Tóm tắt Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) tại miền Bắc Việt Nam

Chia sẻ: Co Ti Thanh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

42
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh PED tại 10 tỉnh/ thành phố khu vực phía Bắc; Làm rõ được đặc điểm di truyền, đặc điểm dịch tễ học phân tử của các genotype PEDV đang lưu hành ở miền Bắc.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh tiêu chảy thành dịch ở lợn (PED) tại miền Bắc Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ NGUYỄN TRUNG TIẾN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC CỦA BỆNH TIÊU CHẢY THÀNH DỊCH Ở LỢN (PED) TẠI MIỀN BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Dịch tễ học thú y Mã số : 9.64.01.08 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Hµ NéI, 2018
Công trình được hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Bá Hiên Phản biện 1: PGS.TS. Đinh Duy Kháng Viện Công nghệ sinh học Phản biện 2: PGS.TS. Bùi Trần Anh Đào Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 3: PGS.TS. Trương Văn Dung Viện Thú y Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện, họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam
PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bê ̣nh tiêu chảy thành dịch trên lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc họ Coronaviridae. Dịch PED xuất hiện lần đầu tiên ở châu Âu vào năm 1971, sau đó bệnh lây lan ra nhiều Quốc gia khác ở châu Á như Trung Quốc, Đài Loan, Nhật, Hàn Quốc và Thái Lan. Ở Việt Nam, bê ̣nh tiêu chảy thành dịch ở lợn lần đầu tiên được phát hiện vào cuối năm 2008, đầu năm 2009. Mặc dù đã lưu hành ở Việt Nam gần 10 năm, đến nay bệnh tiêu chảy thành dịch do PEDV gây ra vẫn là chủ đề mới mẻ. Các nghiên cứu tìm hiểu đặc điểm dịch tễ học của bệnh PED và đặc điểm dịch tễ học phân tử của virus lưu hành ở Việt Nam hiện còn hạn chế. Bên cạnh đó, sự xuất hiện và lưu hành của PEDV nhóm mới nổi (thuộc genogroup 2) từ 2010 đã làm giảm hiệu lực của vacxin (sản xuất từ chủng PEDV thuộc genogroup 1). Do vậy, việc làm rõ đặc điểm dịch tễ của bệnh cũng như dịch tễ học phân tử của virus là cơ sở quan trọng cho đề xuất các biện pháp phòng (đặc biệt là lựa chọn đúng loại vacxin) và chống phù hợp. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học của bệnh PED tại 10 tỉnh/ thành phố khu vực phía Bắc; - Làm rõ được đặc điểm di truyền, đặc điểm dịch tễ học phân tử của các genotype PEDV đang lưu hành ở miền Bắc. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Trang trại nuôi lợn tại 10 tỉnh miền Bắc có lợn mắc tiêu chảy nghi do PEDV. Các tỉnh này được chia làm 2 khu vực: đồng bằng châu thổ sông Hồng (Hà Nội, Hải Dương, Hưng Yên, Hải Phòng, Thái Bình và Vĩnh Phúc) và trung du- miền núi (Hòa Bình, Bắc Giang, Thái Nguyên và Lào Cai). 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Đây là một nghiên cứu có hệ thống về PED và PEDV ở Việt Nam. - Đã làm rõ đặc điểm dịch tễ học bệnh PED trên địa bàn 10 tỉnh/ thành phố của miền Bắc Việt Nam. Trên cơ sở xác định những biểu hiện bệnh lý của bệnh, đặc điểm dịch tễ học phân tử của căn bệnh, đã khẳng định sự lưu hành phổ biến của PED trong các trang trại chăn nuôi. - Nghiên cứu này đã giải mã được 15 trình tự gen S hoàn chỉnh và 8 trình tự gen ORF3, so sánh và chứng minh được những chủng PEDV đang lưu hành tại thực địa không có cùng nguồn gốc với các chủng vacxin đang sử dụng. - Xác định được một số đặc điểm dịch tễ học phân tử, từ đó chứng minh được nguồn gốc đa dạng của các chủng PEDV đang lưu hành tại Việt nam. 1
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI - Luận án đã phân tích và chỉ ra một số đặc điểm dịch tễ học của PED tại 10 tỉnh/ thành phố thuộc miền Bắc Việt Nam và mức độ lưu hành của bệnh, chứng minh được nguồn gốc của các chủng PEDV đang lưu hành tại thực địa. - Là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho nghiên cứu về PED và PEDV; là tư liệu tham khảo cho giảng dạy của chuyên ngành Thú y và Chăn nuôi-Thú y. - Từ kết quả phân tích dịch tễ học phân tử của PEDV đã chỉ rõ mức tương đồng trình tự gen giữa những chủng PEDV phân lập từ thực địa và những chủng vacxin đang sử dụng, từ đó giúp cho việc hoạch định các biện pháp phòng chống bệnh, trong đó có lựa chọn vacxin phòng bệnh phù hợp. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. GIỚI THIỆU CHUNG Dịch tiêu chảy cấp ở lợn (Porcine Epidemic Diarrhea- PED) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm do một loại virus thuộc giống Alphacoronavirus, họ Coronaviridae gây ra. Dịch PED thường xảy ra ở lợn con dưới 7 ngày tuổi với tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết có thể lên đến 100%. Dịch PED đã và đang gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi lợn ở nhiều quốc gia trên thế giới. Dịch PED lần đầu tiên được phát hiện ở Anh vào năm 1971, sau đó các ổ dịch liên tục được phát hiện và xảy ra phổ biến ở các quốc gia châu Âu khác như Bỉ, Đức, Pháp, Hà Lan, Thụy Sỹ, và ở châu Á như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan. Ở Việt Nam, dịch PED lần đầu tiên được phát hiện vào năm 2008 và từ đó đến nay dịch bệnh thường xuyên xảy ra và gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn trong cả nước. 2.2. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PEDV Để xác định mối quan hệ giữa các chủng PEDV, các phân tích về cây phả hệ (phylogenetic tree) và đặc điểm di truyền được tiến hành dựa trên các trình tự gen S, M, và ORF3 đôi khi cả gen E. Nghiên cứu trên một phần của gen S và toàn bộ gen M đã gợi ý chia PEDV thành 3 nhóm (G1, G2, và G3), mỗi nhóm cũng được chia thành các nhóm nhỏ hơn (G1-1, G1-2, và G1-3). Phân tích cây phả hệ dựa trên trình tự gen S và M đều chỉ ra rằng các chủng PEDV phân lập được ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam có độ tương đồng cao và khác biệt với các chủng PEDV phân lập được từ các Quốc gia Châu Âu. Phân tích mối liên hệ gen giữa các chủng PEDV có thể được thực hiện trên cơ sở phân tích toàn bộ hệ gen của virus. Nhiều nghiên cứu cho thấy trình tự của gen mã hóa spike protein hoặc phân đoạn gen mã hóa vùng S1 của spike protein (amino acid 1- 735) là phù hợp để phân tích đặc điểm tiến hóa của virus. Theo tác giả Lee (2015), mặc dù chỉ có 1 serotyp duy nhất, 2
PEDV có thể được chia làm 2 genogroup: nhóm G1 cổ điển (G1, classical) và nhóm G2 (field epidemic/ pandemic). Mỗi nhóm lại được chia thành nhiều dưới nhóm: 1a, 1b và 2a, 2b. Nhóm G1a bao gồm chủng nguyên mẫu CV777, chủng virus vacxin và các chủng virus thích nghi trên tế bào. Nhóm G1b bao gồm một số biến chủng mới được phát hiện lần đầu tiên ở Trung Quốc vào năm 2011, sau đó được phát hiện ở Mỹ vào năm 2014, ở Hàn Quốc năm 2013 và một số nước châu Âu. Nhóm G2 được chia thành dưới nhóm 2a (gây ra các vụ dịch PED ở châu Á trước đây) và dưới nhóm 2b (gây ra các vụ dịch ở châu Á và bắc Mỹ gần đây). Nhóm cổ điển G1a lưu hành ở Trung Quốc có thể xuất phát từ việc sử dụng các chủng virus vacxin hoặc do nhập lậu chủng virus vacxin nhược độc từ Hàn Quốc. Nhóm G2a bắt nguồn từ Hàn Quốc, lây lan sang Trung Quốc và sau đó lây sang các nước Đông Nam Á như: Thái Lan, Việt Nam. Nhóm G2a ở các nước Đông Nam Á cũng có thể bắt nguồn trực tiếp từ Hàn Quốc. Nhóm di truyền mới nổi G1b và G2b hình thành ở Trung Quốc có thể là kết quả của quá trình tái tổ hợp giữa virus thuộc nhóm G1a và G2a lưu hành tại nước này. Cả 2 nhóm này sau đó lây lan gần như đồng thời sang Mỹ, và sau đó xuất hiện ở Hàn Quốc, một số nước bắc Mỹ, nam Mỹ và có thể cả Nhật Bản và Đài Loan. Dựa vào hiện tượng thêm – xóa (insertion- deletion) ở gen mã hóa spike protein (S INDEL), có thể chia PEDV làm 2 nhóm: NON- S INDEL và S INDEL. Ở Mỹ, những biến thể thuộc nhóm S INDEL gây ra các ổ dịch có triệu chứng lâm sàng nhẹ. Các chủng PEDV phân lập được ở châu Âu (Đức, Ý, Bỉ, Hà Lan và Pháp) vào năm 2014 và 2015 đều thuộc nhóm S INDEL cùng với nhóm lưu hành ở Mỹ. PHẦN 3. NỘI DUNG- NGUYÊN LIỆU- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1.1. Tình hình dịch PED tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam - Điều tra tình hình PED từ năm 2013 – 2015 tại 10 tỉnh miền Bắc, - Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng và bệnh tích của lợn mắc PED 3.1.2. Phân tích đặc điểm về trình tự gen - Giải trình tự gen S và ORF3 của các chủng PEDV lưu hành - Phân tích đặc điểm trình tự gen S và gen ORF3 của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam. 3.1.3. Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ học phân tử - Nghiên cứu đặc điểm về sự lưu hành theo nhóm di truyền - Nghiên cứu hiện tượng tái tổ hợp của PEDV lưu hành ở Việt Nam 3
- Nghiên cứu sự phát tán theo không gian và thời gian của các chủng PEDV dựa vào trình tự gen S và gen ORF3 của hai genogroup. 3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU - Mẫu phân hoặc mẫu ruột của lợn nghi mắc tiêu chảy do PEDV. - Bộ kít tổng hợp cDNA, bộ kít PCR. - Trình tự gen S và gen ORF3 của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam và trên thế giới có đầy đủ thông tin về địa điểm và thời gian phân lập. - Cặp mồi đặc hiệu được thừa hưởng từ các nghiên cứu trước đây 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Phương pháp điều tra một số đặc điểm dịch tễ Thu thập thông tin các đàn lợn có triệu chứng của bệnh PED từ các trại trên địa bàn nghiên cứu thông qua các kỹ thuật viên của trại. 3.3.2. Phương pháp theo dõi lâm sàng Dựa vào quan sát triệu chứng lâm sàng và bệnh tích để bước đầu xác định bệnh. 3.3.3. Phương pháp mổ khám Mổ khám nhằm xác định được các biến đổi đại thể của các cơ quan, tổ chức của lợn mắc PED, cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh. Lợn bệnh được cố định cẩn thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ. Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể để quan sát và chụp ảnh. 3.3.4. Phương pháp lấy mẫu Mẫu được thu thập trên thực địa từ những lợn có biểu hiện lâm sàng tiêu chảy cấp tại các trại chăn nuôi ở một số địa phương thuộc miền Bắc Việt Nam, bao gồm: (i) các đoạn ruột và hạch ruột, (ii) phân. Mẫu được bảo quản lạnh sau khi lấy và trong suốt quá trình vận chuyển. 3.3.5. Phương pháp tách ARN tổng số và tổng hợp cDNA - ARN tổng số được tách bằng TRIzol. - cDNA được tổng hợp từ RNA đã được tách chiết nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase), sử dụng kit SuperScript (Invitrogen) và oligo dT. 3.3.6. Phương pháp RT-PCR phát hiện PEDV - Các mẫu bệnh phẩm này sau đó được dùng chẩn đoán PED bằng phản ứng RT-PCR với các cặp mồi đặc hiệu của PEDV. 3.3.7. Phương pháp giải trình tự gen Sản phẩm PCR tinh sạch được giải trình tự theo hai chiều (xuôi và ngược) bằng phương pháp Sanger. Trình tự nucleotide tiếp tục được phân tích bằng chương trình tin sinh học BioEdit v7.1.3.0 trên cơ sở đối chiếu so sánh (i) giữa trình tự nucleotide được giải trình tự theo chiều xuôi và chiều ngược, và (ii) với trình tự gen S hoặc ORF3 tham chiếu công bố trên ngân hàng gen. 4
3.3.8. Phương pháp xác định khoảng cách di truyền Phần mềm MEGA7 (Kumar et al., 2016) được dùng để tính khoảng cách di truyền (genetic distance) giữa các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam, dựa vào trình tự gen S (n=38) và gen ORF3 (n=12). Các mô hình mô phỏng sự biến đổi nucleotide được dùng bao gồm: Kimura-2P (K2P), Tajama-Nei, Tamura-3P và Tamura-Nei. Khoảng cách di truyền giữa các chủng virus sau đó được sắp xếp biểu diễn dưới dạng đồ thị tần suất. 3.3.9. Phương pháp xây dựng cây phả hệ Cây phả hệ (dựa vào trình tự gen S hoặc gen ORF3) được xây dựng như sau: (i) Lập cơ sở dữ liệu bao gồm các chủng PEDV thu nhận từ ngân hàng gen và các chủng đã biết genogroup (Lin et al., 2016). (ii) Sắp xếp (alignment) trình tự nucleotide theo cột trên cơ sở bộ ba mã hóa (codon- based alignment) bằng phần mềm MAFFT (Katoh and Standley, 2013) và PAL2NAL (Suyama et al., 2006). (iii) Xây dựng cây phả hệ bằng thuật toán neighbor-joining được tích hợp trong chương trình MEGA (Kumar et al., 2016). Mức tin cậy của các nhánh phân chia ở mỗi nút (node) được biểu thị bằng giá trị bootstrap. (iv) Phần mềm FigTree (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/) được dùng để biểu diễn và hiệu đính cây phả hệ. 3.3.10. Phương pháp phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử Sử dụng phần mềm BEAST (Drummond et al., 2012) để xây dựng lại quá trình phát tán theo không gian (quốc gia- quốc gia, địa phương- địa phương) và thời gian (năm) của PEDV dựa vào trình tự gen S hoặc gen ORF3. Các tham số của mô hình dựa theo kết quả của nghiên cứu trước đây (Lemey et al., 2009). 3.3.11. Phương pháp xử lý số liệu - Kiểm định giả thuyết về trị trung bình của 2 tổng thể độc lập (independent samples t-test) được thực hiện bằng phần mềm SPSS, - Phân tích phương sai một yếu tố (oneway ANOVA) dùng kiểm định giả thuyết trung bình bằng nhau của các nhóm mẫu, - Các phép kiểm định được thực hiện với mức ý nghĩa là α = 0,05. PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. TÌNH HÌNH DỊCH PED Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC TỪ 2013-2015 4.1.1. Kết quả phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm từ 2013-2015 Trong khuôn khổ của đề tài, tình hình dịch PED đã được nghiên cứu tại các đàn lợn có triệu chứng của bệnh PED tại Hà Nội, Hải Dương, Hải Phòng, Hưng Yên, Thái Bình, Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Bắc Giang, Lào Cai và 5
Thái Nguyên. Kết quả RT-PCR phát hiện PEDV trong mẫu bệnh phẩm được trình bày ở bảng 4.1. Bảng 4.1. Kết quả phát hiện PEDV trong mẫu thu thập từ 2013-2015 Số mẫu Tỷ lệ Loại Số mẫu Tỷ lệ % TT Địa điểm kiểm trung mẫu* dương tính dương tính tra bình Phân 5 2 40,00 1 Bắc Giang 40,00 Ruột 5 2 40,00 Phân 8 3 37,50 2 Hà Nội 47,37 Ruột 11 6 54,50 Phân 7 2 28,50 3 Hải Dương 42,86 Ruột 7 4 57,10 Phân 5 2 40,00 4 Hải Phòng 50,00 Ruột 5 3 60,00 Phân 3 1 33,30 5 Hòa Bình 55,56 Ruột 6 4 66,60 Phân 7 3 42,80 6 Hưng Yên 53,85 Ruột 19 11 57,80 Phân 3 1 33,30 7 Lào Cai 50,00 Ruột 5 3 60,00 Ruột 12 6 50,00 8 Thái Bình 34,25 Phân 61 19 31,14 Ruột 6 3 50,00 9 Thái Nguyên 37,50 Phân 26 9 34,62 Phân 4 2 50,00 10 Vĩnh Phúc 45,45 Ruột 7 3 42,80 Tổng hợp 212 89 41,98 * Trường hợp thu thập được lợn bệnh, mẫu ruột sẽ được dùng thay mẫu phân trong phát hiện PEDV Bảng 4.1 cho thấy sự hiện diện của PEDV ở các địa phương lấy mẫu, với tỷ lệ dương tính dao động từ 34,25% (Thái Bình) tới 55,56% (Hòa Bình). Phân tích phương sai một nhân tố (ANOVA) về tỷ lệ dương tính PEDV giữa 10 tỉnh cho giá trị p = 0,841 > 0,05. Do vậy, khác biệt về tỷ lệ nhiễm PEDV giữa các địa phương là không có ý nghĩa thống kê ở mức 95%. Xét trên khía cạnh vị trí địa lý, kết quả trên cho thấy dịch PED không chỉ xảy ra ở các tỉnh thành tiếp giáp nhau như Hà Nội, Hải Phòng, Hải Dương, Hưng Yên và Thái Bình; mà còn phát hiện được ở một số tỉnh xa như Thái Nguyên, Lào Cai. Ngoài 10 tỉnh thuộc phạm vi nghiên cứu, PEDV cũng được phát hiện ở Bắc Ninh, Hà Nam, Phú Thọ, Thanh Hóa, Nghệ An và Quảng Trị (kết quả không trình bày). Đối với 2 loại mẫu xét nghiệm là phân và ruột, kết quả ở bảng 4.2 cho biết tỷ lệ mẫu ruột dương tính với PEDV (40,00% - 66,60%, trung bình 53,90%) cao hơn so với tỷ lệ mẫu phân dương tính với virus (28,50% - 6
50,00%, trung bình 38,00%). Bằng phân tích phương sai một nhân tố, sự khác biệt kể trên là có ý nghĩa thống kê (p = 0,004 < 0,05). Kết quả xét nghiệm này phù hợp với công bố của Nguyễn Tất Toàn và cs (Nguyễn Tất Toàn và cs., 2012, Nguyễn Tất Toàn and Đỗ Tiến Duy, 2012), trong đó nhóm tác giả cũng phát hiện được 58,14% mẫu ruột non dương tính PEDV và cao hơn nhiều so với các mẫu phân (16,96%). Mặc dù tất cả mẫu bệnh phẩm nêu trên (bảng 4.1) được lấy ở lợn có triệu chứng tiêu chảy nghi ngờ do nguyên nhân virus như: (i) nôn, phân nhiều nước và có cục sữa không tiêu; hoặc (ii) ruột non căng phồng, có cục sữa không tiêu ở các đoạn ruột già, v.v... nhưng chỉ có trung bình 41,98% mẫu dương tính PEDV. Kết quả này có thể do lợn được lấy mẫu nhiễm các virus gây tiêu chảy khác. Khả năng này là có thể bởi lẽ trong một công bố gần đây, deltacoronavirus đã được phát hiện ở Hà Nội và Thái Bình là hai tỉnh thuộc phạm vi thu thập mẫu của nghiên cứu này (Lê Văn Phan và cs., 2017). 4.1.2. Tình hình dịch PED ở một số tỉnh miền Bắc theo trang trại Những nghiên cứu trong vòng 5 năm trở lại đây tại Việt Nam cho thấy PEDV là nguyên nhân chủ yếu gây bùng phát dịch tiêu chảy trên lợn (Do Tien Duy et al., 2011; Vui et al., 2015). Do không nằm trong danh mục các bệnh bắt buộc phải khai báo dịch, nên tình hình dịch PED ở ngoài thực địa được dự đoán xảy ra trên diện rộng. Để làm rõ hơn tình hình dịch PED ở 10 tỉnh miền Bắc, kết quả xét nghiệm được tổng hợp theo trang trại và được trình bày ở bảng 4.2. Bảng 4.2. Tình hình dịch PED ở một số tỉnh miền Bắc theo trang trại Số trại Số trại Tỷ lệ (%) TT Địa điểm theo dõi dương tính dương tính 1 Bắc Giang 4 1 25,00 2 Hà Nội 10 8 80,00 3 Hải Dương 6 4 66,67 4 Hải Phòng 5 3 60,00 5 Hòa Bình 5 2 40,00 6 Hưng Yên 7 6 85,71 7 Lào Cai 3 1 33,33 8 Thái Bình 5 3 60,00 9 Thái Nguyên 5 2 40,00 10 Vĩnh Phúc 5 2 50,00 Tổng hợp 55 32 58,10 Kết quả xét nghiệm PEDV tại 55 trại (có lợn mắc tiêu chảy nghi do virus và chưa từng sử dụng vacxin phòng bệnh do PEDV) cho thấy có 32 trại phát hiện được PEDV trong mẫu bệnh phẩm, tương ứng với tỷ lệ 58,1%. Mặc dù tỷ lệ trang trại dương tính với PEDV khác nhau giữa các tỉnh (dao động từ 25,00% - 85,71%), nhưng không có địa phương nào là không có 7
trang trại mắc PED. Kết quả này cho thấy PEDV xuất hiện khá phổ biến ở các địa phương thuộc phạm vi nghiên cứu của đề tài này. Xét về mặt địa lý, 6 tỉnh thuộc đồng bằng châu thổ sông Hồng đều có tỷ lệ trang trại dương tính trên 50%. Cụ thể, tỷ lệ trang trại dương tính cao nhất là ở Hưng Yên (85,71%) và Hà Nội (80,00%); tiếp đến là Hải Dương, Hải Phòng, Thái Bình với tỷ lệ dương tính lần lượt là 66,67%, 60,00% và 60,00%. Ngược lại, ở 4 tỉnh trung du- miền núi phía Bắc, tỷ lệ trang trại dương tính với PEDV đều dưới 50%, ví dụ như: Lào Cai là 33,33% và Bắc Giang là 25,00%. Kết quả tính chung theo vùng địa lý cho thấy tỷ lệ trang trại có PEDV lưu hành ở 6 tỉnh đồng bằng sông Hồng cao hơn rõ rệt so với các trang trại ở 4 tỉnh trung du- miền núi (68,42% so với 35,29%), ở mức tin cậy 95% (phụ lục 1). Sự khác biệt về tỷ lệ trang trại dương tính PEDV ở 2 vùng nói trên có thể do các tỉnh đồng bằng có số lượng hộ chăn nuôi lớn và mật độ chăn nuôi lợn cao nên tỷ lệ mắc PED cao hơn so với các trại ở khu vực vùng trung du - miền núi. Tổng hợp các kết quả trình bày ở bảng 4.1 và bảng 4.2 cho phép rút ra nhận xét: kể từ khi PEDV được công bố lần đầu tại miền Nam năm 2009 (Do Tien Duy et al., 2011), dịch tiêu chảy ở lợn do PEDV gây ra đã xuất hiện ở miền Bắc với không gian trải rộng (10/10 tỉnh thu thập mẫu) và liên tục theo thời gian (trong các năm thu thập mẫu từ 2013-2015). 4.1.3. Kết quả theo dõi triệu chứng, bệnh tích của lợn mắc PED Để làm rõ đặc điểm về triệu chứng và bệnh tích đặc trưng của lợn mắc tiêu chảy do virus, nghiên cứu này đã tìm hiểu triệu chứng và bệnh tích của 50 lợn con theo mẹ (giai đoạn mẫn cảm nhất với PEDV) đã được khẳng định chỉ dương tính với PEDV (bảng 4.3, bảng 4.4). Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của lợn mắc PED Số con Số con có triệu chứng Địa điểm theo Mùi phân Phân lỏng, Lông xù, Nôn mửa Mất nước dõi tanh, gây có cục sữa bết phân Bắc Giang 7 2 3 2 3 3 Hà Nội 7 0 5 0 7 7 Hải Dương 5 0 5 5 5 5 Hải Phòng 5 0 5 5 5 5 Hòa Bình 5 3 0 0 3 1 Hưng Yên 7 2 4 4 4 7 Thái Bình 10 0 10 3 10 10 Vĩnh Phúc 4 0 0 0 3 3 Tổng hợp 50 7 (14%) 32 (64%) 19 (38%) 40 (80%) 41 (82%) Mặc dù lợn ở mọi lứa tuổi đều mẫn cảm với PEDV và mắc bệnh thể lâm sàng, nhưng lợn con theo mẹ là nhóm có biểu hiện bệnh rõ nhất. Vì vậy, 8
nghiên cứu này đã tập trung làm rõ đặc điểm triệu chứng và bệnh tích ở nhóm lợn này. Kết quả trình bày ở bảng 4.3 cho biết lợn con mắc tiêu chảy do PEDV thường biểu hiện 2 triệu chứng liên quan tới hiện tượng tiêu chảy. Phổ biến nhất là triệu chứng lợn con gầy sọp do mất nước (82%), tiếp theo là hiện tượng lông xù, bết phân ở toàn thân (80%). Kết quả tổng hợp ở bảng 4.3 cũng cho thấy rõ tỷ lệ lợn có triệu chứng lâm sàng điển hình của lợn mắc tiêu chảy do PED: phân tanh và có mùi gây đặc trưng (64%), một số trường hợp trong phân có cục sữa không tiêu (38%). Ngoài các triệu chứng nêu trên, lợn bệnh còn có biểu hiện chung như run rẩy, nằm chồng đống lên nhau, v.v... (kết quả không trình bày). Các đặc điểm về triệu chứng ở lợn con theo mẹ nhiễm PEDV kể trên cũng được mô tả ở nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước (Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014; Sun et al., 2012). Tuy nhiên, hiện tượng nôn mửa chỉ chiếm 7 trong tổng số 50 ca theo dõi (14%). Tóm tắt kết quả nghiên cứu bệnh tích của lợn con theo mẹ mắc PED được tổng hợp và trình bày ở bảng 4.4. Bảng 4.4. Kết quả nghiên cứu bệnh tích đại thể của lợn mắc PED Số con có bệnh tích Số con Sữa chưa tiêu Ruột non Hạch Địa điểm theo ruột Mỏng, Xung dõi Dạ dày Ruột xung trong huyết huyết Bắc Giang 7 7 1 5 0 0 Hà Nội 7 7 0 2 0 0 Hải Dương 5 5 3 5 0 0 Hải Phòng 5 5 2 5 0 0 Hòa Bình 5 5 0 0 1 0 Hưng Yên 7 7 4 3 2 0 Thái Bình 10 10 0 10 1 0 Vĩnh Phúc 4 4 0 0 0 0 Tổng hợp 50 50 (100%) 10 (20%) 30 (60%) 4 (8%) 0 (0%) Đối với lợn con được khẳng định mắc tiêu chảy do PEDV, nghiên cứu này không ghi nhận được biến đổi bệnh lý đại thể ở các hệ cơ quan ngoài đường tiêu hóa như: hô hấp, tuần hoàn. Các nhóm bệnh tích quan sát được ở hệ tiêu hóa chủ yếu tập trung vào các đặc điểm giảm tiêu hóa/ giảm hấp thu. 100% số lợn mổ khám đều quan sát được sữa đông vón trong dạ dày. Khác với nhiều nghiên cứu khác, cục sữa đông vón trong dạ dày thường được nhấn mạnh như một bệnh tích điển hình của lợn mắc PED (Nguyễn Văn Điệp và cs., 2014). Tuy nhiên, trong quá trình mổ khám, đặc điểm này còn thấy cả ở nhóm lợn con theo mẹ không mắc PED (kết quả không trình bày). Do đó, cục sữa đông trong dạ dày là do lợn con theo mẹ chết mà không kịp tiêu hóa hết, không phải là bệnh tích điển hình của bệnh. Hiện tượng ruột non có màu trong, chứa nhiều dịch xuất hiện với tỷ lệ cao nhất (60%). Cục sữa 9
không tiêu ở các đoạn ruột non và kết tràng xuất hiện với tỷ lệ không cao (khoảng 20%). 4.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM VỀ TRÌNH TỰ GEN Để làm cơ sở cho so sánh đa chiều về đặc điểm sinh học phân tử cũng như đặc điểm dịch tễ học phân tử, chúng tôi tiến hành thu thập toàn bộ trình tự gen S và ORF3 của PEDV lưu hành ở Việt Nam. Do vậy, cơ sở dữ liệu về trình tự gen S bao gồm 38 trình tự hoàn chỉnh của gen mã hóa spike protein (gen S), thu thập trong khoảng 2013- 2016, ở 11 tỉnh/ thành phố thuộc miền Bắc, miền Trung và miền Nam. Cơ sở dữ liệu trình tự gen ORF3 bao gồm 12 trình tự gen ORF3 hoàn chỉnh, thu thập trong khoảng 2013- 2014 tại 6 tỉnh thành thuộc miền Bắc, miền Trung và miền Nam. 4.2.1. Đặc điểm gen S của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam 4.2.1.1. Đặc điểm về tính đa dạng di truyền của gen S Đặc điểm đầu tiên phản ánh tính đa dạng của PEDV lưu hành ở Việt Nam là sự biến động chiều dài gen S. Cụ thể, gen S của 38 chủng PEDV được phân tích trong nghiên cứu này có kích thước: 4140 nt (1 chủng), 4146 nt (6 chủng), 4149 nt (5 chủng), 4155 nt (16 chủng), 4158 nt (9 chủng) và 4179 nt (1 chủng). SimPlot - Query: Spike_AF353511_CV777 FileName: D:\ATien\Simplot-Vietnam\S-vietnam-ref-nu-al.fasta.txt 100 KX982561_HaNoi_2013 98 KX982564_HoaBinh_20 96 KX982553_HungYen_20 KX982554_HungYen_20 94 KX982557_HungYen_20 92 KJ960180_HungYen_20 90 KP455313_ThaiBinh_20 KP455314_ThaiBinh_20 88 KJ960178_DongNai_201 KJ960178, KX708903, KJ960179_VungTau_20 86 84 Đồng Nai, 2013 Hải Phòng, 2015 KP455320_HaiPhong_20 KX982568_HaNoi_2014 82 KX982570_HaNoi_2014 80 KX982569_HoaBinh_20 KT941120_HungYen_20 78 Similarity (%) KX982572_ThaiBinh_20 76 KX982571_VinhPhuc_2 KP455315_QuangTri_20 74 KP455316_QuangTri_20 72 KP455317_QuangTri_20 KP455318_QuangTri_20 70 KP455319_QuangTri_20 68 KX708903_HaiPhong_20 KX708901_HaiPhong_20 66 64 A B C D KX708902_HaiPhong_20 KX708896_HaNoi_2015 62 KX982573_HungYen_20 KX982576_HungYen_20 60 KX708906_HungYen_20 58 KX708907_HungYen_20 56 KX708904_LaoCai_2015 KX708905_LaoCai_2015 54 KX708897_ThaiNguyen_ 52 KX708898_ThaiNguyen_ KX708895_ThaiNguyen_ 50 KX708899_VinhPhuc_2 0 200 400 600 800 1,000 1,200 1,400 1,600 1,800 2,000 2,200 2,400 2,600 2,800 3,000 3,200 3,400 3,600 3,800 4,000 KX708900_VinhPhuc_2 Position KX708894_HungYen_20 Vị trí nucleotide (trục Ox) và tỷ lệ % tương đồng nucleotide (trục Oy) Window : 200 bp, Step: 20 bp, GapStrip: On, Kimura (2-parameter), T/t: 2.0 Hình 4.1. Tỷ lệ % tương đồng về trình tự gen S của 38 chủng PEDV Dễ nhận thấy ở 4/5 chiều dài gen S (nucleotide 800 - 4188), 38 chủng PEDV có sự tương đồng > 90% về trình tự nucleotide (ngoại trừ chủng KJ960178 (vùng C) và chủng KX708903 (vùng D)). Ở hai vùng A và B (từ nucleotide 1 - 800), mức tương đồng về trình tự gen giữa các chủng PEDV trong nghiên cứu này là thấp nhất, dao động từ 63,7% - 87,9%. Sự biến động về mức tương đồng trên dọc chiều dài gen S giữa các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam cũng đã được biết đối với một số chủng virus lưu hành trên thế giới, trong đó có Trung Quốc. 10
4.2.1.2. Đặc điểm đột biến ở vùng quyết định kháng nguyên COE Vùng quyết định kháng nguyên COE (aa 499 – 638, hình 4.2) được xác định bao gồm một vùng quyết định kháng nguyên kích thích sản sinh kháng thể trung hoà từ aa 499-600 (tương đương aa 496-597 của chủng CV777). So với chủng tham chiếu CV777, 38 chủng PEDV của Việt Nam sai khác ở 31 vị trí, tập trung tại 8 vị trí là amino acid 517, 521, 527, 549, 594, 605, 612 và 635. Vùng quyết định kháng nguyên COE còn đóng vai trò là receptor gắn thụ thể pAPN (porcine aminopeptidase-N). Trong 4 vị trí gắn với pAPN (đóng khung từ 1-4), có tới 3 vị trí trong đó xảy ra đột biến. Trình tự amino acid ở vùng gắn pAPN số 3 nhìn chung là bảo thủ (trừ 3 chủng là KJ960178, KJ960179, KJ960180 có đột biến). Đột biến ở vùng bám pAPN cũng đã được xác định đối với PEDV lưu hành ở nhiều nước trên thế giới. 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 610 620 630 .|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|... Spike_AF353511_CV777 VTLPSFNDHSFVNITVSAAFGGLSSANLVASDTTINGFSSFCVDTRQFTITLFYNVTNSYGYVSKSQDSNCPFTLQSVNDYLSFSKFCVSTSLLAGACTIDLFGYPAFGSGVKLTSLYFQFTKGELITGTPKPLEGITDV KX982561_HaNoi_2013 ..................S...H.G...I.....................S.................T..........................S..........D......F..........D...........V... KX982564_HoaBinh_2013 ......................H.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V... KX982553_HungYen_2013 ..................S...H.G...I.....................S............F...............................S..........E......F......................V... KX982554_HungYen_2013 ......................H.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V... KX982557_HungYen_2013 ..................S...H.G...I.....................S............F...............................S..........E......F......................V... KJ960180_HungYen_2013 ......................H.G...I............W......S.S.....PT.....................................S..........E......F......................V... KP455313_ThaiBinh_2013 .....................DH.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V... KP455314_ThaiBinh_2013 .....................DH.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V... KJ960178_DongNai_2013 ............K.........HRG...I............R........SR....PT....G....G...........................S..........E......F......................V... KJ960179_VungTau_2013 ......................H.G...I............W......S.S.....PT.....................................S..........E......F......................V... KP455320_HaiPhong_2014 ..................S...H.G...I.....................S...................................L........S..........E......F......................V... KX982568_HaNoi_2014 ......................H.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V... KX982570_HaNoi_2014 ..................S...H.G...I.....................S.................T..........................S..........D......F..........D...........V... KX982569_HoaBinh_2014 ......................P.G...I.....................S............................................S..........D......VA.....................V... KT941120_HungYen_2014 ......................P.G...I.....................S.....................................A......S..........D......VA.....................V... KX982572_ThaiBinh_2014 ..................S...H.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V... KX982571_VinhPhuc_2014 ......................H.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V... KP455315_QuangTri_2014 ..................S...H.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V... KP455316_QuangTri_2014 ..................S...H.G...I.....................S................G...........................S..........E......F......................V... KP455317_QuangTri_2014 ..................S...H.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V... KP455318_QuangTri_2014 ..................S...H.G...I.....................S....................................WC......N..........E......F......................V... KP455319_QuangTri_2014 ..................S...H.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V... KX708903_HaiPhong_2015 ..................V...H.G...I..................................................................S..........E......F......................V... KX708901_HaiPhong_2015 .....................DH.G...I.....................S............................................S........C.E......F......................V... KX708902_HaiPhong_2015 .....................DH.G...I.....................S............................................S..........E......F......................V... KX708896_HaNoi_2015 ......................H.G...I..................................................................S..........E......F......................V... KX982573_HungYen_2015 ......................H.G...I.....................S.......................................................D......F....................V.V... KX982576_HungYen_2015 ......................H.G...I.....................S.............N..............................S..........E......F......................V... KX708906_HungYen_2015 ......................P.G...I.....................S.................................N..........S..........D......VA.....................V... KX708907_HungYen_2015 ......................P.G...I.....................S.....................................A......S..........D......VA.....................V... KX708904_LaoCai_2015 ......................H.G...I.....................S............................................S........H.D......F......................V... KX708905_LaoCai_2015 ......................H.G...I.....................S............................................S........H.D......F......................V... KX708897_ThaiNguyen_2015 ......................H.G...I..................................................................S..........E......F......................V... KX708898_ThaiNguyen_2015 ......................H.G...I..................................................................S..........E......F......................V... KX708895_ThaiNguyen_2015 ..................V...H.G...I..................................................................S..........E......F......S...............V... KX708899_VinhPhuc_2015 ......................H.G...I..................................................................S..........E......F......................V... KX708900_VinhPhuc_2015 ......................H.G...I..................................................................S..........E......F......................V... KX708894_HungYen_2016 ..................V...H.G...I..................................................................S..........E......F.....HS...............V... 1 2 3 4 aa 496- 597 Các vùng gắn với thụ thể porcine aminopeptidase-N (pAPN) được đóng khung. Vùng kích thích sản sinh kháng thể trung hòa (aa 496-597) được xác định bởi Okda và cs., 2017. Vị trí đột biến dẫn tới khả năng lẩn tránh kháng thể trung hòa được đánh dấu bởi mũi tên. Vị trí amino acid được đánh dấu theo chủng tham chiếu CV777 Hình 4.2. Trình tự amino acid ở vùng COE của 38 chủng PEDV Mặc dù có bằng chứng trái ngược nhau nhưng pAPN (đặc biệt là tiểu phần VII) được chứng minh đóng vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình bám và xâm nhập của PEDV vào tế bào. Đối với coronavirus, vùng kháng nguyên làm nhiệm vụ gắn kết với tế bào vật chủ thường là đích tác động của 11
kháng thể trung hòa. Do đó, đột biến ở 4 vị trí bám pAPN của 38 chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam được dự đoán có ảnh hưởng đến quá trình xâm nhập của virus vào tế bào vật chủ. Ở khía cạnh khác, PEDV có thể không bị trung hòa bởi kháng thể đặc hiệu (neutralization resistance) chỉ với một điểm đột biến ở vùng bám với pAPN: từ valine (V) sang glycine (G) ở vị trí 638 (tương đương với vị trí 635 của chủng CV777). Không có chủng virus nào trong 38 chủng ở nghiên cứu này được dự đoán là có khả năng lẩn tránh kháng thể trung hòa do đều mã hóa valine ở vị trí 635 (mũi tên, hình 4.2). 4.2.1.3. Đặc điểm đột biến ở vùng quyết định kháng nguyên S1D Trình tự amino acid của vùng S1D được trình bày ở hình 4.3. Trong 21 vị trí có thay đổi amino acid (so với chủng CV777), có 6 vị trí đột biến nằm trong vùng quyết định kháng nguyên kích thích sản sinh kháng thể trung hòa (aa 741- 768). Trong vùng này, epitop trung hòa SS2 và SS6 của 38 chủng PEDV của Việt Nam có tính bảo thủ rất cao. Epitop SS2 giống với trình tự của chủng CV777 ở 37/38 chủng, trong khi đó epitop SS6 sai khác 1 aa so với chủng CV777 (vùng đóng khung, hình 4.3). SS2 SS6 640 650 660 670 680 690 700 710 720 730 740 750 760 770 780 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... Spike_AF353511_CV777 TDVSFMTLDVCTKYTIYGFKGEGIITLTNSSILAGVYYTSDSGQLLAFKNVTSGAVYSVTPCSFSEQAAYVNDDIVGVISSLSNSTFNNTRELPGFFYHSNDGSNCTEPVLVYSNIGVCKSGSIGYVPSQYGQVKIAPTVTGNISIPTNFSMSI KX982561_HaNoi_2013 .......................V.......L.......................................D...........S....S......................................L..S....................... KX982564_HoaBinh_2013 ...............................F.......................................D................S.........................................S....................... KX982553_HungYen_2013 ...............................F.......................................D...........S....S.........................................S....................... KX982554_HungYen_2013 ...............................F.......................................D...........S....S.........................................S....................... KX982557_HungYen_2013 ...............................F.......................................D...........S....S.........................................S....................... KJ960180_HungYen_2013 ...............................F.......................................D...........S....S.........................................S....................... KP455313_ThaiBinh_2013 ....S...G...................Y..F.......................................D...........S....S......................................L..S....................... KP455314_ThaiBinh_2013 ........G......................F.......................................D...........S....S......................................L..S....................... KJ960178_DongNai_2013 ...............................F.......................................D...........S....S.........................................S....................... KJ960179_VungTau_2013 ...............................F.......................................D...........S....S.........................................S....................... KP455320_HaiPhong_2014 ...............................F.......................................D...........S....S...............I.........................S....................... KX982568_HaNoi_2014 ...............................F....H..................................D...........S....S.........................................S....................... KX982570_HaNoi_2014 .......................V.......L.......................................D................S......................................L..S....................... KX982569_HoaBinh_2014 ...............................F.....................................F.D................S.K...............S.......................S....................... KT941120_HungYen_2014 ...............................F.......................................D................S.K...............S.......................S....................... KX982572_ThaiBinh_2014 ...............................F.......................................D...........S....S.........................................S....................... KX982571_VinhPhuc_2014 ...............................F....H..................................D................S.........................................S.....T................. KP455315_QuangTri_2014 ...............................F..D....................................D...........S....S......................A..................S....................... KP455316_QuangTri_2014 ...............................F.......................................D...........S....S.........................................S.R..................... KP455317_QuangTri_2014 ...............................F.......................................D...........S....S.........................................S....................... KP455318_QuangTri_2014 ...............................F.......................................D...........S....S.........................................S....................... KP455319_QuangTri_2014 ...............................F.......................................D...........S....S.........................................S....................... KX708903_HaiPhong_2015 ...............................F.......................................D...........S....S......................................L..S....................... KX708901_HaiPhong_2015 ........G......................F.......................................DG..........S....S......................................L..S....................... KX708902_HaiPhong_2015 ........G......................F.......................................D...........S....S......................................L..S....................... KX708896_HaNoi_2015 ...............................F.......................................D...........S....S......................................L..S....................... KX982573_HungYen_2015 ...............................F....H..................................D................S.........................................S....................... KX982576_HungYen_2015 ...............................F....H..................................D................S......................................S..S....................... KX708906_HungYen_2015 ...............................F.......................................D................S.K...............S.......................S....................... KX708907_HungYen_2015 ...............................F.......................................D................S.K...............S.......................S....................... KX708904_LaoCai_2015 .....K..E......................F....H..................................D................S.............................R...........S....................... KX708905_LaoCai_2015 ...............................F....H..................................D................S.........................................S....................... KX708897_ThaiNguyen_2015 ...............................F.......................................D...........S....S......................................L..S....................... KX708898_ThaiNguyen_2015 ...............................F.......................................D...........S....S......................................L..S....................... KX708895_ThaiNguyen_2015 ...............................F.......................................D...........S....S......................................L..S....................... KX708899_VinhPhuc_2015 ...............................F.......................................D...........S....S......................................L..S....................... KX708900_VinhPhuc_2015 ...............................F.......................................D...........S....S......................................L..S....................... KX708894_HungYen_2016 ...............................F.......................................D...........S....S......................................L..S....................... aa: 741-756, 744-771, 753-768 Epitop trung hòa SS2 và SS6 được đóng khung. Các phân đoạn aa 741-756, 744-771 và 753-768 kích thích sản sinh kháng thể trung hòa được xác định bởi Okda và cs., 2017. Vị trí amino acid được đánh dấu theo chủng CV777 Hình 4.3. Trình tự amino acid ở vùng S1D của 38 chủng PEDV 12
Ngoài vùng quyết định kháng nguyên kích thích sản sinh kháng thể trung hòa nằm trên tiểu phần S2 kể trên, đột biến R895G (tương đương với vị trí 891 của chủng tham chiếu CV777) được chứng minh có vai trò cực kỳ quan trọng trong quá trình thích nghi của virus in vitro (đột biến R-> G dẫn tới tăng hiệu giá virus và kích thước của plaque nhỏ hơn). Kết quả đối chiếu, so sánh cho biết 38 chủng PEDV trong nghiên cứu này đều mã hóa arginine (R) tại vị trí 891. 4.2.2. Đặc điểm gen ORF3 của PEDV lưu hành ở Việt Nam Gen ORF3 của PEDV gồm 672 nucleotide (không bao gồm codon kết thúc phiên mã). Bằng thực nghiệm, người ta đã chứng minh được vai trò của ORF3 có liên quan đến quá trình thích nghi của virus trên môi trường tế bào và độc lực của virus. Khi so sánh mức độ tương đồng nucleotide gen ORF3 giữa 12 chủng PEDV với chủng tham chiếu DR13 (hình 4.4), tùy thuộc vào vị trí nucleotide được so sánh, các chủng của Việt Nam tương đồng từ 93% - 99%. Từ nucleotide 1- 406, chủng virus KT941120 (Hưng Yên, 2014) giống > 97% so với DR13. Cũng trong khoảng này 11 chủng virus còn lại có mức tương đồng < 97%. Vị trí nucleotide (trục Ox) và tỷ lệ % tương đồng nucleotide (trục Oy) Vị trí nucleotide được đánh dấu theo chủng tham chiếu DR13 (EU054929). Hình 4.4. Tỷ lệ % tương đồng về trình tự gen ORF3 của 12 chủng PEDV Hình 4.5 trình bày kết quả phân tích trình tự amino acid của 12 chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam được thu thập trong năm 2013 và 2014. 13
10 20 30 40 50 60 70 80 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| KT941120_HungYen_2014 MFLGLFQYTIDTVVKDVSKSANLSLDAVQELELNVVPIRQASNVTGFLFTSVFIYFFALFKASSLRRNYIMLAARFAVIV KJ960178_DongNai_2013 ........................S............................................V.........F KJ960179_VungTau_2013 ........................S............................................V.........F KJ960180_HungYen_2013 ........................S...............................L............V.........F KP455967_ThaiBinh_2013 ........................S............................................V.........F KP455968_ThaiBinh_2013 ........................S............................................V.........F KP455969_QuangTri_2014 ....................V...S............................................V.........F KP455970_QuangTri_2014 ........................S............................................V.........F KP455971_QuangTri_2014 ........................S......................F.....................V.........F KP455972_QuangTri_2014 ....................V...S............................................V.........F KP455973_QuangTri_2014 ....................V...S............................................V.........F KP455974_QuangTri_2014 ........................S......................................F.....V.........F 90 100 110 120 130 140 150 160 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| KT941120_HungYen_2014 LYCPLLYYCGAFLDATIICCTLIGRLCLVCFYSWRYKNALFVIFNTTTLSFLNGKADYYDGKSIVILEGGDHYITFGNSF KJ960178_DongNai_2013 ..........................F..............I..............A....................... KJ960179_VungTau_2013 ..........................F..............I..............A....................... KJ960180_HungYen_2013 ...................R......F..............I..............A....................... KP455967_ThaiBinh_2013 ..........................F..............I..............A....................... KP455968_ThaiBinh_2013 ..........................F..............I..............A....................... KP455969_QuangTri_2014 ..........................F..............I..............A....................... KP455970_QuangTri_2014 ..........................F..............I..............A....................... KP455971_QuangTri_2014 ..........................F..............I..............A....................... KP455972_QuangTri_2014 ................T.........F..............I..............A....................... KP455973_QuangTri_2014 ..........................F..............I..............A....................... KP455974_QuangTri_2014 ..........................F..............I..............A.......................   170 180 190 200 210 220 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... KT941120_HungYen_2014 VAFVSSIDLYLAIRGRQEADLQLLRTVELLDGKKLYVFSQHQIVGITNAAFDSIQLDEYATISE KJ960178_DongNai_2013 .......N.............H....................V..................... KJ960179_VungTau_2013 .......N.............H....................V..................... KJ960180_HungYen_2013 .......N.............H.......................................... KP455967_ThaiBinh_2013 .......N.............H.......................................... KP455968_ThaiBinh_2013 .......N.............H.......................................... KP455969_QuangTri_2014 .......N.............H.......................................... KP455970_QuangTri_2014 .......N.............H.......................................... KP455971_QuangTri_2014 .......N.............H.......................................... KP455972_QuangTri_2014 .......N.............H.......................................... KP455973_QuangTri_2014 .......N.............H.......................................... KP455974_QuangTri_2014 .......N.............H..........................................  Các vị trí liên quan đến ức chế sự nhân lên của virus in vitro được đánh dấu bởi mũi tên. Trong đó, aa 81 và 167 có ảnh hưởng rõ rệt nhất được đánh dấu màu xám. Vùng aa 82- 98 liên quan đến hiện tượng ức chế sự nhân lên của virus được gạch chân. Vị trí xuất hiện đột biến tại (aa 98) trong quá trình nhược độc hóa chủng virus nhược độc PC22A được đóng khung nét liền. Vùng aa (1) và (2) ảnh hưởng tới kênh ion K+, trong đó aa 170 có ảnh hưởng rõ rệt được đóng khung bằng nét đứt Hình 4.5. Trình tự amino acid ORF3 protein của 12 chủng PEDV Protein ORF3 ngoài đóng vai trò là kênh ion trên vỏ bọc của virus với Tyrosin ở vị trí 170 (170Y) đóng vai trò quan trọng trong duy trì hoạt động của kênh ion K+. Vị trí này ở protein ORF3 của 12 chủng PEDV của Việt Nam đều không có đột biến. Đối chiếu với 2 vị trí amino acid (F81L và M167S) đóng vai trò then chốt trong quá trình ức chế sự nhân lên của virus trên môi trường tế bào in vitro, chúng tôi không quan sát được các đột biến đã được chứng minh ức chế sự nhân lên của PEDV. 14
4.3. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PEDV 4.3.1. Đặc điểm về sự lưu hành PEDV theo nhóm di truyền 4.3.1.1. Cây phả hệ của PEDV dựa vào gen S Để làm rõ mối liên hệ về trình tự gen giữa các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam với thế giới, chúng tôi đã thu thập và phân tích cơ sở dữ liệu bao gồm 911 trình tự gen S hoàn chỉnh, có đủ thông tin về địa điểm và thời gian thu thập mẫu. Các kết quả phân tích được trình bày ở hình 4.6. Nhóm Bắc Mỹ Nhóm châu Á Nhánh của cây phát sinh chủng loại được đánh dấumàu đen (genogroup 1) và màu xanh (genogroup 2). Nhánh dẫn tới các chủng lưu hành ở Việt Nam được đánh dấu màu đỏ và được chỉ bằng mũi tên Hình 4.6. Cây phả hệ của các chủng PEDV dựa vào trình tự gen S Kết quả cho thấy 38 chủng PEDV của Việt Nam (mũi tên) thuộc về 2 nhóm riêng rẽ là genogroup 1 và genogroup 2. Trong khi các chủng virus thuộc genogroup 1 chỉ bao gồm 1 nhánh, PEDV thuộc genogroup 2 phân bố rải rác ở các nhánh khác nhau của cây phát sinh chủng loại. Cùng với các chủng PEDV lưu hành ở các nước khác, 31 chủng virus của Việt Nam thuộc genogroup 2 được phân bố vào 2 dưới nhóm là nhóm châu Á và nhóm Bắc Mỹ. Kết quả phân loại PEDV lưu hành ở Việt Nam kể trên là phù hợp nghiên cứu được công bố năm 2015 trong đó nhóm tác giả cho biết: dựa vào trình tự toàn bộ gen S, PEDV lưu hành ở một số tỉnh thuộc miền Bắc và miền Trung thuộc về genogroup 1 và genogroup 2. Ở góc độ khác, kết quả phân tích của nghiên cứu này cho biết một số công bố chỉ phát hiện được genogroup 2 của PEDV ở nước ta là chưa chính xác. 15
4.3.1.2. Cây phả hệ của PEDV dựa vào gen ORF3 Mối liên hệ giữa các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam trong tương quan với các chủng lưu hành trên thế giới tiếp tục được phân tích dựa vào gen ORF3. MF577027 KU836638 Genogroup 1 Genogroup 2 Variant Nhánh của cây thuộc về genogroup 1 và genogroup 2 lần lượt được đánh dấu màu đen và màu xanh. Nhánh có chủng PEDV của Việt Nam được đánh dấu màu đỏ. Nhóm biến thể chưa được xác định genogroup được đánh dấu màu tím. Hình 4.7. Cây phả hệ của PEDV dựa vào trình tự gen ORF3 Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự gen ORF3 phân chia các chủng PEDV thành 2 genogroup rõ ràng là genogroup 1 và genogroup 2. Tuy nhiên, khác với các công bố trước đây, kết quả trình bày trong nghiên cứu này cho thấy, ngoài 2 genogroup kể trên, còn quan sát được 1 nhánh phát sinh nằm ở gốc của cây phả hệ. Nhánh này hiện bao gồm 2 chủng virus (với đặc điểm gen khác biệt lớn so với các chủng PEDV hiện lưu hành) được tìm thấy ở các mẫu bệnh phẩm lưu trữ từ năm 2000 ở Anh và năm 2008 ở Nga. Phân tích cơ sở dữ liệu gồm 886 trình tự gen ORF3 có trong ngân hàng gen (gồm trình tự gen cập nhật của Việt Nam), nghiên cứu này đã xác định PEDV lưu hành ở nước ta gồm genogroup 1 (11 chủng, phân lập năm 2013-2014) và genogroup 2 (1 chủng, phân lập năm 2014). Đây được xem như kết quả bổ sung về đặc điểm dịch tễ học virus lưu hành ở nước ta, bởi lẽ dựa vào gen ORF3 nghiên cứu trước đây đã nhận định PEDV lưu hành ở Việt Nam chỉ bao gồm một nhóm di truyền có quan hệ chặt chẽ với nhau. 16
4.3.2. Hiện tượng tái tổ hợp của PEDV lưu hành ở Việt Nam Kết quả phân tích cây phả hệ dựa vào trình tự một phần hoặc toàn bộ gen S, cho thấy một số chủng có sự thay đổi về genogroup được phân loại. Nghiên cứu này đã làm rõ hiện tượng tái tổ hợp của các chủng PEDV lưu hành ở Việt Nam trên cơ sở so sánh cây phả hệ được xây dựng bởi các đoạn khác nhau của gen S: một phần (nt 1534- 2049) gen S và toàn bộ gen S. A B genogroup 2 genogroup 1 (A) Cây phả hệ dựa trên trình tự gen S từ nt 1534- 2049 theo Nguyễn Trung Tiến và cs (2015). (B) cây phả hệ dựa trên trình tự toàn bộ gen S được xây dựng trong nghiên cứu này. Các chủng PEDV giống nhau ở mỗi cây phả hệ được nối với nhau bởi một đường thẳng Hình 4.8. Đối chiếu nhánh cây phả hệ dựa vào trình tự toàn bộ/ một phần gen S Hình 4.8 A cho biết 11/11 chủng PEDV được xếp vào genogroup 1 dựa vào trình tự phân đoạn gen S gồm 650 nt. Đáng chú ý có 5/11 chủng (đánh dấu màu vàng, hình 4.8) được xếp vào genogroup 2 ở cây phả hệ được xây dựng dựa vào trình tự toàn bộ gen S. Đối với các chủng còn lại, mặc dù không thấy có sự thay đổi genogroup, vẫn quan sát được sự thay đổi vị trí (được nhóm với các chủng khác nhau) giữa 2 cây phả hệ. Tái tổ hợp là một cơ chế tiến hóa của virus nói chung và của PEDV nói riêng. Hiện tượng tái tổ hợp của PEDV diễn ra khá đa dạng: (i) giữa PEDV và TGEV, (ii) giữa 2 chủng virus thuộc genogroup 1 và genogroup 2 và xảy ra tại nhiều vị trí của gen S, (iii) giữa các gen khác nhau của bộ gen, v.v... 17
Như vậy, có thể thấy đặc điểm tái tổ hợp của một số chủng PEDV ở Việt Nam không phải là cá biệt. 4.3.3. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV theo không gian và thời gian 4.3.3.1. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV thuộc genogroup 1 Hình 4.9 trình bày kết quả phân tích đặc điểm dịch tễ học phân tử của PEDV thuộc genogroup 1 lưu hành ở Việt Nam dựa vào gen ORF3. ~2012 ~2009 ~2012 ~2013 Các nhánh được đánh dấu bằng màu tương ứng với quốc gia/ vùng lãnh thổ được dự đoán và chiều dài được căn chỉnh tương ứng với trục thời gian được dự đoán. Kích thước của chấm ⚫ ở mỗi nút tương ứng với mức tin cậy của dự đoán 40%- 100% Hình 4.9. Sự phát tán theo không gian và thời gian của genogroup 1 dựa vào gen ORF3 18