần lượt là 11,67.104 bào tử và 12,22.104 bào tử. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Abdou and Cooper (1974) là các môi trường như WA + PLX, OMA phù hợp nhất cho sự sinh trưởng của nấm, kích thước tản nấm đạt mức lớn nhất là 1- 3 mm. Ngược lại, khi nuôi cấy ở điều kiện ủ trong bóng tối liên tục (24h tối) nấm nấm P. personata sinh trưởng rất chậm và không sinh bào tử trên tất cả môi trường nuôi cấy. 4.3.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ bào tử và tuổi lá đên khả năng gây bệnh của nấm P. personata bằng phương pháp lá tách Kết quả thí nghiệm cho thấy, nồng độ bào tử sử dụng để lây nhiễm không ảnh hưởng đến thời gian ủ bệnh, vòng đời và đường kính vết bệnh của nấm P. personata nhưng lại ảnh hưởng lớn đến số vết bệnh trên lá, do đó ảnh hưởng đến diện tích lá nhiễm bệnh và tần số nhiễm của lá. Trong đó, khả năng gây bệnh của nấm khi lây nhiễm với nồng độ 5.105 bào tử/ml đạt mức cao nhất với số vết bệnh là 44,33 vết/lá kép, tỷ lệ diện tích lá nhiễm bệnh là 11,61% và tần số nhiễm đạt 1,29 vết/cm2. Tuổi lá ảnh hướng lớn đến khả năng gây bệnh của nấm P. personata. Bệnh biểu hiện triệu chứng nhanh nhất và hình thành bào tử sớm nhất trên lá 5 tuần tuổi, với thời gian ủ bệnh và vòng đời ngắn nhất là 13,33 ngày và 16,50 ngày. Như vậy, lá 5 tuần tuổi mẫn cảm nhất với nấm P. personata. Thực tế điều tra trên đồng ruộng cho thấy, bệnh đốm đen bắt đầu xuất hiện trên cây khi cây lạc bắt đầu đâm tia hình thành quả (tức khoảng 7 tuần sau khi cây mọc đối với vụ xuân và khoảng 6 tuần sau khi cây mọc đối với vụ thu), với thời gian tiềm dục khoảng 14 ngày thì bào tử nấm phải tiếp xúc khả nhiễm với lá khi cây lạc bắt đầu ra hoa (tức khi cây được 5 tuần tuổi đối với vụ xuân và 4 tuần tuổi đối với vụ thu). Như vậy giai đoạn cây lạc ra hoa là giai đoạn nẫm cảm nhất của cây lạc đối với bệnh đốm đen. 14
Kết quả nghiên cứu trên phù hợp với kết quả nghiên cứu của Zhang et al. (2001) là khi lây nhiễm nhân tạo nấm C. personatum lên giống lạc Florunner trong nhà lưới thì chỉ số bệnh trên cây 5 tuần tuổi đạt cao nhất. Kết quả này là cơ sở khoa học để đưa ra khuyến cáo cho công tác phòng trừ bệnh. Để nâng cao hiệu quả của các biện pháp phòng trừ cần tiến hành phun thuốc khi cây lạc bắt đầu ra hoa. Đây là thời điểm bào tử nấm P. personata trong đất bắt đầu tiếp xúc với tầng lá phía dưới và thực thiện quá trình xâm nhập, lây bệnh. Do đó khi xử lý vào thời điểm này sẽ làm giảm mức độ gây hại của bệnh do việc ức chế sự nảy mầm của bào tử và sự phát triển của sợi nấm khi mới bắt đầu xâm nhiễm. 4.4. NGHIÊN CỨU BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ BỆNH ĐỐM ĐEN HẠI LẠC DO NẤM P. PERSONATA GÂY RA 4.4.1.Nghiên cứu khả năng phòng trừ bệnh đốm đen hại lạc bằng biện pháp hóa học Một số loại thuốc hóa học đang sử dụng phổ biến trên thị trường Việt Nam được tập trung nghiên cứu, bao gồm Topsin M 70WP, Anvil 5SC, Daconil 75WP, Carbenvil 50SC nhằm mục đích tìm ra loại thuốc hóa học có khả năng phòng chống hiệu quả bệnh đốm đen. Hiệu lực của từng loại thuốc được đánh giá từ trong phòng thí nghiệm, đến nhà lưới và ra ngoài đồng ruộng trên giống lạc L14. * Ảnh hưởng của môṭ số loa ̣i thuốc hoá học đến khả năng nảy mầm của bào tử nấm Phaeoisariopsis personata trong điều kiện in vitro. Kết quả nghiên cứu cho thấy, Daconil 75WP và Carbenvil 50SC là hai loại thuốc có hiệu quả cao nhất trong việc ức sự nảy mầm của bào tử P. personata. Tại thời điểm 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ sau khi cấy ở tất cả các nồng độ thử nghiệm đều có hiệu lực đạt mức cao nhất là 100%. * Ảnh hưởng của mô ̣t số loa ̣i thuốc hoá học đến khả năng gây bệnh của nấm P. personata trên giống lạc L14 trong điều kiện in vivo Mặc dù thuốc Daconil 75WP được đánh giá là có khả năng ức chế hiệu quả sự nảy mầm của bào tử nấm P. personata trong điều kiện in vitro nhưng cũng không có tác dụng trong việc kéo dài thời gian ủ bệnh, đồng thời cũng không có tác dụng làm giảm đường kính vết bệnh. Tuy nhiên, do ức chế tốt sự nảy mầm của bào tử nên thuốc có tác dụng làm giàm mạnh số vết bệnh trên cây và khi sử dụng thuốc Daconil 75WP ở nồng 0,19% có tác dụng làm giảm SVB trên cây xuống mức thấp nhất là 30,33 vết. Carbenvil 50SC là thuốc có hiệu quả tốt nhất trong việc ức chế tính gây bệnh của nấm P. personata. Ngoài khả năng khống chế hiệu quả số vết bệnh xuất hiện trên cây, thuốc còn có khả năng ức chế sự phát triển của đường kính vết bệnh. Quan trọng hơn, thuốc có tác dụng kéo dài thời gian ủ bệnh, từ đó làm giảm số lượng chu kỳ xâm nhiễm trên đồng ruộng hay giảm số lần tái xâm nhiễm trong vụ trồng, do đó giảm được mức độ gây hại của bệnh. Trong đó, Carbenvil 50SC nồng độ 0,25% có hiệu quả tối ưu nhất với thời gian ủ bệnh đạt mức dài nhất là 26,78 ngày, số vết bệnh đạt mức thấp nhất là 27,78 vết và đường kính vết bệnh cũng ở mức thấp nhất là 1,53 mm. 15
* Đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh đốm đen hại lạc trên giống L14 của một số thuốc hoá học trong trong điều kiện nhà lưới. Thuốc Carbenvil 50SC ở nồng độ khuyến cáo (0,25%) có hiệu quả cao nhất, tại thời điểm 9 tuần và 12 tuần sau khi cây mọc, hiệu lực phòng trừ đạt 65,9% và 78,59%. Thuốc Daconil 75WP cũng có tác dụng phòng trừ bệnh đốm đen hại lạc tương đối tốt. Tuy nhiên, để có hiệu quả tốt nhất cần sử dụng nồng độ 5/4 khuyến cáo (0.19%). Tại thời điểm 9 tuần và 12 tuần sau khi cây mọc, hiệu lực phòng trừ bệnh đạt mức 63,66% và 72,32%. * Đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh đốm đen của một số thuốc hóa học trên giống lạc L14 ngoài đồng ruộng vụ xuân 2014 tại huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An Thuốc Carbenvil 50SC nồng độ 0,25% và Daconil 75WP nồng độ 0,19% được phun vào 3 thời điểm gồm: 1) Phun khi cây mọc 5 tuần và 6 tuần, đây là thời điểm cây bắt đầu ra hoa, lúc này bào tử trong đất bắt đầu tiếp xúc với tầng lá phía dưới để xâm nhập vào cây. Vì vậy phun vào thời điểm này nhằm khống chế lượng bào tử nảy mầm xâm nhập vào cây và ức chế sự phát triển của sợi nấm ngay từ ban đầu. 2) Phun khi cây mọc 7 tuần là thời điểm bệnh chớm xuất hiện trên đồng ruộng. Thời điểm này được lựa chọn để phun như khuyến cáo của các thuốc trừ bệnh trên thị trường. 3) Phun khi cây mọc 8 tuần và 9 tuần, thời điểm này các vết bệnh xuất hiện nhiều trên cây và bắt đầu hình thành bào tử để phát tán, lây lan. Vì vậy, phun thời điềm này nhằm khống chế sự hình thành bào tử trên vết bệnh, đồng thời ức chế sự nảy mầm, xâm nhập của những bào tử đã phát tán. Ba thời điểm trên cũng được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu về hiệu lực phòng trừ của những sản phẩm khác như chất kích kháng, chế phẩm nấm đối kháng và dịch chiết thực vật. Kết quả thí nghiệm với thuốc Carbenvil 50SC được thể thể hiện ở bảng 4.4. Bảng 4.4. Hiệu lực phòng trừ bệnh đốm đen của thuốc Carbenvil 50SC trên giống lạc L14 ngoài đồng ruộng vụ xuân 2014 tại huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An Khối lượng Nồng Thời điểm TLB CSB HLPT CT quả chắc/cây độ phun (%) (%) (%) (g) CT2 Khuyến Cây mọc 5 tuần + 6 tuần 83,33 9,75 82,14a 14,65a CT2 cáo Cây mọc 7 tuần 100,0 20,25 62,84b 13,42b CT3 (0,25%) Cây mọc 8 tuần + 9 tuần 86,67 10,62 80,56a 14,74a CT4 (Đ/C) Không phun 98,89 54,44 - 11,49c LSD0,05 7,00 1,19 Ghi chú: Giá trị trung bình trong cùng một cột mang các chữ cái khác nhau thì sai khác có ý nghĩa ở mức α = 0,05. Từ kết quả thí nghiệm (bảng 4.4) cho thấy, thuốc Carbenvil 50SC phát huy hiệu quả nhất khi phun vào thời điểm cây mọc được 5 tuần và 6 tuần (CT1). Hiệu quả phòng trừ bệnh đạt mức cao nhất là 82,14%, khối lượng quả chắc trên cây đạt 14,65 16
gam, tăng 27,5% so với đối chứng. Ở CT3, khi phun vào thời điểm 8 tuần và 9 tuần sau khi cây mọc thì hiệu quả phòng trừ tương đương với CT1, đạt mức 80,56% và khối lượng qua chắc đạt 14,74 gam/cây, tăng 28,29% so với đối chứng. Ở CT2, khi phun vào thời điểm bệnh chớm xuất hiện như các loại thuốc hóa học thường khuyến cáo thì hiệu quả phòng trừ bệnh kém nhất. Do lúc này các bào tử đã xâm nhập và phát triển trong cây và chuẩn bị biểu hiện triệu chứng nên phun lúc này không có tác dụng khống chế lượng nguồn bệnh xâm nhập vào trong cây ở giai đoạn đầu. Mặt khác, thời điểm này hầu hết các vết bệnh chưa biểu hiện triệu chứng nên cũng không khống chế được sự hình thành, phát tán, xâm nhiễm của bào tử trên các vết bệnh. Chính vì vậy, hiệu lực phòng trừ bệnh đạt mức thấp nhất là 62,84% và khối lượng quả chắc chỉ đạt mức 13,42 gam/cây, tăng 16,80% so với đối chứng. Tiếp tục thử nghiệm với thuốc Daconil 75WP ở nồng độ 5/4 khuyến cáo (0,19%), kết quả được thể hiện ở bảng 4.5. Bảng 4.5. Hiệu lực phòng trừ bệnh đốm đen của thuốc hóa học Daconil 75WP trên giống lạc L14 ngoài đồng ruộng vụ xuân 2014 tại huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An Khối lượng Nồng độ Thời điểm TLB CSB HLPT CT quả chắc/cây phun (%) (%) (%) (g) a CT1 5/4 khuyến Cây mọc 5 tuần + 6 tuần 97,78 15,06 72,05 13,68a CT2 cáo Cây mọc 7 tuần 96.67 31,97 40,40b 12,11b CT3 (0,19%) Cây mọc 8 tuần + 9 tuần 100,0 15,80 70,69a 13,42a CT4 (Đ/C) Không phun 96,67 53,70 - 11,23b LSD0,05 6,86 1,26 Ghi chú: Giá trị trung bình trong cùng một cột mang các chữ cái khác nhau thì sai khác có ý nghĩa ở mức α = 0,05. Từ kết quả thí nghiệm (bảng 4.5) cho thấy, khi phun thuốc vào thời điểm 5 tuần và 6 tuần sau khi cây mọc hoặc phun khi cây mọc 8 tuần và 9 tuần có hiệu quả phòng trừ bệnh tương đương nhau và đạt mức cao nhất. Khi tiến hành phun vào thời điểm 5 tuần và 6 tuần sau khi cây mọc thì hiệu lực phòng trừ đạt 72,05% và khối lượng quả chắc đạt 13,68 gam/cây, tăng 21,82% so với đối chứng. Khi tiến hành phun vào thời điểm 8 tuần và 9 tuần sau khi cây mọc thì hiệu lực phòng trừ bệnh đạt 70,69% và khối lượng quả chắc đạt 13,42%, tăng 19,5% so với đối chứng. Khi chỉ phun vào lúc bệnh chớm xuất hiện thì hiệu lực phòng trừ đạt mức thấp nhất là 40,40% và khối lượng quả chắc chỉ đạt 12,11 g/cây và không sai khác so với đối chứng. Như vậy, Carbenvil 50SC có hiệu quả phòng trừ bệnh đốm đen cao nhất. Để nâng cao hiệu lực phòng trừ bệnh, góp phần tăng năng suất lạc cần tiến hành phun 17
thuốc khi cây mọc được 5 tuần và 6 tuần hoặc phun khi cây mọc được 8 tuần và 9 tuần. 4.4.2. Nghiên cứu khả năng phòng trừ bệnh đốm đen hại lạc bằng chất kích kháng Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm tìm hiểu xem tính kháng SAR có hình thành trên cây lạc để chống lại bệnh đốm đen hay không. Bốn loại hóa chất gồm SA, Bion 50WG, Oligochitosan, Aliette 800WG sẽ được thử nghiệm trên giống lạc L14. * Ảnh hưởng của một số chất kích kháng đến khả năng gây bệnh của nấm P. personata trên giống lạc L14 trong điều kiện in vivo Kết quả thí nghiệm cho thấy, hầu hết các chất kích kháng được thử nghiệm không có tác dụng kéo dài thời gian ủ bệnh và đường kính vết bệnh ở các công thức thí nghiệm giảm không đáng kể so với đối chứng. Trong đó, Aliette 800WG ở nồng độ 0,4% có hiệu quả cao nhất với thời gian ủ bệnh là 15,33 ngày và số vết bệnh trên cây là 48,22 vết, tiếp đến là Chitonsan, còn SA có hiệu quả kém hơn và kém nhất là Bion 50WG. * Đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh đốm đen của một số chất kích kháng trên giống lạc L14 trong điều kiện nhà lưới. Các chất kích kháng được tiếp tục đánh giá trong điều kiện nhà lưới nhằm xác định chính xác hơn khả năng kích thích sự hình thành tính kháng SAR để phòng chống bệnh đốm đen trên cây lạc. Qua kết quả thí nghiệm cho thấy, Aliette 800WG và Chitosan là hai chất kích kháng có hiệu quả phòng trừ bệnh đốm đen cao nhất. Tuy nhiên, Aliette 800WG nồng độ 0,4% và Chitosan nồng độ 0,15% có hiệu quả cao nhất thì hiệu lực phòng trừ cũng chỉ đạt 43,56% và 40,43% tại thời điểm 12 tuần sau khi cây mọc. Nhìn chung, các chất kích kháng có hiệu quả phòng trừ bệnh đốm đen rất thấp, khả năng kích thích sự hình thành tính kháng tập nhiễm (SAR) để phòng chống bệnh đốm đen trên cây lạc của các hóa chất không cao. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Zhang and Reddy (2001). * Đánh giá hiệu lực phòng trừ bệnh đốm đen của một số chất kích kháng trên giống lạc L14 ngoài đồng ruộng vụ xuân 2014 tại huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An. Các công thức hiệu quả nhất trong điều kiện nhà lưới được lựa chọn để tiếp tục đánh giá ngoài đồng ruộng, bao gồm Bion 50WG nồng độ 0,15%, Alliet 800WG nồng độ 0,40%, SA nồng độ 0,1% và Chitosan nồng độ 0,15%. Từ kết quả thí nghiệm cho thấy, Aliette 800WG 0,4% và Chitosan 0,15% có hiệu lực phòng trừ bệnh cao nhất, tuy nhiên chỉ đạt mức 45,68% và 41,82%, khối lượng quả chắc đạt 12,25 gam/cây và 13,06 gam/cây, tăng 9,07% và 16,30% so với đối chứng. Kết quả này một lần nữa khẳng định rằng, sử dụng chất kích kháng để phòng trừ bệnh đốm đen hại lạc không hiệu quả. 4.4.3. Nghiên cứu khả năng phòng trừ bệnh đốm đen hại lạc bằng biện pháp sinh học Nghiên cứu này nhằm mục đích tìm ra loại chế phẩm sinh học phòng trừ hiệu quả bệnh đốm đen, góp phần tăng năng suất lạc đồng thời bảo vệ môi trường. 18