Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

23
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án "Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam" với mục tiêu xác định được các đặc điểm bệnh lý cơ bản của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của các chủng virus parvo phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam để định hướng công tác chẩn đoán, điều trị bệnh trên lâm sàng và chế tạo vắc xin phòng bệnh trong tương lai.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án Tiến sĩ: Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (CPV2) gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của một số chủng CPV2 lưu hành tại miền Bắc Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM VÕ VĂN HẢI NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA CHÓ MẮC BỆNH VIÊM RUỘT TIÊU CHẢY DO VIRUS PARVO TYPE 2 (CPV2) GÂY RA VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA MỘT SỐ CHỦNG CPV2 LƯU HÀNH TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM Ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9 64 01 02 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2023
Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn: PGS.TS. Bùi Trần Anh Đào PGS.TS. Lê Văn Phan Phản biện 1: GS.TS. Nguyễn Quang Tuyên Hội Thú y Phản biện 2: PGS.TS. Sử Thanh Long Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 3: PGS.TS. Phạm Công Hoạt Bộ Khoa học và Công nghệ Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện, họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ phút, ngày tháng năm 2023 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Trung tâm Thông tin - Thư viện Lương Định Của, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU Canine parvovirus type 2 (CPV2) gây ra Bệnh viêm ruột tiêu chảy trên chó. Bệnh có tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết cao, thường gặp ở chó dưới 1 năm tuổi và chó chưa được phòng bệnh bằng vắc xin. Bệnh xuất hiện với một số triệu chứng điển hình như: ủ rũ, bỏ ăn, sốt cao, nôn mửa, mất nước nhanh chóng và tiêu chảy phân có lẫn máu (Appel & cs., 1979; Hayes & cs., 1979; Vickers, 2017). Mặc dù ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về virus parvo cũng như bệnh của nó gây ra trên chó, nhưng những nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào một phần của vấn đề đơn lẻ. Chưa có nghiên cứu nào toàn diện về bệnh lý học và phân tích toàn bộ hệ gen của CPV2. Do CPV2 thường xuyên có những biến đổi về di truyền để hình thành nên những biến chủng virus mới, vì vậy rất cần những nghiên cứu liên tục về giải mã và phân tích bộ gen của CPV2 để xác định được nguồn gốc tiến hóa và sự biến đổi di truyền của các chủng CPV2 đã và đang gây bệnh trên chó theo không gian và thời gian khác nhau. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 1.2.1. Mục tiêu tổng quát Xác định được các đặc điểm bệnh lý cơ bản của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo gây ra và đặc điểm sinh học phân tử của các chủng virus parvo phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam để định hướng công tác chẩn đoán, điều trị bệnh trên lâm sàng và chế tạo vắc xin phòng bệnh trong tương lai. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể - Xác định được tỷ lệ mắc bệnh, đặc điểm sinh lý sinh hóa máu, triệu chứng, bệnh tích đại thể, bệnh tích vi thể của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo gây ra, mức độ gây hại đến các cơ quan bộ phận của virus parvo trong cơ thể chó mắc bệnh, nhằm đưa ra các khuyến cáo cho công tác phòng trị bệnh. - Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của vùng gen VP2 và trên toàn bộ bộ gen virus CPV2 phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam, từ đó cung cấp thông tin cập nhật về các chủng virus parvo đang lưu hành, làm căn cứ định hướng chế tạo vắc xin phòng bệnh. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU 1.3.1. Đối tượng nghiên cứu Là các cá thể chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 và các mẫu virus parvo phân lập được từ chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy mang đến khám điều trị tại phòng khám thú y 2Vet và một số phòng khám thú y khu vực phía Bắc Việt Nam (Hà Nội, Bắc Giang, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh). 1
1.3.2. Thời gian nghiên cứu Từ tháng 01 năm 2017 đến tháng 12 năm 2021 1.3.3. Địa điểm nghiên cứu - Bộ môn Bệnh lý - Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, - Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. - Hệ thống Thú y 2Vet và một số phòng khám khu vực phía Bắc Việt Nam. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đây là công trình nghiên cứu có tính hệ thống nghiên cứu đồng thời về bộ gen các chủng vi rút CPV2 đang lưu hành, gây bệnh trên đàn chó tại Việt Nam và lần đầu tiên sử dụng phương pháp hoá mô miễn dịch để xác định sự phân bố của CPV2 trong các tổ chức ở chó mắc VRTC do CPV2 gây ra tại Việt Nam. Các công bố của đề tài sẽ là những thông tin khách quan và mới nhất về căn bệnh này trên chó tại nước ta hiện nay. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài này góp phần bổ sung và hoàn thiện thêm hiểu biết về bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 gây ra trên chó tại Việt Nam. Luận án là tài liệu tham khảo chính thống và tương đối toàn diện về bệnh do CPV2 trên chó tại khu vực phía bắc Việt Nam. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn Góp phần giúp cho các bác sĩ thú y nâng cao hiệu quả trong việc chẩn đoán, chẩn đoán phân biệt, tiên lượng, điều trị bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2, đưa ra các khuyến cáo nhằm phòng ngừa và giảm thiểu thiệt hại do căn bệnh gây ra. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS PARVO Virus parvo có đường kính nhỏ (~25 nm), không có vỏ bao phủ. Cấu trúc ba chiều của CPV2 đã được xác định nhờ sử dụng tia X (Tsao & cs., 1991; Xie & Chapman, 1996). Virus này có bộ gen DNA thẳng, sợi đơn âm, kích thước khoảng 5.2kb, chứa hai khung đọc mở (ORF1 và ORF2). Một trong số đó mã hóa hai protein không cấu trúc NS1 và NS2 và một khung khác mã hóa hai protein cấu trúc khác VP1 và VP2. Các đặc tính kháng nguyên của virus parvo ở chó bị ảnh hưởng bởi sự thay thế axit amin trong trình tự VP2 (Strassheim, 1994). CPV2 thuộc chi Protovirus parvo, họ Parvoviridae, đã được đưa vào trong loài Carnivore protovirus parvo 1 theo Uỷ ban quốc tế về phân loại virus (Fernandes & cs., 2011). 2
2.2. BỆNH VIÊM RUỘT TIÊU CHẢY DO VIRUS PARVO TRÊN CHÓ 2.2.1. Dịch tễ học Năm 1967, virus parvo lần đầu tiên được phát hiện là một tác nhân gây bệnh tiêu hóa và hô hấp ở chó (Binn & cs., 1970). Sau đó, virus này được lấy tên là CPV1 (Lamm & cs., 2008). Các tác nhân gây bệnh đã được phân lập và dữ liệu cho thấy đây là một loài mới thuộc họ Parvoviridae (Parrish & cs., 1988), sau đó virus được đặt tên là CPV2. Do thiếu khả năng miễn dịch từ trước trong quần thể chó, virus đã lây lan nhanh chóng và đến năm 1980, virus đã được báo cáo phổ biến trên toàn thế giới (Pollock, 1984). 2.2.2. Triệu chứng lâm sàng Viêm ruột và viêm cơ tim là hai thể bệnh được mô tả ban đầu khi nhiễm CPV2. Ngày nay, viêm cơ tim do CPV2 rất hiếm thấy nhưng có thể nhiễm bệnh ở trong tử cung lúc mang thai hoặc ở chó con dưới 8 tuần tuổi sinh ra từ chó mẹ chưa được tiêm phòng. Viêm ruột cấp tính là biểu hiện phổ biến nhất của bệnh và chủ yếu gặp ở chó dưới 6 tháng tuổi. Dấu hiệu lâm sàng ban đầu là không đặc hiệu, bao gồm chán ăn, mệt mỏi và sốt. Các dấu hiệu điển hình sau này bao gồm nôn mửa và tiêu chảy, ruột non có thể có chất nhầy hoặc xuất huyết. Tình trạng mất nước, protein, sốc thường diễn ra rất nhanh chóng đối với chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 (Prittie, 2004). 2.2.3. Bệnh tích 2.2.3.1. Bệnh tích đại thể Virus xâm nhập trực tiếp và gián tiếp thông qua tiếp xúc phân chó bị bệnh hoặc qua đồ vật dính virus vào cơ thể gây tổn thương mạnh ống tiêu hóa đặc biệt ở dạ dày, ruột, mô bạch huyết, mô tạo máu gây tử vong (Decaro & cs., 2006). Tổn thương đại thể thu được bao gồm sung huyết và xuất huyết nghiêm trọng ở ống tiêu hóa, nhiều nhất là ở ruột, lòng ruột chứa nhiều niêm dịch và máu, xuất hiện các mảng nhợt nhạt ở ruột, cơ tim, ứ huyết ở các mạch máu. 2.2.3.2. Bệnh tích vi thể Bệnh tích vi thể đặc trưng là sự sung huyết, xuất huyết ở hạch lâm ba, niêm mạc dạ dày ruột và tuyến tụy bị đứt nát bong tróc. Theo Vieira & cs. (2008), khi quan sát tiêu bản phổi nhận thấy vách phế nang đứt nát và có hiện tượng phù trong lòng phế nang. 2.2.4. Sự thay đổi về chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu ở chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 Số lượng bạch cầu đếm được khi chó mắc viêm ruột do CPV2 thường khá thấp, cùng với đó, sự giảm bạch cầu nhẹ là phát hiện chủ yếu nhất. Các thay đổi huyết học do phá hủy tế bào tiền thân tạo máu của các loại bạch cầu khác nhau trong tủy xương và các cơ quan điều khiển lympho khác như tuyến ức, hạch bạch huyết và lách. 3
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1.1. Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 (VRTC do CPV2) - Nghiên cứu xác định tỷ lệ mắc bệnh VRTC do CPV2 theo địa phương, giống, nhóm tuổi, giới tính, tình trạng tiêm chủng - Xác định triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh VRTC do CPV2 - Xác định các chỉ tiêu lâm sàng của chó mắc bệnh VRTC do CPV2 - Xác định sự thay đổi chỉ tiêu huyết học của chó mắc bệnh VRTC do CPV2 - Xác định tổn thương đại thể của chó mắc bệnh VRTC do CPV2 - Xác định tổn thương vi thể của chó mắc bệnh VRTC do CPV2 - Xác định sự phân bố của virus parvo ở các cơ quan của chó mắc bệnh VRTC do CPV2 3.1.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của những chủng virus parvo phân lập được 3.1.2.1. Phân tích trình tự nucleotide và acid amin của gen VP2 - Nhân gen VP2 của CPV2 - Phân tích trình tự nucleotide và acid amin gen VP2 của CPV2 - Xây dựng cây sinh học phân tử dựa trên kết quả giải trình tự vùng gen VP2. 3.1.2.2. Phân tích trình tự nucleotide và acid amin của bộ gen CPV2 - Nhân các đoạn gen của CPV2 bằng phản ứng PCR - Phân tích trình tự nucleotide và amino acid bộ gen của các chủng CPV2 - Xây dựng cây phả hệ các chủng virus CPV2 dựa trên trình tự nucleotide bộ gen 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1. Phương pháp thu thập số liệu trực tiếp tại phòng khám - Căn cứ vào hệ thống sổ theo dõi và phần mềm quản lý để tổng hợp các số liệu dịch tễ tại phòng khám. Các ca chó mắc VRTC do CPV2 được tiến hành ghi chép thông tin: tuổi, giới tính, giống, tiền sử bệnh, thông tin bệnh án, ...vào mẫu phiếu điều tra để tổng hợp số liệu. 3.2.2. Phương pháp xác định chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 * Dựa vào điều tra dịch tễ, triệu chứng lâm sàng. * Chẩn đoán bằng Kit test nhanh CPV2 (Canine virus parvo One - step Test Kit) 4
* Dựa vào bệnh tích của quá trình mổ khám chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo (theo quy trình của Melanie J Dobromylskyj, Royal Veterinary College, https://doi.org/10.12968/coan.2015.20.10.565). * Dựa vào kết quả chạy phản ứng PCR 3.2.3. Phương pháp làm các xét nghiệm huyết học và sinh hóa máu chó bị bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 Máu chó mắc bệnh được lấy tại phòng khám hoặc tại nhà khách hàng bởi bác sĩ thú y, sau đó tiến hành xét nghiệm và thu kết quả. 3.2.4. Phương pháp mổ khám quan sát biến đổi bệnh lý đại thể Chó mắc bệnh được cố định trên bàn mổ, mổ khám theo quy trình của Melanie J Dobromylskyj, Royal Veterinary College, https://doi.org/10.12968/coan.2015.20.10.565). 3.2.5. Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý vi thể - Tiến hành thu mẫu các cơ quan như hạch, dạ dày, ruột, tim gan,… ngâm trong dung dịch formol trung tính 10%. - Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng paraffin, nhuộm Haematoxilin - Eosin (HE) thường quy tại phòng thí nghiệm bộ môn Bệnh lý thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. 3.2.6. Phương pháp nhuộm hoá mô miễn dịch Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch theo quy trình nhuộm 18 bước với kháng thể đặc hiệu tại phòng thí nghiệm bộ môn Bệnh lý thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. 3.2.7. Phương pháp PCR - Phương pháp tách chiết DNA tổng số theo quy trình của nhà sản xuất - Phương pháp PCR: Mẫu DNA sau khi tách chiết sẽ được sử dụng cho phản ứng PCR. 3.2.8. Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm PCR Sản phẩm của phản ứng PCR được chạy điện di trong thạch agarose và đọc bằng máy chụp gel UV. 3.2.9. Phương pháp giải trình tự gen và xây dựng cây phả hệ Trong nghiên cứu này tôi tiến hành gửi các sản phẩm PCR đạt yêu cầu đến công ty st 1 BASE DNA Sequencing (Malaysia) để giải trình tự. Công ty giải trình tự gen theo phương pháp Sanger. Các trình tự gen được căn chỉnh và so sánh bằng phần mềm Geneious Prime (https://www.geneious.com/prime) và BioEdit. Cây sinh học phân tử được phân tích bằng phần mềm MEGA X, sử dụng phương pháp Neighbor-Joining với giá trị Bootstrap là 1000 (https://www.megasoftware.net). Các chủng CPV2 tham chiếu sử dụng trong nghiên cứu được thu thập từ dữ liệu ngân hàng gen thế giới (GenBank). 5
3.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU - Dùng kiểm định test T so sánh giá trị trung bình 1 mẫu hoặc so sánh trung bình của hai mẫu. - Để kiểm định sự quan hệ của hai yếu tố tôi dùng kiểm định chi bình phương - Sử dụng phần mềm thống kê SAS để thông kê và xử lý số liệu - Sử dụng ứng dụng Excel. - Dữ liệu trình tự gen thu được sẽ được phân tích xử lý bằng phần mềm Bioedit) và MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 7.0). PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA CPV2 TRÊN CHÓ 4.1.1. Tỷ lệ mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 ở chó theo từng địa phương Qua khảo sát 681 con chó có biểu hiện lâm sàng như mệt mỏi, nôn mửa, tiêu chảy, phân lẫn máu tại các phòng khám thú y ở 4 địa phương trong thời gian từ tháng 06/ 2017 đến tháng 09/2020, xác định tỷ lệ mắc VRTC do CPV2 bằng kít test nhanh, kết quả được trình bày ở bảng 4.1. Bảng 4.1. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 theo địa phương Số chó đến khám Số chó mắc VRTC do Tỷ lệ mắc CPV2 Địa phương (con) CPV2 (con) (%) Hà Nội 306 42 13,73 Vĩnh Phúc 131 23 17,56 Bắc Giang 136 25 18,38 Bắc Ninh 108 18 16,67 Tổng số 681 108 15,86 Kết quả cho thấy tỷ lệ chó mắc VRTC do CPV2 tại một số tỉnh phía bắc Việt Nam là 108/681 (15,86%), trong đó tỷ lệ bệnh do Virus parvo ở chó cao nhất là ở Bắc Giang (18,38%) và thấp nhất là Hà Nội (13,73%), tuy nhiên không có sự khác nhau có ý nghĩa giữa các địa phương (P>0,05). 4.1.2. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo lứa tuổi Kết quả nghiên cứu 108 con chó mắc VRTC do CPV2 (bảng 4.2) cho thấy có sự sai khác về tỉ lệ mắc CPV2 trên chó bị bệnh viêm ruột theo từng lứa tuổi (P
Bảng 4.2. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 theo lứa tuổi Số chó mắc VRTC Số chó mắc VRTC do CPV2 Tháng tuổi Tỷ lệ mắc (%) do CPV2 (con) theo lứa tuổi (con) < 2 tháng 7 6,48 2-6 tháng 54 50,00 108 7-12 tháng 31 28,70 >12 tháng 16 14,82 4.1.3. Tỷ lệ chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo giống Trong nghiên cứu này tỷ lệ chó mắc VRTC do CPV2 được phân tích theo giống chó nội và chó ngoại nhập (bao gồm giống ngoại thuần và lai) (bảng 4.3). Qua khảo sát 108 chó mắc VRTC do CPV2, kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nhiễm của các giống chó ngoại nhập là 75% cao hơn so với tỷ lệ mắc của các giống nội 25% (P 0,05). Bảng 4.4. Tỷ lệ chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 theo giới tính Số chó mắc VRTC Số chó mắc VRTC do CPV2 Tỷ lệ mắc (%) do CPV2 (con) theo giới tính (con) Đực 57 52,78 108 Cái 51 47,22 4.1.5. Tỷ lệ chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 theo tình trạng tiêm chủng Để đánh giá khả năng bảo hộ của vắc xin, tiến hành đánh giá tình hình tỷ lệ mắc VRTC do CPV2 ở chó theo tình trạng tiêm phòng, chó mắc VRTC do CPV2 được phân loại theo các tiêu chí: chưa tiêm vắc xin, đã tiêm 1 mũi vắc xin, đã tiêm 2 mũi vắc xin, đã tiêm 3 mũi vắc xin. Kết quả khảo sát được thể hiện ở bảng 4.5. 7
Bảng 4.5. Tỷ lệ chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do virus parvo type 2 theo tình trạng tiêm chủng Số chó mắc Số chó mắc theo tình Tỷ lệ mắc Tình trạng (con) trạng vắc xin (con) (%) Chưa được tiêm vắc xin 82 75,93 Đã được tiêm vắc xin mũi 1 18 16,67 108 Đã được tiêm vắc xin mũi 2 5 4,63 Đã được tiêm vắc xin mũi 3 3 2,77 Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc bệnh của chó đã được tiêm vắc xin (26/108) thấp hơn nhiều so với chó chưa được tiêm vắc xin (82/108) (P
Bảng 4.7. Chỉ tiêu sinh hóa máu của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 (n=36) Khoảng Các chỉ tiêu Mean±SE tham chiếu* AST (U/L) 64,00±7,32 18-56 ALT (U/L) 110,14±7,76 17-95 Bilirubin TP (mg/dl) 0,67±0,32 0,2-1,3 Creatinin (mg/dl) 2,75±0,54 0,5-1,4 Albumin (g/dl) 2,55±0,46 3,6-5,0 Protein toàn phần (g/dl) 4,68±0,58 6,0-7,5 Calci máu (mmol/L) 1,87±0,36 2,15-2,60 Natri (mmol/L) 137,2±5,3 143-150 Kali (mmol/L) 3,9±0,53 4,1-5,4 Clo (mmol/L) 91,1±5,4 98-110 * Animal Clinical Diagnosis by Laboratory Methods (Michael & Harold, 2012). Các chỉ số men gan (AST, ALT), creatinin đều tăng. Chỉ số bilirubin toàn phần không có sự sai khác. Theo El-Zahar & cs. (2019) chó mắc VRTC do CPV có ALT: 53,0±0,89 AST: 45,0±0,74, creatinin: 5,77±0,24, trong khi chó đối chứng ALT: 20,0±0,62, AST:17,0±0,46, creatinin: 0,9±0,01. Các chỉ tiêu điện giải đồ Cl-, Na+, K+, Ca++ là những tiêu chí quan trọng trong việc đánh giá tình trạng bệnh. Các kết quả nghiên cứu thu được ở bảng 4.7 cho thấy sự xuống thấp của những chỉ tiêu này. 4.3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG, BỆNH TÍCH CỦA CHÓ MẮC BỆNH VIÊM RUỘT TIÊU CHẢY DO CPV2 4.3.1. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 Kết quả nghiên cứu này cho thấy, hầu hết chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 trong 108 con khảo sát đều có biểu hiện mệt mỏi, bỏ ăn và nôn mửa (>90%), có đến 79,63% chó biểu hiển sốt. Triệu chứng tiêu chảy do viêm ruột cũng thường được thấy ở chó mắc VRTC do CPV2, đặc biệt có đến 62,96% chó bị tiêu chảy ra máu (bảng 4.8). Bảng 4.8. Triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 Số chó kiểm Số chó có triệu chứng Triệu chứng Tỷ lệ (%) tra (con) Mệt mỏi 108 108 100,00 Bỏ ăn, ăn ít 108 102 94,44 Nôn mửa 108 103 95,37 Tiêu chảy 108 93 88,89 Sốt 108 86 79,63 Tiêu chảy lẫn máu 108 68 62,96 9
4.3.2. Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể và vi thể của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 4.3.2.1. Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể Kết quả mổ khám 28 cá thể chó chết do CPV2 cho thấy, hầu hết các cơ quan nội tạng, hạch đều có hiện tượng sung huyết và xuất huyết (Hình 4.1 và bảng 4.9). Bảng 4.9. Bệnh tích đại thể của chó mắc bệnh viêm ruột tiêu chảy do CPV2 Số mẫu Số mẫu có Tỷ lệ Stt Bệnh tích đại thể quan sát bệnh tích (%) 1 Ruột sung huyết, xuất huyết 28 28 100,00 2 Dạ dày xuất huyết, sung huyết 28 27 96,43 3 Hạch màng treo sung huyết, xuất huyết 28 25 89,29 4 Thực quản xuất huyết, sung huyết 28 20 71,43 5 Lách sưng, xuất huyết 28 19 67,86 6 Gan sưng, sung huyết 28 18 64,29 7 Phổi sung huyết, xuất huyết 28 16 57,14 8 Hạch ngoại vi xuất huyết, sung huyết 28 16 57,14 9 Tim giãn, cơ tim xuất huyết 28 2 7,14 A. Hạch dưới hàm sưng nhẹ và đổi màu do sung huyết (đầu mũi tên); B. Hạch màng treo ruột sưng, tối màu do sung huyết (đầu mũi tên); C. Ruột non xuất huyết thành từng đám dày đặc với kích thước đa dạng; D. Niêm mạc ruột bong tróc, xuất xuyết, phủ lớp dịch nhày lợn cợn màu vàng; E. Niêm mạc dạ dày xuất huyết điểm nhẹ (đầu mũi tên); F. Niêm mạc dạ dày xuất huyết nghiêm trọng (đầu mũi tên) Hình 4.1. Một số hình ảnh bệnh tích đại thể ở hệ thống hạch bạch huyết và đường tiêu hoá của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 10
4.3.2.2. Kết quả nghiên cứu bệnh tích vi thể Kết quả ở bảng 4.10 cho thấy bệnh tích vi thể đặc trưng của sự sung huyết xuất huyết các cơ quan, 100% số mẫu quan sát có hiện tượng sung huyết, xuất huyết và hoại tử ở hạch lympho. Với dạ dày và ruột, ngoài sung huyết, xuất huyết, các tế bào biểu mô còn bị đứt nát bong tróc và sự giãn rộng của các tế bào hẻm tuyến. Các tế bào biểu mô bị bào mòn, hoại tử, ngắn lại tạo điều kiện thuận lợi cho nhiễm trùng kế phát từ các vi khuẩn trên bề mặt ruột. Mảng Payer suy kiệt với số lượng tế bào lympho giảm thấy rõ. Các tế bào viêm thâm nhiễm xảy ra sau đó, chủ yếu là bạch cầu lympho và một số đại thực bào. Bảng 4.10. Bệnh tích vi thể ở một số cơ quan của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 Số mẫu Số mẫu có Stt Cơ quan Tổn thương vi thể Tỉ lệ quan sát bệnh tích 1 Hạch lympho Sung huyết, hoại tử 8 8 100% 2 Dạ dày Sung huyết, xuất huyết 8 8 100% 3 Ruột Niêm mạc đứt nát, bong tróc 8 8 100% 4 Gan Sung huyết, xuất huyết 8 8 100% 5 Phổi Vách phế nang đứt nát; phù 8 6 75% trong lòng các phế nang 6 Thận Teo các tiểu cầu thận 8 5 63% Xoang Bowman giãn rộng A. Tế bào biểu mô ruột đứt nát bong tróc thành từng đám lớn (đầu mũi tên) rơi vào trong lòng ruột, phần kẽ giữa các lông nhung giãn rộng (dấu hoa thị) (HE 10X); B. Tế bào biểu mô ruột hoại tử, các vi khuẩn dạng tròn và dạng que dài kế phát trên bề mặt (đường đứt nét màu đỏ) (HE 40X); C. Mảng Payer ở ruột tăng kích thước (đầu mũi tên), có hiện tượng suy kiệt với mật độ tế bào giảm (HE 10X); D. Thâm nhiễm tế bào lympho ở lớp niêm mạc ruột (HE 40X). Hình 4.2. Tổn thương vi thể ruột của chó mắc viêm ruột tiêu chảy do CPV2 11
4.4. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH SỰ PHÂN BỐ CỦA VIRUS PARVO Ở MỘT SỐ CƠ QUAN CỦA CHÓ MẮC BỆNH Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch được tổng hợp chi tiết ở bảng 4.11. Kết quả nghiên cứu cho thấy CPV2 được phát hiện thấy ở 9/9 cơ quan của chó mắc VRTC do CPV2 trong nghiên cứu. Trong đó, tất cả các mẫu ruột non, hạch lympho và gan, (100%) đều cho kết quả dương tính cao với kháng thể CPV2. Các cơ quan khác có mật độ dương tính giảm dần, lần lượt là ruột non, lách, phổi và gan (Hình 4.3B, C, D, E, F). Kháng nguyên virus phát hiện ở đại thực bào và bạch cầu đơn nhân lớn (đầu mũi tên) ở hạch màng treo ruột (IHC 40X); B. Kháng nguyên virus phát hiện ở đại thực bào và một số tế bào biểu mô ruột (IHC 40X); C. Kháng nguyên virus phát hiện ở đại thực bào (đầu mũi tên) và bạch cầu đơn nhân lớn ở lách (IHC 40X); D. Kháng nguyên virus phát hiện ở đại thực bào phế nang ở phổi (IHC 40X); E. Kháng nguyên virus phát hiện ở các tế bào Kuffer (đầu mũi tên) ở gan (IHC 40X); F. Kháng nguyên virus phát hiện ở tế bào cơ tim (đầu mũi tên) (IHC 40X) Hình 4.3. Hình ảnh kháng nguyên của virus CPV2 phát hiện ở các tế bào của chó mắc bệnh Bảng 4.11. Kết quả phát hiện tế bào dương tính với kháng nguyên là virus CPV2 Ca bệnh/Mã số mẫu Tỷ lệ Cơ quan 1/ P19-10 2/ P20-07 3/ P20-07 4/ P20-08 5/ P20-08 6/ P20-09 7/P20-10 8/ P20-10 dương tính Hạch +++ +++ + + +++ +++ + ++ 100% lympho Ruột non +++ ++ ++ + +++ +++ ++ + 100% Gan + + + + + ++ + + 100% Lách ++ ++ + + + + - + 87,50% Phổi ++ + + - ++ + - + 75,00% Dạ dày + + - + - + + - 62,50% Tim ++ - + - + - + - 50,00% Thận + - - + + - - - 37,50% Não - - - - + - - - 12,50 % Ghi chú: Mức độ phân bố kháng nguyên virus CPV2 chia theo các mức độ: -: không có tế bào dương tính; +: ít (có từ 1-10 tế bào dương tính); ++: trung bình (có từ 11-20 tế bào dương tính); +++: nhiều (có trên 20 tế bào dương tính) 12
4.5. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CPV2 GÂY BỆNH Ở CHÓ TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM 4.5.1. Kết quả phân tích trình tự nucleotide và acid amin của gen VP2 4.5.1.1. Kết quả nhân gen VP2 của virus parvo Kết quả chẩn đoán bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi ParvoVP2FL-F/ ParvoVP2FL-R đã thu được sản phẩm PCR đặc hiệu và có kích thước khoảng 1.755 bp, đúng với kích thước theo thiết kế ban đầu của cặp mồi (hình 4.4). Sản phẩm PCR thu được đã được sử dụng trực tiếp để giải trình tự và phân tích trình tự gen VP2. Chú thích: M: Marker DNA; Giếng 1-12: sản phẩm PCR thu được của mẫu bệnh phẩm tương ứng với các chủng virus parvo VNUA/C17, VNUA/C31, VNUA/C32 và VNUA/C35, VNUA/CPV152-Hanoi, VNUA/CPV153-VP, VNUA/CPV175-BG, VNUA/CPV376-BN, VNUA/CPV379-VP, VNUA/CPV380-Hanoi, VNUA/CPV384-BN, VNUA/CPV385-HNa; Giếng NC: Đối chứng âm; Giếng PC: Đối chứng dương Hình 4.4. Kết quả chạy điện di trên gel agarose để kiểm tra sản phẩm 4.5.1.2. Kết quả phân tích trình tự nucleotide và acid amin gen VP2 của virus parvo Kết quả phân tích trình tự gen VP2 hoàn chỉnh cho thấy 12 chủng virus parvo trong nghiên cứu này có mức độ tương đồng về nt và aa với nhau cao, tỷ lệ tương đồng về nt là 97,7 – 100% và về aa là 97 – 100%. Trong số 12 chủng virus parvo này có nhóm 4 chủng VNUA/CPV153-VP, VNUA/CPV175-BG, VNUA/CPV376-BN, VNUA/CPV380- Hanoi, 3 chủng VNUA/C31, VNUA/C32 và VNUA/C35 có mức độ tương đồng về nt và aa với nhau là 100% (bảng 4.13, bảng 4.14). Kết quả phân tích trình tự gen VP2 của 12 chủng virus parvo trong nghiên cứu này với 7 chủng tham chiếu trên thế giới có mức độ tương đồng về trình tự nt giao động từ 97,6 – 99,6% và aa từ 96,5 – 99,8%, mức độ tương đồng khi so sánh với 2 chủng virus vacxin ở trên về nt là 98,3 - 99,7% và aa là 97,4 – 100%, trong đó chủng VNUA/C17 có tỷ lệ tương đồng về nt và aa với 2 chủng vắc xin cao nhất lần lượt là 99,7 - 99.9% và 99,4 - 100%, tỷ lệ tương đồng về nt và aa của 12 chủng trong nghiên cứu với 5 chủng tham chiếu phân lập từ thực địa lần lượt là: 97,6 - 99,3% và 96,4 - 100%. 13
14
15
Hình 4.5. So sánh trình tự nucleotide của gen VP2 giữa 12 chủng virus parvo trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng virus parvo tham chiếu khác (1) 16
17
Hình 4.6. So sánh trình tự nucleotide của gen VP2 giữa 12 chủng virus parvo trong nghiên cứu này với nhau và với các chủng virus parvo tham chiếu khác (2) Kết quả phân tích trình tự aa suy diễn gen VP2 virus parvo hình 4.5 cho thấy 12 chủng trong nghiên cứu này có 20 vị trí aa sai khác với nhau, đó là các vị trí nt số: 5; 44; 80; 87; 93; 101; 103; 232; 267; 298; 300; 305; 323; 324; 370; 426; 447; 563; 568; 573. Khi so sánh trình tự aa suy diễn gen VP2 của 12 chủng trong nghiên cứu này với 7 chủng tham chiếu trên thế giới (MF069445 FPV, HQ184203 KS58, GU392254 Dalian1, GU392245 Shangdong4, KY094119 MEV-SD8, KY083089 Vaccine Singapore, EU914139 Pfizer/vaccine/06) có 31 sự sai khác về aa, cụ thể ở các vị trí aa số: 3; 5; 44; 80; 87; 93; 101; 103; 137; 219; 232; 234; 236; 258; 267; 270; 297; 300; 305; 323; 324; 370; 377; 386; 413; 426; 440; 447; 564; 568; 573 (Hình 4.5; Hình 4.6). 4.5.1.3. Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử dựa trên kết quả giải trình tự vùng gen VP2 Bệnh viêm ruột tiêu chảy trên chó do virus parvo phân bố khắp thế giới và bệnh nghiêm trọng với đối tượng chó con. Virus parvo có 3 genotypes (2a, 2b và 2c) được phân biệt dựa vào sự khác nhau của axit amin tại vị trí 426 trên đoạn gen VP2 (Martella & cs., 2006, Parthiban & cs., 2010). Đoạn gen VP2 mã hoá cho protein capsid của virus, đó là protein có vai trò chính trong cấu trúc của CPV2 và liên quan đến sự đáp ứng miễn dịch của vật chủ. Vì vậy, một sự thay đổi nhỏ trong VP2 có thể làm thay đổi đặc tính gây bệnh của virus (& cs., 2014). Kết quả xây dựng cây phả hệ dựa trên trình tự gen VP2 của 12 chủng virus parvo cho thấy chúng thuộc 2 nhánh phát sinh khác nhau (Hình 4.7). Cụ thể 3 chủng virus 18